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Bioengineering

Nanosensors-इनवेसिव निदान के लिए वीवो में गतिविधि को छेड़ने का पता लगाने के लिए

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57937

Summary

टीज़ कसकर विनियमित मौलिक जैविक प्रक्रियाओं में शामिल एंजाइमों हैं, और dysregulated इस तरह के कैंसर के रूप में जटिल रोगों की गतिविधियों की प्रगति को छेड़ो । इस विधि का लक्ष्य nanosensors कि मेजबान मूत्र और भेदभाव रोग से पता लगाने के लिए है एक दरार संकेत का उत्पादन करके वीवो में गतिविधि को मापने के लिए बनाने के लिए है ।

Abstract

एक बहु-कार्यात्मक एंजाइमों कि पेप्टाइड के hydrolysis में विशेषज्ञ बांड और homeostasis और allostasis सहित व्यापक जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित कर रहे हैं । इसके अलावा, dysregulated रोगजनन गतिविधि ड्राइव और कैंसर के रूप में रोगों के एक कार्यात्मक अगोचर है; इसलिए, vivo में छेड़ने वाली गतिविधि का पता लगाने की क्षमता बायोमेडिकल डायग्नोस्टिक्स के लिए चिकित्सकीय प्रासंगिक जानकारी प्रदान कर सकता है । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य nanosensors बनाने के लिए है कि vivo में मूत्र में एक quantifiable संकेत उत्पादन द्वारा गतिविधि को छेड़ने के लिए जांच । इन छेड़ने nanosensors दो घटकों से मिलकर बनता है: एक nanoparticle और सब्सट्रेट । nanoparticle कार्य संचलन आधा जीवन और सब्सट्रेट प्रसव के लिए रोग साइटों लक्ष्य को बढ़ाने के लिए । सब्सट्रेट एक छोटी पेप्टाइड अनुक्रम (6-8 एए), जो एक लक्ष्य को छेड़ने या छेड़ने के समूह के लिए विशिष्ट होने के लिए डिज़ाइन किया गया है. सब्सट्रेट nanoparticle की सतह के लिए संयुग्मित है और एक रिपोर्टर द्वारा समाप्त किया जाता है, इस तरह के एक फ्लोरोसेंट मार्कर के रूप में, पता लगाने के लिए. के रूप में dysregulated के लिए पेप्टाइड सब्सट्रेट सट, रिपोर्टर ठहराव के लिए मूत्र में एक को छेड़ने गतिविधि की एक अगोचर के रूप में फ़िल्टर्ड है । यहां हम मैट्रिक्स metalloproteinase 9 (MMP9), जो ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस के साथ जुड़ा हुआ है के लिए एक nanosensor के निर्माण का वर्णन, एक माउस मॉडल में कोलोरेक्टल कैंसर का पता लगाने के लिए ।

Introduction

teases बहु-कार्यात्मक एंजाइमों कि पेप्टाइड के hydrolysis में विशेषज्ञ बांड और कई जैविक प्रक्रियाओं पर महत्वपूर्ण नियंत्रण है, homeostasis, allostasis सहित, और1रोग हैं । एक बदल की स्थिति को छेड़ने गतिविधि कैंसर और हृदय रोग सहित रोगों की एक किस्म के लिए संबंधित किया गया है, बनाने के लिए विकास के लिए आकर्षक उंमीदवारों के नैदानिक में2,3। इसके अलावा, गतिविधि को कार्यात्मक रूप से अलग pathogeneses, रोगी परिणामों से जुड़ा हुआ है, और रोग का निदान4। मोटे तौर पर, जैव संवेदी विभिन्न जैविक घटनाएं और रोगों का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है, जैसे कैंसर, neurodegenerative रोग, और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण प्रक्रियाओं5,6,7,8 , 9. अधिक विशेष रूप से, सब्सट्रेट आधारित को चिढ़ाने के सेंसरों को छेड़ने वाली गतिविधि का पता लगाने के लिए विकसित किया गया है, और नैदानिक इमेजिंग के लिए fluorogenic जांच शामिल10 और isotopically के लिए लेबल पेप्टाइड सब्सट्रेट में इन विट्रो जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा डिटेक्शन11. इसके अलावा, गतिविधि आधारित जांच विकसित किया गया है, जो सब्सट्रेट की तरह क्षेत्रों है कि बांध या संशोधित लक्ष्य12को रोकने के होते हैं । इस विधि के साथ, लक्ष्य को छेड़ने अचल जब सक्रिय साइट संशोधित किया गया है, और विश्लेषण ऊतक, जो vivo अनुप्रयोगों में सीमा की कटाई की आवश्यकता है । हालांकि, यह महत्वपूर्ण है कि वीवो मेंगतिविधि को छेड़ने की भावना है, क्योंकि इस तरह की गतिविधि का विनियमन अंतर्जात अवरोधकों की उपस्थिति के रूप में अंय जैविक गतिविधियों के संदर्भ पर भारी निर्भर है ।

इस काम का लक्ष्य है गतिविधि के निर्माण का वर्णन-आधारित nanosensors कि vivo में मूत्र में एक औसत दर्जे का संकेत उत्पादन द्वारा चिढ़ा गतिविधि का पता लगाने । इस मंच एक कार्यात्मक के रूप में dysregulated को छेड़ने गतिविधि का उपयोग करके इस तरह के कैंसर के रूप में जटिल रोगों के भेदभाव के लिए एक इनवेसिव नैदानिक के रूप में प्रयोग किया जाता है । हमारे nanosensor प्लेटफार्म में आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (IONP) संयुग्मित के होते हैं । इन सब्सट्रेट एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जो जारी की है जब teases सब्सट्रेट सट से समाप्त कर रहे हैं । इन IONPs vivo मेंप्रसारित, रोग साइटों के लिए स्थानीयकरण, और सक्रिय रोग से जुड़े teases को सब्सट्रेट बेनकाब । दरार के बाद, फ्लोरोसेंट पत्रकारों और जारी कर रहे हैं, उनके छोटे आकार के कारण, मूत्र में फ़िल्टर कर रहे हैं, जबकि IONP पर uncleav सब्सट्रेट शरीर में रहते हैं । इसलिए, vivo में गतिविधियों को छेड़ने में वृद्धि मूत्र में रिपोर्टर के उच्च सांद्रता में परिणाम होगा (चित्रा 1) । चूंकि हमारे मंच एक मूत्र परीक्षण है, कोई इमेजिंग मंच की आवश्यकता है और नैदानिक संकेतों मूत्र में समृद्ध कर रहे हैं ।

इस मंच के कैंसर, फाइब्रोसिस, और घनास्त्रता13,14सहित रोगों की एक किस्म का पता लगाने के लिए इंजीनियर जा सकता है । यहां हम nanosensors के डिजाइन का वर्णन करने के लिए मैट्रिक्स metallopeptidase 9 में उंनयन का पता लगाने (MMP9) कोलोरेक्टल कैंसर के एक अगोचर के रूप में गतिविधि । कोलोरेक्टल कैंसर संयुक्त राज्य अमेरिका में कैंसर की मौत का दूसरा प्रमुख कारण है, एक अनुमान के साथ १३६,८०० नए मामलों और २०१४ अकेले15में ५०,३०० मौतें । कोलोरेक्टल ट्यूमर कोशिकाओं MMP9 उत्पादन, जो घातक प्रगति, मैट्रिक्स क्षरण, साथ ही साथ मेटास्टेसिस16ड्राइव करने के लिए दिखाया गया है । इसके अतिरिक्त, हम17साहित्य से MMP9 के लिए एक उपयुक्त पेप्टाइड सब्सट्रेट (PLGVRGK) की पहचान की । इस मंच जल्दी कैंसर का पता लगाने और कम लागत बिंदु की देखभाल निदान13,14,18,19,20,21के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: vivo मेंNanosensor गतिविधि की योजनाबद्ध । Nanosensors शरीर के माध्यम से प्रसारित और रोग की साइटों के लिए स्थानीयकरण । उसके बाद, रोग से संबंधित IONPs द्वारा प्रस्तुत किए गए पेप्टाइड सब्सट्रेट । यह मूत्र में स्थानीयकरण करने के लिए कारण, एक साथ सट टुकड़े का आकार गुर्दे की निकासी के लिए अनुमति देता है । पशु पेशाब के बाद, इन पेप्टाइड टुकड़े उनके रिपोर्टर अणु द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

शोधकर्ता की संस्था में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) से संस्थागत अनुमोदन निम्न पशु प्रयोगों को पूरा करने के लिए आवश्यक है । इसके अतिरिक्त, मानक पशु देखभाल सुविधाएं (जैसे, आवास मंडलों, बाँझ जानवर डाकू, anesthetization के लिए isofluorane कक्षों, और सह एथिकल समापन बिंदु euthanization के लिए2 मंडलों) को ठीक से इन बाहर ले आवश्यक हैं प्रयोगों. इन सुविधाओं के साथ विशेष प्रशिक्षण और सहायता एक संस्था में शारीरिक अनुसंधान प्रयोगशाला (PRL) द्वारा प्रदान की जा सकती है । सभी पशु काम जॉर्जिया टेक पर IACUC द्वारा अनुमोदित (प्रोटोकॉल: A14100) था ।

1. आयरन ऑक्साइड Nanoparticle (IONP) संश्लेषण

नोट: सुरक्षा: पूरे आयरन ऑक्साइड Nanoparticle संश्लेषण व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग कर और एक रासायनिक धुएं हुड के नीचे किया जाना चाहिए ।

  1. एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में, 30 मिनट के लिए एक बर्फ की बाल्टी में 30% अमोनियम हीड्राकसीड का ठंडा 1 मिलीलीटर ।
  2. एक २५० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी पानी के साथ धो लें और 10 मिलीलीटर डबल आसुत जल (ddH2हे) जोड़ें । एक बर्फ स्नान पर आराम कर एक हलचल में कुप्पी के बाहर जलमग्न/ ddH2ओ में कुप्पी में N2 गैस प्रवाह के लिए एक प्लास्टिक पिपेट का प्रयोग करें । deoxygenate के लिए N2 के साथ 15 मिनट के लिए बुलबुला ।
  3. वजन २२४ µmol (४.५ ग्राम) की dextran (आणविक भार (मेगावाट) = 20 केडीए) एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में । एच2ओ जोड़ें इस तरह कि मिश्रण की अंतिम मात्रा, dextran सहित, 20 मिलीलीटर है । भंवर जोरदार dextran भंग करने के लिए ।
  4. लोहे के २९० µmol (७८.५ ग्राम) वजन (III) क्लोराइड hexahydrate, dextran समाधान और भंवर को भंग करने के लिए जोड़ें ।
  5. परिणामी समाधान एक ०.२ µm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें ।
  6. स्थानांतरण 1 मिलीलीटर ठंडा अमोनियम हीड्राकसीड deoxygenated पानी की 9 मिलीलीटर में । 4 ° c पर लौटें ।
  7. लोहे के ३६७ µmol (७३.० ग्राम) वजन (द्वितीय) क्लोराइड टेट्राहाइड्रेट, ऑक्सीजन के 1 मिलीलीटर मुक्त ddH2ओ में भंग, और एक ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से फिल्टर ।
  8. dextran-आयरन (III) सॉल्यूशन को २५० एमएल Erlenmeyer कुप्पी और deoxygenate एन2 के साथ बर्फ पर 15 मिनट के लिए ट्रांसफर करें । एक चुंबकीय हलचल बार १६०० rpm पर कताई के साथ मिश्रण ।
  9. एक समरूप नाइट्रोजन वातावरण बनाने के लिए, एक रबर पट के साथ कुप्पी टोपी । एक 18 गेज सुई के साथ पट पंचर को कुप्पी में एन2 प्रवाह । एक प्रवाह आउटलेट के रूप में एक अलग 18 गेज सुई डालें ।
  10. जोड़ें ४६७ µ आयरन (द्वितीय) समाधान के लिए dextran-आयरन (III) समाधान के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज, एक चुंबकीय हलचल बार के साथ सरगर्मी १६०० rpm पर । लौह के इस अनुपात (द्वितीय) आयरन के लिए (III) एक संतुलित प्रतिक्रिया है कि मैग्नेटाइट का उत्पादन होगा में परिणाम, या Fe3हे4.
  11. ठंडा करने में जोड़ें पतला अमोनियम हीड्राकसीड dropwise आयरन (II)-आयरन (III)-dextran समाधान nucleation प्रक्रिया आरंभ करने के लिए21. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक छोटी बूंद दूसरे में छोड़ने से पहले अच्छी तरह घोला जा सकता है । अमोनियम हीड्राकसीड के 1-2 मिलीलीटर के अलावा के बाद प्रतिक्रिया समाप्त ।
  12. N2 के प्रवाह को रोकें और रबर पट निकालें । बर्फ स्नान निकालें और गर्म पानी की एक स्नान के साथ की जगह है, जबकि समाधान हलचल जारी है । सुनिश्चित करें कि समाधान के तापमान ७५ डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है और ७५ मिनट के लिए मशीन ।
  13. हलचल/गर्म थाली से कुप्पी निकालें और ०.२ µm के माध्यम से समाधान दोगुनी फ़िल्टर फिर ०.१ µm फिल्टर मोटे कणों को दूर करने के लिए ।
  14. बफर ddH2ओ में कणों का आदान प्रदान, १०० का उपयोग कर केडीए आणविक भार कट ऑफ (m.w.c.o.) के लिए समाधान से अतिरिक्त dextran को दूर करने के लिए, जो बहुत चिपचिपा होना चाहिए । फ़िल्टर बदलें यदि प्रवाह के माध्यम से भी 2-3 स्पिन, जो इंगित करता है कि फिल्टर टूट गया है हो सकता है के बाद अंधेरा रहता है ।
    1. स्पिन फ़िल्टर के साथ एक्सचेंज बफर करने के लिए, 15 मिनट के लिए ४८०० X g पर 4 ° c पर केंद्रापसारक, प्रवाह के माध्यम से त्यागें, और IONP समाधान के लिए नए बफर जोड़ें । दोहराएं 3-5 बार ।
  15. एक spectrophotometer/प्लेट रीडर का उपयोग कर नैनोकणों की एकाग्रता का निर्धारण । ४०० एनएम पर अवशोषक माप ले लो और इस तरंग दैर्ध्य पर IONP के दाढ़ अवशोषकता का उपयोग करें (ε = २.०७ x 106 cm-1 एम-1) IO कणों की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए ।
  16. resuspend IONPs को 10 मिलीग्राम/एमएल में ddH2ओ (आमतौर पर कुल मात्रा ~ 3 मिलीलीटर है) और सुनिश्चित करें कि इस कदम के लिए रासायनिक संगतता के लिए के लिए उपयोग के लिए ट्यूब । 5 एम NaOH के १.६ खंड जोड़ें, तो epichlorohydrin के ०.६५ संस्करणों जोड़ें । कड़ाई से crosslink dextran के लिए 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक प्लेट शेखर पर मिश्रण ।
  17. ५० केडीए m.w.c.o. डायलिसिस झिल्ली में IONP समाधान हस्तांतरण करने के लिए एक 18-गेज सुई के साथ एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें । डायलिसिस झिल्ली को 4 एल ddH2ओ में रखें और स्थ H2हे कुछ समय (हर 2-3 घंटे) । रात भर गर्मी ।
  18. एकाग्रता को मापने और IONPs लाने के लिए 5 मिलीग्राम/एमएल (१.१५ कदम देखें) । 20% (v/v) तक पहुंचने के लिए अमोनियम हीड्राकसीड जोड़ें और IONPs की सतह को aminate करने के लिए > 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शेक करें । 30 केडीए m.w.c.o. फ़िल्टर्स का उपयोग करके बफ़र एक्सचेंज (१.१४ देखें) ।
  19. तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अंतिम शुद्धि से पहले २.५-३.५ मिलीलीटर के लिए नीचे की मात्रा समायोजित (FPLC, जेल निस्पंदन कॉलम के लिए सामग्री की तालिका देखें) ।
  20. IONPs (अपेक्षित रेंज 10-100 एनएम, औसत आकार ४०-५० एनएम) के hydrodynamic त्रिज्या निर्धारित करने के लिए गतिशील लाइट कैटरिंग (DLS) का उपयोग करें । एक cuvette में 100X पतला IONP नमूना के 1 मिलीलीटर aliquoting द्वारा यह मत करो, मशीन में जगह है, और निर्माता के सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए माप ले ।
    नोट: IONPs की कुल जनसंख्या DLS माप द्वारा 10 और १०० एनएम के बीच होगा, लेकिन जनसंख्या का बहुमत औसत व्यास, जो ४०-५० एनएम से पर्वतमाला के आसपास है । अगर एक आकार सीमा को सीमित करना चाहता है, एक आगे आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी अलग व्यास के साथ भिंन भागों का उपयोग कर सकते हैं । IONPs 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए ।

2. पेप्टाइड डिजाइन, विकार करने के लिए IONP, और इन विट्रो मान्यता

  1. एक पेप्टाइड सब्सट्रेट (जैसे, एक कोर सुविधा या व्यावसायिक रूप से) एक N-टर्मिनल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जैसे Fluorescein isothiocyanate (FITC) और एक सी टर्मिनल cysteine अवशेषों के साथ एक लक्ष्य के लिए thiol-मध्यस्थता युग्मन की अनुमति देने के लिए संश्लेषित ।
    नोट: MMP9 के लिए इस अध्ययन के मामले में इस्तेमाल किया पेप्टाइड FITC-PLGVRGK-सी था, कश्मीरबिल्ली/Kएम ~ २.० x 105 एम के साथ-1एस-1
  2. IONP के Aliquot ०.५ मिलीग्राम (1 मिलीग्राम/एमएल), और बफर युग्मन बफर में एक्सचेंज (५० mm सोडियम बोराटे 1 mm EDTA, पीएच = ८.५) का उपयोग कर एक 10 केडीए m.w.c.o. स्पिन फ़िल्टर (देखें चरण १.१४).
  3. भंग Succinimidyl iodoacetate (सिया) में dimethylformamide (DMF) के एक एकाग्रता तक पहुंचने के लिए ~ 30 मिलीग्राम/एमएल, और ५०० सिया: IONP के एक तिल के अनुपात में IONP को सिया जोड़ें ।
    नोट: सिया IONPs पर sulfhydryl समूहों के लिए पेप्टाइड सब्सट्रेट पर अमीन के युग्मन कि मध्यस्थता एक heterobifunctional पार linker है ।
  4. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए मशीन । अगर रात भर छोड़कर, 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
  5. बफर एक्सचेंज का उपयोग कर एक 10 केडीए m.w.c.o. स्पिन फ़िल्टर युग्मन बफर में unreact व्यक्त सिया को दूर करने के लिए (१.१४ कदम देखें) ।
  6. अंतिम उत्पाद समाधान 1 मिलीग्राम/एमएल (०.५ एमएल समाधान) के लिए लाओ । 20:1 (खूंटी: दाढ़) के एक IONP अनुपात में 20 केडीए thiol-समाप्त पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के साथ 90:1 (पेप्टाइड: IONP) के एक दाढ़ अनुपात में ब्याज की पेप्टाइड मिश्रण । IONP के साथ इस पेप्टाइड-खूंटी समाधान मिश्रण ।
  7. उच्चतम गति पर एक प्लेट शेखर पर कमरे के तापमान पर रात भर गर्मी, पंनी में ट्यूब को कवर फ्लोरोसेंट अणुओं के photobleaching को रोकने के लिए ।
  8. किसी भी अनहोनी सिया अणुओं को बेअसर करने के लिए 500:1 (C:IONP) के दाढ़ अनुपात में एल-cysteine जोड़ें । कमरे के तापमान पर उच्चतम गति से एक शेखर पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
  9. FPLC के माध्यम से शुद्ध (1.1.19 देखें). नमूना समाधान के अवशोषण को मापने के लिए और निम्न के अनुसार पेप्टाइड: IONP अनुपात की गणना करने के लिए एक spectrophotometer का उपयोग करें । शुद्धि के बाद, पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर उत्पाद 1 मिलीग्राम/
    1. ४०० एनएम (एकनमूना, 400) में नमूना समाधान के अवशोषण को मापने के लिए एक spectrophotometer का उपयोग करें और fluorophore के लिए उपयोग किया जाता है, जो ४८८ एनएम के लिए FITC (एकनमूना, 488) के लिए अधिकतम अवशोषक की तरंग दैर्ध्य । एक ही दो तरंग दैर्ध्य (४०० एनएम और ४८८ एनएम) है, जो क्रमशः एकएनपी, 400 और एकएनपी, 488के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे है पर एक शेयर अमीन IONP समाधान के अवशोषण को मापने ।
    2. का प्रयोग करें समीकरण 1 और 2 सामान्यीकृत एक४०० और एक४८८ मूल्यों की गणना करने के लिए ।
      Equation 1समीकरण 1
      Equation 2समीकरण 2
    3. एक४०० और एक४८८ नमूना के सामान्यीकृत मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं । समीकरण 3 के साथ पेप्टाइड: IONP के अनुपात की गणना करने के लिए इन मानों का उपयोग करें ।
      Equation 3समीकरण 3
    4. जहां Equation 4 और Equation 5 IONP और fluorophore, क्रमशः के दाढ़ absorptivities हैं । इन Equation 4 कणों के लिए = २.०६ x 106 एम-1सेमी-1 और FITC Equation 5 = ७२,००० एम-1सेमी-1 के लिए, इसलिए का Equation 6 मूल्य २८.७५ होना चाहिए । ठेठ पेप्टाइड: IONP अनुपात 20:1 से 50:1 की सीमा में होना चाहिए ।
  10. जांच की कार्यक्षमता को सत्यापित करने के द्वारा एक इन विट्रो दरार परख में प्रदर्शन ।
    1. पंजाबियों (1% BSA) के साथ, एक 18 µ एल nanoparticle के साथ एक २०० एनएम एकाग्रता पेप्टाइड का समाधान करें । (MMP9; ०.१-1 मिलीग्राम/एमएल) की µ के साथ मिश्रण 2 ।
    2. 1 घंटे के लिए ३७ ° c में एक प्लेट रीडर में मशीन, प्रतिदीप्ति माप लेने (उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, जो ४८५ एनएम और ५२८ एनएम FITC के लिए, क्रमशः) हर 1-2 मिनट के लिए दरार की निगरानी कर रहे है का उपयोग कर ।

3. Nanosensors और मूत्र कैंसर का पता लगाने के प्रशासन

नोट: उदाहरण मॉडल पर अधिक विवरण के लिए, हमारी पिछली रिपोर्ट13देखें.

  1. एक ९६ अच्छी तरह से थाली के शीर्ष करने के लिए एक बेलनाकार आस्तीन सुरक्षित द्वारा मूत्र संग्रह के लिए एक चयापचय पिंजरे बनाएं । मूत्र संग्रह के दौरान, आस्तीन के अंदर एक चूहा जगह और एक पेट्री डिश कवर के साथ कवर करने के लिए पशु के भागने को रोकने के ।
  2. एक इंजेक्शन समाधान तैयार करें (२०० µ l अधिकतम मात्रा) nanosensors युक्त ३००० मिलीग्राम/kg (~ ५० µmol) में पेप्टाइड द्वारा बाँझ खारा.
  3. महिला में, 8-सप्ताह पुराने, नग्न चूहों असर xenograft LS174T कोलोरेक्टल ट्यूमर के एक बोझ पर ~ 100-300 mm3, जो लगभग 10 दिन पर होने चाहिए, पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से nanosensor समाधान प्रशासन । इंजेक्शन के तुरंत बाद, चयापचय पिंजरों में जगह चूहों और प्रत्येक माउस के लिए इंजेक्शन के समय ध्यान दें.
  4. इंजेक्शन के बाद ६०-९० मिनट पर, ९६ अच्छी तरह से प्लेट से बेलनाकार आस्तीन निकालें । माउस को रोकना और मूत्राशय पर मामूली दबाव लागू करने के लिए चूहों को प्रेरित करने के लिए प्लेट पर किसी भी शेष मूत्र शूंय । सभी मूत्र लीजिए (२००-५०० µ एल) ।
  5. मूत्र से FITC को शुद्ध करने के लिए immunoprecipitation द्वारा मूत्र के नमूनों का विश्लेषण करें और संवेदनशीलता को बढ़ाएँ । विरोधी FITC एंटीबॉडी के साथ मिलकर चुंबकीय मोती का प्रयोग करें ।
    1. सबसे पहले, धो 25 कोटिंग बफर के साथ 3 बार चुंबकीय मोती के मिलीग्राम, और २२५ µ के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए एल
      नोट: यह कोटिंग बफर बनाने के लिए महत्वपूर्ण है (०.१ एम सोडियम बोराटे, पीएच ९.५), बफर अवरुद्ध (पंजाब, ०.५% BSA, ०.०५% के बीच-20, पीएच ७.४), और धोने बफर (पंजाब, ०.१% BSA, ०.०५% के बीच-20, पीएच ७.४) ताजा हर बार, और प्रत्येक के लगभग 20 मिलीलीटर आवश्यक है ।
    2. एंटी-FITC (5 मिलीग्राम/एमएल) के २०० µ एल और अमोनियम सल्फेट (3 एम) के २०० µ एल जोड़ें । एक रोटेटर पर ३७ C पर 16-24 घंटे के लिए मशीन ।
    3. एक चुंबकीय विभाजक के समाधान जोड़ें, supernatant निकालें, ६२५ Equation 7 Λ अवरुद्ध बफर के साथ बदलें, और ३७ सी पर रात भर में मशीन । फिर धो बफर और १.२५ मिलीलीटर धोने बफर में स्टोर के साथ 3 बार धो ।
    4. 5 चुंबकीय मोती के µ एल के साथ मूत्र के 2 µ एल मशीन (20 मिलीग्राम/एमएल) और ५० µ एल के लिए एक कुल मात्रा में लाने के साथ पंजाब (०.०१% के बीच 20) । ६० मिनट के लिए मशीन ।
    5. ५० µ l पंजाबियों के साथ दो बार धो (०.०१% के बीच 20) प्रत्येक धोने के बाद चुंबकीय मोतियों को इकट्ठा करने के लिए एक चुंबकीय विभाजक का उपयोग करना ।
    6. 5% हिमनदों एसिटिक अम्ल के ३२.५ µ l के साथ दो बार Elute. बेअसर हो गया परित का रेफरेंस (७० µ l) के साथ ३५ µ l के 2 M Tris के अंतिम pH को प्राप्त करने के लिए ~ 7.
    7. एक प्लेट रीडर पर पढ़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) पर उचित उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य मूत्र प्रतिदीप्ति यों तो । मुक्त fluorophore के ज्ञात सांद्रता की एक सीढ़ी के खिलाफ फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की एकाग्रता की गणना ।

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Representative Results

IONPs की आबादी का बहुमत औसत व्यास, जो ४०-५० एनएम से पर्वतमाला के आसपास है । pegylation के बाद, इस आकार रेंज में एक संचलन आधा के लगभग 6 घंटे13 vivo में जीवन है ( चित्रा 2aदेखें) । एक विशेष आकार सीमा के लिए चयन करना चाहता है, तो एक अलग व्यास के साथ IONP भागों को अलग करने के लिए आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर सकते हैं । उनि द्वारा नैनोकणों व्यक्तिगत गोलाकार आयरन ऑक्साइड नैनोकणों crosslinked के रूप में एक साथ dextran की एक बाहरी परत के रूप में दिखाई देगा. 13  IONPs का एक समाधान रंग में कोई तेज़ी और हल्के ब्राउन के साथ पारदर्शी दिखाई देगा । सफल पेप्टाइड विकार के बाद, वर्णक्रमीय अवशोषक विश्लेषण फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अधिकतम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में एक अलग अवशोषक चोटी प्रकट होगा । FITC के मामले में, यह ४८८ एनएम के आसपास केंद्रित हो जाएगा ( चित्र bदेखें) । एक ठेठ पेप्टाइड विकार प्रतिक्रिया FPLC शुद्धि के बाद 20-50 के दाढ़ अनुपात IONP करने के लिए एक पेप्टाइड में परिणाम होगा. जांच की क्षमता का परीक्षण करने के लिए भावना को छेड़ने गतिविधि, nanosensors के एक aliquot रिकॉमबिनेंट के साथ किया जा सकता है और fluorimetry द्वारा निगरानी की । क्लीवेज गतिविधि फ्लोरोसेंट पत्रकारों की रिहाई में परिणाम होगा-जो अंयथा nanoparticle की सतह पर homoquenched-समाधान में है और नमूना प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई है । यह Michaelis-मेनटेन कैनेटीक्स ( चित्र 2cदेखें) का पालन करें सब्सट्रेट दरार वेग का निरीक्षण करने के लिए ठेठ है.

Figure 2
चित्रा 2: संरचना और Nanosensors के समारोह में इन विट्रो मेंमांय । (क) एक DLS एक IONP जनसंख्या पद संश्लेषण के आकार वितरण का प्रतिनिधित्व ग्राफ । (b) FITC-लेबल्ड एमएमपी-9 सब्सट्रेट्स के साथ IONPs पोस् ट-विकार का अवशोषक स्पेक्ट्रम । (ग) इन विट्रो दरार दिखा रहा है कि MMP9 तेजी से एक घंटे के पाठ्यक्रम पर nanosensor द्वारा प्रस्तुत पेप्टाइड सट । ०.५ मिलीग्राम/एमएल के एक को छेड़ो एकाग्रता पंजाब (1% BSA) बफर में इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

कैंसर के माउस मॉडल में इस मंच को लागू करने के लिए, यह ठेठ के पास एक अवरक्त फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ लेपित nanosensors का उपयोग करने के लिए पूरे पशु फ्लोरोसेंट इमेजिंग (चित्र 3ए) द्वारा फार्माकोकाइनेटिक्स के दृश्य की अनुमति है । चूहों LS174T कोलोरेक्टल ट्यूमर असर में, एक फ्लोरोसेंट संकेत nanosensors पर पेप्टाइड सब्सट्रेट के MMP9 दरार के कारण nanosensors के नसों में प्रशासन के बाद 60-90 मिनट के भीतर मूत्र में स्थानीयकृत होगा । इसके विपरीत, नियंत्रण समूह चूहों के मूत्राशय में कम फ्लोरोसेंट संकेत होगा ( चित्र 3ए देखें) । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संकेत जिगर में मनाया उठता है क्योंकि कणों अंततः monocytes और reticuloendothelial प्रणाली है, जो सामान्यतः जिगर, तिल्ली और लिम्फ नोड्स में पाए जाते हैं में मैक्रोफेज द्वारा सफाई कर रहे हैं । इसलिए, आंकड़ा 3 ए में जिगर से आ रही संकेत नैनोकणों की मंजूरी के कारण है । 13 जब immunoprecipitation द्वारा मूत्र प्रतिदीप्ति बढ़ाता है, एक काफी ऊंचा संकेत स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में LS174T ट्यूमर असर चूहों में मनाया जाएगा ( चित्र बी1 देखें) ।

Figure 3
चित्रा 3: एक माउस मॉडल में कोलोरेक्टल कैंसर का पता लगाने । (a) vivo में ट्यूमर और नियंत्रण समूह चूहों की छवियों, रोग की साइटों के लिए IONP स्थानीयकरण देख, साथ ही मूत्र स्थानीयकरण ट्यूमर प्रगति के कारण. (ख) LS174T ट्यूमर मॉडल में नियंत्रण चूहों में ट्यूमर का मूत्र प्रतिदीप्ति ठहराव. त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (*p < ०.०५ से दो-पुच्छेड t परीक्षण) के रूप में प्लॉट किए गए हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस विधि गतिविधि आधारित nanosensors एक nanoparticle कोर को छेड़ने सब्सट्रेट संयुग्मित से मिलकर के विकास का वर्णन करता है । proteolytic क्लीवेज की घटना को "pharmacokinetic स्विच" करार दिया है, क्योंकि सट पेप्टाइड उत्पाद 5 एनएम23 के गुर्दे के आकार निस्पंदन सीमा से छोटे होते हैं और मूत्र में फिल्टर एक इनवेसिव संकेत का उत्पादन करने के लिए । इसलिए, यह एक hydrodynamic त्रिज्या है कि 5 एनएम से बड़ा है के साथ नैनोकणों या वाहक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में कुछ भी छोटे तेजी से गुर्दे द्वारा मंजूरी दे दी जाएगी और मूत्र संकेतों पाया । हम pegylated IONPs का उपयोग करें, क्योंकि वे एफडीए को मंजूरी दे दी, अच्छी तरह से सहन कर रहे हैं, और 3-5 घंटे के एक परिसंचारी आधा जीवन है । 13 nanosensors तैयार करने में एक और महत्वपूर्ण विचार पेप्टाइड सब्सट्रेट दाढ़ अनुपात करने के लिए खूंटी है । 24 , 25 अनुपात बढ़ाने से गैर-विशिष्ट क्लीवेज को कम कर देगा, steric के माध्यम से लक्ष्य को चिढ़ाता है26पेप्टाइड्स की परिरक्षण के माध्यम से, लेकिन संभावित कम लक्ष्य गतिविधि के रूप में अच्छी तरह से । इसके विपरीत, एक निचले खूंटी पेप्टाइड अनुपात को छेड़ने पहुंच और पेप्टाइड्स की दरार है, जो पता लगाने के संकेतों को बढ़ाना होगा वृद्धि होगी, लेकिन यह भी पृष्ठभूमि शोर बढ़ सकता है । vivo में, खूंटी के एक निचले सतह एकाग्रता भी reticuloendothelial प्रणाली (RES) द्वारा nanosensor को बढ़ा सकते है और परिसंचरण समय में कमी ।

अन्य रोगों के निदान के लिए इस तकनीक को लागू करने के लिए, एक रोग-राज्य में विनियमित रहे हैं कि साहित्य17से पहचान की जानी चाहिए । डिस्कवरी प्रयासों extracellular पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए, क्योंकि इन nanosensors डिजाइन करने के लिए कोशिकाओं भावना intracellular गतिविधि में घुसना नहीं कर रहे हैं । ये nanosensors भी समझ endoproteases इंजीनियर हैं जो पेप्टाइड के बीच में सट जाते हैं, जो कई परीक्षार्थी रोगों को निशाना प्रदान करता है. extracellular endoproteases लक्ष्य करके अकेले हम जिगर फाइब्रोसिस, कैंसर के कई प्रकार के लिए निदान विकसित किया है, और घनास्त्रता13,19,20,21। यह प्लेटफॉर्म26,27बीमारी के संदर्भ में endoprotease क्लीवेज के बाद exoprotease गतिविधि के लिए आगे की जांच के लिए डिजाइन किया जा सकता है । यह भी एक पेप्टाइड सब्सट्रेट कि ब्याज की चिढ़ाने के लिए विशिष्ट है डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस के साथ इन विट्रो दरार परख (कदम २.१०-२.११) स्क्रीनिंग उंमीदवार पेप्टाइड दृश्यों द्वारा पूरा किया जा सकता है । संभावित गैर-विशिष्ट टीज़ क्लीवेज भी पेप्टाइड डिजाइन के दौरान परीक्षण किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, MMP9 के मामले में, हम thrombin, एक जमावट खून में उच्च सांद्रता पर पाया छेड़ने के साथ सब्सट्रेट विशिष्टता का परीक्षण किया । vivo मेंगतिविधि nanosensors का उपयोग करने के लिए, इष्टतम मूत्र संग्रह समय nanosensors के प्रशासन के बाद इमेजिंग या मूत्र के असतत नमूना द्वारा संकेत उत्पादन की कैनेटीक्स निगरानी द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए । चूहों को भी बाँझ खारा के साथ निर्जलीकरण जानवरों के साथ संचार किया जा सकता है और मूत्र उत्पादन में वृद्धि. व्यावहारिक रूप से, इस तकनीक को विनियमित या downregulated extracellular के साथ किसी भी बीमारी के लिए बढ़ाया जा सकता है गतिविधि को छेड़ो । इस मंच की एक ताकत यह है कि यह लक्ष्य का प्रवर्धन संकेत के लिए अनुमति देता है, तो भी अगर केवल रोग के एक अंश-साइट को चिढ़ाने जनसंख्या सर्वेक्षण किया है, एक महत्वपूर्ण रीडिंग बाहर मापा जा सकता है । वर्तमान मंच को नब्ज extracellular endoproteases इंजीनियर है । जब अन्य रोगों के लिए इस मंच को लागू करने, एक की जरूरत है कि रोग के चिढ़ा जीव विज्ञान की पहचान, इस तरह है कि इस मंच ब्याज की भावना को चिढ़ाने के लिए देखते हो सकता है ।

इस कोर प्रौद्योगिकी आगे दरार पत्रकारों कि अलग विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों के साथ पता लगाया जा सकता अनुप्रयोगों की संख्या में वृद्धि के साथ इंजीनियर हो सकता है । उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी बाइंडिंग के लिए लाइगैंडों शामिल क्लीवेज रिपोर्टर्स कम लागत बिंदु-की-देखभाल निदान19के लिए काग़ज़ परीक्षण द्वारा पाया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, बड़े पैमाने पर पत्रकारों के साथ लेबलिंग सब्सट्रेट एकाधिक को एक साथ सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री13द्वारा मूत्र से पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है । अंत में, इस विधि गतिविधि आधारित nanosensors की भावना को तैयार करने का वर्णन करता है vivo में बीमारी के एक गैर इनवेसिव मूत्र के रूप में गतिविधि को छेड़ने ।

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Disclosures

डॉ Kwong सह संस्थापक है और Glympse जैव, जो इस समाचार पत्र में वर्णित अनुसंधान से संबंधित उत्पादों को विकसित कर रहा है के लिए सलाहकार के रूप में कार्य करता है । यह अध्ययन उनकी व्यक्तिगत वित्तीय स्थिति को प्रभावित कर सकता है । इस व्यवस्था की शर्तों की समीक्षा की गई है और जॉर्जिया टेक द्वारा अनुमोदित ब्याज नीतियों के अपने संघर्ष के अनुसार

Acknowledgments

यह काम एक NIH निदेशक नए आविष्कारक पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया (पुरस्कार सं. DP2HD091793) । Q.D.M. NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप प्रोग्राम द्वारा समर्थित है (अनुदान सं. डीजीई-१६५००४४) । बी. ए. एच. पुरस्कार संख्या 5T32EB006343 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों जीटी BioMAT प्रशिक्षण अनुदान के साथ ही जॉर्जिया टेक राष्ट्रपति फैलोशिप द्वारा समर्थित है । G.A.K. बरोज स्वागत कोष से वैज्ञानिक अंतरफलक पर एक कैरियर पुरस्कार रखती है । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filters VWR 4652
18G needle VWR 89134-024
15 mL conicals VWR 89039-670
250 mL Erlenmeyer flask VWR 89000-362
Stir bar VWR 58949-006
Hot Plate/Magnetic Stirrer VWR 97042-634
Glacial acetic acid VWR 97064-482
Albumin from Bovine Serum (BSA) Thermo Fisher A13100
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma 236489
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 44939
Epichlorohydrin Sigma 45340-500ML-F
DMF Sigma D4551
Ammonium Hydroxide Sigma 320145-500ML
Sodium Hydroxide pellets Sigma 221465-500G
EDTA Sigma E9884
Sodium Borate Sigma B9876
L-Cysteine Sigma 168149-100G
Tris-HCl Sigma T5941
Tris base Sigma T6066
PBS tablets Sigma P4417
Dextran Pharmacosmos 5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk Millipore UFC901024
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk Millipore UFC903024
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk Millipore UFC910024
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical NanoZS
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette LifeTech 66130
Dynabeads MyOne Tosylactivated LifeTech 65501
SIA Life Tech 22349
PEG 20k Laysan Bio MPEG-SH-20K-1g
Fluorescein Antibody [2A3] GeneTex GTX10257
Hiload 16/600 superdex 200 GE Healthcare 45-002-490
Plate Reader Fisher BTCYT5M
BD Insulin Syringes Fisher NC0872854

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References

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समस्या १३७ सिंथेटिक रासायनिक गतिविधि आधारित जांच nanosensors नैनोकणों मूत्र निदान-इंजीनियरिंग,
Nanosensors-इनवेसिव निदान के लिए <em>वीवो में</em> गतिविधि को छेड़ने का पता लगाने के लिए
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Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G.More

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G. A. Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics. J. Vis. Exp. (137), e57937, doi:10.3791/57937 (2018).

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