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Bioengineering

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57937
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute of Bioengineering and Bioscience, 3Institute for Electronics and Nanotechnology, Georgia Tech, 4Integrated Cancer Research Center, Georgia Tech, 5The Georgia Immunoengineering Consortium, Emory University and Georgia Tech

Summary

Proteasen sind streng regulierte Enzyme grundlegende biologische Prozesse und Dysregulated Protease-Aktivität Laufwerke Fortschreiten von komplexen Krankheiten wie Krebs beteiligt. Diese Methode soll Nanosensoren geschaffen, die Protease-Aktivität in Vivo durch die Herstellung einer Spaltung Signal, das vom Host Urin nachweisbar ist und Krankheit diskriminiert messen.

Abstract

Proteasen sind multifunktionelle Enzyme, die die Hydrolyse von Peptidbindungen spezialisiert und Breite biologische Prozesse einschließlich der Homöostase und Handlungspotentiale steuern. Darüber hinaus Dysregulated Proteaseaktivität treibt Pathogenese und ist eine funktionelle Biomarker von Krankheiten wie Krebs; Daher kann die Möglichkeit, Protease-Aktivität in Vivo zu erkennen klinisch relevante Informationen für die biomedizinische Diagnostik bieten. Dieses Protokoll soll Nanosensoren geschaffen, die für die Protease-Aktivität in Vivo Sonde durch die Herstellung einer quantifizierbaren Signals im Urin. Diese Protease Nanosensoren bestehen aus zwei Komponenten: einem Nanopartikel und Substrat. Die Nanopartikel Funktionen Zirkulation Half-Life und Substrat Lieferung an Ziel-Krankheit-Sites zu erhöhen. Das Substrat ist eine kurze Peptidsequenz (6-8 AA), die spezifisch für ein Ziel Protease oder eine Gruppe von Proteasen werden soll. Das Substrat wird an die Oberfläche der Nanopartikel konjugiert und wird von einem Reporter, wie z. B. einen fluoreszierenden Marker für die Erkennung beendet. Wie Dysregulated Proteasen das Peptid-Substrat Spalten, wird die Reporter in Urin für die Quantifizierung als Biomarker der Proteaseaktivität gefiltert. Hier beschreiben wir Bau des Nanosensor für Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9), der Tumorprogression und Metastasierung, zur Erkennung von Darmkrebs in einem Mausmodell zugeordnet ist.

Introduction

Proteasen sind multifunktionelle Enzyme, die die Hydrolyse von Peptidbindungen spezialisiert und haben wesentliche Kontrolle über viele biologische Prozesse, einschließlich der Homöostase, Handlungspotentiale und Krankheit1. Ein veränderter Bewusstseinszustand der Protease-Aktivität hat zu einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, machen Proteasen attraktive Kandidaten für die Entwicklung in klinischen Biomarker2,3korreliert. Darüber hinaus ist die Protease-Aktivität funktional verknüpften zu unterscheiden Pathogeneses, Behandlungsergebnisse und Prognose der Erkrankung4. Im großen und ganzen, Biosensoren wurde entwickelt, um verschiedene biologische Phänomene zu erkennen und Krankheiten wie Krebs, neurodegenerativen Erkrankungen und Elektronentransfer verarbeitet5,6,7,8 , 9. genauer gesagt, Protease Substrat-basierte Sensoren wurden entwickelt, um die Protease-Aktivität zu erkennen, und beinhalten Fluorogenic Sonden für die diagnostische Bildgebung10 und isotopischer beschriftet Peptid Substrate für in-vitro- Erkennung durch Massenspektrometrie11. Darüber hinaus wurden Activity based Sonden entwickelt, die Substrat-Regionen, die binden oder ändern das Ziel Protease12enthalten. Mit dieser Methode wird die Ziel-Protease irreversibel gehemmt, wenn aktiven Seite geändert wird, und Analyse des Gewebes, das in Vivo Anwendungen begrenzt Ernte benötigt. Jedoch ist es wichtig, die Protease-Aktivität in Vivo, Sinn, weil Regulierung der Protease-Aktivität stark abhängig vom Kontext des anderen biologischen Aktivitäten wie das Vorhandensein von endogene Inhibitoren ist.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Formulierung des Activity based Nanosensoren zu beschreiben, die Protease-Aktivität in Vivo zu erkennen, indem Sie ein messbares Signal im Urin produzieren. Diese Plattform dient als eine nicht-invasive Diagnostik, um komplexe Krankheiten wie Krebs mithilfe Dysregulated Protease-Aktivität als funktionelle Biomarker zu unterscheiden. Unsere Nanosensor-Plattform besteht aus Eisenoxid-Nanopartikeln (IONP) konjugiert, Protease Substrate. Diese Substrate werden von einem fluoreszierenden Reporter beendet die Proteasen Spalten das Substrat freigesetzt wird. Diese IONPs in Vivozirkulieren, zu Krankheit Websites lokalisieren und setzen Substrate zu aktiven krankheitsassoziierten Proteasen. Nach der Spaltung fluoreszierende Reporter freigegeben sind und aufgrund ihrer geringen Größe sind in Urin, gefiltert, während uncleaved Substrate auf die IONP im Körper verbleiben. Daher führt eine Erhöhung der Protease Tätigkeiten in Vivo in höheren Konzentrationen der Reporter im Urin (Abbildung 1). Da unsere Plattform ein Urin-Test ist, keine imaging Plattform ist erforderlich und Diagnosesignale im Urin angereichert.

Diese Plattform kann entwickelt werden, um eine Vielzahl von Krankheiten einschließlich Krebs, Fibrose und Thrombose13,14zu erkennen. Hier beschreiben wir das Design der Nanosensoren Erhebungen in Matrix Metallopeptidase 9 (MMP9) erkennen Aktivität als Biomarker von Dickdarmkrebs. Darmkrebs ist die zweithäufigste Ursache für Krebstod in den Vereinigten Staaten, mit schätzungsweise 136.800 neue Fälle und 50.300 Todesfälle in 2014 allein15. Kolorektalen Tumorzellen produzieren MMP9, das gezeigt worden ist, zur malignen Progression, Matrix Schädigung sowie Metastasen16fahren. Darüber hinaus haben wir eine geeignete Peptid-Substrat (PLGVRGK) aus der Literatur17für MMP9 identifiziert. Diese Plattform kann für Früherkennung und kostengünstige Point-of-Care Diagnostik13,14,18,19,20,21verwendet werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Nanosensor Aktivität In Vivo. Nanosensoren durch den Körper zirkulieren und auf Seiten der Krankheit zu lokalisieren. Krankheitsbezogenen Proteasen Spalten dann Peptid Substrate von IONPs präsentiert. Die Größe der Fragmente gespalten ermöglicht renale Clearance, wodurch sie im Urin zu lokalisieren. Nachdem das Tier uriniert, können diese Peptid-Fragmente durch ihre Reporter Molekül analysiert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Protocol

Institutionelle Genehmigung institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Forschers Institution ist notwendig, die folgenden Tierversuche durchzuführen. Darüber hinaus sind standard Tierbetreuung Einrichtungen (z. B. Gehäuse, Kammern, sterile Tier Hauben und Isofluorane Kammern für Anesthetization CO2 Kammern für ethische Endpunkt Euthanization) notwendig, um diese ordnungsgemäß durchführt Experimente. Spezielle Schulungen und Unterstützung bei diesen Einrichtungen können durch physiologische Forschung Labor (PRL) an der Hochschule bereitgestellt werden. Alle tierische Arbeit von IACUC an der Georgia Tech genehmigt wurde (Protokoll: A14100).

(1) Eisenoxid-Nanopartikel (IONP)-Synthese

Hinweis: Sicherheit: die gesamte Eisenoxid-Nanopartikel-Synthese Verwendung persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden sollte und unter einer chemischen Rauch Haube.

  1. Entspannen Sie in einem 15 mL konische Rohr 1 mL 30 % Ammonium Hydroxid in einem Eiskübel für 30 min.
  2. Waschen Sie eine 250-mL-Erlenmeyerkolben mit entionisiertem Wasser zu, und fügen Sie 10 mL doppelt destilliertes Wasser (DdH2O). Tauchen Sie die Außenseite des Kolbens im Eisbad ruht auf einem rühren/Heizplatte. Verwenden Sie eine Kunststoff Pipette zum Fluss N2 Gas in der DdH2O in den Kolben. Blase für 15 Minuten mit N2 , ebenso.
  3. 224 µmol (4,5 Gramm) von Dextran wiegen (Molekulargewicht (MW) = 20 kDa) in ein 50 mL konische Röhrchen. Fügen Sie H2O hinzu, so dass der letzte Band der Mischung, einschließlich der Dextran 20 mL. Wirbel der Dextran kräftig aufzulösen.
  4. Wiegen Sie 290 µmol (78,5 Gramm) von Eisen(III)-Chlorid Hexahydrat, hinzu kommen Dextran-Lösung und Strudel auf auflösen.
  5. Filtern Sie die resultierende Lösung durch einen 0,2 µm-Filter.
  6. Übertragen Sie 1 mL gekühlten Ammonium Hydroxid in 9 mL sauerstoffarmes Wasser. Zurück zu 4 ° C.
  7. 367 µmol (73,0 Gramm) von Eisen(II) chlorid Tetrahydrat wiegen, lösen sich in 1 mL der sauerstofffreien DdH2O und durch einen 0,2 µm-Filter filtern.
  8. Die dextran-iron(III)-Lösung in der 250-mL-Erlenmeyerkolben übertragen und ebenso mit N2 für 15 Minuten auf dem Eis. Mit einen magnetischen Stir bar dreht bei 1600 u/min mischen.
  9. Um eine homogene Stickstoffatmosphäre zu schaffen, Kappe der Flasche mit einem gummiseptum. Punktion das Septum mit einer 18 gauge Nadel Fluss N2 in den Kolben. Separate 18-Gauge Nadel als Flow Ventil.
  10. Die dextran-iron(III) Lösung fügen Sie 467 µL der Lösung Eisen(II) mit eine 1 mL Spritze, die mit einer magnetischen Stir Bar bei 1600 u/min unter ständigem Rühren hinzu. Dieses Verhältnis von Eisen(II) zu Eisen führt zu einer ausgewogenen Reaktion, die Magnetit oder Fe3O4produzieren wird.
  11. Fügen Sie die gekühlte verwässern Ammonium Hydroxid tropfenweise in die Eisen (II) - Eisen (III) - Dextran-Lösung, die Keimbildung Prozess21zu initiieren. Stellen Sie sicher, dass mischt jeden Tropfen auch vor dem Ablegen in einem anderen. Die Reaktion nach der Zugabe von 1-2 mL von Ammonium Hydroxid zu beenden.
  12. Stoppen Sie die Strömung von N2 und entfernen Sie der gummiseptum zu. Entfernen Sie das Eisbad zu und ersetzen Sie durch eine Badewanne mit warmem Wasser, während Sie weiterhin rühren Sie die Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Lösung 75 ° C erreicht und 75 Minuten inkubieren.
  13. Entfernen Sie den Kolben aus der rühren/heiße Platte und Filtern Sie doppelt die Lösung durch 0,2 µm dann 0,1 µm Filter, grobe Partikel zu entfernen.
  14. Puffer wechseln die Partikel in DdH2O, mit 100 kDa Molekulargewicht abgeschnitten (m.w.c.o.)-Konzentratoren um überschüssige Dextran aus der Lösung zu entfernen, die sehr dickflüssig sein sollte. Filter zu ersetzen, wenn der Durchfluss durch dunkel bleibt auch nach 2-3 Drehungen, die angibt, dass der Filter gebrochen haben kann.
    1. Puffer-Austausch mit Spin Filter, für 15 Minuten bei 4 ° C bei 4800 X g zentrifugieren, verwerfen die Durchströmung und neuen Puffer der IONP Projektmappe hinzufügen. Wiederholen Sie 3 - 5 Mal.
  15. Bestimmen Sie die Konzentration der Nanopartikel mit einem Spektrophotometer/Platte-Reader. Nehmen Sie Absorption Messungen bei 400 nm und Verwendung der molaren Absorptionsvermögen von IONP bei dieser Wellenlänge (ε = 2,07 x 106 cm-1 M-1) zur Bestimmung der Konzentration von e/a-Teilchen.
  16. Aufschwemmen Sie der IONPs auf 10 mg/mL in DdH2O (Gesamtvolumen ist in der Regel ca. 3 mL) und achten Sie darauf, für diesen Schritt für die chemische Verträglichkeit Polypropylenröhrchen verwenden. Fügen Sie 1,6 Mengen von 5 M NaOH, dann fügen Sie 0,65 Bände von Epichlorhydrin. Konsequent auf eine Platte Schüttler bei Raumtemperatur für 12 Stunden Crosslink Dextran mischen.
  17. Verwenden Sie eine 20 mL Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel IONP Lösung in die 50 kDa m.w.c.o. Dialysemembran zu übertragen. Legen Sie die Dialysemembran in 4 L DdH2O und ersetzen Sie H2O ein paar Mal (alle 2-3 Stunden) zu. Über Nacht inkubieren.
  18. Messen der Konzentration und IONPs bis 5 mg/mL (siehe Schritt 1.15) zu bringen. Fügen Sie Ammonium Hydroxid um bis zu 20 % (V/V) und schütteln bei Raumtemperatur für > 12 Stunden aminate der Oberfläche des IONPs hinzu. Buffer Tausch mit 30 kDa m.w.c.o. Filtern (siehe 1.14).
  19. Stellen Sie die Lautstärke bis auf 2,5-3,5 mL vor der Endreinigung durch schnell Protein Liquid Chromatography (FPLC; siehe Tabelle der Materialien für Gel-Filtration-Spalte).
  20. Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung (DLS), um den hydrodynamischen Radius des IONPs (erwarteten Bereich 10-100 nm, durchschnittliche Größe 40-50 nm) zu bestimmen. Zu diesem Zweck Aliquotierung 1 mL 100 X verdünnten IONP Probe in eine Küvette, legen in die Maschine und die Software des Herstellers zu verwenden, um die Messung vorzunehmen.
    Hinweis: Die Gesamtbevölkerung von IONPs werden zwischen 10 und 100 nm von DLS-Messungen, aber die Mehrheit der Bevölkerung ist rund um den durchschnittlichen Durchmesser, die von 40-50 nm reicht. Will man den Größenbereich zu begrenzen, können eine weitere Größe Ausgrenzung Chromatographie Brüche mit verschiedenen Durchmessern zu isolieren. IONPs sollte bei 4 ° c gelagert werden

(2) Peptid Design, Konjugation, IONP und In-vitro- Validierung

  1. Ein Peptid-Substrat (z. B. durch eine zentrale Einrichtung oder kommerziell) für ein Ziel-Protease mit einer N-terminalen fluoreszierende Reporter wie Fluorescein erfolgt (FITC) und ein C-terminal Cystein-Rückstand Thiol-vermittelten Kupplung ermöglichen zu synthetisieren.
    Hinweis: Bei dieser Studie für MMP9, war das Peptid verwendet FITC-PLGVRGK-C, mit kKatze/km ~ 2.0 x 105 M-1s-1.
  2. Aliquoten 0,5 mg IONP (bei 1 mg/mL) und Buffer Tausch in Kupplung Puffer (50 mM Natrium Borat mit 1 mM EDTA, pH = 8,5) mit einem 10 kDa m.w.c.o. Spin Filtern (siehe Schritt 1,14).
  3. Succinimidyl Jodazetat (SIA) in Dimethylformamid (DMF), eine Konzentration von ~ 30 mg/mL erreichen auflösen, und IONP bei einem mol-Verhältnis von 500 SIA:IONP SIA hinzufügen.
    Hinweis: SIA ist ein Heterobifunctional cross-Linker, der Kopplung von Aminen auf IONPs den Sulfhydryl Gruppen auf das Substrat Peptid vermittelt.
  4. 1-2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Wenn Sie über Nacht verlassen, bei 4 ° c inkubieren
  5. Puffer-Austausch mit einem 10 kDa m.w.c.o. Spin Filter in Kupplung Puffer nicht umgesetztes SIA zu entfernen (siehe Punkt 1.14).
  6. Bringen Sie die Endprodukt-Lösung 1 mg/ml (0,5 mL Lösung). Mischen Sie das Peptid von Interesse in einem molaren Verhältnis von 90:1 (Peptid: IONP) mit 20 kDa Thiol-terminierte Polyethylenglykol (PEG) in einem molaren Verhältnis von 20:1 (PEG: IONP). Mischen Sie dieses Peptid-PEG-Lösung mit IONP.
  7. Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Teller Shaker auf höchste Geschwindigkeit, für Rohre in Folie, Immunofluoreszenz fluoreszierende Moleküle zu verhindern.
  8. Fügen Sie L-Cystein in einem molaren Verhältnis von 500: 1 (C:IONP), nicht umgesetztes SIA-Moleküle zu neutralisieren. 1 Stunde bei 25 ° C auf einem Boston-Shaker mit höchster Geschwindigkeit bei Raumtemperatur inkubieren.
  9. Über FPLC reinigen (siehe 1.1.19). Verwenden Sie ein Spektralphotometer zur Messung der Extinktion der Probenlösung und das Peptid: IONP Verhältnis wie folgt zu berechnen. Nach der Reinigung Lagern Sie Produkt bei 1 mg/mL bei 4 ° C mit PBS-Puffer.
    1. Verwenden Sie ein Spektralphotometer zur Messung der Extinktion der Probenlösung bei 400 nm (eineProbe, 400) und die Wellenlänge der maximalen Absorption für die Fluorophor verwendet, das 488 nm für FITC (eineProbe, 488). Die Extinktion einer Aktie Amin IONP Lösung bei den gleichen zwei Wellenlängen zu messen (400 nm und 488 nm), die jeweils als einNP, 400 und einNP, 488vertreten sind.
    2. Verwenden Sie Gleichungen 1 und 2 der normalisierten berechnen A400 und eine488 -Werte.
      Equation 1Gleichung 1
      Equation 2Gleichung 2
    3. Eine400 und eine488 repräsentieren die normalisierte Werte der Probe. Verwenden Sie diese Werte, um das Verhältnis von Peptid: IONP mit Gleichung 3 zu berechnen.
      Equation 3Gleichung 3
    4. Wo Equation 4 und Equation 5 sind die molaren Absorptivities der IONP und der Fluorophor, beziehungsweise. Für diese Teilchen Equation 4 = 2,06 x 106 M-1cm-1 und für FITC Equation 5 = 72.000 M-1cm-1, also der Wert der Equation 6 28,75 werden sollte. Typische Peptid: IONP Verhältnisse sollte im Bereich von 20:1 bis 50: 1.
  10. Funktionalität der Sonden durch durchführen eines in-vitro- Spaltung Assays zu validieren.
    1. Mit PBS (1 % BSA), eine 18 µL-Nanopartikel-Lösung mit einer 200 nM-Konzentration von Peptid zu machen. Mischen Sie mit 2 µL Protease von Interesse (MMP9; 0,1 - 1 mg/mL).
    2. 1 Stunde, die Fluoreszenz-Messungen in einem Teller-Reader bei 37 ° C inkubieren (mit den entsprechenden Anregung und Emission Wellenlängen, die sind 485 nm und 528 nm für FITC, beziehungsweise) alle 1-2 Minuten, Spaltung zu überwachen.

3. Verwaltung der Nanosensoren und Urin Erkennung von Krebs

Hinweis: Für mehr Details über das Beispielmodell, siehe unsere vorherigen Bericht13.

  1. Erstellen Sie einen metabolische Käfig für die urinsammlung durch eine Zylindrische Hülse an die Spitze einer 96-well-Platte zu sichern. Während Urin sammeln legen Sie eine Maus im Inneren der Hülse und Deckel mit einer Petrischale Abdeckung zur Flucht des Tieres zu verhindern.
  2. Bereiten Sie eine Injektionslösung (200 µL maximale Lautstärke) mit Nanosensoren in einer Konzentration von 3000 mg/kg (~ 50 µmol) durch Peptid in sterile Kochsalzlösung.
  3. Weiblich, 8 - Wochen alten, nackten Mäusen mit Xenograft LS174T kolorektalen Tumoren bei einer Belastung von ca. 100-300 mm3, die auf etwa auftreten sollten Tag 10, Nanosensor Lösung mittels Rute Vene Injektion verabreichen. Sofort nach der Injektion Mäuse in metabolische Käfige und notieren Sie die Zeit der Injektion für jede Maus.
  4. Entfernen Sie bei 60-90 Minuten nach der Injektion Zylindrische Hülse aus 96-Well-Platte. Zurückhalten von Maus und leichten Druck auf die Blase, Mäuse, alle restlichen Urin auf den Teller nichtig zu induzieren. Sammeln Sie alle Urin (200-500 µL).
  5. Analysieren Sie Urinproben durch Immunopräzipitation FITC aus dem Urin zu reinigen und Empfindlichkeit zu erhöhen. Verwenden Sie magnetische Beads mit Anti-FITC Antikörper gekoppelt.
    1. Zuerst waschen Sie 25 mg von den magnetischen Beads 3 Mal mit Beschichtung Puffer, und 225 µL bringen Sie Endvolumen.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Beschichtung Puffer (0,1 M Natrium Borat, pH 9,5), blockierende Puffer (PBS, 0,5 % BSA, 0,05 % Tween-20, pH 7,4), und waschen Puffer (PBS, 0,1 % BSA, 0,05 % Tween-20, pH 7,4) frisch jedes Mal und etwa 20 mL der jeweils erforderlich ist.
    2. Fügen Sie 200 µL Anti-FITC (5 mg/mL) und 200 µL Ammoniumsulfat (3 M). 16-24 Stunden bei 37 C auf ein Rotator inkubieren.
    3. Die Lösung zu einem Magnetabscheider hinzufügen, entfernen den überstand, ersetzen mit 625 Equation 7 Puffer Λ blockieren, und über Nacht bei 37 C inkubieren. Dann 3 Mal mit Waschpuffer waschen und Lagern in 1,25 mL Waschpuffer.
    4. Brüten 2 µL Urin mit 5 µL des magnetischen Beads (20 mg/mL) und bringen ein Gesamtvolumen zu 50 µL mit PBS (0,01 % Tween 20). 60 min inkubieren.
    5. Zweimal mit 50 µL PBS waschen (0,01 % Tween 20) mit einem Magnetabscheider, um magnetische Beads nach jedem Waschen zu sammeln.
    6. Eluieren Sie zweimal mit 32.5 µL 5 % Eisessig. Neutralisieren Sie zusammengefasste Elution (70 µL) mit 35 µL 2 M Tris, einen endgültigen pH-Wert von ~ 7 zu erreichen.
    7. Auf einem Teller-Reader zu lesen (siehe Tabelle der Materialien) bei geeigneter Anregung und Emission Wellenlängen, Urin Fluoreszenz zu quantifizieren. Berechnen Sie die Konzentration von fluoreszierenden Reporter gegen eine Leiter der bekannten Konzentrationen von freien Fluorophor.

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Representative Results

Die Mehrheit der Bevölkerung der IONPs ist rund um den durchschnittlichen Durchmesser, die von 40-50 nm reicht. Nach PEGylierung, hat dieser Größenordnung eine Zirkulation Halbwertszeit von etwa 6 Stunden13 in Vivo (siehe Abb. 2a). Will man für einen bestimmten Größenbereich auswählen, können eine Größe Ausgrenzung Chromatographie um IONP Fraktionen mit unterschiedlichen Durchmessern zu isolieren. Die Nanopartikel durch TEM erscheint als einzelne sphärische Eisenoxid-Nanopartikeln vernetzt zusammen durch eine äußere Schicht der Dextran. 13  Eine Lösung des IONPs erscheint mit keine überstürzten und hellbraun in der Farbe durchscheinend. Nach erfolgreichen Peptid Konjugation werden spektrale Absorption Analyse eine unterschiedliche Extinktion Spitze bei der maximalen Erregung Wellenlänge von fluoreszierenden Reporter zeigen. Im Falle der FITC, dies wird das Bild zentriert rund 488 nm (siehe Abb. 2 b). Eine typische Peptid Konjugation Reaktion führt ein Peptid IONP Molverhältnis von 20-50 nach FPLC Reinigung. Um die Fähigkeit der Sonde zu Sinn Protease-Aktivität zu testen, kann eine Aliquote Nanosensoren mit rekombinanten Proteasen inkubiert und durch Fluorimetry überwacht werden. Dekolleté-Aktivität führt die Freisetzung von fluoreszierenden Reporter - die sonst Homoquenched auf der Oberfläche der Nanopartikel - in Lösung und Probe Fluoreszenz zu erhöhen. Es ist typisch, Substrat Spaltung Geschwindigkeiten zu beobachten, die Michaelis-Menten Kinetik zu folgen (siehe Abbildung 2 c).

Figure 2
Abbildung 2: Validierung der Struktur und Funktion von Nanosensoren In Vitro. (a) A DLS-Diagramm, die Größenverteilung der eine IONP Bevölkerung nach Synthese darstellt. (b) das Absorptionsspektrum des IONPs Post-Konjugation mit Substraten, FITC-markierte MMP-9. (c) der in-vitro- Dekolleté Test zeigt, dass MMP9 stetig das Peptid präsentiert von der Nanosensor im Laufe einer Stunde spaltet. Eine Protease Konzentration von 0,5 mg/mL wurde mit PBS-Puffer verwendet (1 % BSA) Puffer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Um diese Plattform in Mausmodellen von Krebs zu bewerben, ist es üblich, Nanosensoren beschichtet mit einem Nah-Infrarot-fluoreszierende Reporter verwenden, um Visualisierung der Pharmakokinetik von ganzen Tier Leuchtstofflampen imaging (Abbildung 3a) zu ermöglichen. Bei Mäusen mit LS174T kolorektalen Tumoren wird ein Fluoreszenzsignal in den Urin innerhalb von 60-90 Minuten nach der intravenösen Verabreichung von Nanosensoren aufgrund MMP9 Spaltung von Peptid Substrate auf die Nanosensoren lokalisieren. Im Gegensatz dazu werden niedrigere fluoreszierende Signale in der Blase der Kontroll-Gruppe-Mäusen (siehe Abbildung 3a). Es sei darauf hingewiesen, dass das Signal beobachtet in der Leber entsteht, weil Teilchen schließlich von Monozyten und Makrophagen im retikuloendothelialen System aufgeräumt sind die häufigsten in der Leber, Milz und Lymphknoten zu finden sind. Daher ist das Signal von der Leber in Abbildung 3a auf Räumung der Nanopartikel. 13 wenn Urin Fluoreszenz durch Immunopräzipitation zu quantifizieren, wird eine deutlich erhöhte Signal bei Mäusen mit LS174T Tumoren im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen (siehe Abb. 3 b) beobachtet werden.

Figure 3
Abbildung 3: Erkennung von Darmkrebs in einem Mausmodell. (a) In Vivo -Bilder von Tumor und Kontrolle Gruppe Mäuse, IONP Lokalisierung auf Seiten der Krankheit als auch Urin Lokalisierung durch Tumorprogression zu beobachten. (b) Urin Fluoreszenz Quantifizierung des Tumors im Kontroll-Mäusen im LS174T-Tumor-Modell. Fehlerbalken werden dargestellt als Standardabweichung (*p < 0,05 durch zwei-tailed gepaarten t-Test). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Diese Methode beschreibt die Entwicklung der Activity based Nanosensoren bestehend aus Protease Substrate zu einem Nanoparticle Kern konjugiert. Das Ereignis der proteolytischen Spaltung ist die "pharmakokinetischen Switch", genannt, weil gespalten Peptid-Produkte kleiner als die renale Filtration Größenbeschränkung von 5 nm23 und Filter in Urin sind, eine nicht-invasive Signal zu produzieren. Daher ist es wichtig, Nanopartikel oder Träger mit einem hydrodynamischen Radius, die größer ist als 5 nm, als alles, was kleiner durch Nieren schnell gelöscht und Urin Signale zu verwirren. Wir nutzen pegyliertem IONPs, weil sie FDA zugelassen, gut verträglich sind und eine umlaufende Halbwertszeit von 3-5 Stunden haben. 13 ein weiterer wichtiger Aspekt bei der Formulierung Nanosensoren ist der PEG, Peptid Substrat Molverhältnis. 24 , 25 Erhöhung des Verhältnisses wird reduzieren unspezifische Spaltung durch Ziel Proteasen durch sterische Abschirmung von Peptiden26, sondern potenziell auf-Aktivität sowie. Umgekehrt erhöht eine niedrigere PEG Peptid-Verhältnis Protease Zugänglichkeit und Spaltung von Peptiden, die Erkennung Signale zu verstärken, sondern kann auch Hintergrundgeräusche erhöhen. In Vivo kann auch eine niedrigere oberflächenkonzentration der PEG Nanosensor Aufnahme vom retikuloendothelialen System (RES) zu erhöhen und Umwälzung zu verringern.

Um diese Technologie, um andere Krankheiten diagnostizieren anzuwenden, sollten Proteasen, die hochreguliert in einem Krankheitsstadium sind aus der Literatur17ermittelt werden. Entdeckung Bemühungen sollten auf extrazelluläre Proteasen konzentrieren, da diese Nanosensoren nicht ausgelegt sind, Zellen intrazelluläre Tätigkeit Sinn zu durchdringen. Diese Nanosensoren sind auch an Sinn Endoproteases entwickelt, die in der Mitte das Peptid cleave bietet viele Kandidaten Krankheiten zum Ziel. Durch gezielte extrazellulären Endoproteases allein haben wir Diagnose der Leberfibrose, mehrere Arten von Krebs und Thrombose13,19,20,21entwickelt. Diese Plattform kann weiter für Exoprotease Tätigkeit nach Endoprotease Spaltung im Zusammenhang mit der Krankheit26,27Sonde gestaltet werden. Es ist auch wichtig, ein Peptid-Substrat zu entwerfen, die speziell für die Protease von Interesse ist. Dies könnte erreicht werden, durch screening Kandidat Peptid-Sequenzen mit dem in-vitro- Spaltung Assay (Schritte 2.10 2.11). Mögliche nicht-spezifische Protease Dekolleté sollte auch während Peptid Design getestet werden. Zum Beispiel im Falle von MMP9 testeten wir Substratspezifität mit Thrombin, eine Koagulation Protease in hohen Konzentrationen im Blut gefunden. Um Aktivität Nanosensoren in Vivoverwenden, sollte die optimale urinsammelzeit durch Überwachung der Kinetik der Signal-Produktion durch Bildgebung oder diskrete Probenahme des Urins nach Verabreichung von Nanosensoren bestimmt werden. Mäuse können auch mit steriler Kochsalzlösung, overhydrate Tiere und Urin Produktionserhöhung infundiert werden. Praktisch, kann diese Technologie auf jede Krankheit mit hochreguliert oder herunterreguliert extrazelluläre Protease-Aktivität ausgedehnt werden. Eine Stärke dieser Plattform ist, dass es für die Verstärkung des Ziel-Protease-Signals, so dass selbst wenn nur ein Bruchteil der Krankheit-Website Protease Bevölkerung befragt wird, eine bedeutende Auslesung gemessen werden kann. Die aktuelle Plattform ist, Sinn extrazellulären Endoproteases entwickelt. Beim Anwenden dieser Plattform auf andere Krankheiten muss man die Protease Biologie dieser Krankheit zu identifizieren, so, dass diese Plattform auf Sinn Proteasen von Interesse abgestimmt werden kann.

Diese Core-Technologie kann weiter mit Spaltung Reporter entwickelt werden, die mit unterschiedlichen analytischen Plattformen zur Erhöhung der Zahl der Anwendungen erkannt werden können. Zum Beispiel können Spaltung Reporter, die Liganden für die Antikörperbindung enthalten durch Papier-Tests für low-cost Point-of-Care Diagnostik19erkannt werden. Darüber hinaus ermöglicht die Kennzeichnung von Substraten mit Masse Reportern mehrere Proteasen aus dem Urin von Massenspektrometrie13gleichzeitig erkannt werden. Diese Methode beschreibt zusammenfassend formulieren Activity based Nanosensoren Protease-Aktivität in Vivo als nicht-invasive Harn Biomarker der Krankheit spüren.

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Disclosures

Dr. Kwong ist Mitbegründer und dient als Berater Glympse Bio, die Entwicklung von Produkten im Zusammenhang mit der Forschung, die in diesem Dokument beschriebenen. Diese Studie könnte seine persönliche finanzielle Situation auswirken. Die Bedingungen dieser Vereinbarung überprüft und von Georgia Tech gemäß seinen Interessenkonflikt Richtlinien genehmigt

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch eine NIH Direktor neue Innovator Award (Auszeichnung Nr. finanziert. DP2HD091793). Q.D.M. wird unterstützt durch die NSF Graduate Research Fellowships Program (Grant Nr. DGE-1650044). B.A.H wird von den nationalen Instituten der Gesundheit GT BioMAT Training Zuschuss im Rahmen Prämiennummer 5T32EB006343 sowie der Georgia Tech President Fellowship unterstützt. G.A.K. hält den Career Award an der wissenschaftlichen Schnittstelle aus dem Burroughs-Willkommen-Fonds. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filters VWR 4652
18G needle VWR 89134-024
15 mL conicals VWR 89039-670
250 mL Erlenmeyer flask VWR 89000-362
Stir bar VWR 58949-006
Hot Plate/Magnetic Stirrer VWR 97042-634
Glacial acetic acid VWR 97064-482
Albumin from Bovine Serum (BSA) Thermo Fisher A13100
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma 236489
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 44939
Epichlorohydrin Sigma 45340-500ML-F
DMF Sigma D4551
Ammonium Hydroxide Sigma 320145-500ML
Sodium Hydroxide pellets Sigma 221465-500G
EDTA Sigma E9884
Sodium Borate Sigma B9876
L-Cysteine Sigma 168149-100G
Tris-HCl Sigma T5941
Tris base Sigma T6066
PBS tablets Sigma P4417
Dextran Pharmacosmos 5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk Millipore UFC901024
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk Millipore UFC903024
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk Millipore UFC910024
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical NanoZS
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette LifeTech 66130
Dynabeads MyOne Tosylactivated LifeTech 65501
SIA Life Tech 22349
PEG 20k Laysan Bio MPEG-SH-20K-1g
Fluorescein Antibody [2A3] GeneTex GTX10257
Hiload 16/600 superdex 200 GE Healthcare 45-002-490
Plate Reader Fisher BTCYT5M
BD Insulin Syringes Fisher NC0872854

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References

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Synthetische Biotechnologie Ausgabe 137 Biomarker Activity based Sonden Proteasen Nanosensoren Nanopartikel Urin-Diagnose
Nanosensoren Protease-Aktivität <em>In Vivo</em> für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen
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Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G.… More

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G. A. Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics. J. Vis. Exp. (137), e57937, doi:10.3791/57937 (2018).

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