Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Nanosensorer att upptäcka proteas aktivitet In Vivo för noninvasiv diagnostik

Published: July 16, 2018 doi: 10.3791/57937
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4,5
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Tech College of Engineering and Emory School of Medicine, 2Parker H. Petit Institute of Bioengineering and Bioscience, 3Institute for Electronics and Nanotechnology, Georgia Tech, 4Integrated Cancer Research Center, Georgia Tech, 5The Georgia Immunoengineering Consortium, Emory University and Georgia Tech

Summary

Proteaser är hårt reglerade enzymer som är involverade i grundläggande biologiska processer och dysreglerad proteas aktivitet enheter progression av komplexa sjukdomar såsom cancer. Denna metods mål är att skapa nanosensorer som mäter proteas aktivitet i vivo genom att producera en klyvning-signal som är detekterbar från värd urin och diskriminerar sjukdom.

Abstract

Proteaser är multifunktionella enzymer som är specialiserade på hydrolys av peptidbindningar och styra bred biologiska processer inklusive homeostas och allostasis. Dessutom dysreglerad proteas aktivitet driver patogenes och är en funktionell biomarkör för sjukdomar som cancer; Därför kan förmågan att upptäcka proteas aktivitet i vivo ge kliniskt relevant information för biomedicinsk diagnostik. Målet med detta protokoll är att skapa nanosensorer som sond för proteas aktivitet i vivo genom att producera en mätbar signal i urinen. Dessa proteas nanosensorer består av två komponenter: en nanopartikel och substrat. Funktionerna nanopartiklar att öka omsättning halveringstid och substrat leveransen till målet sjukdom platser. Substratet är en sekvens med kort peptid (6-8 AA), som syftar till att vara specifika för en target proteashämmare eller grupp av proteaser. Substratet är konjugerat med ytan av nanopartikelportföljen och avslutas av en reporter, såsom en fluorescerande markör, för upptäckt. När dysreglerad proteaser klyva peptid substratet, filtreras reportern i urin för kvantifiering som en biomarkör av proteas aktivitet. Detta dokument beskriver vi byggandet av en nanosensor för matrix metalloproteinas 9 (MMP9), som är associerad med tumör progression och metastasering, för upptäckt av kolorektal cancer i en musmodell.

Introduction

Proteaser är multifunktionella enzymer som är specialiserade på hydrolys av peptidbindningar och har betydande kontroll över många biologiska processer, inklusive homeostasis, allostasis och sjukdom1. Ett förändrat tillstånd av proteas aktivitet har korrelerats till en mängd olika sjukdomar, däribland cancer och hjärt-kärlsjukdom, att göra proteaser attraktiva kandidater för utveckling till kliniska biomarkörer2,3. Dessutom är proteas aktivitet funktionellt kopplade till distinkta vägarna, behandlingsresultat och prognos av sjukdom4. Broady, biosensorer har utvecklats för att upptäcka olika biologiska fenomen och sjukdomar, såsom cancer, neurodegenerativa sjukdomar och elektronöverföring bearbetar5,6,7,8 , 9. mer specifikt substrat-baserade proteas sensorer har utvecklats för att upptäcka proteas aktivitet, och inkluderar fluorogenic sonder för diagnostisk avbildning10 och isotopically märkt peptid substrat för in vitro identifiering av masspektrometri11. Activity based sonder har dessutom utvecklats, som innehåller substrat-liknande regioner som binder eller ändra målet proteas12. Med den här metoden hämmas irreversibelt i målet proteas när den aktiva platsen ändras, och analysen kräver skörd av vävnad, vilket begränsar i vivo applikationer. Det är dock viktigt att känna proteas aktivitet i vivo, eftersom regleringen av proteas aktivitet är starkt beroende av ramen för andra biologiska aktiviteter såsom förekomsten av endogen hämmare.

Målet med detta arbete är att beskriva utformningen av verksamhetsbaserad nanosensorer som upptäcker proteas aktivitet i vivo genom att producera en mätbar signal i urinen. Denna plattform används som en icke-invasiv diagnostik för att diskriminera komplexa sjukdomar såsom cancer genom att använda dysreglerad proteas aktivitet som en funktionell biomarkör. Vår nanosensor plattform består av järnoxid nanopartiklar (IONP) konjugerat med proteas substrat. Dessa substrat avslutas av en fluorescerande reporter som frigörs när proteaser klyva substratet. Dessa IONPs cirkulera i vivo, lokalisera till sjukdom webbplatser och exponera substrat till aktiva sjukdomsassocierade proteaser. Efter klyvning, fluorescerande reportrar är släppt och på grund av sin storlek, filtreras i urin, medan uncleaved substrat på IONP kvar i kroppen. Därför kommer att en ökning av proteashämmare aktiviteter i vivo resultera i högre koncentrationer av reporter i urinen (figur 1). Eftersom vår plattform är ett urinprov, ingen tänkbar plattform krävs och diagnossignaler är berikad med urin.

Denna plattform kan vara konstruerad för att upptäcka en rad sjukdomar inklusive cancer, fibros och trombos13,14. Här beskriver vi utformningen av nanosensorer att upptäcka förhöjningar i Matrix metallopeptidase 9 (MMP9) verksamhet som en biomarkör för kolorektal cancer. Kolorektal cancer är den näst vanligaste orsaken till dödsfall i cancer i USA, med uppskattningsvis 136.800 nya fall och 50,300 dödsfall i 2014 ensam15. Kolorektal tumörceller producerar MMP9, som har visat att köra malign progression, matrix nedbrytning, samt metastas16. Dessutom har vi identifierat ett passande peptid substrat (PLGVRGK) för MMP9 från litteratur17. Denna plattform kan användas för tidig upptäckt av cancer och låg kostnad point-of-care diagnostics13,14,18,19,20,21.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av Nanosensor aktivitet i vivo. Nanosensorer cirkulerar genom kroppen och lokalisera till platser av sjukdom. Sedan klyva sjukdomsrelaterade proteaser peptid substrat presenteras av IONPs. Storleken på klyvs fragment möjliggör renalt clearance, vilket får dem att lokalisera i urinen. Efter djuret kissar, kan dessa peptidfragment analyseras av deras reporter molekyl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Institutionella godkännande från institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) på forskarens institution är nödvändigt att utföra de följande djurförsök. Dessutom är standard djurvård faciliteter (t.ex. bostäder chambers, sterila djur huvar, isofluorane kammare för anesthetization och CO2 kammare för etiska endpoint dödshjälp) nödvändiga för att korrekt utföra dessa experiment. Särskild utbildning och hjälp med dessa anläggningar kan tillhandahållas av fysiologisk forskning laboratorium (PRL) vid sin institution. Alla djur arbetet godkändes av IACUC på Georgia Tech (protokoll: A14100).

1. järnoxid nanopartiklar (IONP) syntes

Obs: Säkerhet: hela järnoxid nanopartiklar syntes bör utföras med hjälp av personlig skyddsutrustning och under en kemisk rök huva.

  1. En 15 mL koniska rör, chill 1 mL 30% ammoniumhydroxid i en ishink för 30 min.
  2. Tvätta en 250 mL-Erlenmeyerkolv med avjoniserat vatten och tillsätt 10 mL dubbel destillerat vatten (ddH2O). Dränka utsidan av kolven i ett isbad som vilar på en uppståndelse/värme platta. Använd en plast pipett till flöde N2 gas in i ddH2O i kolven. Bubbla i 15 minuter med N2 till deoxygenate.
  3. Väga 224 µmol (4,5 gram) av dextran (molekylvikt (MW) = 20 kDa) till en 50 mL konisk tub. Lägg till H2O så att den slutliga volymen av blandningen, inklusive dextran, är 20 mL. Vortex kraftigt för att upplösa dextran.
  4. Väger 290 µmol (78,5 gram) av järn klorid hexahydrat, lägga till dextran lösning och vortex att upplösa.
  5. Filtrera lösningen genom ett 0,2 µm filter.
  6. Över 1 mL kylt ammoniumhydroxid till 9 mL av syrefattigt vatten. Återgå till 4 ° C.
  7. Väga 367 µmol (73,0 gram) av järn(II) klorid tetrahydrat, lös i syrefri ddH2O 1 mL och filtrera genom ett 0,2 µm filter.
  8. Överför dextran-iron(III) lösningen till en 250 mL-Erlenmeyerkolv och deoxygenate med N2 i 15 minuter på isen. Blanda med magnetiska uppståndelse bar spinning på 1600 rpm.
  9. För att skapa en homogen kväveatmosfär, cap kolven med en gummi septum. Punktering septum med en 18 gauge nål till flöde N2 i kolven. Infoga en separat 18 gauge nål som ett flöde utlopp.
  10. Tillsätt 467 µL av järn(II) lösningen till dextran-iron(III) lösningen med en 1 mL spruta, omrörning med magnetiska rör bar vid 1600 rpm. Detta förhållande av järn(II) till järn resulterar i en balanserad reaktion som kommer att producera magnetit eller Fe3O4.
  11. Lägg till den kylda späd ammoniumhydroxid droppvis i järn (II) - järn (III) - dextran lösningen att initiera kärnbildning processen21. Se till att varje droppe blandar väl innan att lämna i en annan. Avsluta reaktionen efter tillsats av 1-2 mL ammoniumhydroxid.
  12. Stoppa flödet av N2 och ta bort gummi septum. Ta bort isbadet och ersätta med ett bad med varmt vatten, samtidigt som du rör om lösningen. Se till att temperaturen i lösningen når 75 ° C och inkubera i 75 minuter.
  13. Ta bort kolven från uppståndelse/varm plattan och dubbelt filtrera lösningen genom 0,2 µm sedan 0,1 µm filter för att ta bort grova partiklar.
  14. Buffert utbyta partiklarna i ddH2O, använda 100 kDa molekylvikt avskurna (m.w.c.o.) koncentratorer ta bort överflödig dextran från den lösning som bör vara mycket trögflytande. Byt filter om flödet genom förblir mörk även efter 2-3 spins, vilket indikerar att filtret kan ha brutit.
    1. Att buffra exchange med spin filter, Centrifugera vid 4 ° C vid 4800 X g i 15 minuter, kasta genomströmmande och lägger till nya bufferten i IONP lösningen. Upprepa 3 - 5 gånger.
  15. Bestämma koncentrationen av de nanopartiklar med en spektrofotometer/plate reader. Ta absorbansen mätningar på 400 nm och Använd den molar absorptivity av IONP på denna våglängd (ε = 2,07 x 106 cm-1 M-1) att bestämma koncentrationen av IO partiklar.
  16. Återsuspendera IONPs 10 mg/ml i ddH2O (oftast totala volym är ~ 3 mL) och se till att använda polypropylene rören för det här steget för kemisk kompatibilitet. Till 1,6 volymer av 5 M NaOH och sedan lägga till 0,65 volymer av epiklorhydrin. Blanda noggrant på en tallrik shaker i rumstemperatur i 12 timmar till crosslink dextran.
  17. Använda en 20 mL spruta med en 18 gauge nål för att överför IONP lösningen till 50 kDa m.w.c.o. dialys membranet. Placera dialys membranet i 4 L ddH2O och ersätta H2O ett par gånger (varje 2-3 timmar). Inkubera över natten.
  18. Mätning av koncentrationen och ta IONPs till 5 mg/mL (se steg 1.15). Lägga ammoniumhydroxid för att nå 20% (v/v) och skaka vid rumstemperatur för > 12 timmar att aminate ytan av IONPs. Buffert exchange med 30 kDa m.w.c.o. filter (se 1.14).
  19. Justera volymen ned till 2,5-3,5 mL innan slutliga rening genom snabbt Protein vätskekromatografi (FPLC, se Tabell för material för gel filtrering kolumn).
  20. Använd dynamiska ljusspridning (DLS) för att bestämma hydrodynamiska radien av IONPs (förväntade intervallet 10-100 nm, genomsnittlig storlek 40-50 nm). Gör detta genom att alikvotering 1 mL 100 X utspädda IONP provet i en kyvetten, placera i maskinen och använda tillverkarens programvara för att ta mätning.
    Obs: Den sammanlagda befolkningen av IONPs kommer att vara mellan 10 och 100 nm genom DLS mätningar, men majoriteten av befolkningen är runt den genomsnittliga diameter, som sträcker sig från 40-50 nm. Om man vill begränsa storleksintervallet, kan man ytterligare använda storlek utslagning kromatografi för att isolera fraktioner med olika diametrar. IONPs ska förvaras vid 4 ° C.

2. peptid Design, konjugation till IONP, och In Vitro validering

  1. Syntetisera ett peptid-substrat (t.ex. genom en core facilitet eller kommersiellt) för ett mål proteas med en N-terminala fluorescerande reporter såsom Fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) och en C-terminal cysteinrest tillåta thiol-medierad koppling.
    Obs: När det gäller denna studie för MMP9 peptiden användes var FITC-PLGVRGK-C, med kkattkm ~ 2,0 x 105 M-1s-1.
  2. Alikvot 0,5 mg IONP (vid 1 mg/mL) och buffert exchange in koppling buffert (50 mM natriumborat med 1 mM EDTA, pH = 8,5) använder en 10 kDa m.w.c.o. spin filtrera (se steg 1.14).
  3. Lös Succinimidyl iodoacetate (SIA) i dimetylformamid (DMF) till en koncentration av ~ 30 mg/mL, och Lägg till SIA IONP i mole förhållandet 500 SIA:IONP.
    Obs: SIA är en heterobifunctional gränsöverskridande länkare som förmedlar kopplingen av aminer på IONPs till sulfhydryl grupper på peptid substratet.
  4. Inkubera i 1-2 timmar vid rumstemperatur i mörkret. Om lämnar över natten, inkubera vid 4 ° C.
  5. Buffra exchange med ett 10 kDa m.w.c.o. spin filter till koppling buffert att ta bort oreagerad SIA (se steg 1.14).
  6. Ta den slutprodukt lösningen 1 mg/ml (0,5 ml). Blanda peptiden sevärdheter på en molar förhållandet av 90:1 (peptid: IONP) med 20 kDa thiol-avslutad polyetylenglykol (PEG) i molar förhållandet 20:1 (PEG: IONP). Blanda denna peptid-PEG-lösning med IONP.
  7. Inkubera över natten i rumstemperatur på en tallrik shaker på högsta hastighet, som omfattar rör i folie för att förhindra fotoblekning fluorescerande molekyler.
  8. Lägga till L-cystein på en molar förhållandet på 500: 1 (C:IONP) att neutralisera eventuella oreagerad SIA-molekyler. Inkubera i 1 timme vid 25 ° C i en shaker med högsta hastighet vid rumstemperatur.
  9. Rena via FPLC (se 1.1.19). Använd en spektrofotometer för att Mät absorbansen för provlösningen och beräkna förhållandet peptid: IONP enligt följande. Efter rening, Förvara produkten vid 1 mg/mL vid 4 ° C i PBS.
    1. Använd en spektrofotometer för att mäta absorbansen för provlösningen på 400 nm (ettprov, 400) och våglängden för maximal absorbans för fluorophore används, vilket är 488 nm för FITC (ettprov, 488). Mät absorbansen hos en lager amine IONP lösning på de samma två våglängderna (400 nm och 488 nm), som föreställs respektive som enNP, 400 och enNP, 488.
    2. Använda ekvationer 1 och 2 för att beräkna den normaliserade A400 och en488 värden.
      Equation 1Ekvation 1
      Equation 2Ekvation 2
    3. En400 och en488 representerar de normaliserade värdena av provet. Använda dessa värden för att beräkna förhållandet mellan peptid: IONP med ekvation 3.
      Equation 3Ekvation 3
    4. Där Equation 4 och Equation 5 är de molar absorptivities av IONP och fluorophore, respektive. För dessa partiklar Equation 4 = 2.06 x 106 M-1cm-1 och för FITC Equation 5 = 72.000 M-1cm-1, så värdet av Equation 6 bör vara 28,75. Typiska peptid: IONP nyckeltal bör vara i intervallet 20:1 till 50: 1.
  10. Validera funktionaliteten i sonderna genom att utföra ett in vitro- klyvning test.
    1. Med PBS (1% BSA), göra en 18 µL nanopartiklar lösning med 200 nM koncentration av peptid. Blanda med 2 µL av proteashämmare sevärdheter (MMP9; 0,1 - 1 mg/mL).
    2. Inkubera i en spektrofotometer vid 37 ° C i 1 timme, fluorescens mätningar (med hjälp av lämpliga excitation och utsläpp våglängder, vilka är 485 nm och 528 nm för FITC, respektive) varje 1-2 minuter att övervaka klyvning.

3. administration av nanosensorer och urin upptäckt av Cancer

Obs: För mer information om exempel modellen, se vår tidigare rapport13.

  1. Skapa en metabolisk bur för urin samling genom att säkra en cylindrisk hylsa till toppen av en 96 väl platta. Under urin samling, placera en mus inne i hylsan och täck med en petriskål täckmantel för att förhindra rymning av djuret.
  2. Bered en injektion (200 µL maximala volym) som innehåller nanosensorer vid en koncentration på 3000 mg/kg (~ 50 µmol) av peptid i steril koksaltlösning.
  3. I kvinnliga, 8 - vecka-gammal, naken möss med xenograft LS174T kolorektal tumörer på en börda på ~ 100-300 mm3, som skulle inträffa på cirka dag 10, administrera nanosensor lösning via svans ven injektion. Omedelbart efter injektion, placera möss i metabolismburar och notera tiden för injektion för varje mus.
  4. På 60-90 minuter efter injektion, ta bort plattan med 96 brunnar cylindrisk hylsa. Hindra musen och applicera lätt tryck på blåsan att inducera möss att ogiltigförklara eventuella återstående urin på plattan. Samla alla urin (200-500 µL).
  5. Analysera urinprov av immunoprecipitation att rena FITC från urinen och öka känsligheten. Använda magnetiska pärlor tillsammans med anti-FITC antikroppar.
    1. Först tvätta 25 mg av magnetiska pärlor 3 gånger med coatingbuffert och föra den slutliga volymen till 225 µL.
      Obs: Det är viktigt att göra den coatingbuffert (0,1 M natriumborat, pH 9,5), blockerande buffert (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, pH 7,4) och tvätt buffert (PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20, pH 7,4) färska varje gång, och ungefär 20 mL av varje är nödvändigt.
    2. Tillsätt 200 µL anti-FITC (5 mg/mL) och 200 µL av ammoniumsulfat (3 M). Inkubera under 16-24 timmar vid 37 ° C på en rotator.
    3. Lägga till lösningen i en magnetisk separator, avlägsna supernatanten, ersätta med 625 Equation 7 Λ blockerande buffert och inkubera vid 37 ° C över natten. Tvätta sedan 3 gånger med tvättbuffert och lagra i 1,25 mL tvättbuffert.
    4. Inkubera 2 µL av urin med 5 µL av magnetiska pärlor (20 mg/mL) och föra till en total volym på 50 µL med PBS (0,01% Tween-20). Inkubera i 60 min.
    5. Tvätta två gånger med 50 µL PBS (0,01% Tween-20) med en magnetisk separator att samla in magnetiska pärlor efter varje tvätt.
    6. Eluera två gånger med 32,5 µL av 5% ättiksyra. Neutralisera poolade eluering (70 µL) med 35 µL av 2 M Tris att nå ett slutligt pH på ~ 7.
    7. Läste på en Plattläsare (se Tabell för material) lämpliga excitation och utsläpp våglängder att kvantifiera urin fluorescens. Beräkna koncentrationen av fluorescerande reporter mot en stege av kända koncentrationer av gratis fluorophore.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Majoriteten av befolkningen i IONPs är runt den genomsnittliga diameter, som sträcker sig från 40-50 nm. Efter pegylering, denna storleksordning har en omsättning halveringstid på cirka 6 timmar13 i vivo (se figur 2a). Om man vill markera för en viss storlek, kan man använda storlek utslagning kromatografi för att isolera IONP fraktioner med olika diametrar. Nanopartiklarna av TEM visas som enskilda sfäriska järnoxid nanopartiklar tvärbundna tillsammans av ett yttre lager av dextran. 13  En lösning av IONPs visas genomskinliga med inga förhastade och ljus brun färg. Efter framgångsrika peptid konjugation, kommer att spektrala absorbansen analys avslöja en distinkt absorbansen topp vid de högsta magnetiseringen våglängden av fluorescerande reporter. När det gäller FITC, detta kommer att vara centrerad omkring 488 nm (se figur 2b). En typisk peptid konjugation reaktion kommer att resultera i en peptid IONP molar förhållandet mellan 20-50 efter FPLC rening. För att testa förmågan av sonden avkänningen proteas aktivitet, kan en alikvot av nanosensorer inkuberas med rekombinant proteaser och övervakas av fluorimetry. Klyvning verksamhet kommer resultera i lanseringen av fluorescerande reportrar - som annars homoquenched på ytan av nanopartikelportföljen - in lösning och öka prov fluorescens. Det är typiskt att iaktta substrat klyvning hastigheter som följer Michaelis-Menten kinetik (se figur 2 c).

Figure 2
Figur 2: Validera strukturen och funktionen av nanosensorer i vitro. (a) A DLS graf som representerar fördelningen av storlek av en IONP befolkning efter syntes. (b) absorbans spectrumen av IONPs efter konjugering med FITC-märkt MMP-9 substrat. (c) in vitro- klyvning analysen visar att MMP9 stadigt klyver peptiden presenteras av nanosensor under loppet av en timme. Proteas koncentrationen 0,5 mg/mL användes i PBS (1% BSA) buffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Om du vill använda denna plattform i musmodeller av cancer, är det typiskt att använda nanosensorer belagd med nära infraröd fluorescerande reporter för att tillåta visualisering av farmakokinetiken av hela djur fluorescerande imaging (figur 3a). I möss med LS174T kolorektal tumörer, kommer en fluorescerande signalen lokalisera i urinen inom 60-90 minuter efter intravenös administrering av nanosensorer på grund av MMP9 klyvning av peptid substrat på nanosensorer. Däremot finns det lägre fluorescerande signaler i urinblåsan kontroll gruppen möss (se figur 3a). Det bör noteras att den signal som observerats i levern uppstår eftersom partiklarna är så småningom rensas av monocyter och makrofager i retikuloendoteliala systemet, som vanligen finns i levern, mjälten och lymfkörtlarna. Signalen från levern i figur 3a är därför, på grund av clearance av nanopartiklar. 13 när kvantifiera urin fluorescens av immunoprecipitation, en betydligt förhöjd signal kommer att iakttas i möss med LS174T tumörer jämfört med friska kontroller (se figur 3b).

Figure 3
Figur 3: att upptäcka kolorektal Cancer i en musmodell. (a) In vivo bilder av tumör och kontroll gruppen möss, Observera IONP lokalisering till platser av sjukdom, samt urin lokalisering på grund av tumör progression. (b) urin fluorescens kvantifiering av tumör i kontroll möss i LS174T tumör modellen. Felstaplar ritas som standardavvikelse (*p < 0,05 av två-tailed parade t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna metod beskriver utvecklingen av verksamhetsbaserad nanosensorer bestående av proteashämmare substrat konjugerat med en nanopartikel kärna. Händelse av proteolytisk klyvning är dubbad ”farmakokinetiska switch”, eftersom klyvs peptid produkter är mindre än nedsatt filtration storleksgräns 5 nm23 och filter i urinen för att producera en noninvasiv signal. Därför är det viktigt att använda nanopartiklar eller bärare med en hydrodynamiska radien som är större än 5 nm, som något mindre snabbt rensas av njurarna och blanda ihop urin signaler. Vi använder pegylerat IONPs eftersom de är FDA-godkänd, tolereras väl, och har en cirkulerande halveringstid på 3-5 timmar. 13 en annan viktig faktor vid utformningen av nanosensorer är PEG till peptid substrat molar förhållandet. 24 , 25 ökar förhållandet kommer att minska icke-specifik klyvning av off-target proteaser via sterisk skärmning av peptider26, men potentiellt minska på målet aktiviteten samt. Däremot ökar en lägre PEG-peptid förhållande proteas tillgänglighet och klyvning av peptider, som kommer att förstärka upptäckt signaler men kan också öka bakgrundsljud. I vivo, kan en lägre yta koncentration av PEG också öka nanosensor upptag av retikuloendoteliala systemet (RES) och minska cirkulationen tid.

För att tillämpa denna teknik för att diagnostisera andra sjukdomar, bör proteaser som är uppreglerad i en sjukdom-stat identifieras från litteratur17. Discovery ansträngningar bör inriktas på extracellulära proteaser eftersom dessa nanosensorer inte är utformad för att tränga in i cellerna till sense intracellulära aktivitet. Dessa nanosensorer är också framtagna till sense endoproteases att klyver i mitten av peptiden, vilket ger många kandidat sjukdomar att rikta. Av målobjekt extracellulära endoproteases ensam har vi utvecklat diagnostik för leverfibros, flera typer av cancer, och trombos13,19,20,21. Denna plattform kan utformas ytterligare sond för exoprotease aktivitet efter endoprotease klyvning i samband med sjukdom26,27. Det är också viktigt att utforma ett peptid-substrat som är specifik för proteasen sevärdheter. Detta skulle kunna åstadkommas genom screening kandidat peptid sekvenser med in vitro- klyvning analys (steg 2.10-2.11). Potentiella ospecifika proteas klyvning bör också testas under peptid design. Till exempel när det gäller MMP9 testade vi substrat specificitet med trombin, ett koagulering proteas hittade vid höga koncentrationer i blodet. Använd aktiviteten nanosensorer i vivogenom bör optimal urin samling tiden fastställas genom att övervaka kinetik av signal produktion av imaging eller diskret provtagning av urin efter administrering av nanosensorer. Möss kan också infunderas med steril koksaltlösning att overhydrate djur och öka urinproduktion. Praktiskt, kan denna teknik utökas till någon sjukdom med uppreglerad eller nedreglerade extracellulär proteashämmare aktivitet. En styrka med denna plattform är att det tillåter för förstärkning av målet proteas signal, så även om bara en bråkdel av sjukdom-site proteas befolkningen är tillfrågade, en betydande avläsningssystem kan mätas. Den aktuella plattformen är konstruerad att sense extracellulära endoproteases. När du tillämpar denna plattform på andra sjukdomar, måste man identifiera proteas biologi på denna sjukdom, sådan att denna plattform kan vara inställda känsla proteaser sevärdheter.

Denna core-teknik kan vara ytterligare konstruerad med klyvning reportrar som kan upptäckas med olika analytiska plattformar att öka antalet ansökningar. Exempelvis kan klyvning reportrar som innehåller ligander för antikropp bindande upptäckas av papper tester för låg kostnad point-of-care diagnostics19. Dessutom, tillåter märkning substrat med massa reportrar flera proteaser att upptäckas samtidigt från urin av masspektrometri13. Denna metod beskriver slutligen formulera aktivitetsbaserade nanosensorer för att känna proteas aktivitet i vivo som en icke-invasiv urin biomarkör för sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Kwong är medgrundare och serverar som konsult till Glympse Bio, som utvecklar produkter som är relaterade till den forskning som beskrivs i detta dokument. Denna studie skulle kunna påverka hans personliga finansiella ställning. Villkoren i detta avtal har granskats och godkänts av Georgia Tech i enlighet med dess intressekonflikt policy

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av en NIH-regissörens nya innovatör Award (Award No. DP2HD091793). Q.D.M. stöds av NSF forskning stipendier forskarutbildningen (Grant nr. DGE-1650044). B.A.H stöds av nationella institut för hälsa GT BioMAT utbildning bidraget under Award antal 5T32EB006343 samt Georgia Tech presidentens Fellowship. G.A.K. håller en karriär Award vid vetenskapliga gränssnittet från Burroughs Välkommen fonden. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm syringe filters VWR 4652
18G needle VWR 89134-024
15 mL conicals VWR 89039-670
250 mL Erlenmeyer flask VWR 89000-362
Stir bar VWR 58949-006
Hot Plate/Magnetic Stirrer VWR 97042-634
Glacial acetic acid VWR 97064-482
Albumin from Bovine Serum (BSA) Thermo Fisher A13100
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma 236489
Iron (II) chloride tetrahydrate Sigma 44939
Epichlorohydrin Sigma 45340-500ML-F
DMF Sigma D4551
Ammonium Hydroxide Sigma 320145-500ML
Sodium Hydroxide pellets Sigma 221465-500G
EDTA Sigma E9884
Sodium Borate Sigma B9876
L-Cysteine Sigma 168149-100G
Tris-HCl Sigma T5941
Tris base Sigma T6066
PBS tablets Sigma P4417
Dextran Pharmacosmos 5510 0020 9006
Amicon 15 mL 10k filters, 24 pk Millipore UFC901024
Amicon 15 mL 30k filters, 24 pk Millipore UFC903024
Amicon 15 mL 100k filters, 24 pk Millipore UFC910024
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical NanoZS
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette LifeTech 66130
Dynabeads MyOne Tosylactivated LifeTech 65501
SIA Life Tech 22349
PEG 20k Laysan Bio MPEG-SH-20K-1g
Fluorescein Antibody [2A3] GeneTex GTX10257
Hiload 16/600 superdex 200 GE Healthcare 45-002-490
Plate Reader Fisher BTCYT5M
BD Insulin Syringes Fisher NC0872854

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopez-Otin, C., Bond, J. S. Proteases: Multifunctional enzymes in life and disease. Journal of Biological Chemistry. 283 (45), 30433-30437 (2008).
  2. Hua, Y., Nair, S. Proteases in cardiometabolic diseases: Pathophysiology, molecular mechanisms and clinical applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1852 (2), 195-208 (2015).
  3. Koblinski, J. E., Ahram, M., Sloane, B. F. Unraveling the role of proteases in cancer. Clinica Chimica Acta. 291 (2), 113-135 (2000).
  4. Lilja, H., Vickers, A., Scardino, P. Measurements of proteases or protease system components in blood to enhance prediction of disease risk or outcome in possible cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (4), 347-348 (2007).
  5. Jin, H., et al. Flexible surface acoustic wave resonators built on disposable plastic film for electronics and lab-on-a-chip applications. Scientific Reports. 3, 2140 (2013).
  6. Ma, W., Liu, H. -T., Long, Y. -T. Monitoring dopamine quinone-induced dopaminergic neurotoxicity using dopamine functionalized quantum dots. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (26), 14352-14358 (2015).
  7. Zhang, W. -H., Ma, W., Long, Y. -T. Redox-mediated indirect fluorescence immunoassay for the detection of disease biomarkers using dopamine-functionalized quantum dots. Analytical Chemistry. 88 (10), 5131-5136 (2016).
  8. Ma, W., et al. Investigating electron-transfer processes using a biomimetic hybrid bilayer membrane system. Nature Protocols. 8 (3), 439-450 (2013).
  9. Holt, B. A., et al. Fc microparticles can modulate the physical extent and magnitude of complement activity. Biomaterials science . 5, 463-474 (2017).
  10. Edgington, L. E., Verdoes, M., Bogyo, M. Functional imaging of proteases: Recent advances in the design and application of substrate-based and activity-based probes. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (6), 798-805 (2011).
  11. Kleifeld, O., et al. Identifying and quantifying proteolytic events and the natural N terminome by terminal amine isotopic labeling of substrates. Nature Protocols. 6 (10), 1578-1611 (2011).
  12. Sanman, L. E., Bogyo, M. Activity-based profiling of proteases. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 249-273 (2014).
  13. Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nature Biotechnology. 31 (1), 63-70 (2013).
  14. Dudani, J. S., Buss, C. G., Akana, R. T. K., Kwong, G. A., Bhatia, S. N. Sustained-release synthetic biomarkers for monitoring thrombosis and inflammation using point-of-care compatible readouts. Advanced Functional Materials. 26 (17), 2919-2928 (2016).
  15. Meester, R. G. S., et al. Public health impact of achieving 80% colorectal cancer screening rates in the United States by 2018. Cancer. 121 (13), 2281-2285 (2015).
  16. Mehner, C., et al. Tumor cell-produced matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) drives malignant progression and metastasis of basal-like triple negative breast cancer. Oncotarget. 5 (9), 2736-2749 (2014).
  17. Bremer, C., Tung, C. H., Weissleder, R. In vivo molecular target assessment of matrix metalloproteinase inhibition. Nature Medicine. 7 (6), 743-748 (2001).
  18. Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13709-13714 (2014).
  19. Warren, A. D., Kwong, G. A., Wood, D. K., Lin, K. Y., Bhatia, S. N. Point-of-care diagnostics for noncommunicable diseases using synthetic urinary biomarkers and paper microfluidics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), 3671-3676 (2014).
  20. Kwong, G. A., et al. Mathematical framework for activity-based cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12627-12632 (2015).
  21. Dudani, J. S., Jain, P. K., Kwong, G. A., Stevens, K. R., Bhatia, S. N. Photoactivated spatiotemporally-responsive nanosensors of in vivo protease activity. ACS Nano. 9 (12), 11708-11717 (2015).
  22. Palmacci, S., Josephson, L. AMAG Pharmaceuticals Inc. Synthesis of polysaccharide covered superparamagnetic oxide colloids. US patent. , 5,262,176 (1991).
  23. Choi, H. S., et al. Renal clearance of nanoparticles. Nature Biotechnology. 25 (10), 1165-1170 (2007).
  24. Harris, T. J., von Maltzahn, G., Derfus, A. M., Ruoslahti, E., Bhatia, S. N. Proteolytic actuation of nanoparticle self-assembly. Angewandte Chemie (International edition in English). 45 (19), 3161-3165 (2006).
  25. Kwon, E. J., Dudani, J. S., Bhatia, S. N. Ultrasensitive tumour-penetrating nanosensors of protease activity. Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).
  26. Villanueva, J., Nazarian, A., Lawlor, K., Tempst, P. Monitoring Peptidase activities in complex proteomes by MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 4 (8), 1167-1183 (2009).
  27. Villanueva, J., et al. Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns. The Journal of Clinical Investigation. 116 (1), 271-284 (2006).

Tags

Bioteknik fråga 137 syntetiska biomarkörer activity based sonder proteaser nanosensorer nanopartiklar urin diagnostik
Nanosensorer att upptäcka proteas aktivitet <em>In Vivo</em> för noninvasiv diagnostik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G.… More

Holt, B. A., Mac, Q. D., Kwong, G. A. Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics. J. Vis. Exp. (137), e57937, doi:10.3791/57937 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter