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Biology

Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

Published: July 14, 2018 doi: 10.3791/57944
Automatic Translation
*1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4, *2
1Centre for Experimental Medicine, Queen's University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education), Queen's University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University of Belfast
* These authors contributed equally

Summary

本稿では、電気生理学的、カルシウム イメージングおよび圧力図法試験に使用することができますラット網膜の細動脈の隔離のための簡単なプロトコルについて説明します。

Abstract

網膜は、高い代謝活性の組織で実質的な血液供給を必要とします。網膜循環には、脈絡膜血管供給視細胞間内部の網膜がサポートしています。網膜の血流の変化、緑内障や網膜枝静脈閉塞糖尿病性網膜症を含む、多数の視力を脅かす障害に。網膜と眼疾患の中にどのようにこれらの変更を介して血流の調節に関わる分子機構の解明は、これらの条件の処置のための新しいターゲットの同定に 。網膜の細動脈は網膜の主要な抵抗血管であり、その結果、内腔の直径の変化を通じて網膜循環動態の調節に重要な役割を果たします。近年では、細胞生理学を含むアプリケーションの広い範囲のために適しているラット網膜の細動脈を分離する方法を開発しました。どのように血流が網膜内で制御して眼疾患中に発生する主な変更のいくつかを識別することができましたに新しい洞察力をもたらすこの準備が始まっています。この記事では、ラット網膜細動脈の隔離のための方法を説明およびパッチ ・ クランプ電気生理学、カルシウム イメージング、圧力図法の研究の使用のためのプロトコルが含まれます。これらの血管は PCR - 西部にしみが付くと免疫組織化学-ベースの研究での使用に適しています。

Introduction

網膜の血流を制御する方法を理解することは重要な目標、異常な血流は、視力にかかわる各種の病態に関与している網膜疾患1,2,3、 4。内側の網膜神経細胞とグリア細胞の供給, 網膜の循環、網膜動脈、網膜静脈そして静脈5に毛細血管を通って細動脈からの血液のすべてと終わり動脈提携しています。網膜の血流が網膜動脈および細動脈のトーンだけでなく、網膜毛細血管・後毛細血管細静脈6,7,の壁にある血管の収縮の活動によって調節されています。8. 網膜血管音の制御は複雑であり血液循環システムおよび循環分子とホルモン、血液ガスを含む周囲の網膜組織からの入力の範囲によって変調され、血管作動性物質から解放、網膜血管内皮細胞と macroglia9,10,11。裏地の縦配置内皮細胞12,13,と網膜の細動脈は、網膜の小さな動脈枝血管平滑筋細胞の単一の層で構成されています14です。 これらの血管網膜循環内血管抵抗のメインサイトを形成し、したがって網膜血流の局所制御に重要な役割を果たします。網膜の細動脈は、拡張または収縮血管平滑筋収縮力10,1516,の変化を介したその内腔の直径によって網膜の毛細血管の血流を調節します。どの網膜細動脈調節を通じて網膜血流したがって必要です準備細動脈の平滑筋細胞をアクセスしてできるだけ生理的に近い条件で勉強できる分子機構を理解します。

まだその機能と基になる血管内皮細胞と相互接続性を維持しつつ、孤立した網膜血管の前のヴィヴォ準備は血管平滑筋細胞へのアクセスを提供します。孤立した船舶を使用してほとんどの研究が大きなウシまたはブタ動脈血管 (60-150 μ m) に焦点を当てた。これらは、市販のワイヤーや血管平滑筋細胞収縮メカニズム17,18の薬理学的尋問を有効にする圧力第 1 報システムでマウントできます。このような準備大きく通常の条件下での網膜血管生理学の知識に貢献します。いくつかの研究は、その小さい直径として実験小動物から分離された網膜細動脈を使用している (〜 8-45 μ m) 慣習的な図法システム19,20,21,22での使用を防ぐことができます。ただし、実験小動物から船舶を使用してのなる重要な利点、遺伝的変更された遺伝子組換え、網膜疾患モデルの幅広い可用性です。実験小動物は介入研究生体内で適しています。

ここで隔離し、圧力図法実験用ラット網膜細動脈の cannulating のための簡単なプロトコルについて述べる。また、Ca2 +イメージング、電気生理学のプロトコルこれらの血管を使用して詳細します。これらはさらに血管平滑筋収縮、網膜の血流の調節に洞察力を提供することができます。

Protocol

ここで説明したすべての実験は、1986 年の英国動物 (科学的なプロシージャ) の行為に含まれているガイドラインに従って行われ、女王のベルファストの大学動物の福祉と倫理的な調査機関によって承認されました。

1. 網膜細動脈の分離

メモ: 次のプロトコルは、網膜細動脈を分離する使用されます。このメソッドは、ラット網膜細動脈の最適化されますが、マウスの網膜で使用することができます。ただし、船舶の収量は低くマウスを使用する場合です。

  1. 低 Ca2 +ハンクス (LCH) を含む表 1に示すように、ソリューションを構成します。
    注意: このソリューションが 4 ° C で最大 3 日間保存することができます (LCH を保存を使用するときことを確認それは部屋の温度にある pH が使用する前に正しい)。
  2. 網膜の急速なレーザーマイクロダイ セクションを確保するための組織のコレクションの前に次の機器を組み立てる: 曲線はさみ、解剖皿 (ペトリ皿をシリコン コーティング)、単一研がれた刃鉗子、鉗子 (鈍) 1 杯の 2 セットを鋸歯状パスツール ピペット(火がスムーズにない狭い先端にポリッシュ)、1 の使い捨てプラスチック ピペット (先端に開口部を増やすをオフにトリミング 〜 5-7 mm)、1 ガラス丸底テスト チューブ (5 mL) とホルダー。LCH のガラス ビーカーに約 50 mL をデカントし、廃棄物の流体をデカントする 2 番目のビーカーを準備します。
    注: は、仕様および製造元の詳細テーブルの材料を参照してください。
  3. Exsanguinate に続いて心臓穿刺 CO2を使用してラットを安楽死させる (と目の血管に損傷を与える可能性がありますこれらは頚部転位や脳震盪を避ける)。鋸歯鉗子でまぶたを撤回し、軌道の筋肉の周りと視神経をカットする曲線はさみを使用します。優しく世話をハサミで残り添付ファイルをカットする軌道から目を抽出します。
  4. (必要に応じて、目は LCH の溶液に氷の上も転送できる) 解剖皿の上の LCH ソリューションに没頭して目を配置します。軌道筋肉の添付ファイルまたは視神経を伝って料理に目を固定するのに 1 セットの鈍い鉗子を使用します。アンカー ポイントが目を安定させるために強膜にできるだけ近くあるを確認します。
  5. ブレードを使用すると、鋸状縁に沿って角膜を切って、鉗子で強膜の軽く、レンズを取り外します。
  6. 視神経乳頭を対称的に半分にアイカップをカットします。使用鉗子閉鎖優しく世話を視神経乳頭で残り添付ファイルを削除するアイカップの 2 つの半分から網膜を ' ブラシ'。2 番目の目とプロセスを繰り返すし、試験管を使用して LCH 媒体のプラスチック ピペットと小さな損失に切り裂かれた網膜を転送します。
  7. LCH と試験管を埋めるプラスチック製のピペットを使用して 〜 5 mL ができ、底に沈殿する網膜。
  8. 削除することにより約 3 倍の組織を洗って 〜 4 mL チューブとプラスチックのピペットを使用して新鮮な LCH の追加のソリューション。必要に応じて、靱帯、硝子や毛などの余分な組織を削除します。
  9. ガラス ピペットへのこだわりから、組織を防ぐために LCH のパスツール ピペット (洗練されたチップ) の内側を洗います。同じピペットを使用して、試験管から約 4 mL の溶液を取り外します。新鮮な LCH の約 2 mL を加えます。
  10. 優しく分離 (カップ刻んだ) ガラスの先端から組織を描画することによって網膜ゆっくりピペット、試験管の中に内容を排出します。注意してください、この段階で気泡を導入しないように。
  11. ステップは 1.10 を繰り返して、網膜が約 2 〜 3 mm2のサイズに分割されます。
  12. LCH の約 2 ml ピペットの内部を洗浄し、試験管の中にこれを追放します。5-10 分以上の底に沈殿する内容が許可します。
  13. 組織部分が約 1 mm2のサイズになるまで、もう少しの力で 1.10 1.12 で説明したように、製粉プロセスを繰り返します。もう一度、5-10 分のために解決する組織を許可します。
  14. 内容は完全に均質化し、網膜の部分が残っていないまで、3 分の 1 が時間より多くの力手順 1.10 1.12 (ソリューションでは外観が乳白色になる必要があります)。
    注: この方法が得られるまで 8 arteriolare セグメント (周囲の構造といくつかの枝は、そのまま残り比較的自由) 8-45 μ m 径と 200-2500 μ m の長さの測定の独立性あたり。
  15. 生理学的記録室に分離株の少量を転送または細胞内 Ca2 +濃度 ([Ca2 +]i; セクション 3 を参照) の測定用蛍光染料を追加します。目のカップや動物の廃棄物の取り扱いに関するローカル ルールに従って分離プロセス中に削除されたソリューションの残骸の処分します。
    メモ: 分離後すぐに船で実験することをお勧めですが、余剰の分離は 8 h まで 4 ° C で保存できます。

2. 細動脈圧図法

注: 動脈圧図法次のように図 1 a、 Bおよび材料の表に詳細な機器を使用して実行されます。

  1. 網膜血管ホモジネートの因数を転送 (1-2 mL のセクション 1 に従って分離) 生理学的記録室に (部分的に満ちて名目上 Ca2 +無料ハンクス液; 0Ca2 +ハンクスの表 1を参照) のステージ上にセット、倒立顕微鏡。実験の前に少なくとも 5 分記録室の下解決する船を残します。
  2. 視覚的に細動脈 > 200 μ m の長さと、容器を cannulated できるオープン エンドを所持を識別するために記録室全体スキャン (容器の種類の同定はさらに検討結果セクションで)。ビューのフィールドの中央に容器を置きます。適当な容器が存在しない場合は、手順 2.1 に従って記録室に磨砕液容器のもう一つの因数を転送します。
  3. 微細鉗子と小さなタングステン ワイヤのスリップを使用して容器の一方の端をアンカー (75 μ m 径と 〜 長さ 2-4 mm)、容器の上に配置 (図 1(i) を参照してください)。これを行う鉗子のワイヤーを保持し、記録室上鉗子を探します。
    1. ワイヤーが明らかになるまで風呂に鉗子を下げる、顕微鏡下で鉗子の対応するシャドウを識別します。開放端から船約 200 μ m のワイヤーを配置し、容器の長軸に垂直な線をドロップします。
      注: タングステン線の重量は遠位挿管および加圧中に内容の流れを停止する血管を閉塞するのに十分です。
  4. 加圧カニューレに沿ってオープン エンドとお風呂で水平になるように記録室内の適切な位置に、細動脈を移動 (図 1(ii 〜 iv) を参照してください)。優しく鉗子; 内で開催されたワイヤーの追加セクションで遮蔽タングステン ワイヤー スリップを微調整してください。鉗子に不可逆的準拠として、細動脈を触れないでください。
  5. 容器の閉塞と開放端の間の距離が以上 200 μ m になるよう (長い細動脈セグメント) のため必要に応じてを追加、船追加タングステン ワイヤー スリップこれは、加圧時の視野の外に移動する細動脈を防ぐのに役立ちます。船に任意の側枝がある場合これらも追加タングステン ワイヤー スリップを閉塞する必要があります.側枝を閉塞できない場合は、容器を破棄します。
  6. 0Ca2 +ハンクス余分な網膜組織を削除し、生理的温度にお風呂を暖かく 37 ° C でチャンバーを灌流します。
    注: 標準重力供給風呂灌流およびインライン ヒーター システムは、この目的に使用することができます (図 1A参照)。2 +により、外部の Ca の削除以来残っている細動脈を拡張、0Ca2 +ハンクスの穿刺の手順を容易にするために使われます。
  7. 作製 filamented ホウケイ酸ガラス管 (cannulated する容器の直径に応じて先端直径 3 〜 10 μ m; 小型船の狭いカニューレが必要;材料の表を参照してください) から加圧カニューレを使用して、電極の引き手および 0Ca2 +ハンクス液で埋め戻す。カニューレのシャンクは、カニュレーションを容易にするために先端に向かって優しくテーパを確認します。
  8. Y コネクタと 3 ウェイ タップ; を介して 10 mL 注射器、ピペット ホルダーにカニューレをマウントします。これを使用してシステムを加圧し、圧力を圧力計、他側アーム Y コネクタに接続されているを使用して記録されている (図 1B参照)。
    注: 'ヘルパー' ピペット穿刺プロセスを支援するために必要です。ホウケイ酸ガラス キャピラリー先端径 0.5 に電極の引き手を引いたからピペットを作製 - 2 μ m 大きく火災時のポーランド語使用、マイクロフォージ ピペット (多くの場合終了) まで。
  9. 慎重に移動してヘルパー ピペット容器の長軸に対して直角に近い 3 軸マニピュレーターを用いたオープン エンド (図 1を参照)。それは触れないではないが、船のすぐ上、ヘルパー ピペットを配置します。
  10. 容器の開口端カニュレーション ピペットの位置 (図 1および2 a(i) 参照) 微動マイクロマニピュレーター; を使用して(20 X) で顕微鏡の焦点の平面を調整することによって評価のように、先端開口部に隣接を置きます。カニュレーションのカニューレが正しく配置されて同時に容器とカニューレ先端末がフォーカスされているとき (図 2 a(ii) を参照してください)。
  11. 微動マイクロマニピュレーターの x 軸コントロールを使用して容器の開口部に加圧カニューレを進む (図 2 a(iii) を参照してください)。Y 軸に沿ってカニューレを移動することによってカテーテル留置の成功を評価します。カニューレが容器内に残っている場合、正常に ● キャニュレイテッド (図 2 a(iv) を参照) です。カニューレは船の上なりやすいカニューレは容器の外に移動する場合もしそうなら z 軸の下面にカニューレとステップ 2.10 2.11 を繰り返します。
  12. 成功カニュレーション時に、血管を抑制するため船にヘルパー ピペットをゆっくりと下ろします。細動脈の壁のガイド ヘルパー ピペットと加圧カニューレを介して同時にカニュレーション ピペットの先端に、さらに約 30-50 μ m の距離に血管内腔に (図 2 a(v, vi) を参照してください)。
    注: この手順必要があります両方のマニピュレーター (ヘルパー ピペット カニューレを血管内腔に移動しながらカニューレへの移動) の同時に制御された動きと高い成功率を達成するために広範な練習が必要です。
  13. 2 mM は Ca2 +を含む通常ハンクスにバス ソリューションを変更 (表 1参照) 37 ° C で通常これは、細動脈と加圧カニューレの周りタイトなシールの形成のわずかな縮小されます。ヘルパーのピペットは、船から移動できます。
  14. 15 分 USB カメラ (と画像集録ソフトウェア) を使用して船を顕微鏡と容器の境界、(を参照してください外部で管腔内のスペースの間のコントラストを最大限にフォーカスを調整するビューを開発するタイトなシールを許可します。図 2B)。0.5 - で船を画像 5 フレーム/秒。
  15. 加圧カニューレに接続されている 3 ウェイ タップを閉じることによって所望のレベルに内圧を増加 0 mmHg に記録の 1 分後 (図 1B参照) 注射器を介してシステムに肯定的な圧力の少量を適用します。圧力の圧力計の変動を観察します。
    メモ: 圧力を追加できます 100 mmHg までまたは 1 つの値のステップで賢明な方法で例えば 40 mmHg (生体内で網膜細動脈圧近似)23。容器は、カニュレーションの成功を確認する急速に広がるべきであります。注意してください、圧力誘起収縮 (すなわち、筋原性の応答)、その後 15 分の期間にわたって開発が、これらの血管のサイズが小さいためこれが常に視覚的に検出されません。
  16. 慎重に明白なリークの初期加圧中船を監視します。リークのソースは、細動脈の内側に劈開側枝やカニューレの不十分なシールから起きる可能性があります。
    1. 船を残して腔内容を監視します。小さくより少なく明らかな漏れは圧力計圧力の低下につれて明らかになる可能性があります。可能であれば、カニューレを邪魔しないように世話その他タングステン ワイヤー スリップと開口部が閉塞してしまったり。さらに分析から明らかな漏れ準備を除外します。
  17. 前に、容器または (前者、後者の効果の分析が可能に決定する筋音の発達に及ぼす影響実験の目的に応じて 15 分加圧、次に関心 abluminally の薬を適用します。定常状態の筋トーン)。典型的なドラッグデリバリー システムは、図 3 aの写真です。
    1. 距離で (図 1で示されている) として配信アウトレット関心の船の部分に垂直の位置 〜 500 μ m 確保に留意し関心の船から、コンセントが最適角度を完全に superfuse エリア (を参照してください図 3B)。血流の変化が物理的に船を邪魔しないでことを確認します。
  18. 実験が完了した後、パッシブの直径を決定するための容器を最大限に拡張する 10 μ M ワートマンニン (ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤) を含む 0Ca2 +ハンクスのソリューションを適用します。
    注: カニュレーション シールの強度テストされる実験の結論に内圧を上げることによって > 100 mmHg。船舶の大半もタイトなシールを示すこの高圧で接続されているままになります。
  19. エッジ検出を使用して細動脈径の変化を追跡するオフライン分析を行う (推奨するソフトウェアの材料表を参照してください)。容器間比較のため受動的な直径に細動脈径を正規化します。

3. Ca2 +イメージング

注: 孤立した網膜細動脈が従来 (microfluorimetry) の準備し、共焦点 Ca2 +イメージングとして (材料の表に詳細な機器を使用して) 次のましょう。

  1. セクション 1 で説明したよう、5 mL のガラス試験管に網膜のホモジネートを準備します。網膜の磨砕液の 1 mL に 5 μ M の最終的な集中を与える Fura 2 (microfluormetric Ca2 +記録) または蛍光-4 (共焦点 Ca2 +イメージング) を追加 (光から保護する);平滑筋細胞に色素インジケーターを優先的に読み込みます。
  2. 網膜組織を再停止する 15-20 毎分 2 h 管の側をフリック、暗所に室温で維持します。その後、染料のローディングを減らすために LCH ソリューションと磨砕液 1:4 希釈します。
    注: 血管まで 6 時間 (4 ° C で、暗闇の中に格納されている) 場合。 実行可能なままただし内部器官の色素の区分や時間の経過とともに色素の押出の影響を減らすために、できるだけ早く実験を開始をお勧めします。
  3. 1-2 mL の網膜の磨砕液をガラス底記録室 (LCH で満たされて) Ca2 + microfluorimetry または共焦点顕微鏡システムに接続されている倒立顕微鏡のステージ上にセットに転送します。
    1. 間隔タングステン ワイヤー スリップ (50 μ m 径、長さ 2-4 mm) を記録室に細動脈の流れの方向に垂直のアンカー 〜 100-200 μ m の容器の長さに沿って間隔 (図 3を参照) で説明した同様の手法を使用して2.3 をステップします。
  4. 37 ° C で通常 Ca2 +ハンクス液と一緒にお風呂を灌流します。図 3に示すよう薬配信アウトレットを置き、2.17 の手順で説明するように、薬を船舶に適用します。
  5. 従来 Ca2 +イメージング、油浸漬 UV 目的 (例えば100 X、NA 1.3) を介して 340/380 nm の光の容器を照らすし、510 で放出される蛍光の収集を介してフォトンカウンティング光電子増倍管 (PMT) nm。
  6. 各実験の最後に、焼入れ MnCl 含有溶液の容器によるバック グラウンド蛍光を測定 (表 1参照)。バック グラウンド補正蛍光比 (R-F340/F380) を使用して、分析や細胞内の Ca2 + ([Ca2 +]i) 使用する変換 R分と R最大測定 (表 1 参照;を焼入する前に適用24) と Grynkiewicz 式25。
  7. 共焦点 Ca2 +イメージング、励起蛍光 4 ロード船、488 nm 帯およびキャプチャ 490 535 nm 行のいずれかの結果として生じる蛍光排出量スキャン モード (xt) または xyt スキャン モード (512 x 512 ピクセル; 推奨ピンホール 300 nm)。正規化時間 t で記録された蛍光測定 = 0 (0F)。医薬品申請または加圧オフライン特定の地域で関心 (ROIs) の画像解析ソフトを使用中に [Ca2 +]iの変更を評価します。
  8. 必要な場合は、圧力図法による Ca2 +イメージングを実行します。
    注: 上記の説明は、非与圧部血管に最適化されていますしかし Ca2 +イメージング図法の圧力で次のように組み合わせることが可能です。
    1. セクション 1 に従って細動脈を分離します。3.1 3.2 の手順に従って Ca2 +インジケーター染料とともにロードします。記録室に細動脈を転送し、セクション 2 に従って cannulate。取付手順中にライトへの露出を制限するため注意してください。
    2. Ca2 + 3.5 または 3.7 上記手順に従って測定します。容器を加圧し、Ca2 +.の測定を繰り返す血管径の計測は Ca2 +測定器具使用のモードによって異なります。
      注: 共焦点 Ca2 +測定の必要があります光に長時間露光中に色素の漂白のため画像別々 の領域前後加圧します。

4. パッチ ・ クランプの電気生理

注: 個々 の細動脈平滑筋細胞の静止 (材料の表に詳細な機器を使用して) 次のように、親動脈に埋め込まれたから全細胞および単一チャネル記録が可能です。

  1. 切り分け、録音室で網膜細動脈のアンカー 1、2.3、および 3.3 の手順で説明するようします。パッチ ・ クランプ記録のスリップはタングステン線は血管に沿って 200 800 μ m 離れてを等間隔しました。
  2. 基底膜、血管の周囲を外し、電気に隣接する平滑筋細胞とパッチ前に基になる血管内皮細胞を切り離します。これを行うに superfuse 必須の持続期間のための 37 ° C で酵素液 (表 1) の一連の容器。
    注: 酵素露出の持続期間はラット網膜細動脈に最適です (プロテアーゼ、~ 8 分; コラゲナーゼ、~ 12 分) と薬物送達システム (私たちの設定 〜 1 mL/分) の流量と使用されている酵素のバッチのユニット活動に依存します。
  3. 消化の内皮の視覚分離のレベルを評価し、コラゲナーゼの中に平滑筋層は、図 4に示すようにステップします。(図 4 bに示すように)、細胞層の分離が見られる適用 DNAse 私ソリューション (~ 4 分) 入浴液の通常 Ca2 +ハンクスの差し替えにより消化を終了します。
  4. 慎重に容器の表面に沿って微細鉗子の閉じたヒントをスイープすることにより基底膜および/または末梢神経網の任意の残りの繊維を削除します。
  5. 引っ張るとガラス管 (資材表)、ピペット ソリューション (表 1) の塗りつぶしを磨くし、パッチ ・ クランプ パッチアンプ用アダプターのピペット ホルダーにしっかりと配置。記録室に関連して 45 ° の角度でピペットを置き、電動マイクロマニピュレーターを荒い設定を使用して船に向かって前進します。
  6. 血管壁から突き出ている平滑筋細胞を選択し、その表面は目に見える物から無料 (図 4 bを参照してください)。徐々 に、マイクロマニピュレーターの罰金/遅い動きを使用して興味のセル上パッチ ピペットの先端を垂直方向に位置を上下平滑筋膜との接触。
    1. 細胞と細胞運動と集録ソフトウェアの膜 (シール) テスト プロトコルを用いてピペット抵抗の変化から視覚的にピペットの接触を評価 (5-10 mV 負のステップ 0 から mV、周波数 25 KHz; を参照してください図 5 a(i)).
  7. シール抵抗が 5 倍に増加しているとき (例えば、 2 から 10 MΩ; に上昇図 5A(ii)) y コネクタ、3 ウェイ タップ、シリンジ、ピペット ホルダーに接続されているチューブを介してピペット ホルダーの裏側に一過性否定的な圧力を適用する。 (細動脈の加圧で用いられている同様の方法で組み立て、図 1 bを参照)。
  8. 負圧の応用を繰り返して、gigaseal (> 1 GΩ 抵抗; 集録ソフトウェアで膜テストによって示される) が (図 5 a(iii)) を形成しました。1-5 分かかることがありますに注意してください。フォームに、gigaseal が失敗した場合は、パッチク ランプ新鮮なパッチ ピペットを使用する別のセルを選択します。
  9. 行われている実験 (通常 0、-40 または-80 mV) に従って取得ソフトウェアを介した細胞に潜在的な保持を適用されます。
  10. 現在の構成の研究 (セル) 単一チャネル活動。また、gigaseal 形成後細胞表面からパッチ ピペットを急速に後退してインサイド アウト パッチを生成します。
    1. 膜の空いている端点することができますこれらの条件の下で再アニーリングとマニピュレーター (粗設定) の急速な上下運動で風呂からピペットを削除します。ピペット チップ内部のパッチのみを残して改良された膜を削除する半月板を介して急速に返します。
  11. サンプリング周波数を 5 KHz に集録ソフトウェアの設定、記録チャンネル活動に連続記録モードをアクティブにします。ソフトウェアまたはアンプ経由で必要な場合は、電圧変更を適用します。
  12. 必要であれば、2.17 の手順の説明に従って、薬を容器/膜パッチに適用します。
  13. 膜のストレッチが必要な場合、3 ウェイ タップや y コネクタを介して圧力計に接続されている注射器を用いたピペットの後方に負圧を適用されます。
  14. 開いている確率と標準手順26に従ってユニタリ コンダクタンスの単一チャンネル録音を分析します。
  15. 全体セル現在記録材料の表に従ってプルとポーランドのピペット、ピペット溶液アムホテリシン B と記入 (DMSO の 50 μ L にアムホテリシン B の 3 mg を追加、全細胞ピペット溶液 1 mL にこれの 3-6 μ L を追加; ミックスする超音波)4.6 4.9 の手順に従ってシールを形成します。
  16. アムホテリシン B の包含のため全体のセルへのアクセスを得るためにピペット チップ内膜を破壊する必要はありません。集録ソフトウェアにおける膜テスト プロトコルの使用を徐々 に得て、アクセスを監視 (-40 から-20 mV ステップ mV、サンプル周波数 25 KHz; を参照してください図 5 b)。
  17. いくつかのソフトウェアの容量の過渡現象の自動フィッティング アクセス抵抗 (またはトランジェントの相対的な衰退を目で評価する) セル キャパシタンスのリアルタイム測定値が得られます。アクセス抵抗 < 15 MΩ になると、一度シリーズ抵抗補償 (図 5) アンプの全体セル パラメーター ダイヤル (容量や直列抵抗) を使用してを実行します。
    1. これを行うには、自動当てはめ値を使用して (図 5(ii) 参照) ダイヤルの初期設定し、シリーズ抵抗補正ダイヤル (予測と補正アンプの使用可能な場合) を増やすセル全体補償を再調整静電容量の過渡を削減しながら (図 5(iii) を参照してください)。
    2. 世話を補償 (図 5(iv) に示すように) とします。通常、穿孔パッチ モード (最大設定するラグ補償が必要) で 75% の直列抵抗を補償することが可能です。
  18. 自動継手が使用できない場合は、全体セル パラメーター 15 pF と 15 mΩ (これらの細胞は典型的な値) にダイヤルし、図 5(ii) に示すように、出力を生成する調整の設定によって開始します。シリーズ抵抗の補正ダイヤルは 〜 75% を増加し、図 5(iii) に従って全体セル パラメーター ダイヤルを再調整。
  19. 実験を開始する前に手動補正後のセルの容量測定初期の自動フィッティングからまたはダイヤルからに注意してください。
    注: この値は、セル サイズに電流を正常化する使用されます。直列抵抗の補償は、アクセス可能性がありますさらにパッチにアムホテリシン B の定款により向上するのにつれ、実験中に調整する必要があります。
  20. 2.17 の手順で説明するように、薬を船舶に適用します。実験的要件に従って電圧プロトコル (手順またはランプ) を適用します。
    注: 標準電圧ステップ プロトコル、0.1 - 1 期間、開催から適用されます 10-20 mV の電位をインクリメント電圧アクティブ電流の家族を生成するすべての 5-10 s。またゆっくりと電圧を変化させることによって 1 つ '掃引' における電圧のシリーズで電流を測定するランプ プロトコルを使用 (100-200 mV/秒) から例えば+80 に-80 mV (すべて 5-10 s を適用) ランプの中に 10 mV 間隔で電流のサンプリングをオフラインで。
  21. パッチ ・ クランプ記録通りで Ca2 +イメージングを組み合わせることが可能です。セクション 1 に従って細動脈を分離します。3.1 3.2 の手順に従って Ca2 +インジケーター染料とともにロードします。セクション 4 に従って録音室でマウントします。これらの手順の中にライトへの露出を制限するため注意してください。
    注: これまでにされていない酵素分解過程中に基底膜と血管整合性の損失による圧力図法の研究とパッチ ・ クランプを組み合わせることが可能

Representative Results

図 6 aは、ラット網膜血管ツリーの図を示しています。当研究室で実験最初順序 (30-45 μ m)、二次 (20-30 μ m)、および前毛細血管細動脈 (8-20 μ m) の直径の範囲を確認されて標識ラット網膜のホール マウント標本における共焦点イメージングによるいますα-平滑筋アクチン (図 6 b)。網膜の解離時の口径と血管平滑筋細胞の配置による一次、二次と前毛細血管細動脈を識別できます。最初と 2 番目の順序細見えて明るいフィールド顕微鏡下で視覚的に類似のサイズ (図 6) に基づいて識別することができます。前毛細血管細動脈は準備で最小動脈、血管平滑筋線維のまばら整理のためわかりやすい。分離の細動脈は毛細血管や細静脈分離内から明確に区別できます。毛細血管は、小口径 (直径 4-10 μ m) 血管の網目静脈が薄い壁し、平滑筋セル範囲 (図 6) がないので明白です。プライマリ、セカンダリ、前毛細血管細動脈圧・ Ca2 +イメージングおよびパッチ ・ クランプの研究に適しています。

図 7は、初代ラット網膜細動脈は cannulated されて圧図法実験と内圧が 40 mmHg に発生を示しています。細動脈はこの圧力容器の受動的な直径を得るため 0Ca2 +ハンクスを含む 10 μ M ワートマンニン添加する前に筋トーンの開発のために維持されます。図 7Aは、実験の過程で、さまざまな時点で、細動脈の顕微鏡写真を示しています。時間の経過とともに血管径の変化を示すフルタイム コース レコードは、図 7Bカスタム作られたエッジ検出ソフトウェア27を使用で描かれています。加圧後すぐに血管を拡張させる、15 分 0Ca2 +ハンクスの添加後定常状態レベルに到達するアクティブな筋収縮が、続いている/ワートマンニン ソリューション レベルと同様に血管を拡張させるすぐに次の初期圧力ステップ観察。前述のように、薬は前に船や開発、これらの血管の筋緊張の維持のメカニズムを調査する次の加圧に適用可能性があります。このアプローチを使用して、我々 は以前に伸展活性化一過性受容体電位バニロイド 2 (TRPV2) チャンネル、L と T 型電位依存性 Ca2 +チャネルが最初に筋トーン開発を促進する上で中心的な役割を果たすこととラット網膜細20,21,22 を二次します。我々 はまた、大コンダクタンス Ca2 +活性化カリウム チャネル (BK チャネル)19,28と Kv1 含む電位依存性 K+チャンネル法における筋活動に反対する報告します。これらの血管は、以来、これらのチャネルのそれぞれの特異的阻害剤の追加トリガー血管収縮 (図 7)。

図 8は、前に網膜細動脈と血管収縮ペプチド、エンドセリン 1 (エ-1) への暴露後に従来および共焦点 Ca2 +イメージングの例を示します。従来 fura 2 ベース録音 (図 8 a) エ 1 (10 nM) 相性増加を引き出す [Ca2 +]私網膜細動脈平滑筋の層で、持続的な低い続いて初期過渡コンポーネントから成るコンポーネント。我々 は以前小胞体からの Ca2 +放出と細胞外空間、それぞれ29からの Ca2 +流入に起因すると非定常かつ持続的なコンポーネントを特徴とします。蛍光ベース 4 共焦点 Ca2 +イメージングは、エ-1 細胞レベルでの影響の詳細な画像を提供します。これらの実験では、グローバルな [Ca2 +]私ら 1 の反復的な非同期 [Ca2 +]私の活性化を刺激することから私たちの microfluorimetry 研究結果においての変化を滑らかに傾斜は明白です。(図 8 b, C;血管壁に沿って近隣の網膜細動脈平滑筋細胞における振動30)。

図 9は、シングル チャネルと細胞のパッチ クランプ録音網膜細動脈平滑筋細胞からの例を示しています。日には、両方のセルとインサイド アウトのシングル チャネル パッチ クランプの録音22,28を行った。図 9 a, B はたとえば、細胞のパッチク ランプ記録する前と次膜ストレッチ (パッチ ピペットに否定的な圧力を適用することによって生成) を示します。この特定の修正プログラムには、メカニカル ストレッチによって作動する 2 つのチャネルが含まれています。我々 は以前 TRPV2 チャネル細孔ブロッキング抗体22を使用してこれらの流れを禁じることができることを実証しました。チャンネル (249.71 pS) の単一のコンダクタンスがある TRPV231によって仲介されているこれらの流れと整合性も。

全セル電圧アクティブ電流は、電圧ステップ プロトコルを使用して誘発することができます。図 9は、このようなアプローチを使用して記録電圧作動した K A 型+電流のファミリーを示します。これらの流れが明らかになったときにこれらの細胞に存在する他の大電流 (例えばBK と Ca+-Cl-電流を活性化) 特定の薬理学的エージェント32,33を使用してブロックされます。非または弱の電圧依存したイオン チャネル電流は通常電圧ランプ プロトコルを使用して検討します。そのようなプロトコルを識別し、特徴付ける TRPV2 電流低張性ストレッチ22およびチャネル作動薬 (図 9) 網膜細動脈平滑筋細胞内で活性化使いました。

図 10では、図法の二重の圧力が示しています、共焦点 Ca2 +イメージングが初代ラット網膜細動脈に適用されます。エ 1 で加圧トリガー [Ca2 +]iと同様の個々 の平滑筋細胞における振動の頻度の増加が観察されます。私たちは以前これらの振動が Ca2 + (ローカライズされた Ca2 +リリース イベント) を火花、筋トーン20の世代に貢献の総和によって引き起こされることを示しています。

Figure 1
図 1.図法ラット網膜細動脈圧の実験のセットアップ。A) 実験装置の倒立顕微鏡、バスによる、3 軸機械とマイクロ マニピュレーター、圧力計、カニューレ ホルダー、空気テーブルの行でヒーターを含みます。B) 図 cannulating ピペットとレコーディング室で関心の船の最適配置を示します。この図は、与圧装置の基本的なセットアップを示しています。C) 模式図アンカーと微細鉗子にて追加タングステン ワイヤー スリップを使って船を移動するプロセス。(i) 血管を閉塞し 1stスリップをドロップします。(ii、iii)隠れスリップ (方向矢印によって示されます)、(iv) に示すように最適な向きに血管を伴うを微調整するのに追加の伝票を使用します。D) 図穿刺前に整理したように、タングステン ワイヤー スリップ、ヘルパー ピペットや容器に関連してカニューレを遮蔽の最適な位置を示します。ドラッグデリバリー システムの出口の距離に配置されます 〜 新薬承認申請中の動きの成果物を減らすために容器から 500 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.図法圧送プロセス。A) (次穿刺 (vi) ii)-(v) の間に (i) の前にレコーディング室で固定されて網膜細動脈の顕微鏡写真青い矢印はカニューレの動きの方向を示し、緑の矢印は、ヘルパー ピペットの動きの方向を示します。B) 顕微鏡写真は赤色でハイライトとして加圧中に筋活動の記録に最適な地域を示します。自動分析用容器エッジのトラッキング精度の向上により、光と血管壁のコントラストを上げるにフォーカスの調整に注意してください。スケール バーを示します 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.薬物送達します。A) 機器ドラッグデリバリー ソリューション タンク 3 ウェイ タップによって制御され、3 軸マニピュレーターに接続されているマルチ ・ チャネル配信マニホールドに接続されているを示すために使用します。B) 図薬物送達の最適な垂直位置マニホールド記録室に関連して。C) 薬配信アウトレットの理想的な位置を示す記録室で固定されて船の顕微鏡写真。スケール バーを表します 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4.パッチク ランプのため網膜細動脈の酵素消化を記録します。(A) 前に網膜細動脈の顕微鏡写真の光と (B) の酵素消化後。(ECs) 基になる血管内皮細胞から平滑筋細胞 (SMCs) の物理的な分離 (矢印によって示されます) に注意してください。パッチク ランプ向け適当な平滑筋細胞は、アスタリスクで示されます。スケール バーを表す 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5.シングル チャネルおよびセル全体パッチ ・ クランプ記録します。A) 図試験電流の観測 'テスト シール' プロトコルとき: 外部の入浴中に入る (i) パッチ ピペット、(ii)、ピペット チップが血管平滑筋細胞の膜と接触する、(iii) 吸引はgigaseal 形成を有効にピペットの背面に適用されます。ピペット容量補正パッチ クランプ アンプを使用して、次の単一チャネル電流は細胞の構成で今記録されるかもしれないまたは膜のパッチは急速に「インサイド アウト」パッチを作成するピペットを撤回することによって切除があります。B) アムホテリシン B の全細胞の中に細胞内部への電気の開発に関連付けられている現在の変更が穿孔パッチ クランプ技術 (i): (ii) として、膜にアムホテリシン B パーティションにアクセス抵抗の滝と過分極電圧ステップ中に誘発される容量の過渡現象 (-40 ~-60 から mV) のサイズが大きくなります。(iii) とアクセス抵抗 (Rを) < 15 MΩ は、gigaseal の形成の後 5-10 分かかります、下がっている実験が可能です。C) 前に全細胞記録、抵抗、セル容量は、パッチ クランプ アンプに関連するダイヤルを使用して補償する必要があります。パッチ ・ クランプのソフトウェア内で自動化された機能によって提供されるアクセス抵抗と電池容量の値は、このプロセスを導くために使用できます: B(iii); で強調表示された領域から取得した補償の前に一時的な容量を表示 (i)(ii) は、低減容量過渡通常観察時抵抗と静電容量を補償しました。(iii) シリーズ抵抗補償、75% とアクセス抵抗するを修正し、微調整その結果一時的な必要があります比較的容量補償等しい振幅の上と下の中に現在の高原レベルステップ。(iv) 注意が必要 ('' 非定常のリンギングの存在によって示される) をアクセス抵抗は以上補正されないように、時々 アクセスが実験の過程で改善を続けている場合に発生します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6.摘出ラット網膜細動脈の同定。A) 図ラット網膜血管ツリーの配列を示します。ΑSMA のステンド グラスB) ラット網膜細動脈と細静脈フラット マウント標本内の共焦点画像 (赤核が青色染色; スケールバーを表す 50 μ m)。C) 分離 1 °、2 °、前毛細血管細動脈、毛細血管、細静脈の光顕微鏡 (スケール バーは、10 μ m を表します)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7.細動脈圧図法録音。休憩直径 (約 35.6 μ m)、加圧時に拡張 (ii)、(iii) 筋収縮と (iv) 0Ca で 10 μ M のワートマンニンの添加による拡張の開発 (i) ● キャニュレイテッド網膜細動脈示すA) 画像2 +・ ハンクスのソリューション。スケール バー表します 10 μ m. B) における実験 (2.5 フレーム/秒でサンプリングされる) A に示すように血管径の時間コース プロット。C) 直径 Kv1 チャネル阻害剤 correolide (10 μ M) と BK チャネル阻害剤 iberiotoxin の効果を示す定常筋トーン (径 38.7 μ m) の下で異なる動脈からトレース (100 nM) (0.5 フレーム/秒でサンプリングされる)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 8
図 8.[Ca2 +] の Et 1 の効果私ラット網膜細動脈内のアクティビティを通知します。A) 従来 fura 2 ベース録音グローバル [Ca2 +]私のエ-1 (10 nm) の効果を示します。基底 [Ca2 +]私は 82 才だったこの 1 ° 細動脈の nM。B) 共焦点 xt の蛍光ベース 4 の画像は [Ca2 +]私細胞レベルでの Et 1 の効果を示します。B のマークの細胞単位正規化蛍光強度 (F0) C) プロットこの図は、Tumeltyらから変更されています。30権限を持つ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 9
図 9.シングル チャネルとラット網膜細動脈平滑筋細胞から細胞ホールセル記録。A、 B) 同じ膜から細胞の単一チャンネル録音 (A) 前にパッチし、パッチへの否定的な圧力 (-45 mmHg) の適用がピペット (B) 中。2 つのチャネルがあるパッチ (ユニタリ現在 12.81 pA; ユニタリ コンダクタンス 249.71 pS) 伸張条件下で活性化で大幅な増加を示します。上部パネルから選択された領域 (i) が低いパネル (ii) 基本速い時間に表示されます。A タイプ K+チャネル電流 (i) のC) 家族が BK と Ca2 +の阻害薬の存在下でセル全体モードで録音した-アクティブに Cl-チャネル阻害剤は、間-80 20 mV 電圧ステップ単位に応答を引き出した +80 mVmV (ii)。D) セル全体電流 (i)-80 間電圧ランプによって誘発される mV と +80 mV (黒線) の前に (赤い線) アプリケーション、TRPV2 チャネル アゴニスト デルタ-9-テトラヒドロカンナビノール (THC Δ9) の中に。使用電圧ランプ プロトコルは、(ii) の下のパネルに表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 10
図 10.前に Ca2 +共焦点イメージングとラット網膜細動脈の加圧を次します。(I) (A) の下で網膜細動脈平滑筋細胞の代表的な共焦点 xt スキャン非与圧部と (B) 加圧条件同じ容器の別の領域から得た。(ii) 変更正規化蛍光 (F0) で記録された個々 の細胞-e で、(i) に示された時間軸に対してプロットします。アスタリスクは、各細胞内 Ca2 +加圧後、周波数の増加と細胞 Ca2 +振動をトリガーする summate の火花を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

化合物 (mM) 低 Ca2 +ハンクス 0Ca2 +ハンクス 通常ハンクス 分離酵素プロテアーゼ 分離酵素コラゲナーゼ 分離酵素 DNAse ソリューションを消す 射程ソリューション Rmax ソリューション セル付細胞外の解決策 セル付ピペット ソリューション 全体細胞細胞外液 全細胞ピペット ソリューション
水の純度 (抵抗) ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm
塩化ナトリウム 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140
kCl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138
D-グルコース 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
MgCl2 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1
HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
CaCl2 0.1 2 0.1 0.1 0.1 10 2 2 2 0.2
グリコールエーテルジアミン四酢酸 4 0.5
MnCl 10
イオノマイシン 0.01
コ 140 130
D グルコン酸 130 130
水酸化ナトリウム 10
全 A 0.0001 0.0001 0.0001
4-アミノピリジン 10
発症 0.01 0.01
フルオキセチン 0.1
9-anthracenecarboxylic 酸 1
アムホテリシン B 300-600 μ g mL-1
プロテアーゼ タイプ XIV ~0.01% (0.4 〜 0.6 mg/40 mL)
1 a 型コラゲナーゼ 0.1% (6 mg/60 mL)
DNAse 私 20 区 (20 mL 入荷 1 MU/mL の 20 μ L)
pH 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.2
滴定 水酸化ナトリウム 水酸化ナトリウム 水酸化ナトリウム 水酸化ナトリウム 水酸化ナトリウム 水酸化ナトリウム 水酸化ナトリウム 水酸化ナトリウム 水酸化ナトリウム トリス トリス 水酸化ナトリウム コ

表 1.外部の例などの実験で使用される溶液の組成と電流 (a) 単一チャネル (TRPV2) と全セル用ピペット ソリューション。

Discussion

上記で説明したプロトコルは、練習は必要最小限のトラブルシューティングで達成する必要があります。平均日の分離から 6-8 使用可能な動脈を取得し、3-4 実験の成功を達成するため。問題が発生した場合ただし、成功率を向上させるために取ることができるいくつかの手順があります。時折我々 とき発見した、特に若いラット (< 8 週間)、細動脈の収量が低いことができます。この問題を回避するためには、1.12 1.14 の手順で手順、および trituration のそれぞれの間の網膜組織 (500 x g で 10-30 s) を遠心分離をお勧めします。これはしばしば船の収量を向上させるのに役立ちますが、準備内細胞の残骸の量も増えます。

Cannulating 圧力図法研究血管分岐サイト近くに切断されている可能性があります側枝のために慎重に細動脈を確認することが重要です。これは、実験中に漏れの一般的な原因と圧力損失を表します。[Ca2 +]私のプロトコルで発生する主な問題は、染料のローディングのレベルです。貧しい染料の読み込みは、通常 Ca2 +ホメオスタシスの中断の結果をオーバー ロードしながら低信号対雑音比につながります。これらの問題のいずれかの可能性を減らすためには、網膜のホモジネートの小さい因数を削除ことができますと孤立した血管を読み込みプロトコル中に定期的にチェックします。事業 - パッチク ランプ実験、gigaseal 形成の成功率も高い方法に依存するとき、基底膜が消化されました。とき最初このプロトコルをテストまたは新しい多くの酵素を使用して酵素の消化力の濃度/期間を調整する必要があります。十分な基底を削除するための十分な消化は、内皮細胞および平滑筋層の分離を注意深く監視アクセス亂。慎重な監視も、血管が収縮するにつれてマニフェストすることができます過剰消化は避けるべきです。このような場合は平滑筋細胞、パッチ ・ クランプ記録のためあまりにも壊れやすい。酵素を適用すると、DNAse を含めることが重要だから解放された DNA の繊維の除去を確実に私は分離プロセスの間に損傷した細胞。DNA のフラグメントはべたべたして洗浄工程 (ステップ 4.4) の最終段階で、血管に付着する鉗子を引き起こす多くの場合容器の損失の結果します。容器の洗浄は技術的に難しいと最高の可能な先端の直径の閉じ鉗子の穏やかな抜本的な動きと高倍率 (20 X) で実行される最も。スイープ、間きれいラボで鉗子をロールバックします。

ハイライトとして以前、本稿に記載されているプロトコルの開発の後ろの主な動機は網膜血管中の血流が中断される理由を理解するためだった。糖尿病性網膜症28,33日に我々 の仕事のほとんどが集中しています。細動脈はセクション 1 で説明した方法を使用して糖尿病の実験齧歯動物モデルの網膜から分離できます。糖尿病から網膜細動脈分離の実験、密接に生体内で血管が経験, 高血糖状態を複製しようとすることが重要です。このため、分離 25 mm 実験的ソリューションで D-グルコース レベルを通常我々 引き上げます。血管基底膜の肥厚は糖尿病34,35中に網膜血管のよく知られている現象です。動物を使用すると、長期にわたる糖尿病 (> 1 ヶ月病悩期間)、増加酵素濃度または消化時間はしばしばパッチ ・ クランプ記録方法のアプリケーションを有効にする必要です。

前のヴィヴォを使用しての重要な制限事項が網膜血管生理学を勉強する網膜細動脈を分離し、病態は周囲の網膜の構造の損失。不在そして網膜の存在の血管作動性メディエーターに対する血管の反応が劇的に変化することができます網膜のグリアと神経細胞の除去は、細胞生理学の網膜血管平滑筋細胞へ簡単にアクセス可能組織。アデノシン 3 リン酸 (ATP) のアクションは、たとえば、このポイントのよい例を提供します。分離ラットの網膜細動脈, ATP トリガーの追加船36の堅牢な収縮、そのまま構造の存在中に、血管を広げる37。したがって、可能な限り、我々 は通常ください網膜全体-マウント前のヴィヴォと血管径と血流16,37の生体内測定を使用して私たちの孤立した細動脈の準備から主要な調査結果を検証するには.注記のうち、新しい方法最近小細動脈と38,39体外灌流全体のブタ網膜の毛細血管を研究するため浮上しています。このような準備は、網膜の神経網が網膜の細動脈や毛細血管のトーンに調整して網膜された血流動態の変化が網膜神経細胞の活動を調節する方法の私達の理解を改善する可能性があります。

またにおける内皮細胞の機能の研究を有効にするプロトコルも行っているが、本稿で説明している手順を理解細動脈の平滑筋細胞生理学研究用ラット網膜細動脈を当てている、これらの血管。予備的な作業で Ca2 +イメージング、ホルモンアッセイ法について実習研究の記録に適している実行可能な血管内皮細胞の管をもたらす網膜細動脈セグメントの酵素消化を変更することに成功しました。腔内配薬を有効にする、両端に孤立した細動脈の穿刺は、将来的にこれらの血管で調査される有効にする内皮依存性血管拡張反応をまたできた。

Disclosures

博士ジョアンナ Kur メドトロニック (ツイン都市、ミネソタ州、米国) の従業員は、今、彼女の現在の仕事は競合しないとここで紹介します。

Acknowledgments

このペーパーで説明したプロトコルの開発は、次の資金の機関からの助成金によって支えられた: BBSRC (BB/I026359/1)、視力 (1429 と 1822)、若年性糖尿病研究財団 (2-2003-525)、Wellcome の信頼 (074648/Z/04) のための戦い英国心臓財団 (PG/11/94/29169)、HSC の R & D 部門 (STL/4748/13) と MRC (MC_PC_15026)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers Fisherbrand 15409083 Or any equilavent product
Curved Scissors Fisher Scientific 50-109-3542 Or any equilavent product
Disposable plastic pipette/ transfer Sarstedt 86.1174 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture
Dissecting microscope Brunel Microscopes LTD Or any equilavent product
Forceps World Precision Instruments Dumont #5 14095 Any equivalent fine forceps
Pasteur pipette Fisherbrand 11546963 Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip
Petri dish Sigma-Aldrich P7741 Or any equilavent 10cm product
Pipette teat Fisherbrand 12426180 Or any equilavent product
Purified water supply Merek Milli-Q Integral Water Purification System Or any equilavent system
Round bottomed test tube Fisherbrand 14-958-10 B 5 mL; any equilavent product
Seratted forceps Fisher Scientific 17-467-230 Or any equilavent product
Single edge blades Agar Scientific T585 Or any equilavent product
Sylgard Dow Corning 184 Or any pliable surface 
Testtube rack Fisherbrand Derlin 10257963 Or any equilavent product
Pressure myography
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  x2 (or any equilavent product)
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software  Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Analysis plugin Myotraker  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 Custom plugin for imageJ Freely available for download
Cannulation pipette glass World Percision instruments TW150F-4 Or any equilavent product
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fluo-4-AM Thermo Fisher Scientific F14201 Make 1 mM stock in DMSO
Forceps World Precision Instruments Dumont #7 14097 Any equivalent fine forceps
Fura-2-AM Thermo Fisher Scientific F1221 Make 1 mM stock in DMSO
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Helper pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Manometer Riester LF1459 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W558818 75μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Or any equilavent product
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Video capture software Hypercam version 2.28.01 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Patch clamping
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve)
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200a Or any equilavent product
Analogue digital converter Axon Digidata 1440A Or any equilavent product
Collagenase Type 1A Sigma-Aldrich C9891  0.1mg/mL in LCH
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
DNAse I Millipore 260913 Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) 
Faraday cage Custom made Any equilavent commerical product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Headstage Molecular Devices CV203BU Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Patching software Molecular Devices Pclamp v10.2 Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Protease Type XIV Sigma-Aldrich P5147  0.01mg/mL in LCH
Single channel pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
Whole cell pipette glass Warner Instruments GC150TF-7.5 Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
x40 lens Nikon 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Ca2+ imaging
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Acquisition software  Cairn Research Ltd. Acquisition Engine V1.1.5 Or any equilavent product; microfluorimetry
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software for confocal imaging Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Confocal microscope Leica Geosystems SP5  Or any equilavent product; confocal
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000 Or any equilavent product; microfluorimetry
Monochromator  Cairn Research Ltd. Optoscan Or any equilavent product; microfluorimetry
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Software for confocal microscope Leica Geosystems LAS-AF version 3.3. Or any equilavent product; confocal
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x100 lens Nikon x100 N.A. 1.3 oil Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Leica Geosystems HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D Or any equilavent product; confocal
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product; microfluorimetry
x63 lens Leica Geosystems HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/E Or any equilavent product; confocal
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Pipettes Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation
Helper pipette World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >10 MΩ
Cannulation pipette World Percision instruments TW150F-4 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 290
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 58
Time: 150
No of cycles: 4
Tip diameter: 3-10 μm
Polishing: no
Final Resistance: <1 MΩ
On-cell patching World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >5 MΩ
Whole-cell patching Warner Instruments GC150TF-7.5 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 296
Pressure: 200
Heat: 287
Pull : 0
Velocity: 50
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 2-3 μm
Polishing: helpful but not necessary
Final Resistance: 1-2 MΩ

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References

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生物学 問題 137 網膜細動脈分離筋音図法、パッチ ・ クランプ、細動脈平滑筋、血流の自己調節、カルシウム イメージング
<em>Ex Vivo</em>細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離
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Curtis, T. M., McLaughlin, D.,… More

Curtis, T. M., McLaughlin, D., O'Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).

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