Summary
Dette manuskript beskriver en enkel protokol til isolering af arterioler fra rotte nethinden, der kan bruges i elektrofysiologiske, calcium imaging og pres blodkar undersøgelser.
Abstract
Nethinden er en yderst metabolisk aktive væv, der kræver en betydelig blodforsyning. Den retinale omsætning understøtter den indre Nethinde, mens de choroidal fartøjer levere fotoreceptorer. Ændringer i retinal perfusion bidrage til talrige sight-truende lidelser, herunder diabetisk retinopati, glaukom og retinal gren vene tillukning. Forstå de molekylære mekanismer involveret i kontrollen af blodgennemstrømningen gennem nethinden og hvordan disse er ændret under okulær sygdomme kan føre til identifikation af nye mål for behandlingen af disse betingelser. Retinal arterioler er de vigtigste modstand fartøjer af nethinden, og derfor spiller en central rolle i reguleringen af retinale Hæmodynamik gennem ændringer i luminale diameter. I de seneste år, har vi udviklet metoder til isolering af arterioler fra rotte nethinden, som er egnet til en bred vifte af applikationer, herunder celle fysiologi undersøgelser. Dette præparat er allerede begyndt at give ny indsigt i hvordan blodgennemstrømningen er kontrolleret i nethinden og har gjort det muligt at identificere nogle af de vigtigste ændringer, der opstår under okulær sygdomme. I denne artikel, vi beskriver metoder til isolering af rotte retinal arterioler og omfatter protokollerne for deres anvendelse i patch-clamp Elektrofysiologi, calcium imaging og pres blodkar undersøgelser. Disse fartøjer er også indstillet til brug i PCR-, western blotting og Immunhistokemi-baserede undersøgelser.
Introduction
Forstå hvordan blodgennemstrømningen er kontrolleret i nethinden er et vigtigt mål, da unormal blodgennemstrømning har været involveret i patogenesen af en række sight-truende retinal sygdomme1,2,3, 4. Den retinale omsætning, der forsyner den indre nethinde neuroner og gliaceller, har en ende arterie arrangement, med alle blod fra retinal arterier og arterioler passerer gennem kapillærerne retinale vener og endelig vener5. Blodgennemstrømningen i nethinden er reguleret af tonen i de retinale arterier og arterioler samt de kontraktile aktivitet af pericytes beliggende på væggene i retinal kapillærer og post kapillær venules6,7, 8. kontrol af retinal vaskulær tone er komplekse og moduleres af en vifte af input fra kredsløbssygdomme og omkringliggende retinale væv, herunder blod gasser, cirkulerende molekyler og hormoner, og vasoaktive stoffer frigives fra de retinal vaskulær endotel og macroglia9,10,11. De retinale arterioler er den lille arterielle filialer af nethinden og er sammensat af et enkelt lag af vaskulære glatte muskelceller og en indre foring af langs arrangeret endotelceller12,13, 14. disse fartøjer udgør de vigtigste site af vaskulære modstand inden for den retinale omsætning og derfor spiller en vigtig rolle i den lokale kontrol af retinale blodgennemstrømning. Retinal arterioler regulere kapillær blod flyde i nethinden ved at dilatere eller snærende deres luminale diameter, medieret af ændringer i vaskulære glatte muskulatur kontraktilitet10,15,16. Forstå de molekylære mekanismer gennem hvilke retinal arterioler regulere retinal perfusion derfor kræver præparater hvor arteriolære glatte muskelceller kan tilgås og studerede under forhold så tæt på fysiologiske som muligt.
Ex vivo præparater af isolerede retinale blodkar giver adgang til de vaskulære glatte muskelceller, mens de stadig bevare deres funktionalitet og sammenkobling med det underliggende endotelet. De fleste undersøgelser til dato ved hjælp af isolerede fartøjer har fokuseret på store kvæg eller svin arteriel fartøjer (60-150 µm). Disse kan monteres i kommercielt tilgængelige wire eller pres myograph systemer til at sætte farmakologiske forhør af vaskulær glat muskel celle kontraktile mekanismer17,18. Sådanne præparater har i høj grad bidraget til vores viden om retinal vaskulær fysiologi under normale forhold. Få studier har brugt retinal arterioler isoleret fra små forsøgsdyr som deres mindre diameter (~ 8-45 µm) forhindrer deres brug i konventionelle blodkar systemer19,20,21,22. En vigtig fordel, dog er af ved hjælp af fartøjer fra små forsøgsdyr genetisk modificerede, transgene og retinal sygdomsmodeller bred tilgængelighed. Lille laboratoriedyr er også mere modtagelig for i vivo intervention undersøgelser.
Her beskriver vi ligetil protokoller til isolering og cannulating rotte retinal arterioler for pres blodkar eksperimenter. Ca2 + imaging og Elektrofysiologi protokoller ved hjælp af disse fartøjer er også detaljeret. Disse kan give yderligere indsigt i reguleringen af vaskulær glat muskulatur kontraktilitet og blodgennemstrømningen i nethinden.
Protocol
Alle forsøg beskrives her blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i den britiske dyr (videnskabelige procedurer) Act af 1986 og blev godkendt af Queen's University i Belfast dyrevelfærd og etiske klageinstansen.
1. isolering af retinale arterioler
Bemærk: Følgende protokol bruges til at isolere retinal arterioler. Denne metode er optimeret til rotte retinal arterioler men kan bruges med mus nethinder. Udbyttet af fartøjer, men er lavere, når du bruger mus.
- Udgør en løsning af lave Ca2 + indeholdende Hanks' (LCH) som vist i tabel 1.
Bemærk: Denne løsning kan opbevares i op til 3 dage ved 4 ° C (når ved hjælp af oplagret LCH, sikre at det afbalancerer til stuetemperatur og pH er korrekte før brug). - Samle følgende udstyr før samling af væv til at sikre hurtig microdissection af nethinder: savtakkede pincet buet saks, dissektion parabol (silikone-belagt petriskål), enkelt kantet blade, 2 sæt af pincet (stumpe) 1 glas Pasteur pipette (brand poleret til en glat, men ikke smal spids), 1 engangs plast pipette (med spids trimmet til at øge blænden til ~ 5-7 mm), 1 glas rundt om bunden reagensglas (5 mL) og indehaveren. Dekanteres ca 50 mL af LCH i et glas bægerglas og forberede et andet bægerglas til dekanteres affald væsker.
Bemærk: Se Tabel af materialer for specifikationer og fabrikanten detaljer. - Aflive rotten ved hjælp af CO2 efterfulgt af hjerte punktering til exsanguinate (undgå livmoderhalskræft dislokation eller hjernerystelse, da disse kan beskadige blodkar i øjet). Trække øjenlåg med savtakket pincet, så brug den buede saks til at skære omkring orbital musklerne og gennem synsnerven. Forsigtigt uddrag øjnene fra kredsløb pasning til at skære igennem enhver resterende vedhæftede filer med en saks.
- Placere øjnene nedsænket i LCH løsning på dissektion parabol (øjne kan blive transporteret på isen i en opløsning af LCH, hvis nødvendigt). Bruge et sæt af stump pincet til at forankre øje til skålen ved at holde orbital muskel vedhæftede filer eller synsnerven; sikre at den forankring punkt er så tæt som muligt på sclera til at stabilisere øjet.
- Ved hjælp af bladet, skære gennem hornhinden langs ora serrata og fjerne linsen ved at trykke forsigtigt på sclera med pincet.
- Skære øjenkop i halve symmetrisk gennem den optiske disk. Ved hjælp af lukkede pincet forsigtigt 'pensel' ud nethinder fra de to halvdele af øjestykket pasning til at fjerne enhver resterende vedhæftede filer på den optiske disk. Gentag processen med det andet øje og overføre de dissekerede nethinder i test-tube ved hjælp af plast pipette og en lille dråbe af LCH medium.
- Ved hjælp af den plast pipette fyld reagensglasset med LCH til ~ 5 mL og tillade nethinder til at bilægge til bunden.
- Vask vævet ca 3 gange ved at fjerne ~ 4 mL af opløsning fra røret og tilføje frisk LCH ved hjælp af den plast pipette. Om fornødent fjerne uvedkommende væv som opsættende ledbånd, Corpus vitreum og hår.
- Vask på indersiden af glasset Pasteur pipette (poleret tip) med LCH at forhindre vævet klistrer til pipetten. Bruger den samme pipette, fjerne ca 4 mL af opløsning fra test-tube. Derefter tilsættes ca. 2 mL frisk LCH.
- Forsigtigt adskille (triturate) nethinder ved at tegne væv gennem spidsen af glasset afpipetteres langsomt og udvise indholdet i reagensglasset. Bemærk, prøv ikke at indføre bobler på dette stadium.
- Gentag trin 1.10 indtil nethinder er brudt til en størrelse på ca 2-3 mm2.
- Vask på indersiden af pipetten med ca. 2 mL LCH og udvise det i reagensglasset. Tillad indhold at bilægge til bunden over 5-10 min.
- Gentag ændring proces, som skitseret i 1.10-1.12 med lidt mere kraft, indtil væv stykkerne er ca 1 mm2 i størrelse. Igen, tillade væv nøjes med 5-10 min.
- Gentag trin 1.10-1.12 en tredje gang med mere kraft indtil indholdet er fuldt homogeniseret og ikke stykker af nethinden forblive (løsningen bør blive mælkehvid i udseende).
Bemærk: Denne teknik vil give op til 8 arteriolare segmenter (relativt fri af omgivende neuropile og med nogle grene, resterende intakt) pr. isolation måler 8-45 µm i diameter og 200-2500 µm i længden. - Overføre en lille mængde af isolatet i en fysiologisk optagelse kammer eller tilføje fluorescerende farvestoffer til måling af intracellulære Ca2 + koncentration ([Ca2 +]jeg; Se afsnit 3). Disponere over resterne af øjet kopper og fjernede under isolation processen i henhold til lokale regler for håndtering af animalsk affald.
Bemærk: Selv om det er tilrådeligt at eksperimentere på fartøjer straks efter isolation, overskydende isolat kan opbevares ved 4 ° C i op til 8 h.
2. arteriolære pres blodkar
Bemærk: Arteriolære pres blodkar er udført som følger hospitalsudstyr udførligt beskrevet i figur 1A, B og Tabel af materialer.
- En alikvot del af retinale fartøj homogenatet (1-2 mL; isolerede ifølge afsnit 1) til en fysiologisk optagelse kammer (delvist fyldt med nominelt Ca2 +gratis Hanks' løsning; 0Ca2 + Hanks'; Se tabel 1) monteret på scenen i en inverteret mikroskop. Forlade fartøjer at bosætte sig på bunden af optagelse kammer i mindst 5 min. før eksperimenter.
- Visuelt Skan på tværs af optagelse kammer til at identificere arterioler > 200 µm i længde og besidder en åben ende, hvor fartøjet kan kanylerede (identifikation af fartøjets type er yderligere undersøgt i afsnittet resultater). Placere fartøjet i midten af synsfeltet. Hvis der findes nogen passende fartøjer, overføre en anden alikvot af fartøjet homogenatet ind i optagelse salen pr. trin 2.1.
- Anker ene ende af fartøjet ved hjælp af fine pincet og en lille wolfram wire slip (75 µm diameter og ~ 2-4 mm i længden) placeret over fartøjet (Se figur 1 c(i)). At gøre dette hold wiren i pincet og finde pincet ovenfor optagelse kammer.
- Identificere den tilsvarende skyggen af pincet under mikroskop, lavere pincet ind i badet, indtil wiren bliver synlige. Placer ledningen over fartøjet ca 200 µm fra den åbne ende og slip wire vinkelret på længdeaksen på fartøjet.
Bemærk: Vægten af wolfram tråd er tilstrækkelig til at occlude fartøjet distalt stoppe strømmen af luminale indhold under cannulation og opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet.
- Identificere den tilsvarende skyggen af pincet under mikroskop, lavere pincet ind i badet, indtil wiren bliver synlige. Placer ledningen over fartøjet ca 200 µm fra den åbne ende og slip wire vinkelret på længdeaksen på fartøjet.
- Flytte arteriole til en passende position inden for optagelse kammer, sådan at det ligger vandret over badet med den åbne ende i overensstemmelse med opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet kanyle (Se figur 1 c(ii-iv)). Gør dette ved forsigtigt skubbe den occluding wolfram wire slip med et ekstra afsnit af wire afholdt inden for pincet; Berør ikke arteriole, som det vil uigenkaldeligt overholde pincet.
- Om nødvendigt (for lange arteriole segmenter), tilføje yderligere wolfram wire glider over fartøjet, således at afstanden mellem fartøjets tilstoppet og åbne ender er ikke mere end 200 µm; Dette medvirker til at forhindre arteriole bevæger sig ud af synsfeltet på opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet. Hvis fartøjet har nogen sidegrene, skal disse også tilstoppet med yderligere wolfram wire underkjoler. Hvis en side gren kan blive tilstoppet kassere fartøjet.
- Perfuse i salen med 0Ca2 + Hanks ved 37 ° C fjerne uvedkommende retinale væv og varme bad til fysiologiske temperaturer.
Bemærk: En standard tyngdekraft fodret bad perfusion og in-line opvarmningsanlægget system kan bruges til dette formål (Se figur 1A). 0Ca2 + Hanks' bruges til at lette proceduren for cannulation, da fjernelse af eksterne Ca2 + sikrer, at arterioler forblive udspilede. - Fremstil opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet cannulas fra filamented borsilikatglas kapillærer (tip diameter ~ 3-10 µm afhængig af diameter på fartøjet at være kanylerede; mindre fartøjer kræver snævrere cannulas, se Tabel af materialer) ved hjælp af en mikroelektrode aftrækker og back-fyld med 0Ca2 + Hanks' løsning. Sikre skanken af kanylen er tilspidset forsigtigt mod spidsen for at lette cannulation.
- Montere kanyle i en pipette indehaveren er knyttet til en 10 mL sprøjte via en Y-stik og en 3-vejs hane; Dette bruges til at presse systemet, tryk registreres ved hjælp af et manometer, der er knyttet til den andre side-arm af Y-konnektoren (Se figur 1B).
Bemærk: 'Hjælper' pipette er forpligtet til at bistå med cannulation processen. Fremstil pipette fra en borsilikatglas kapillær trukket på en mikroelektrode aftrækker til en spids diameter på 0,5 - 2 µm. brand stærkt polsk pipette (ofte indtil lukket) ved hjælp af en microforge. - Omhyggeligt placere helper pipette vinkelret på den lange akse fartøjets tæt på den åbne ende ved hjælp af en 3-akse mekaniske manipulator (Se figur 1 d). Placer helper pipette, lige over skibet, men ikke røre den.
- Placer cannulation afpipetteres på den åbne ende af fartøjet (Se figur 1 d og 2A(i)) ved hjælp af en fin micromanipulator; Placer spidsen umiddelbart støder op til åbningen, som vurderes ved at justere planet for fokus på mikroskop (på 20 X). Når begge slutningen af fartøjet og kanyle tip er i fokus samtidig kanylen er korrekt placeret for cannulation (Se figur 2A(ii)).
- Rykke opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet kanyle ind i fartøjet blænden ved hjælp af x-aksen kontrol af den fine micromanipulator (Se figur 2A(iii)). Vurdere cannulation succes ved at flytte kanylen langs y-aksen. Hvis kanylen forbliver i fartøjet er det med held kanylerede (Se figur 2A(iv)). Hvis kanylen bevæger sig uden for fartøjet, er kanylen tilbøjelige til at være over fartøjet; Hvis så Gentag trin 2.10-2.11 med kanyle på et lavere plan i z-aksen.
- Efter vellykket cannulation Sænk forsigtigt helper pipette på fartøjet at tøjle arteriole. Guide arteriolære væggen over opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet kanyle med pipette helper på samme tid som cannulation pipette er avanceret længere ind i fartøjet lumen til en afstand af ca 30-50 µm (Se figur 2A(v, vi)).
Bemærk: Denne procedure kræver samtidige, kontrolleret bevægelse af både manipulatorer (helper pipette bevæger sig i retning af kanylen mens kanylen bevæger sig ind i fartøjet lumen) og vil kræve omfattende praksis at opnå en høj succesrate. - Ændre bad løsning til normal Hanks indeholdende 2 mM Ca2 + (Se tabel 1) ved 37 ° C. Dette medfører normalt en lille indsnævring af arteriole og dannelsen af en tæt forsegling omkring opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet kanyle. Helper pipette kan derefter flyttes væk fra fartøjet.
- Giver mulighed for en tæt forsegling til at udvikle i 15 min. Se fartøjet ved hjælp af et USB-kamera (og image erhvervelse software) knyttet til mikroskop og justere fokus til at maksimere kontrasten mellem fartøjet grænserne og de ydre og intraluminal rum (Se Figur 2B). Billede skib på 0,5 - 5 rammer/s.
- Efter 1 min af optagelse på 0 mmHg, øge intraluminal presset til det ønskede niveau ved at lukke 3-vejs vandhanen er knyttet til opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet kanyle (Se figur 1B) og anvende en lille mængde af overtryk på systemet via sprøjten. Observere trykket ændre på trykmåleren.
Bemærk: Pres kan tilføjes i en skridt klog mode op til 100 mmHg eller til én værdi for eksempel 40 mmHg (tilnærmelse af retinale arteriolære pres i vivo)23. Fartøjet skal hurtigt spile bekræfter vellykket cannulation. Bemærk venligst, pres-induceret vasokonstriktion (dvs, den myogenic svar) vil senere udvikle over en periode på 15 min, men på grund af den lille størrelse af disse fartøjer, dette kan ikke altid være visuelt kan påvises. - Nøje overvåge skibet under indledende opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet for åbenlyse utætheder. Kilder til lækagen kan stamme fra kløvet sidegrene eller utilstrækkelig tætning af kanylen til indersiden af arteriole.
- Watch for intraluminal indholdet forlader fartøjet. Mindre, mindre åbenlyse utætheder kan vise sig med tiden som et fald i trykket på trykmåleren. Hvis det er muligt, occlude åbningen med yderligere wolfram wire underkjoler pas på ikke for at forstyrre kanylen. Udelukke præparater med indlysende lækage fra yderligere analyse.
- Anvende stoffet af interesse abluminally til fartøj forud for eller efter 15 min opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet afhængig af mål for eksperimentet (den tidligere tillader effekter på udviklingen af den myogenic tone skal fastlægges, mens sidstnævnte giver mulighed for analyse af virkningerne steady-state myogenic tone). En typisk drug delivery system er afbilledet i figur 3A.
- Placer levering outlet vinkelret på del af skibet af interesse (som illustreret i figur 1 d) i en afstand ~ 500 µm fra fartøj af interesse at tage omsorg for, at forretningen er optimalt vinklet til fuldt superfuse område (Se Figur 3B). Sikre, at ændringer i perfusion ikke fysisk forstyrrer fartøjet.
- Efter afslutningen af et eksperiment, anvende en løsning af 0Ca2 + Hanks' indeholdende 10 µM wortmannin (myosin lys kæde kinase inhibitor) for at inddæmme spile fartøj for at bestemme den passive diameter.
Bemærk: Styrken af cannulation segl kan testes ved afslutningen af forsøget ved at hæve intraluminal presset til > 100 mmHg. Fleste fartøjer forbliver knyttet selv ved denne højtryk, der angiver en tæt forsegling. - Udføre offline analyse ved hjælp af edge detection til at spore ændringer i arteriolære diameter (Se Tabel af materialer for foreslåede software). Normalisere arteriole diameter til den passive diameter for sammenligning mellem fartøjer.
3. Ca2 + Imaging
Bemærk: Isolerede retinal arterioler er forberedt til konventionelle (microfluorimetry) og konfokal Ca2 + imaging som følger (ved hjælp af udstyr, der er beskrevet i Tabel af materialer).
- Forberede retinal homogeniseret i en 5 mL reagensglas, som beskrevet i afsnit 1. 1 mL af retinale homogenatet tilføje Fura - 2 AM (microfluormetric Ca2 + optagelse) eller Fluo - 4 AM (Konfokal Ca2 + imaging) for at give en endelig koncentration på 5 µM (beskyttelse mod lys); Dye indikatorer indlæse fortrinsvis i glatte muskelceller.
- Vedligeholde ved stuetemperatur i mørke for 2 h svippede siden af røret hver 15-20 min for at genopslæmmes den retinale væv. Derefter fortyndes homogenatet 1:4 med LCH løsning til at reducere yderligere farvestof lastning.
Bemærk: Fartøjer forbliver levedygtige for op til 6 h (når den opbevares ved 4 ° C og i mørket); men det anbefales, at eksperimenter er påbegyndt så snart som muligt at reducere virkningerne af opdelingen af farvestof i indre organeller eller ekstrusion af farvestoffet over tid. - Overføre 1-2 mL af retinale homogenatet til et glas-bund optagelse kammer (delvist fyldt med LCH) monteret på scenen i en inverteret mikroskop tilsluttet en Ca2 + microfluorimetry eller konfokalmikroskopi system.
- Anker arterioler vinkelret på strømmen på tværs af den optagelse kammer, med wolfram wire underkjoler (50 µm diameter, længde 2-4 mm) fordelt ~ 100-200 µm apart langs fartøjets længde (Se figur 3 c) ved hjælp af en lignende teknik til som beskrevet i trin 2.3.
- Perfuse bad med normal Ca2 + Hanks' løsning ved 37 ° C. Placer drug delivery outlet som afbilledet i figur 3 c og gælde fartøjer narkotika, som beskrevet i trin 2.17.
- For konventionelle Ca2 + imaging, belyse fartøj med 340/380 nm lys via en UV oliebestandighedsobjektet (f.eks. 100 X, NA 1.3) og indsamle udsendte fluorescens på 510 nm via en foton tælle photomultiplier tube (PMT).
- I slutningen af hvert eksperiment, måle baggrund fluorescens af quenching fartøj med en frihedsbevægelse-holdige løsning (Se tabel 1). Bruge baggrundskorrigeret fluorescens nøgletal (R-F340/F380) til analyse eller konvertere til intracellulære Ca2 + ([Ca2 +]jeg) ved hjælp af Rmin og Rmax målinger (se tabel 1, anvendt forud for dæmper 24) og Grynkiewicz ligningen25.
- For Konfokal Ca2 + imaging, ophidse Fluo-4 indlæst fartøjer på 488 nm og fange resulterende fluorescens emission på 490-535 nm i enten linje scan mode (xt) eller xyt scan modes (512 x 512 pixel; foreslåede pinhole 300 nm). Normalisere målinger til fluorescens indspillet i tiden t = 0s (F/F0). Vurdere eventuelle ændringer i [Ca2 +]jeg under drug ansøgninger eller opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet offline i specifikke områder af interesse (ROIs) ved hjælp af billede analyse software.
- Hvis det er nødvendigt, udføre Ca2 + imaging med pres blodkar.
Bemærk: De ovenstående beskrivelser er blevet optimeret til skubbes fartøjer; Det er dog muligt at kombinere Ca2 + imaging med pres blodkar som følger.- Isolere arterioler pr afsnit 1. Indlæse med Ca2 + indikator farvestoffer som pr trin 3.1-3.2. Overføre arterioler til optagelse kammer og kanyleres henhold til afsnit 2. Sørge for at begrænse eksponeringen for lys under montering procedure.
- Mål Ca2 + pr trin 3.5 eller 3,7 ovenfor. Presse fartøjet og gentage måling af Ca2 +. Samtidig måling af fartøjet diameter er afhængig af tilstanden af Ca2 + måling og udstyr, der anvendes.
Bemærk: For Konfokal Ca2 + måling kan det være nødvendigt at billedet separate områder før og efter opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet på grund af blegning af farvestoffet under lange eksponeringer lys.
4. Patch-Clamp Elektrofysiologi
Bemærk: Hele-celle og enkelt kanal optagelse er muligt fra enkelte arteriolære glatte muskelceller stadig indlejret i deres overordnede arterioler som følger (ved hjælp af udstyr, der er beskrevet i Tabel af materialer).
- Isolere og forankre retinal arterioler i optagelse kammeret som beskrevet i trin 1, 2,3 og 3.3. For patch-clamp optagelse fordelte wolfram wire glider er 200-800 µm apart langs skibet.
- Fjerne basal lamina omkring arteriole og elektrisk koble tilstødende glatte muskelceller og underliggende endotelceller før patch fastspænding. At gøre dette, superfuse skib med en Sekventiel serie af enzymet løsninger (tabel 1) ved 37 ° C i den nødvendige varighed.
Bemærk: Varigheden af enzymet eksponering er optimeret til rotte retinal arterioler (protease, ~ 8 min, collagenase, ~ 12 min) og afhænger af strømningshastigheden af drug delivery system (~ 1 mL/min. på vores set-up) og enhed aktiviteter af parti af enzymer anvendes. - Vurdere niveauet for fordøjelsen på visuel separation i endothelial og glat muskel lag under collagenase trin som vist i figur 4. Når adskillelse af cellelag er observeret (som vist i figur 4B), anvende DNAse jeg løsning (~ 4 min) derefter afslutte fordøjelsen ved udskiftning af Bad løsning med normal Ca2 + Hanks' løsning.
- Fjern eventuelle resterende tråde af basal lamina og/eller perifere neuropile ved omhyggeligt fejer de lukkede tips af fine pincet langs overfladen af fartøjet.
- Trække og polsk glas kapillærer (Table of Materials), fyld med pipette løsning (tabel 1) og placere sikkert i pipette indehaveren af patch-klemme headstage. Placer pipetten på en 45° vinkel i forhold til optagelse kammer og fremme det mod fartøjet ved hjælp af grove indstilling på en motoriseret micromanipulator.
- Vælg en glatte muskelceller fremspringende fra karvæggen og hvis overflade er fri for synligt snavs (Se figur 4B). Placer spidsen af patch pipette lodret over celle af interesse og sænke gradvist ved hjælp af den fine/langsom bevægelse af micromanipulator for at gøre kontakt med glatte muskelceller membran.
- Vurdere kontakt mellem celle og pipette visuelt fra celle bevægelse og en ændring i den pipette modstand måles ved hjælp af membran (sæl) testprotokol i erhvervelse software (5-10 mV negative skridt fra 0 mV, frekvensen 25 KHz; Se figur 5A(i)) .
- Når seal modstanden har øget 5-fold (fx, stiger fra 2 til 10 MΩ; Figur 5A (ii)) anvende undertryk forbigående på bagsiden af indehaveren pipette via en y-stik, 3-vejs hane, sprøjte og slanger knyttet til indehaveren af pipette (samlet i en lignende måde der anvendes i opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet af arterioler, se figur 1B).
- Gentag anvendelser af undertryk indtil en gigaseal (> 1 GΩ modstand, som det fremgår af membran test i erhvervelse software) er dannet (figur 5A(iii)). Bemærk, at denne proces kan tage 1-5 min. Hvis en gigaseal ikke form, vælge en anden celle til patch klemme ved hjælp af en frisk patch pipette.
- Anvende en bedrift potentielle til cellen via erhvervelse software som eksperimentet udføres (typisk 0,-40 eller-80 mV).
- Undersøgelse (på-celle) enkelt kanal aktivitet i den nuværende konfiguration. Alternativt, generere inside-out patches af hurtigt tilbagetrækningskraften patch pipette fra cellens overflade efter gigaseal dannelse.
- Som de frie ender af membranen kan re anneal under disse betingelser skal du fjerne pipetten fra bad via rapid lodret bevægelse af manipulator (grove indstilling). Hurtigt tilbage gennem menisk til at fjerne den reformerede membran forlader kun patch inde pipette tip.
- Slået erhvervelse software til 5 KHz sampling-frekvens og aktivere kontinuerlig optagelse måde at optage kanal aktivitet. Anvende spændinger ændringer, om nødvendigt via softwaren eller forstærkeren.
- Hvis det er nødvendigt, gælde narkotika fartøj/membran patch som beskrevet i trin 2.17.
- Hvis membran strækning er påkrævet, gælde bageste af pipette ved hjælp af sprøjten knyttet til et manometer via en 3-vejs hane og y-konnektoren undertryk.
- Analysere single channel-indspilninger for åben sandsynlighed og unitær konduktans efter standardprocedurer26.
- For hele cellen aktuelle optagelse pull og polsk pipetter ifølge Tabel af materialer, fylde med pipette løsning indeholdende amphotericin B (tilføje 3 mg af amphotericin B til 50 µL af DMSO; tilføje 3-6 µL af dette til 1 mL af hele-celle pipette løsning; sonikeres for at mix) og danne en forsegling pr. trin 4.6-4.9.
- På grund af amphotericin B er der ingen grund til at briste membran inden for pipette tip til at få hele cellen adgang. Overvåge adgang, som vil blive vundet gradvist, ved hjælp af forsøgsprotokollen membran i erhvervelse software (-20 mV skridt fra-40 mV, prøve frekvensen 25 KHz; Se figur 5B).
- Automatisk montering af kapacitiv transienter i nogle software giver real-time målinger af adgang modstand og celle kapacitans (alternativt den relative nedgang af transienter kan vurderes med det blotte øje). Når adgang modstand falder til < 15 MΩ, udføre serien modstand kompensationer (figur 5 c) ved hjælp af hele-celle parameter skiver (kapacitans og serie modstand) på forstærkeren.
- For at gøre dette, bruge automatiserede montering værdier til oprindeligt indstillet ringer (Se figur 5 c(ii)) så øge serie modstand kompensation skiven (både forudsigelse og korrektion hvis tilgængelige på forstærkeren) re justering hele cellen kompensationer samtidig reducere kapacitiv forbigående (Se figur 5 c(iii)).
- Pas på ikke at over kompensere (som vist i figur 5 c(iv)). Typisk, er det muligt at kompensere serie modstand med 75% i perforeret patch tilstand (kræver lag kompensation fastsættes til maksimalt).
- Hvis ingen automatiseret montering er tilgængelig, start ved hjælp af indstillingen hele-celle parametre ringer til 15 pF og 15 MΩ (typiske værdier for disse celler) og derefter justere for at producere output som vist i figur 5 c(ii). Øge serie modstand kompensation dial ~ 75% og justere de hele-celle parametre ringer som figur 5 c(iii).
- Bemærk celle kapacitans måling enten fra de indledende automatiseret montering eller fra ringe efter manuel kompensation før påbegyndelse eksperimenter.
Bemærk: Denne værdi bruges til at normalisere strømme til Cellestørrelse. Kompensation for serien modstand kan skal justeres under eksperimenter, som access kan fortsætte med at forbedre på grund af yderligere integration af amphotericin B i lappe. - Anvende medicin til fartøjer, som beskrevet i trin 2.17. Anvende spænding protokoller (trin eller ramper) pr eksperimentelle krav.
Bemærk: Typisk spænding trin protokoller, 0,1 - 1 s i varighed, der anvendes på bedriften potentialet i 10-20 mV forøges hver 5-10 s til at producere en familie af spænding-aktiveret strømninger. Alternativt bruge rampe protokoller til at måle strøm ved en række spændinger i en 'oprydning' af ramping spænding langsomt (100-200 mV/s) fra fx -80 til +80 mV (anvendes hver 5-10 s) med offline prøvetagning af nuværende 10 mV mellemrum under rampen. - Det er muligt at kombinere Ca2 + imaging med patch-klemme optagelse som følger. Isolere arterioler pr afsnit 1. Indlæse med Ca2 + indikator farvestoffer som pr trin 3.1-3.2. Mount i optagelse salen ifølge afsnit 4. Sørge for at begrænse eksponeringen for lys under disse procedurer.
Bemærk: Indtil det har ikke været muligt at kombinere patch-klemme med pres blodkar undersøgelser på grund af tabet af basalmembranen og fartøjets integritet under den enzymatiske dissociation proces
Representative Results
Figur 6A viser en skematisk tegning af rotte retinal vaskulær træ. Diameter intervaller af første orden (30-45 µm), anden orden (20-30 µm) og pre kapillær arterioler (8-20 µm) er blevet bekræftet eksperimentelt i vores laboratorium ved Konfokal billeddannelse af rotte retinal hele-mount præparater immunohistochemically mærket til α-glat muskel aktin (fig. 6B). Ved dissociation af nethinden, kan primære, sekundære og pre kapillær arterioler identificeres baseret på deres kaliber og ordning af de vaskulære glatte muskelceller. De første og anden orden arterioler vises visuelt lignende under-lysfelt mikroskopi, men kan skelnes på grundlag af deres størrelse (figur 6 c). De pre-kapillær arterioler er de mindste arteriel fartøjer i forberedelsen og er let genkendeligt på grund af deres sparsommere arrangement af vaskulære glatte muskelfibre. De isolerede arterioler kan skelnes klart fra kapillærer og venules inden for isolering. Kapillærer er tilsyneladende som en meshwork af lille kaliber (4-10 µm i diameter) fartøjer, mens venules er tynde vægge og mangler glat muskel celle dækning (figur 6 c). Primære, sekundære og pre kapillær arterioler egner sig til pres blodkar, Ca2 + imaging og patch-clamp undersøgelser.
Figur 7 viser et pres blodkar eksperiment, hvor en primær rotte retinal arteriole har været kanylerede og intraluminal trykket hæves til 40 mmHg. Arteriole derefter vedligeholdes på dette pres for at tillade for udvikling af myogenic tone før tilsætning af 0Ca2 + Hanks' indeholdende 10 µM wortmannin at få den passive diameter af fartøjet. Figur 7A viser mikrofotografier af arteriole på forskellige tidspunkter i løbet af eksperimentet. En fuld tid-kursus post viser ændringerne i fartøjet diameter tidens har været afbildet i figur 7B ved hjælp af custom made kant-afsløring software27. Straks efter opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet fartøjet dilaterer, som efterfølges af en aktiv myogenic konstriktion, der når et steady state niveau efter 15 min. tilsætning af 0Ca2 + Hanks'/ wortmannin løsning dilaterer skibet tilbage til et niveau svarende til observeret umiddelbart efter det indledende pres skridt. Som beskrevet ovenfor, kan lægemidler anvendes på skibe før eller følgende opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet at efterforske de mekanismer, der ligger til grund for udvikling og vedligeholdelse af myogenic tone i disse fartøjer. Brug denne fremgangsmåde, vi har tidligere vist at stræk-aktiveret forbigående Receptor potentielle Vanilloid 2 (TRPV2) kanaler og L - og T-type spænding-gated Ca2 + kanaler spiller en central rolle i at lette myogenic tone udvikling i første og anden Bestil rotte retinal arterioler20,21,22. Vi har også rapporteret, at stor-konduktans Ca2 + aktiveret kalium-kanaler (BK kanaler)19,28 Kv1-holdige spænding-gated K+ kanaler loven og at modsætte sig myogenic aktivitet i disse fartøjer, da tilsætning af specifikke hæmmere for hver af disse kanaler udløser vasokonstriktion (figur 7C).
Figur 8 viser eksempler på konventionelle og konfokal Ca2 + imaging i retinal arterioler forud for og efter eksponering for vasokonstriktor peptid, endothelin-1 (Et-1). I konventionelle fura-2-baserede optagelser (figur 8A), Et-1 (10 nM) frembringer et bifasisk stigning i [Ca2 +]jeg i retinal arteriolære glat muskel lag, bestående af en indledende forbigående komponent efterfulgt af en lavere vedvarende komponent. Vi har tidligere karakteriseret de forbigående og vedvarende komponenter som værende på grund af Ca2 + frigivelse fra det endoplasmatiske reticulum og Ca2 + tilstrømning fra det ekstracellulære rum, henholdsvis29. Fluo-4-baseret Konfokal Ca2 + imaging giver et mere detaljeret billede af virkningerne af Et-1 på cellulært niveau. I disse eksperimenter er det indlysende, at glat graded ændringer i globale [Ca2 +]jeg observeret i vores microfluorimetry undersøgelser resultatet fra Et-1 stimulerende aktivering af gentagne asynkrone [Ca2 +]jeg svingninger i de tilstødende retinal arteriolære glatte muskelceller langs karvæggen (fig. 8B, C; 30).
Figur 9 viser eksempler på single-channel og hele-celle patch klemme optagelser fra retinal arteriolære glatte muskelceller. Til dato har vi udført både på celle og inside-out enkelt kanal patch klemme optagelser22,28. Figur 9A, B for eksempel viser en på celle patch klemme optagelse forud for og følgende membran strækning (genereres ved at anvende undertryk patch pipette). Denne særlige patch indeholder to kanaler, som aktiveres ved mekanisk stræk. Vi har tidligere vist, at disse strømme kan hæmmes ved hjælp af TRPV2 kanal pore-blokerende antistoffer22. Den unitær konduktans af kanaler (249.71 pS) er også i overensstemmelse med disse strømninger at være medieret af TRPV231.
Hele-celle spænding-aktiveret strømninger kan være fremkaldt ved hjælp af spænding trin protokoller. Figur 9 c viser en familie af spænding-aktiverede A-type K+ strømninger registreres ved hjælp af en sådan fremgangsmåde. Disse strømninger bliver tydelig, når andre store strømninger til stede i disse celler (f.eks., BK og Ca+-aktiveret Cl- strømninger) er blokeret ved hjælp af særlige farmakologiske midler32,33. Strømme gennem ikke- eller svagt spænding-afhængige Ionkanaler typisk undersøges ved hjælp af spænding rampe protokoller. Vi har brugt sådanne protokoller til at identificere og karakterisere TRPV2 strømninger aktiveres af hypotonic stretch22 og kanal agonister (figur 9 d) i retinal arteriolære glatte muskelceller.
Figur 10 viser dobbelt pres blodkar og konfokal Ca2 + billeddannelse anvendes i en primær rotte retinal arteriole. Opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet udløser øget hyppighed af [Ca2 +]i svingninger i de enkelte glatte muskelceller ligner dem observeret med Et-1. Vi har tidligere vist, at disse svingninger der udløses ved summation af Ca2 + gnister (lokaliseret Ca2 + release begivenheder) og bidrage til generation af myogenic tone20.
Figur 1 . Eksperimentel opsætning for pres blodkar i rotte retinal arterioler. A) eksperimentelle udstyr herunder inverterede mikroskop, i linje varmelegeme til bad perfusate, 3-akse mekaniske og mikro-manipulatorer, manometer, kanyle indehaveren og luft tabel. B) skematisk diagram viser den optimale arrangement af cannulating pipette og fartøj interesse for optagelse kammer. I dette diagram illustreres også de grundlæggende opsætning af opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet udstyr. C) skematisk diagram vist forankring og flytte fartøjet ved hjælp af yderligere wolfram wire underkjoler holdt i fine pincet. (i) drop 1st slip til at occlude fartøj. (ii, iii) Bruge yderligere glider til at skubbe tilstoppe slip (retning angivet med pilen) og ledsager fartøjet i optimal orientering fremgår (iv). D) skematisk diagram viser optimal positionering af tilstoppe wolfram wire slip, helper pipette og kanyle i forhold til fartøjet, som arrangeret før cannulation. Outlet af drug delivery system er placeret i en afstand af ~ 500 µm fra fartøj til at reducere bevægelse artefakter under drug application. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Cannulation proces for pres blodkar. A) mikrofotografier viser en retinal arteriole forankret ned i optagelse salen før (i), under (ii)-(v) og følgende cannulation (vi). Blå pil angiver retningen for flytning af kanylen, mens den grønne pil angiver retningen for flytning af helper pipette. B) Photomicrograph viser optimal region for optagelse af myogenic aktivitet under opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet som fremhævet med rødt. Bemærk, justering af lys og fokus at øge kontrasten af fartøj vægge giver bedre sporing af fartøjer kanter for automatiseret analyse. Skalalinjen angiver 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Drug delivery. A) udstyr anvendt til medicinafgivelse viser løsning reservoirer tilsluttet en multi-kanal levering manifold kontrolleret af 3-vejs haner og knyttet til en 3-akse mekaniske manipulator. B) Diagram viser den optimale lodret positionering af drug delivery mangfoldige i forbindelse med optagelse kammer. C) Photomicrograph af et skib forankret ned i optagelse salen viser den ideelle placering af drug delivery outlet. Skalalinjen repræsenterer 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Enzymatisk nedbrydning af retinale arterioler for patch klemme optagelse. Lys micrographs af en retinal arteriole før (A) og efter (B) Enzymatisk nedbrydning. Bemærk den fysiske adskillelse (angivet med pile) af de glatte muskelceller (SMCs) fra de underliggende endotelceller (ECs). Glatte muskelceller egnet til patch fastspænding er angivet med en asterisk. Skalalinjen repræsenterer 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Enkelt kanal og hele cellen patch klemme optagelse. A) Illustration af test strømme observeret under den 'forsegle test' protokol når: (i) patch pipette træder eksterne badning medium, (ii) afpipetteres tip kommer i kontakt med vaskulære glatte muskelceller celle plasma membran og (iii) suge er anvendes til bagsiden af pipette til aktiverer gigaseal dannelse. Efter pipette kapacitans kompensation ved hjælp af patch klemme forstærker, enkelt kanal strøm kan nu registreres i konfigurationen af på celle eller en patch af membranen kan være skåret ud af hurtigt trække pipette for at oprette en 'indefra og ud' patch. B) nuværende ændringer forbundet med udvikling af elektriske adgang til kraterets celle under anvendelse af amphotericin B hele-celle perforeret patch klemme teknik (i): (ii) som amphotericin B partitioner i membranen, adgang til modstand falls og kapacitans transienter fremkaldte under hyperpolarizing spænding trin (fra-40 til -60 mV) blive større; (iii) når adgang modstand (Ren) er faldet til < 15 MΩ, som normalt tager 5-10 min. efter gigaseal dannelse, er eksperimenteren muligt. C) forudgående til hele-celle optagelse, adgang modstand og celle kapacitans skal udlignes ved hjælp af de relevante skiver på patch klemme forstærker. Værdier af adgang modstand og celle kapacitans af automatiserede funktioner inden for patch-clamp software kan bruges til at hjælpe guide denne proces: (i) viser kapacitansen forbigående inden erstatningen tages fra det fremhævede område i B(iii); (ii) viser en reduktion i kapacitansen forbigående normalt observeret Hvornår adgang modstand og kapacitans er kompenseret; (iii) serie modstand kompensation skal derefter rettes op til 75% og adgang modstand og kapacitans kompensationer finjusteres, så den resulterende forbigående bør være relativt lige i amplitude ovenfor og nedenfor plateau niveauet af aktuelle under skridt. (iv) pleje bør træffes for at sikre, at adgang modstanden ikke er over kompenseres (angivet ved tilstedeværelsen af 'ringen' af forbigående), der kan opstå nogle gange, hvis adgang fortsætter med at forbedre i løbet af eksperimentet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Identifikation af isolerede rotte retinal arterioler. A) Illustration viser arrangement af rotte retinal mikrovaskulære træet. B) Konfokal billeder af rotte retinal arterioler og venules inden for flad mount præparater farvet for αSMA (røde kerner farves blå; skala søjler repræsenterer 50 µm). C) lys micrographs af isolerede 1 °, 2 ° og pre kapillær arterioler, kapillær netværk og venule (skala søjler repræsenterer 10 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 . Arteriolære pres blodkar optagelser. A) billeder af en kanylerede retinal arteriole viser (i) hvilende diameter (cirka 35,6 µm), (ii) dilatation ved opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet, (iii) udvikling af myogenic vasokonstriktion og (iv) dilatation som følge af tilsætning af 10 µM wortmannin i 0Ca2 + Hanks' løsning. Skala bar repræsenterer 10 µm. B) tid kursus plot af fartøjet diameter for fuld forsøget vist i A (stikprøven på 2,5 rammer/s). C) Diameter spore fra en anden arteriole under steady-state myogenic tone (diameter 38,7 µm) viser virkningerne af Kv1 kanal hæmmer correolide (10 µM) og BK kanal hæmmer iberiotoxin (100 nM) (stikprøven på 0,5 rammer/s). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 . Virkningerne af Et-1 på [Ca2 +] jeg signalering aktivitet i rotte retinal arterioler. A) konventionelle fura-2-baserede optagelse viser virkningerne af Et-1 (10nM) på globale [Ca2 +]jeg. Basal [Ca2 +]jeg var 82 nM i dette 1 ° arteriole. B) Fluo-4-baseret Konfokal xt billeder viser virkningerne af Et-1 på [Ca2 +]jeg på cellulært niveau. C) Plot af normaliserede fluorescens intensitet (F/F0) målt i celler som markeret i B. Dette tal er blevet ændret fra Tumelty et al. 30 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 . Enkelt kanal og hele-celle patch-klemme optagelser fra rotte retinal arteriolære glatte muskelceller. A, B) på celle single channel-optagelser fra den samme membran patch før (A) og under (B) anvendelse af undertryk (-45 mmHg) hen til lappe afpipetteres. To kanaler er til stede i patch (unitær nuværende 12.81 pA; unitær konduktans 249.71 pS) som viser en betydelig stigning i aktivering stretch betingelser. Udvalgte områder fra de øverste paneler (i) er vist på en hurtigere tid base i lavere paneler (ii). C) familie af A-type K+ kanal strøm (i) registreres i hele cellen tilstand i overværelse af hæmmere af BK og Ca2 +-aktiveret Cl- kanal hæmmere, fremkaldte i respons til 20 mV spænding trin intervaller mellem-80 mV til +80 mV (ii). D) hele cellen strøm (i) fremkaldt af spænding ramper mellem-80 mV og +80 mV før (sort streg) og under (rød linje) anvendelse af TRPV2 kanal agonist delta-9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC). Den spænding rampe protokol bruges er vist i det nederste panel (ii). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10 . Ca2 + Konfokal imaging forud for og efter opretholdelse af en rotte retinal arteriole tryk i hovedbrandledningssystemet. Skubbes repræsentative Konfokal xt scanninger (i) af retinale arteriolære glat muskelceller under (A) og (B) Tryk betingelser opnået fra forskellige regioner i det samme fartøj. (ii) ændringer i normaliseret fluorescens (F/F0) registreres i individuelle celler a - e, som anført i (i), plottes i tid. Stjerner angiver individuelle subcellulært Ca2 + gnister som stige i hyppighed efter opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet og summere til at udløse cellulære Ca2 + svingninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Sammensatte (mM) | Lave Ca2 + Hanks' | 0Ca2 + Hanks' | Normal Hanks' | Isoleret enzym Protease | Isoleret enzym Collagenase | Isoleret enzym DNAse | Dæmpning løsning | Rmin løsning | Rmax løsning | Celle vedlagte ekstracellulære løsning | Celle vedlagte pipette løsning | Hele-celle ekstracellulære løsning | Hele-celle pipette løsning |
| Vand renhed (modstand) | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥18 MΩ.cm | ≥15 MΩ.cm | ≥18 MΩ.cm |
| NaCl | 140 | 140 | 140 | 140 | 140 | 140 | 140 | 140 | 140 | 140 | |||
| kCl | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 138 | ||
| D-glukose | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| MgCl2 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1.3 | 1 |
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| CaCl2 | 0,1 | 2 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 10 | 2 | 2 | 2 | 0,2 | |||
| EGTA | 4 | 0,5 | |||||||||||
| Frihedsbevægelse | 10 | ||||||||||||
| Ionomycin | 0,01 | ||||||||||||
| KOH | 140 | 130 | |||||||||||
| D-gluconsyre | 130 | 130 | |||||||||||
| NaOH | 10 | ||||||||||||
| Penitrem Andersen | 0,0001 | 0,0001 | 0,0001 | ||||||||||
| 4-aminopyridine | 10 | ||||||||||||
| Nimodipin | 0,01 | 0,01 | |||||||||||
| Fluoxetin | 0,1 | ||||||||||||
| 9-anthracenecarboxylic syre | 1 | ||||||||||||
| Amphotericin B | 300-600 μg mL-1 | ||||||||||||
| Protease Type XIV | ~0.01% (0,4-0,6 mg/40 mL) | ||||||||||||
| Collagenase Type 1A | 0,1% (6 mg/60 mL) | ||||||||||||
| DNAse jeg | 20 KU (20 μL af 1 MU/mL bestand i 20 mL) | ||||||||||||
| pH | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.2 |
| titreres med | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | Tris | Tris | NaOH | KOH |
Bord 1. Sammensætning af løsninger anvendes i forsøg herunder eksempler på eksterne og pipette løsninger anvendes til enkelt kanal (TRPV2) og hele cellen (A-Type) strømninger.
Discussion
De protokoller, der er beskrevet ovenfor kræver praksis men bør opnås med minimal fejlfinding. På en gennemsnitlig dag ville vi få 6-8 brugbar arterioler fra isolation og opnå 3-4 vellykkede eksperimenter. Hvis der opstår problemer, men er der nogle skridt, der kan træffes for at forbedre succesrate. Lejlighedsvis har vi fundet, især når du bruger yngre rotter (< 8 uger), at udbyttet af arterioler kan være lav. For at omgå dette problem, vil vi foreslå, centrifugering den retinale væv (10-30 s 500 x g) mellem hver af ændring skridt i trin 1.12-1.14. Dette ofte bidrager til at forbedre udbyttet af fartøjer, men vil også øge mængden af celle debris inden for udarbejdelsen.
Når cannulating fartøjer til pres blodkar undersøgelser er det vigtigt at kontrollere arterioler nøje for eventuelle sidegrene, der kan have været kløvet tæt på webstedet tvedeling. Dette repræsenterer en almindelig årsag til lækage og tab af pres under eksperimenter. Det vigtigste spørgsmål, der kan opstå med [Ca2 +]jeg protokollerne er niveauet af farvestof lastning. Dårlig farvestof lastning fører til lavt signal til støj forhold, mens overbelastning resulterer i afbrydelse af normale Ca2 + homøostase. For at reducere sandsynligheden for, at nogen af disse forhold, en lille alikvot af retinale homogenatet kan fjernes, og isolerede fartøjer kontrolleres regelmæssigt under lastning protokol. Når virksomheden patch-clamp eksperimenter, succesraten for gigaseal dannelse er meget afhængige af hvordan godt er basal lamina blevet fordøjet. Når i første omgang teste denne protokol eller ved hjælp af nye masser af enzymer kan det være nødvendigt at justere koncentration/varighed af enzymet fordøjelsen. Nøje overvågning adskillelse i endothelial og glatte muskulatur lag vil sikre tilstrækkelig fordøjelsen at fjerne nok basal laminal at få adgang. Omhyggelig overvågning er også nødvendig for at undgå overdreven fordøjelse, som kan manifestere sig som fartøjet begynder at snøre. Hvis dette sker, er de glatte muskelceller ofte alt for skrøbelig til patch klemme optagelse. Når du anvender enzymer, det er vigtigt at medtage DNAse jeg at sikre fjernelse af dele af DNA befriet fra beskadigede celler under isolering proces. DNA fragmenter er klæbrig og forårsage pincet til at overholde arteriole under de sidste faser af den rengøringsproces (trin 4.4), hvilket ofte resulterer i fartøjet tab. Rengøring af fartøjer er teknisk vanskeligt og udføres bedst ved høj forstørrelse (20 X) med blid fejende bevægelser af lukkede pincet med det fineste muligt tip diameter. Mellem fejer roll ren pincet med lab.
Som understreget tidligere var en vigtig motivation bag udviklingen af de protokoller, der er skitseret i dette håndskrift til bedre at forstå hvorfor blodtilførslen afbrydes under retinale Vaskulære sygdomme. De fleste af vores arbejde til dato har fokuseret på diabetisk øje sygdom28,33. Arterioler kan isoleres fra nethinder af eksperimentelle gnavere modeller af diabetes ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i afsnit 1. Når eksperimentere på isolerede retinal arterioler fra diabetisk dyr, er det vigtigt at forsøge at nøje efterligne hyperglykæmisk betingelser opleves af fartøjer i vivo. Derfor ville vi normalt hæve D-glucose niveauer i vores isolation og eksperimenterende løsninger til 25 mM. Fortykkelse af vaskulære kælderen membraner er et velkendt fænomen i retinal fartøjer under diabetes34,35. Når du bruger dyr med langvarig diabetes (> 1 måneder sygdom varighed), er øget enzym koncentrationer eller fordøjelsen gange ofte nødvendig hen til muliggøre anvendelse af patch-clamp optagelse metoder.
En vigtig begrænsning af brug af ex vivo isoleret retinal arterioler at studere retinal vaskulær fysiologi og patofysiologi er tabet af de omkringliggende retinale neuropile. Selv om fjernelse af de retinale neuronal og glial celler giver nem adgang til de retinale vaskulære glatte muskelceller for celle fysiologi undersøgelser, kan svar af fartøjer til vasoaktive mediatorer ændre sig dramatisk i fravær og tilstedeværelsen af retinal væv. Handlinger af adenosin-tri-phosphat (ATP), for eksempel, giver en god illustration af dette punkt. I isolerede rotte retinal arterioler, tilsætning af ATP udløser en robust konstriktion af fartøjer36, mens i tilstedeværelsen af et intakt neuropile, fartøjer spile37. Derfor, når det er muligt, vi normalt forsøger at validere hovedresultaterne fra vores isolerede arteriole præparater ved hjælp af ex vivo retinal hele-mounts og i vivo målinger af fartøjet diameter og blood flow16,37 . Af note, er nye metoder for nylig dukket op for at studere små arterioler og kapillærer i hele perfunderet svin nethinder ex vivo38,39. Sådanne præparater er tilbøjelige til at forbedre vores forståelse af hvordan den retinale neuropile regulerer retinal arteriolære og kapillær tone og hvordan ændringer i retinal Hæmodynamik modulere neuronal aktivitet i nethinden.
Selv om de procedurer, der er beskrevet i denne hvidbog er fokuseret på brugen af isolerede rotte retinal arterioler til forståelse arteriolære glat muskel celle fysiologi, vi er i øjeblikket at udvikle protokoller for at også aktiverer undersøgelse i endothelial cellefunktion i disse fartøjer. I indledende arbejde, har vi haft succes med modificerer den enzymatiske fordøjelsen af retinale arteriolære segmenter til udbytte levedygtige endotel celle rør, der er indstillet til Ca2 + imaging og patchclamp optagelse undersøgelser. Cannulation af de isolerede arterioler i begge ender, aktivering intraluminal leveringen af narkotika, kan i fremtiden også aktiver endotel-afhængig vasodepressivt svar skal undersøges i disse fartøjer.
Disclosures
Dr. Joanna Kur er nu ansat af Medtronic (Twin-Cities, Minnesota, USA), hendes nuværende arbejde ikke er i konflikt med der præsenteres her.
Acknowledgments
Udvikling af de protokoller, der er beskrevet i denne hvidbog blev støttet af tilskud fra de følgende finansielle organer: BBSRC (BB/I026359/1), kampen for synet (1429 og 1822), den Juvenile Diabetes Research Foundation (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04) British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) og MRC (MC_PC_15026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beakers | Fisherbrand | 15409083 | Or any equilavent product |
| Curved Scissors | Fisher Scientific | 50-109-3542 | Or any equilavent product |
| Disposable plastic pipette/ transfer | Sarstedt | 86.1174 | 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture |
| Dissecting microscope | Brunel Microscopes LTD | Or any equilavent product | |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #5 14095 | Any equivalent fine forceps |
| Pasteur pipette | Fisherbrand | 11546963 | Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip |
| Petri dish | Sigma-Aldrich | P7741 | Or any equilavent 10cm product |
| Pipette teat | Fisherbrand | 12426180 | Or any equilavent product |
| Purified water supply | Merek | Milli-Q Integral Water Purification System | Or any equilavent system |
| Round bottomed test tube | Fisherbrand | 14-958-10 B | 5 mL; any equilavent product |
| Seratted forceps | Fisher Scientific | 17-467-230 | Or any equilavent product |
| Single edge blades | Agar Scientific | T585 | Or any equilavent product |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | Or any pliable surface |
| Testtube rack | Fisherbrand Derlin | 10257963 | Or any equilavent product |
| Pressure myography | |||
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | x2 (or any equilavent product) |
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Analysis plugin | Myotraker | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 | Custom plugin for imageJ Freely available for download |
| Cannulation pipette glass | World Percision instruments | TW150F-4 | Or any equilavent product |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fluo-4-AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Forceps | World Precision Instruments | Dumont #7 14097 | Any equivalent fine forceps |
| Fura-2-AM | Thermo Fisher Scientific | F1221 | Make 1 mM stock in DMSO |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Helper pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Manometer | Riester | LF1459 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W558818 | 75μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Or any equilavent product |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Video capture software | Hypercam | version 2.28.01 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Patch clamping | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve) |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200a | Or any equilavent product |
| Analogue digital converter | Axon | Digidata 1440A | Or any equilavent product |
| Collagenase Type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 | 0.1mg/mL in LCH |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| DNAse I | Millipore | 260913 | Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) |
| Faraday cage | Custom made | Any equilavent commerical product | |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| Headstage | Molecular Devices | CV203BU | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclypse TE 300 | Or any equilavent product |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P97 | Or any equilavent product |
| Microforge + Olympus CX 31 microscope | Glassworks | Fine Point F-550 | Or any equilavent product |
| Micromanipulator | Sutter instruments | MP-285 | Or any equilavent product |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Patching software | Molecular Devices | Pclamp v10.2 | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Pipette holder | Molecular Devices | 1-HL-U | Or any equilavent product |
| Protease Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | 0.01mg/mL in LCH |
| Single channel pipette glass | World Percision instruments | IB150F-3 | Or any equilavent product |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| USB camera | Logitech | HD Pro Webcam C920 | Or any equilavent product |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| Whole cell pipette glass | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Or any equilavent product |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product |
| x40 lens | Nikon | 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 | Or any equilavent product |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Ca2+ imaging | |||
| 3-way taps | Cole-Parmer | UY-30600-02 | Or any equilavent product |
| 3-axis mechanical manipulator | Scientifica | LBM-7 | Or any equilavent product |
| Acquisition software | Cairn Research Ltd. | Acquisition Engine V1.1.5 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Air table | Technical Manufacturing Corporation | Clean Bench | Or any equilavent product |
| Analysis software for confocal imaging | Image J | https://downloads.imagej.net/fiji/ | Free imaging software |
| Computer | Dell | Optiplex 7010 | Or any equilavent product |
| Confocal microscope | Leica Geosystems | SP5 | Or any equilavent product; confocal |
| Digital Thermometer | RS | 206-3722 | Or any equilavent product |
| Fine forceps | Dumont | No. 7 | Any superfine forcep |
| Glass bottomed recording chamber | Warner Instruments | 64-0759 | Or any equilavent product |
| In-line heater | Custom made | Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Monochromator | Cairn Research Ltd. | Optoscan | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| Multi-channel delivery manifold | Automate Scientific | Perfusion Pencil | Or any equilavent product |
| Pipette filler | BD Plastipak | 1mL | Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette |
| Software for confocal microscope | Leica Geosystems | LAS-AF version 3.3. | Or any equilavent product; confocal |
| Suction pump | Interpet | AP1 | Converted aeration pump by reversing bellows |
| Syringe | BD Plastipak | 20mL Luer-lok | Or any equilavent product |
| Tungsten wire | Advent | W557418 | 50μm diameter |
| Tygon Tubing | VWR | miscellaneous sizes | Any equilavent product to fit |
| Water bath | Grant | Sub Aqua 12 Plus | Or any equilavent product |
| x100 lens | Nikon | x100 N.A. 1.3 oil | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Nikon | 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x20 lens | Leica Geosystems | HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D | Or any equilavent product; confocal |
| x4 lens | Nikon | 4x/0.10, WD 30, ∞/- | Or any equilavent product; microfluorimetry |
| x63 lens | Leica Geosystems | HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/E | Or any equilavent product; confocal |
| Y-connectors | World Percision Instruments | 14012 | Or any equilavent product |
| Pipettes | Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation | ||
| Helper pipette | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >10 MΩ |
| Cannulation pipette | World Percision instruments | TW150F-4 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 290 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 58 Time: 150 No of cycles: 4 Tip diameter: 3-10 μm Polishing: no Final Resistance: <1 MΩ |
| On-cell patching | World Percision instruments | IB150F-3 | Inner diameter: 0.86 mm Ramp: 261 Pressure: 300 Heat: 280 Pull : 0 Velocity: 56 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 0.5-2 μm Polishing: yes Final Resistance: >5 MΩ |
| Whole-cell patching | Warner Instruments | GC150TF-7.5 | Inner diameter: 1.17 mm Ramp: 296 Pressure: 200 Heat: 287 Pull : 0 Velocity: 50 Time: 250 No of cycles: 4 Tip diameter: 2-3 μm Polishing: helpful but not necessary Final Resistance: 1-2 MΩ |
References
- Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes. 44, 603-607 (1995).
- Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects. American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).
- Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis? Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).
- Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease). Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).
- Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- Delaey, C., Van de Voorde, J. Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation. Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).
- Metea, M. R., Newman, E. A. Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling. Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).
- Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).
- Shepro, D., Morel, N. M. Pericyte physiology. The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network. Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).
- Matsushita, K., Puro, D. G. Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes. Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).
- Needham, M., et al. The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).
- Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles. Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).
- Delaey, C., Van de Voord, J. Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).
- Kur, J., et al. Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).
- Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).
- Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).
- McGahon, M. K., et al. TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).
- Guidoboni, G., et al. Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).
- Scholfield, C. N., Curtis, T. M. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina. Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
- Sakmann, B., Neher, E. Single Channel Recording, Second Edition. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).
- Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis. PLoS One. 9, e91791 (2014).
- McGahon, M. K., et al. Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle. Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- Tumelty, J., et al. Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).
- Huynh, K. W., et al. Structural insight into the assembly of TRPV channels. Structure. 22 (2), 260-268 (2014).
- McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).
- McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes. Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).
- Ljubimov, A. V., et al. Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).
- Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).
- Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
- Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).
- Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level. Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).
- P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).
