Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Retina arteriyoller yalıtım Ex Vivo Hücre fizyolojisi çalışmaları için

Published: July 14, 2018 doi: 10.3791/57944
Automatic Translation
*1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 4, *2
1Centre for Experimental Medicine, Queen's University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education), Queen's University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University of Belfast
* These authors contributed equally

Summary

Bu el yazması arteriyoller elektrofizyolojik, kalsiyum görüntüleme ve baskı myography çalışmalarda kullanılan fare retina üzerinden yalıtım için basit bir protokol açıklar.

Abstract

Retina bir önemli kan akımı gerektirir yüksek metabolik olarak aktif bir dokudur. Photoreceptors choroidal damarları tedarik ederken iç retina retina dolaşım destekler. Retina perfüzyon değişiklikler diabetik retinopati dahil olmak üzere çok sayıda görüş tehdit bozuklukları için katkıda bulunmak, glokom ve Retina şube occlusions damar. Moleküler mekanizmalar yoluyla retina ve nasıl bunlar göz hastalığı sırasında değişmiş kan akışını kontrol dahil anlamak bu koşullar tedavisi için yeni hedefler tanımlaması neden olabilir. Retina arteriyoller ana direnç damarlarının Retina ve sonuç olarak, değişiklikleri luminal çapı ile retina hemodinami düzenlenmesinde anahtar bir rol oynamak. Son yıllarda, çeşitli hücre fizyolojisi çalışmaları da dahil olmak üzere uygulamalar için uygun olan arteriyoller sıçan retina dan izole için yöntemler geliştirdik. Bu hazırlık nasıl kan akımı retinada kontrol edilir ve bize bazı göz hastalığı sırasında oluşan anahtar değişiklikleri tanımlamaya izin verdi yeni anlayışlar vermeye başlamış durumda. Bu makalede, biz sıçan retina arteriyoller yalıtım için yöntemleri tarif ve yama-kelepçe Elektrofizyoloji, kalsiyum görüntüleme ve baskı myography çalışmalar bunların kullanımı için iletişim kuralları içerir. Bu gemiler de mükellef kullanılmak üzere PCR-, western blot ve immünhistokimya tabanlı çalışmalar bulunmaktadır.

Introduction

Retinada kan akışını nasıl denetlenir en önemli noktadır önemli bir hedefi, anormal kan akımı görme tehdit eden çeşitli patogenezinde karıştığı olmuştur beri retina hastalıkları1,2,3, 4. İç retina sinir hücreleri ve Gliyal hücreler malzemeleri, retina dolaşım kan retina damarları ve kılcal damarlar geçen Retina venüller ve sonunda damarlar5arteriyoller tümünün bulunduğu bir bitiş arter düzenleme vardır. Kan akımı retina Retina arter ve arteriyoller sesi hem de retinal kapiller ve sonrası kapiller venüller6,7, duvarlarında yer alan perisitlerden contractile etkinliği tarafından düzenlenmiştir 8. retinal vasküler sesi kontrolünü karmaşıktır ve girişlerden dolaşım sistemi ve çevresindeki Retina dokusu, moleküller ve hormonlar, dolaşan kan gazı da dahil olmak üzere bir dizi tarafından modüle ve vazoaktif maddeleri yayınladı retinal vasküler endotel ve macroglia9,10,11. Retina arteriyoller retina küçük atardamar dallarında ve vasküler düz kas hücre tek bir tabaka oluşur ve bir iç astar boyuna endotel hücreleri12,13, düzenlenen 14. Bu gemiler vasküler direnç retina dolaşım içinde ana site oluşturmak ve bu nedenle retinal kan akımı yerel kontrol önemli bir rol oynamaktadır. Retina arteriyoller genişletici veya vasküler düz kas contractility10,15,16değişikliklerden aracılı onların luminal çapı constricting tarafından retina kılcal kan akışını düzenler. Moleküler mekanizmalar hangi Retina arteriyoller düzenleyen Retina perfüzyon bu nedenle nerede arterioler düz kas hücreleri erişilebilir ve koşulları olabildiğince fizyolojik olarak yakın Okulu'nu hazırlıklar gerektirir anlama.

Ex vivo hazırlıklar izole Retina kan damarlarının ederken hala onların işlevsellik ve altta yatan endotel ile Birleştiricisi koruyarak vasküler düz kas hücreleri erişim sağlar. İzole gemileri kullanan bugüne kadar en çalışmaları büyük sığır veya domuz arteryel gemilerin üzerinde (60-150 µm) odaklanmıştır. Bunlar piyasada bulunan tel veya vasküler düz kas hücre contractile mekanizmaları17,18farmakolojik sorgulama etkinleştirmek için basınç myograph sistemleri monte edilebilir. Böyle hazırlıkları büyük ölçüde normal şartlar altında retinal vasküler fizyoloji ile ilgili bilgilerimizi katkıda bulunmuştur. Kaç çalışmalar Retina arteriyoller küçük laboratuvar hayvan--dan onların daha küçük çapta izole kullandık (~ 8-45 µm) geleneksel myography sistemleri19,20,21,22bunların kullanımı engeller. Önemli bir avantaj, ancak, küçük Laboratuvar hayvanlarının gemileri genetik olarak değiştirilmiş, transgenik ve retina hastalığı modelleri geniş durumu kullanmaktır. Küçük Laboratuvar hayvanlarının da vivo içinde müdahale çalışmaları için daha fazla mükellef bulunmaktadır.

Burada izole ve sıçan retina arteriyoller basınç myography deneyleri için cannulating için basit iletişim kuralları açıklar. Bu gemiler kullanarak Ca2 + görüntüleme ve Elektrofizyoloji iletişim kuralları da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bunlar daha fazla vasküler düz kas contractility ve kan akımı retina Yönetmeliği kazandırabileceğini.

Protocol

Burada açıklanan tüm deneylerin 1986 İngiltere'de hayvanlar (bilimsel yordamlar) hareket içinde yer alan yönergelere uygun olarak gerçekleştirilen ve Queen's University Belfast hayvan refahı ve etik İnceleme vücut tarafından kabul edildi.

1. Retina arteriyoller yalıtım

Not: Aşağıdaki protokol Retina arteriyoller izole etmek için kullanılır. Bu yöntem sıçan retina arteriyoller için en iyi duruma getirilmiş ancak fare Retina ile kullanılabilir. Gemiler, verim ancak, fare kullanırken düşüktür.

  1. Tablo 1' de gösterildiği gibi Hanks' (LCH) içeren düşük Ca2 + bir çözüm oluşturur.
    Not: Bu çözüm 4 ° C'de 3 güne kadar saklanabilir (kullanarak LCH depolandıklarında, oda sıcaklığında sakinleştiği ve pH kullanmadan önce doğru olduğundan emin olun).
  2. Koleksiyon doku retina hızlı mikrodiseksiyon emin olmak için önce aşağıdaki ekipman montajı: tırtıklı forseps, eğri makas, diseksiyon çanak (Petri dish silikon kaplı), tek kenarlı bıçak, forseps (kör) 1 cam 2 takım Pasteur pipet (yangın pürüzsüz ama değil dar ucuna kadar cilalı), 1 tek kullanımlık plastik pipet (için diyafram artırmak için kesilmiş uç ile ~ 5-7 mm), 1 cam yuvarlak alt test tüpü (5 mL) ve tutucu. Yaklaşık 50 mL LCH bir cam kabı içine dikkatle boşaltmak ve atık sıvılar dikkatle boşaltmak için ikinci bir ölçek hazırlamak.
    Not: Malzemeler tablo özellikleri ve üretici Ayrıntılar için bkz.
  3. Exsanguinate için kalp ponksiyon tarafından takip CO2 kullanarak fare ötenazi (servikal yerinden çıkması veya beyin sarsıntısı Bunlar kan damarları gözüne zarar verebilir önlemek). Göz kapaklarının tırtıklı forseps ile geri çek, sonra çevresinde yörünge kasları ve optik sinir aracılığıyla kesmek için eğri makas kullanın. Yavaşça gözlerini kalan herhangi bir ek makasla kesmek için dikkat çekici yörüngeden ayıklayın.
  4. LCH çözüm (gözleri buz LCH bir çözümde gerekirse taşınmış) diseksiyon çanak üzerinde dalmış gözler yerleştirin. Yörünge kas ekler veya optik sinir tutarak çanak gözle tutturmak künt forseps kümesi kullanın; bağlantı noktası göz dengelemeye sklera mümkün olduğu kadar yakın olduğundan emin olun.
  5. Bıçak kullanarak, kornea ora serrata boyunca kesti ve forseps ile sklera üzerinde hafifçe basarak objektif kaldırın.
  6. Göz Kupası optik disk üzerinden simetrik olarak ikiye kesin. Kullanarak forseps yavaşça 'fırça' Retina optik disk, kalan ekleri kaldırmak için dikkat çekici kadeh iki yarısı üzerinden dışarı kapalı. İkinci göz ile işlemi tekrarlayın ve disseke Retina tüp LCH orta plastik pipet ve küçük bir damla kullanarak içine aktarın.
  7. Plastik pipet kullanarak doldurmak için LCH ile test tüpü ~ 5 mL ve Retina altına yerleşmek izin verir.
  8. Doku yaklaşık yıkama 3 kez kaldırarak ~ 4 mL tüp ve taze LCH plastik pipet kullanarak ekleme çözeltisi. Gerekli hallerde, suspensory bağ, vitre mizah ve kıllar gibi yabancı dokuyu.
  9. İç cam Pasteur pipet (cilalı ucu) doku için pipet yapışmasını önlemek için LCH ile yıkayın. Aynı pipet kullanarak, çözüm yaklaşık 4 mL tüp kaldırın. Daha sonra yaklaşık 2 mL taze LCH ekleyin.
  10. Yavaşça (triturate) ayırmak doku cam ucu ile çizerek Retina yavaş yavaş pipet ve içeriği tüp sınırdışı. Not, bu aşamada kabarcıklar tanıtmak değil deneyin.
  11. Retina yaklaşık 2-3 mm2boyutuna kadar kırık kadar 1,10 tekrarlayın.
  12. Pipet iç LCH yaklaşık 2 mL ile yıkama ve bu tüp sınırdışı. İçeriği üzerinde 5-10dk alt yerleşmek izin verir.
  13. Toz doku parçaları boyutu yaklaşık2 1 mm kadar 1.10-1.12 biraz daha fazla bir güçle içinde özetlenen adımları tekrarlayın. Yine, doku 5-10dk için yerleşmek izin verir.
  14. 1.10-1.12 adımları yineleyin üçüncü kez daha fazla bir güçle içeriği tam olarak homojen ve retina no adet kalması kadar (Çözüm Görünümü sütlü olacaktır).
    Not: Bu teknik 8 arteriolare kesimleri (nispeten neuropile çevreleyen ve sağlam kalan bazı dalları ile ücretsiz) verecektir çapı ve 200-2500 µm uzunluğu 8-45 µm ölçme yalıtım başına.
  15. Fizyolojik kayıt odasına izole küçük bir miktar aktarabilir veya floresan boyalar intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu ([Ca2 +]i; bkz: Bölüm 3) ölçümü için ekleyin. Kalıntıları göz bardak ve hayvan atıkları işleme yerel kurallara uygun yalıtım işlemi sırasında kaldırıldı çözüm atın.
    Not: Bu gemiler üzerinde yalıtım sonra hemen denemek için tavsiye edilir iken, ihtiyaç fazlası izole etmek en fazla 8 saat için 4 ° C'de depolanabilir.

2. arterioler basınç Myography

Not: Arterioler basınç myography donanımları ayrıntılı Şekil 1A, B ve Malzemeler tabloaşağıdaki gibi kullanarak yapılır.

  1. Retinal damar homogenate bir aliquot transferi (1-2 mL; 1 bölüm başı olarak izole) fizyolojik kayıt odasına (kısmen sözde dolu Ca2 +ücretsiz Hanks çözüm; 0Ca2 + Hanks'; bkz. Tablo 1) sahnede monte bir ters mikroskop. En az 5 dk önce deneme için kayıt odası dibinde yerleşmek için gemiler bırakın.
  2. Arteriyoller > 200 µm uzunluğu ve hangi aracılığıyla damar cannulated bir açık uçlu sahip tanımlamak için kayıt odası arasında görsel olarak tarayın (gemi tipi kimliği daha da sonuçları bölümünde araştırdı). Gemi görüş alanı ortasına yerleştirin. Uygun hiçbir gemi varsa, gemi homogenate başka bir aliquot adım 2.1 göre kayıt odasına aktar.
  3. İyi forseps ve küçük tungsten tel slip kullanarak gemi bir ucunu çapa (75 µm çapı ve ~ 2-4 mm uzunluğunda) gemi yerleştirilir (bkz. Şekil 1 c(i)). Bunu yapmak için tel forseps tutun ve forseps kayıt odası bulun.
    1. Mikroskop altında forseps karşılık gelen gölge tanımlamak, Tel belirgin hale gelinceye kadar forseps banyo içine düşmüş olursun. Tel açık sonundan itibaren gemi yaklaşık 200 µm üzerine getirin ve gemi uzun eksenine dik tel bırakın.
      Not: Tungsten tel ağırlığını klemple luminal içeriği akışını durdurma cannulation ve basınçlandırma sırasında gemi doldurmak için yeterli olur.
  4. Öyle ki yatay olarak banyo arasında açık uçlu doğrultusunda basınçlandırma kanül ile yatıyor arteriyol kayıt odası içinde uygun bir pozisyona taşımak (bkz. Şekil 1 c(II-IV)). Bunu nazikçe occluding tungsten tel notu tel forseps içinde düzenlenen yeni bir bölüm ile hafifçe hareket ettirme tarafından; geri dönüşümsüz forseps için uygun olacaktır gibi arteriyol dokunmayın.
  5. Öyle ki gemi tehlikesi ve açık uçları arasındaki mesafe en fazla 200 µm (uzun arteriyol segmentler için) gerektiğinde, ek tungsten tel fişleri üzerinde gemi ekleyin; Bu basınçlandırma üzerine görüş alanı dışında hareketli arteriyol önlemeye yardımcı olur. Geminin herhangi bir yan dallar varsa, bunlar da ek tungsten tel torbalarla tıkandı. Eğer bir yan dal tıkandı gemi atmak.
  6. Odası ile 0Ca2 + Hanks' 37 ° C'de yabancı Retina dokuyu ve fizyolojik sıcaklıklara banyo sıcak sıvı.
    Not: Bir standart yerçekimi beslenen banyo perfüzyon ve satır içi kalorifer sistemi bu amaç için kullanılabilir ( Şekil 1A' ya bakınız). 0Ca2 + Hanks'cannulation yordamı kolaylaştırmak için kullanılır, dış Ca2 + sağlar kaldırılması beri arteriyoller dilate kalır.
  7. Basınçlandırma kanüller filamented borosilikat cam kılcal damarlar (uç çapı ~ 3-10 µm cannulated için damar çapı göre; dar kanüller gerektirir; Tablo reçetesibakın daha küçük damarları) dan imal kullanarak bir Elektrot puller ve arka-dolgu 0Ca2 + Hanks çözümü ile. Kanül şaft cannulation kolaylaştırmak için belgili tanımlık uç doğru hafifçe konik emin olun.
  8. 10 mL şırınga Y konektörü ve bir 3'lü musluk üzerinden bağlı bir pipet tutucu kanül mount; Bu sistem baskı yapmak, diğer yan-kol için Y ucunun bağlı bir manometre kullanarak kaydedilen baskı için kullanılır (bkz. Şekil 1B).
    Not: 'Yardımcı' pipet cannulation işlemine yardımcı olmak için gereklidir. Pipet borosilikat cam kılcal bir elektrot çektirmenin bir uç çapı 0,5 için çekti imal - 2 µm. ağır ateş Lehçe pipet (kez kapatılıncaya kadar) bir microforge kullanarak.
  9. Dikkatle yardımcı pipet gemi uzun eksenine dik açılarla yakın 3 eksenli mekanik manipülatör kullanarak açık ucuna yerleştirin (bkz. Şekil 1 d). Yardımcı pipet hemen üstünde gemi ama değil dokunaklı getirin.
  10. Cannulation pipet, gemi açık sonuna yerleştirin (bkz: Şekil 1 d ve 2A(i)) kullanarak iyi bir micromanipulator; Açılış, hemen bitişik uç mikroskop (at 20 X) odak düzlemi ayarlayarak değerlendirildi olarak yerleştirin. Ne zaman her iki sonuna gemi ve kanül ucu olan odakta kanül doğru yerleştirilmiş aynı anda cannulation için (bkz. Şekil 2A(II)).
  11. Basınçlandırma kanül iyi micromanipulator x ekseni denetimlerini kullanarak gemi diyafram önceden ( Şekil 2A(III) bakın). Cannulation başarısı kanül y ekseni boyunca hareket ettirerek değerlendirmek. Başarılı bir şekilde cannulated (bakınız Şekil 2A(IV)) ise kanül gemi içinde kalır. Kanül geminin dışında hareket ederse, kanül gemi olması muhtemeldir; Eğer öyleyse adım 2.10-2,11 alt uçağa z ekseni, kanül ile yineleyin.
  12. Başarılı cannulation yardımcı pipet arteriyol dizginlemek için gemi üzerine yavaşça indirin. Arterioler duvar rehberlik cannulation pipet gelişmiş yardımcı pipet ile basınçlandırma kanül üzerinden aynı anda gemi lümen yaklaşık 30-50 µm bir mesafe içine daha da ( Şekil 2A(v, VI) bakın).
    Not: Bu yordam için her iki manipülatörler (yardımcı pipet kanül gemi lümen hareket ederken doğru kanül hareketli) aynı anda, kontrollü hareket gerekir ve yüksek başarı oranı elde etmek için geniş uygulama gerektirir.
  13. 2 mM Ca2 + içeren normal Hanks için banyo çözüm değiştirin (bkz. Tablo 1) 37 ° C'de Genellikle bu bir hafif daralma arteriyol ve basınçlandırma kanül çevresinde sıkı bir mühür oluşumu neden olur. Yardımcı pipet gemi uzak taşınabilir.
  14. 15 dk. bir USB kamera (ve görüntü alma yazılımı) kullanarak gemi için mikroskop bağlı ve gemi sınırları ve (bkz: dış ve intraluminal alanlarda arasındaki kontrast en üst düzeye çıkarmak için odak ayarlamak görünümü geliştirmek için sıkı bir mühür izin Şekil 2B). 0,5 - gemisine resim 5 kare/s.
  15. Kayıt 0 mmHg, 1 dk sonra basınçlandırma kanül bağlı 3'lü musluk kapatarak istenen seviyeye intraluminal basınç artışı (bkz. Şekil 1B) ve pozitif basınç az miktarda şırınga ile sisteme uygulanır. Manometre üzerinde değiştirmek basınç gözlemlemek.
    Not: Basıncı 100 mmHg kadar veya bir değer bir adım akıllıca moda örneğin 40 mmHg (Retina arterioler basınç vivo içindeyaklaşıldığıdır)23eklenebilir. Gemi hızla başarılı cannulation teyit genişletmek. Lütfen dikkat, basınç kaynaklı vazokonstriksiyona (Yani, myogenic yanıt) daha sonra bir 15 dk boyunca gelişecektir ama bu gemiler küçük boyutu nedeniyle, bu her zaman görsel olarak tespit olmayabilir.
  16. Dikkatle gemi açık kaçakları için ilk basınçlandırma sırasında izleyebilirsiniz. Kaynaklarının sızıntı i ciddi yan dalları veya kanül yetersiz mühürleme arteriyol içeriye doğru kaynaklanan.
    1. Gemiyi terk intraluminal içeriği için dikkat et. Manometre üzerinde baskı bir düşüş olarak zaman içinde daha küçük, daha az belirgin sızıntı belirgin hale gelebilir. Mümkünse, açılış kanül bozmamaya dikkat çekici ek tungsten tel torbalarla doldurmak. Hazırlıklar belirgin sızıntı ile daha fazla çözümleme dışı bırakmak.
  17. Gemi önce veya aşağıda, (eski ikinci etkileri analizine olanak sağlarken, belirlenecek myogenic sesi gelişimi üzerinde etkileri sağlar deneme 15dk basınçlandırma amaçlarına bağlı olarak faiz abluminally uyuşturucu uygulamak kararlı durum myogenic sesi üzerine). Tipik uyuşturucu dağıtım sistemi Şekil 3Aresmedilmiştir.
    1. Gemi ilgi bölümüne dikey teslim çıkış ( Şekil 1 diçinde gösterildiği gibi) bir mesafede pozisyon ~ 500 µm sağlamak için dikkat çekici faiz gemi uzak çıkış en iyi şekilde olduğunu tam olarak superfuse için (bkz: alan açılı Şekil 3B). Perfüzyon değişimler fiziksel olarak gemi rahatsız değil emin olun.
  18. Bir deney tamamlanmasını takiben, sonuna kadar pasif çapı belirlemek için gemi genişletmek için 10 µM wortmannin (myosin hafif zincir kinaz inhibitörü) içeren bir çözüm 0Ca2 + Hanks geçerli.
    Not: Cannulation mühür gücünü deneme sonucunda intraluminal basınç yükselterek test edilebilir > 100 mmHg. Damarları çoğunluğu sıkı bir mühür gösteren bile bu yüksek basınçta ekli kalır.
  19. Arterioler çapı değişiklikleri izlemek için kenar algılamayı kullanarak çevrimdışı çözümlemeler ( Tablo malzemeler için önerilen yazılım bakın). Gemiler arasında karşılaştırma için pasif çapı için arteriyol çapı normale.

3. Ca2 + görüntüleme

Not: İzole Retina arteriyoller geleneksel (microfluorimetry) için hazırlanır ve takip olarak görüntüleme confocal Ca2 + ( Tablo malzemelerikonusunda ayrıntılı cihazlar kullanılıyor).

  1. Retina homogenates 5 mL Cam tüp içinde 1 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın. Retina homogenate için 1 mL Fura - 2 AM (microfluormetric Ca2 + kayıt) veya Fluo - 4 AM (confocal Ca2 + görüntüleme) 5 mikron son bir konsantrasyon vermek ekleyin (ışıktan korumak); boya göstergeleri tercihen düz kas hücreleri yüklemek.
  2. 2 tüp tarafında flicking h için karanlıkta oda sıcaklığında Retina doku yeniden askıya almak için her 15-20 dk korumak. Bundan sonra homogenate 1:4 yükleme boya daha da azaltmak için LCH solüsyonu ile oranında seyreltin.
    Not: Kaplar (4 ° C'de ve karanlıkta saklandığında) 6 saat için uygun kalır; Bu deney en kısa zamanda iç organelleri boya compartmentalization veya zamanla boya ekstrüzyon etkisini azaltmak için başladı önerilir.
  3. 1-2 mL Retina homogenate, sahne alanı'ndaki bir Ca2 + microfluorimetry veya confocal mikroskobu sistemine bağlı bir ters mikroskop monte edilmiş bir cam popolu kayıt odası (LCH ile kısmen dolu) aktarın.
    1. Çapa arteriyoller akış yönünü dikey aralıklı kayıt odası arasında tungsten tel paket fişi (50 µm çapı, 2-4 mm uzunluğunda) ile ~ 100-200 µm gemi uzunluğu boyunca ayrı (bkz. Şekil 3 c) için açıklanan benzer bir teknik kullanarak 2.3. adımda.
  4. Normal Ca2 + Hanks çözüm 37 ° C'de banyo sıvı Uyuşturucu teslim çıkış gibi Şekil 3 c resimde getirin ve uyuşturucu 2.17 adımda açıklanan gemiler için geçerli.
  5. Geleneksel Ca2 + görüntüleme için gemi ile 340/380 nm ışık objektif bir petrol daldırma UV (Örneğin, 100 X, NA 1.3) ile aydınlatmak ve 510, verilmiş floresans toplamak üzerinden photomultiplier tüp (PMT) sayma bir foton nm.
  6. Her deneme sonunda MnCl içeren bir çözüm ile gemi Şoklama tarafından arka plan floresans ölçmek (bkz. Tablo 1). Arka plan-düzeltilmiş floresans oranları (R-F340/F380) çözümlemesi için kullanma veya intrasellüler Ca2 + ([Ca2 +]i) kullanarak dönüştürmek Rmin ve RMaksimum ölçümleri (bakınız Tablo 1; Şoklama uygulanan öncesinde 24) ve Grynkiewicz eşitlik25.
  7. Confocal Ca2 + görüntüleme için Fluo-4 yüklü gemiler heyecanlandırmak 488 nm ve yakalama modu (xt) veya xyt tarama modları (512 x 512 piksel; önerilen iğne deliği 300 nm) sonuç floresans emisyon çizgisini 490-535 nm, tarama. Zaman t kaydedilen floresan için ölçümleri normale 0s (F/F0) =. [Ca2 +]i herhangi bir değişiklik ilaç uygulamaları veya görüntü analiz yazılımı kullanarak basınçlandırma çevrimdışı belirli bölgelerde ilgi (ROIs) sırasında değerlendirmek.
  8. Gerekirse, Ca2 + görüntüleme basınç myography ile gerçekleştirin.
    Not: Yukarıdaki açıklamalar basınçsız kapları optimize edilmiştir; Ancak Ca Imaging2 + basınçla myography aşağıdaki gibi birleştirmek mümkündür.
    1. Bölüm 1 göre arteriyoller yalıtmak. Ca2 + göstergesi boya göre adım 3.1-3.2 yükleyin. Kayıt odasına arteriyoller aktarmak ve 2 bölüm başı olarak cannulate. Montaj işlemi sırasında ışığa maruz kalma sınırı için dikkat ediniz.
    2. CA2 + 3.5 ya da 3.7 yukarıda adım başı olarak ölçmek. Gemi baskı yapmak ve ölçüm Ca2 +. tekrar Gemi çapında eş zamanlı ölçüm cihazları ve Ca2 + ölçüm modu bağlıdır.
      Not: confocal Ca2 + ölçüm için boya uzun pozlama sırasında gün ışığına ağartma nedeniyle görüntü ayrı bölgeler öncesi ve sonrası basınçlandırma gerekli olabilir.

4. yama-kelepçe Elektrofizyoloji

Not: Bütün hücreli ve tek kanallı kayıt ( Tablo malzemelerikonusunda ayrıntılı donanımları kullanarak) aşağıdaki gibi onların üst arteriyoller içinde gömülü bireysel arterioler düz kas hücreleri hala mümkündür.

  1. İzole ve Retina arteriyoller kayıt odasında 1, 2,3 ve 3.3 adımlarda açıklandığı gibi çapa. Yama-kelepçe kaydı, gemi 200-800 µm ayrı paket fişi olan tungsten tel aralıklı.
  2. Bazal lamina arteriyol çevreleyen kaldırmak ve elektrikle bitişik düz kas hücreleri ve yama sıkma önce altta yatan endotel hücreleri Böl. Bunu yapmak için superfuse enzim çözümleri (Tablo 1) için gerekli süre 37 ° C'de sıralı bir dizi ile gemi.
    Not: Enzim pozlama süresi için fare Retina arteriyoller getirilmiştir (proteaz, ~ 8 min; collagenase, ~ 12 dk) ve ilaç dağıtım sistemi (~ 1 mL/dk yapımız) akış hızı ve kullanılan enzimler toplu birim faaliyetleri bağlıdır.
  3. Sindirim endotel, görsel renk düzeyini değerlendirmek ve Şekil 4gösterildiği gibi düz kas katmanları collagenase sırasında adım. Hücre katmanları ayrılması ( Şekil 4B' de gösterildiği gibi) gözlenen sonra DNaz başvuruda ben çözüm (~ 4 dk) sonra yerine normal Ca2 + Hanks çözüm ile banyo çözümün tarafından sindirim sonlandırmak.
  4. Bazal lamina ve/veya periferik neuropile kalan herhangi bir ipliklerini dikkatle gemi yüzeyi boyunca iyi forseps kapalı ipuçları süpürme tarafından kaldırın.
  5. Çekin ve Lehçe cam kılcal damarlar (Tablo malzemeler), pipet çözüm (Tablo 1) ile doldurun ve güvenli bir şekilde yer yama-kelepçe headstage pipet tutucu. Kayıt odası ile ilgili olarak 45 ° açıyla pipet getirin ve kaba ayarı üzerinde motorlu bir micromanipulator kullanarak gemi doğru ilerlemek.
  6. Damar duvarından çıkıntılı bir düz kas hücre seçin ve kimin yüzeydir görünür enkaz ücretsiz (bkz. Şekil 4B). Yama pipet ucu dikey olarak faiz hücrenin üzerine getirin ve yavaş yavaş yapmak micromanipulator güzel/yavaş hareketi kullanarak alt düz kas zarı ile temas.
    1. Hücre ve hücre hareketi ve edinme yazılımındaki membran (mühür) test protokolü kullanarak ölçülen pipet direnç değişikliği gelen görsel olarak pipet arasında temas değerlendirmek (5-10 mV 0 negatif adımından mV, frekans 25 KHz; bkz: Şekil 5A(i)) .
  7. Ne zaman mühür direnç 5-fold artmıştır (rising 2 10 MΩ için;Örneğin, Şekil 5A (II)) uygulamak negatif basınç geçici pipet sahibi arkasına bir y-bağlayıcı, 3'lü musluk, şırınga ve pipet sahibine bağlı boru üzerinden (arteriyoller basınçlandırma içinde kullanılan için benzer bir şekilde monte, Şekil 1Bbakın).
  8. Negatif basınç uygulamaları bir gigaseal kadar tekrarlayın (> satın alma yazılım membran testinde gösterildiği gibi 1 GΩ direnç;) olduğunu (Şekil 5A(III)) kurdu. Not, bu işlem 1-5 dk sürebilir. Bir gigaseal forma başarısız olursa, bir taze yama pipet kullanarak düzeltme eki kelepçe için farklı bir hücre seçin.
  9. Bir holding potansiyel hücre gerçekleştirilen deneme (genellikle 0, -40 veya-80 mV) göre satın alma yazılımı ile uygulanır.
  10. Çalışma (tarih-hücre) tek kanal aktivite mevcut yapılandırma. Alternatif olarak, Inside-out yamalar hızla yama pipet hücre yüzeyinden gigaseal oluşumu sonra geri çeker tarafından oluşturmak.
    1. Membran ücretsiz biter bu koşullar altında yeniden TAV gibi pipet banyo manipülatör (kaba ayarı) hızlı dikey hareket üzerinden kaldırın. Yalnızca düzeltme pipet ucu içinde bırakarak reform membran kaldırmak için menisküs aracılığıyla hızla geri.
  11. Satın alma yazılım 5 kHz örnekleme frekansı ayarla ve sürekli çekim moduna kayıt kanal etkinlik için harekete geçirmek. Yazılım veya amplifikatör ile gerekli voltaj değişiklikleri uygulayın.
  12. Gerekirse, uyuşturucu 2.17 adımda anlatıldığı gibi gemi/membran yama için geçerlidir.
  13. Membran streç gerekiyorsa, bir manometre 3'lü musluk ve y-bağlayıcı üzerinden bağlı Ģırınga kullanarak pipet arka için negatif basınç uygulayın.
  14. Tek kanallı kayıtları açık olasılık ve üniter gürültülerinden uygun olarak standart prosedürler26için analiz.
  15. Tüm cep telefonu için çekme ve Lehçe pipetler Malzemeleri masabaşı olarak kayıt geçerli, Amfoterisin B içeren pipet çözüm ile doldurun (amfoterisin b 3 mg DMSO 50 µL için Ekle; 3-6 µL bu bütün hücreli pipet çözüm için 1 mL ekleyin; karıştırmak için solüsyon içeren temizleyicide) ve bir mühür adımları 4.6-4,9 göre oluşturur.
  16. Amfoterisin B eklenmesi nedeniyle tüm cep telefonu erişim kazanmak için pipet ucu içinde membran rüptürü için gerek yoktur. İzlemek erişim, yavaş yavaş, edinme yazılımındaki membran test protokolü kullanarak elde (-20 mV -40 adımından mV, örnek frekans 25 KHz; bkz: Şekil 5B).
  17. Bazı yazılım kapasitif geçişler otomatik sığdırma erişim direnci ve hücre kapasite (alternatif olarak geçişler göreli düşüş göz tarafından tespit edilebilir) gerçek zamanlı ölçümler verir. 15 < MΩ erişim direnci düşer sonra tüm hücreli parametre aramalar (kapasitans ve seri direnç) üzerinde amplifikatör kullanarak seri direnç tazminatlar (Şekil 5C) gerçekleştirin.
    1. Bunu yapmak için başlangıçta (bkz. Şekil 5C(II)) aramalar ayarlamak için otomatik sığdırma değerleri kullanın sonra seri direnç tazminat arama (tahmini ve düzeltme amplifikatör üzerinde varsa) artırmak tüm cep telefonu tazminatlar yeniden ayarlama Kapasitif geçici azaltırken (bkz. Şekil 5C(III)).
    2. Değil telafi etmek üzerinden ( Şekil 5Ciçinde (IV) gösterildiği gibi) için dikkat çekici. Tipik olarak, seri direnç (en yüksek seviyede ayarlamak için gecikme tazminat gerektirir) delikli yama modunda 75 oranında telafi etmek mümkündür.
  18. Bütün hücre parametreleri 15 pF ve 15 mΩ (Bu hücreler için tipik değerler)'i arar ve sonra Şekil 5Ciçinde (II) gösterildiği gibi çıktıların üretmek için ayarlamak ayarı tarafından hiçbir otomatik sığdırma kullanılabilirse başlat. Seri direnç tazminat arama ~ %75 artırmak ve bütün hücreli parametreleri aramalar Şekil 5C(III) göre yeniden ayarlayabilirsiniz.
  19. Deney başlıyor önce el ile tazminat sonra hücre kapasitans ölçüm ilk otomatik sığdırma veya arama unutmayın.
    Not: Bu değer hücre boyutu akımları normalleştirmek için kullanılır. Seri direnç için tazminat olarak erişim daha fazla Amfoterisin B ortaklığın yama içine nedeniyle geliştirmek devam deneme sırasında ayarlanması gerekebilir.
  20. Uyuşturucu 2.17 adımda anlatıldığı gibi gemiler için geçerlidir. Gerilim protokolleri (adımları veya rampalar) deneysel ihtiyaçlarına göre uygulanır.
    Not: Tipik gerilim adım iletişim kuralları, 0.1 - 1 s süresi, holding üzerinden uygulanan potansiyel olarak 10-20 mV artırır bir aile gerilim-harekete geçirmek akıntılarının üretmek için her 5-10 s. Alternatif olarak yavaş yavaş gerilim ramping tarafından akımları gerilim bir 'tarama' bir dizi, ölçmek için rampa protokolleri kullanın (100-200 mV/s) üzerinden Örneğin, -80 için + 80 mV (her 5-10 s uygulanan) geçerli rampa sırasında çevrimdışı örnekleme 10 mV aralıklarla ile.
  21. Ca2 + görüntüleme düzeltme eki aşağıdaki gibi kayıt tipi kelepçe ile birleştirmek mümkündür. Bölüm 1 göre arteriyoller yalıtmak. Ca2 + göstergesi boya adımları 3.1-3.2 göre yükleyin. Bölüm 4 başına kayıt odasında bağlayın. Bu işlemler sırasında ışığa maruz kalma sınırı için dikkat ediniz.
    Not: Bu bugüne kadar yama-kelepçe enzimatik ayrılma işlemi sırasında basınç myography çalışmaları nedeniyle membran ve beden bütünlüğü kaybı ile birleştirilmesi de mümkün olmamıştır

Representative Results

Şekil 6A sıçan retinal vasküler ağacı çizim bir şematik gösterir. İlk sipariş (30-45 µm), ikinci mertebeden (20-30 µm) ve önceden kapiller arteriyoller (8-20 µm) çapı aralıklarının onaylandıktan deneysel olarak bizim laboratuvar sıçan retina bütün montaj hazırlıkları immunohistochemically etiketli confocal görüntüleme tarafından α-düz kas aktin (Şekil 6B). Ayrılma Retina birincil, ikincil ve önceden kapiller arteriyoller onların kalibreli ve vasküler düz kas hücreleri düzenleme göre tespit edilebilir. Birinci ve ikinci sırada arteriyoller parlak alan mikroskobu altında görsel olarak benzer görünür, ancak büyüklükleri (Şekil 6C) temel alınarak ayırt edici olabilir. Önceden kapiller arteriyoller hazırlanmasında en küçük atardamar damarları ve vasküler düz kas lifleri sparser onların düzenleme nedeniyle kolayca tanınabilir. İzole arteriyoller açıkça kılcal damarlar ve venüller izolasyon içinde farklı. Kılcal bir meshwork küçük kalibreli (çapı 4-10 µm) gemilerin varken venüller ince duvarlı ve düz kas hücre kapsamı (Şekil 6C) eksikliği belirginleşti. Birincil, ikincil ve önceden kapiller arteriyoller basınç myography, Ca2 + görüntüleme ve yama-kelepçe çalışmalar için uygundur.

Şekil 7 nerede bir birincil fare Retina arteriyol cannulated basınç myography deney ve 40 mmHg kaldırdı intraluminal basınç gösterir. Arteriyol sonra gemi pasif çapını elde etmek için önce 0Ca2 + Hanks' 10 µM wortmannin içeren ek myogenic sesi gelişimi için izin vermek için bu basınçta korunur. Şekil 7A arteriyol photomicrographs deneme süresince çeşitli zaman noktalarda gösterir. Zaman içinde damar çapı değişiklikleri gösteren bir tam zamanlı kurs kayıt özel yapılmış kenar algılama yazılımı27kullanarak Şekil 7B içinde çizilen. Hemen sonra basınçlandırma gemi genişletir, hangi sonra 15 dk. sonra 0Ca2 + Hanks ek bir kararlı durum düzeyi aşağıdaki noktaya etkin bir myogenic daralma takip ediyor / wortmannin çözüm için benzer bir bir seviyeye geri gemi genişletir hemen ilk basınç adım görülmektedir. Yukarıda açıklandığı gibi ilaçlar damarları önce veya geliştirme ve bakım myogenic sesi bu gemiler içinde yatan mekanizmaları incelemek için aşağıdaki basınçlandırma için uygulanabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, biz daha önce geçici reseptör potansiyel Vanilloid 2 (TRPV2) Kanal streç-harekete geçirmek ve L ve T tipi voltaj Ca2 + kanal ilk myogenic sesi geliştirme kolaylaştırmak merkezi bir rol oynamak göstermiştir ve İkinci fare Retina arteriyoller20,21,22sipariş. Biz de o büyük gürültülerinden Ca2 + potasyum kanalları (BK kanalları)19,28 ve myogenic faaliyete karşı çıkmak için Kv1 içeren voltaj K+ kanalları hareket aktif bildirdin Bu gemiler, her biri bu kanallar için belirli inhibitörleri eklenmesi vazokonstriksiyona (Şekil 7C) tetikler bu yana.

Şekil 8 önce retina arteriyoller ve vasoconstrictor peptid, endotelin-1 (Et-1) aşağıdaki maruz kalma geleneksel ve confocal Ca2 + görüntüleme örnekleri gösterir. Geleneksel fura-2 tabanlı kayıtları (Şekil 8A), Et-1 (10 nM) bifazik artış ortaya çıkarır [Ca2 +]ben Retina arterioler düz kas katmanı, bir alt tarafından takip bir ilk geçici bileşeninin oluşan sürekli bileşen. Biz daha önce geçici ve sürekli bileşenleri nedeniyle Ca2 + endoplazmik retikulum yayınlamasını ve Ca2 + akını ekstraselüler uzaydan, sırasıyla29olarak nitelendirmiştir. Fluo-4 tabanlı confocal Ca2 + görüntüleme Et-1 hücresel düzeyde etkileri daha ayrıntılı bir resim sağlar. Bu deneylerde, bu yumuşak Et-1 tekrar eden zaman uyumsuz [Ca2 +]ben aktivasyonu uyarıcı bizim microfluorimetry çalışmalar sonucundaki gözlenen küresel [Ca2 +]ben değişiklikleri kademeli açıktır salınım (Şekil 8B, C; damar duvar boyunca komşu Retina arterioler düz kas hücrelerinde 30).

Şekil 9 tek kanallı ve bütün hücreli yama kelepçe kayıtları Retina arterioler düz kas hücrelerinden gösterilmektedir. Bugüne kadar her iki hücre üzerinde ve iç-out tek kanal yama kelepçe kayıtları22,28taşıdı. Þekil 9A, B Örneğin, bir hücre üzerinde yama kelepçe önce kayıt ve (yama pipet negatif basınç uygulanarak oluşturulan) aşağıdaki membran streç göstereyim. Bu belirli yama Mekanik streç tarafından etkinleştirilen iki kanal içerir. Biz daha önce Bu akımlar TRPV2 kanal gözenek engelleme antikorlar22kullanarak inhibe gösterdi. Üniter gürültülerinden kanal (249.71 pS) Ayrıca bu akımlar TRPV231tarafından aracılı ile tutarlıdır.

Bütün hücre voltaj-harekete geçirmek akımları gerilim adım protokolleri kullanarak uyarılmış olabilir. Şekil 9C gerilim-harekete geçirmek A tipi K+ akımları böyle bir yaklaşım kullanarak kaydedilen bir ailenin gösterir. Ne zaman bu hücreler diğer büyük akımlar mevcut bu akımları belirgin hale gelir (Örneğin, BK ve Ca+-Cl- akımları aktif) belirli farmakolojik ajanlar32,33kullanarak engellenir. Non - veya zayıf voltaj bağımlı iyon kanalları üzerinden akıntılar genellikle voltaj rampa protokolleri kullanarak incelenir. Böyle iletişim kuralları belirlemek ve TRPV2 akımlar tarafından hipotonik streç22 ve kanal agonistler (Şekil 9 d) Retina arterioler düz kas hücrelerinde aktif karakterize için kullandık.

Şekil 10 çift basınç myography gösterir ve confocal Ca2 + görüntüleme bir birincil fare Retina arteriyol uygulanır. Basınçlandırma Tetikleyiciler [Ca2 +]i salınımlarını benzer bireysel düz kas hücrelerinde artış sıklığı Et-1'de görülmektedir. Biz daha önce bu salınımlar toplamı2 + (yerelleştirilmiş Ca2 + yayın olaylar) kıvılcım ve myogenic sesi20nesile katkıda CA tarafından tetiklenen göstermiştir.

Figure 1
Resim 1 . Deneysel kur baskısı sıçan retina arteriyoller myography. Ters mikroskop, banyo perfusate, 3 eksenli mekanik ve mikro-manipülatörler, manometre, kanül tutucu ve hava tablo için satır içi ısıtıcı dahil A) deneysel ekipmanların üzerine koymayın. En uygun düzeni cannulating pipet ve gemi kayıt odası ilgi gösteren şematik şekil B). Bu diyagram Ayrıca basınçlandırma ekipman temel kurulum gösterilmektedir. C) Şematik diyagramı veya uygun ve iyi forseps düzenlenen ek tungsten tel paket fişi kullanarak gemi taşıma işlemi gösterilen. (i) gemi doldurmak için 1st not bırak. (II, III) SLIP (okla gösterilen yönde) occluding ve (IV) gösterilen optimum yönlendirmeyi içine gemi eşlik itelemek için ek paket fişi kullanın. Tungsten tel kayma, yardımcı pipet ve kanül gemi ile ilgili olarak önce cannulation gibi occluding en iyi konumlandırma gösteren D) Şematik diyagramı. İlaç dağıtım sistemi çıkış mesafede konumlandırılmış ~ 500 µm gemisinden ilaç uygulama sırasında hareket dışlayıcıları azaltmak için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . Cannulation işlem için basınç myography. Aşağı (ı), önce kayıt odası (ii)-(v) ve aşağıdaki cannulation (VI) sırasında. demirlemiş bir retina arteriyol gösterilen A) Photomicrographs Yeşil ok yardımcı pipet hareketin yönünü gösterir iken mavi ok kanül hareketin yönünü belirtir. En uygun bölge için myogenic aktivite kayıt sırasında basınçlandırma kırmızı vurgulanmış olarak gösterilen B) Photomicrograph. Unutmayın, ışık ve kontrast damar duvarlarının artırmak için odak ayarı daha iyi gemiler kenarları otomatik analizi için izleme sağlar. Ölçek çubuğu gösterir 50 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 . İlaç teslim. A) cihazları için 3-yollu musluklar tarafından kontrol edilir ve 3-eksenli mekanik manipülatör bağlı bir çok kanallı teslim manifold bağlı çözüm rezervuarlar gösterilen ilaç dağıtım. Kayıt odası ile ilgili olarak ilaç dağıtım en uygun dikey konumlandırma manifold gösteren B) şekil. C) Photomicrograph aşağı ideal ilaç teslim çıkış konumlandırma gösterilen kayıt odasında demirli bir gemi. Ölçek çubuğu temsil eden 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Yama kelepçe için Retina arteriyoller enzimatik sindirim kayıt. Işık(a)önce bir retina arteriyol Filmler ve (B) enzimatik sindirim sonra. Altta yatan endotel hücreleri (ECs) düz kas hücrelerinden (SMCs) fiziksel ayrılması (oklarla gösterilen) unutmayın. Düz kas hücreleri yama sıkma için uygun bir yıldız işareti ile gösterilir. Ölçek çubuğu temsil eden 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Tek kanal ve tüm cep telefonu yama kelepçe kayıt. A) resimde test akıntılarının 'test mühür' iletişim kuralı sırasında gözlenen zaman: (i) yama pipet dış banyo orta girer, (ii) pipet ucu vasküler düz kas hücre plazma zarı ile temas gelir ve (iii) emme gigaseal oluşumu etkinleştirmek için pipet arkasına doğru uygulanır. Pipet kapasitans tazminat, yama kelepçe amplifikatör kullanarak aşağıdaki tek kanal akımları şimdi hücre içi yapılandırma kaydedilebilir veya bir yama membran hızla bir 'Inside-out' yama oluşturmak için pipet çekilerek eksize. Hücre iç elektrik şebekesinin geliştirilmesi sırasında Amfoterisin B bütün hücre uygulanması ile ilgili B) geçerli değişiklikleri delikli yama klemp tekniği (i): (II) gibi membran, Amfoterisin B bölümlere erişim direnç falls ve gerilim adımları hyperpolarizing sırasında elde edildi kapasitans geçişler (-40 -60 için gelen mV) daha büyük; hale (iii) erişim direnç (Rbir) 15 < genellikle 5-10 dk gigaseal oluşumu takip alır, MΩ düşmüş bir kez deneme mümkündür. C) önceden bütün hücreli kayıt, erişim direnç ve hücre kapasitans alakalı aramalar üzerinde yama kelepçe amplifikatör kullanarak tazmin edilmesi gerekir. Yama-kelepçe yazılım içinde otomatik işlevleri tarafından sağlanan erişim direnç ve hücre kapasitans değerleri bu sürecine rehberlik yardımcı olmak için kullanılır: (i) kapasite B(iii); vurgulanan bölgede alınan tazminat önce geçici gösterir (ii) azaltma içinde kapasite geçici normalde ne zaman erişim direnci ve kapasite telafi edilir gözlenen gösterir; (III) serisi direnç tazminat sonra yukarı % 75 ve erişim direnç düzeltilmesi gerektiğini ve genlik yukarıdaki ve sırasında geçerli Yaylası seviyesinin altında öyle ki elde edilen geçici-meli var olmak nispeten ince ayar kapasitans tazminatlar eşit adım. (iv) bakım erişim direnç üzerinde ('geçici zil' varlığını tarafından belirtilir), telafi değil olduğunu emin olmak için alınmalıdır hangi oluşabilir bazen erişim deneme süresince geliştirmeye devam ederse. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 . İzole sıçan retina arteriyoller tanımlaması. Sıçan retina mikrovasküler ağaç düzenlenmesi gösteren A) çizim. B) Confocal görüntüleri sıçan retina arteriyoller ve venüller düz montaj hazırlıkları içinde lekeli αSMA için (kırmızı çekirdeği mavi lekeli; ölçek çubukları temsil 50 µm). C) ışık filmler izole 1 °, 2 ° ve önceden kapiller arteriyoller, kapiller ağ ve venule (ölçek çubukları temsil eden 10 µm). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 . Arterioler basınç myography kayıtlarından. A) resimleri dinlenme çapı (yaklaşık 35,6 µm), basınçlandırma üzerine dilatasyon (II), (III) gelişimi myogenic vazokonstriksiyona ve dilatasyon (IV) 0Ca içinde 10 µM wortmannin ilavesi nedeniyle bir cannulated Retina arteriyol gösteren (i)2 + Hanks çözüm. Ölçek çubuğu temsil 10 µm. B) damar çapı (2.5 kare/s örneklenmiş) a gösterilen tam deneme için saat ders arsa. C) çapı iz kararlı durum myogenic sesi Kv1 kanal inhibitörü correolide (10 µM) ve BK kanal inhibitörü iberiotoxin efektleri gösterme (çapı 38,7 µm) altında farklı bir arteriyol üzerinden (100 nM) (0.5 kare/s örnek). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8 . Et-1 [Ca2 +] etkileri ben sıçan retina arteriyoller etkinliğinde sinyal. Et-1 (10nM) etkileri küresel [Ca2 +]benüzerinde gösterilen A) geleneksel fura-2 tabanlı kayıt. Bazal [Ca2 +]ben 82 yapıldı bu 1 ° arteriyol nM. B) confocal xt Fluo-4 tabanlı görüntü [Ca2 +]ben hücresel düzeyde üzerinde Et-1 efektleri gösterme. D., işaretlendiği şekilde hücrelerdeki C) Arsa normalleştirilmiş floresan yoğunluğu (F/F0) ölçülen Bu rakam Tumelty ve ark. değiştirildi 30 iznine sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9 . Tek kanal ve bütün hücreli yama-kelepçe kayıtları sıçan retina arterioler düz kas hücrelerinden. a, B) hücre üzerinde tek kanallı kayıtları aynı zar yama önce (A) ve (B) sırasında negatif basınç (-45 mmHg) uygulama yama pipet. İki kanal içinde yama mevcut (üniter geçerli 12.81 pA; üniter gürültülerinden 249.71 pS) etkinleştirme streç koşullar altında önemli bir artış gösterir. Seçili üst panelleri bölgelerden daha hızlı bir zaman alt paneller (II) içinde temel gösterilir (i). C) aile A tipi K+ kanal akımlarının (i) kaydedilen BK ve Ca2 +inhibitörleri huzurunda bütün hücre modunda-Cl- kanal inhibitörleri, yanıt 20 mV gerilim adım artışlarla-80 arasında elde edildi aktif + 80 mV mV (II). D) tüm cep telefonu akımları (i)-80 arasındaki gerilim rampaları tarafından elde edildi mV ve + 80 mV (siyah çizgi) önce ve TRPV2 kanal agonist delta-9-tetrahidrokanabinol (Δ9-THC) (kırmızı çizgi) uygulanması sırasında. Kullanılan voltaj rampa iletişim kuralı alt panelinde (II) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10 . Önce Ca2 + confocal görüntüleme ve bir fare Retina arteriyol basıncını takip. (İ),(a)altında Retina arterioler düz kas hücreleri temsilcisi confocal xt tarar basınçsız ve (B) koşullar aynı gemi ayrı bölgelerden elde edilen basınç altında. (ii) değiştirir normalleştirilmiş Floresan (F/F0) içinde kaydedilen tek tek hücreler zamana karşı çizilen bir - e, (ı), içinde belirtildiği gibi. Yıldız tek tek hücre altı Ca2 + hangi frekans sonra basıncını artırmak ve hücresel Ca2 + salınımlarını tetiklemek için summate kıvılcım gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bileşik (mM) Düşük Ca2 + Hanks 0Ca2 + Hanks Normal Hanks Yalıtım enzim proteaz Yalıtım enzim Collagenase Yalıtım enzim DNaz Çözüm gidermek Rmin çözüm Rmax çözüm Hücre hücre dışı çözüm bağlı Hücre pipet çözüm bağlı Bütün hücre hücre dışı çözümü Bütün hücre pipet çözüm
Su saflık (direnç) ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm ≥15 MΩ.cm ≥18 MΩ.cm
NaCl 140 140 140 140 140 140 140 140 140 140
kCl 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 138
D-glikoz 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
MgCl2 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1.3 1
HEPES 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
CaCl2 0,1 2 0,1 0,1 0,1 10 2 2 2 0,2
EGTA 4 0,5
MnCl 10
Ionomycin 0,01
KOH 140 130
D-Glukonik asit 130 130
NaOH 10
Penitrem A 0,0001 0,0001 0,0001
4-aminopyridine 10
Nimodipine 0,01 0,01
Fluoksetin 0,1
9-anthracenecarboxylic asit 1
Amfoterisin B 300-600 μg mL-1
Proteaz türü XIV ~0.01% (0.4-0.6 mg/40 mL)
Collagenase türü 1A %0.1 (6 mg/60 mL)
DNaz ben 20 KU (20 ml 1 MU/mL stokunun 20 μL)
pH 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.4 7.2
ile titre NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH NaOH Tris Tris NaOH KOH

Tablo 1. Dış örnekleri de dahil olmak üzere deneme kompozisyon çözümleri kullanılan ve pipet çözümleri tek kanal (TRPV2) ve tüm cep telefonu için kullanılan (A tipi) akımları.

Discussion

Yukarıda açıklanan protokoller pratik gerektirir ama çok az sorun giderme adımları konusunda ulaşılabilir olmalıdır. Ortalama bir günde 6-8 kullanışlı arteriyoller izolasyonu elde etmek ve 3-4 başarılı deneyler ulaşmak. Karşılaşılan sorunlar, ancak, başarı oranlarını artırmaya yardımcı olmak için alınan bazı adımlar vardır. Zaman zaman biz bulduk, özellikle genç rats (< 8 hafta), kullanırken arteriyoller verimi düşük olabilir. Bu sorunu aşmak için her bir toz arasında retina dokusunun (10-30 s 500 x g) centrifuging içinde 1.12-1.14 adım öneririz. Bu kez damarları verimini artırmak için yardımcı olur ancak aynı zamanda hücre artıkları hazırlık içinde miktarını artırır.

Basınç myography çalışmalar kapları cannulating zaman arteriyoller yakın çatallanma site i ciddi herhangi bir yan dalları için dikkatli bir şekilde kontrol etmek önemlidir. Bu ortak bir neden kaçak ve basınç kaybı deneme sırasında temsil eder. [Ca2 +]ben iletişim kuralları ile ortaya çıkabilir ana konu yükleme boya düzeyidir. Zavallı boya yükleme düşük sinyal-gürültü oranı, normal Ca2 + homeostazı çalışmasının sonuçlarında aşırı yükleme sırasında yol açar. Ya bu sorunların olasılığını azaltmak için Retina homogenate küçük bir aliquot kaldırılabilir ve izole kaplar periyodik olarak yükleme iletişim kuralı sırasında kontrol. Girişim yama-kelepçe deneyler, gigaseal formasyonu başarı oranını olduğunda nasıl son derece bağımlı de bazal lamina sindirmek. Ne zaman başlangıçta bu protokol test veya yeni birçok enzim kullanarak bu enzim sindirim konsantrasyon/süresi ayarlamak gerekli olabilir. Dikkatle endotel ve düz kas katmanları ayrılması izleme yeterince bazal kaldırmak için yeterli sindirim sağlayacak laminal erişim kazanmak için. Dikkatli izlenmesi de gemi sıkmak başlar gibi meydana gelen aşırı sindirim, önlemek gereklidir. Bu durum ortaya çıkarsa, düz kas hücreleri sık sık düzeltme eki kelepçe kayıt için çok kırılgan. Enzimler uygularken DNaz eklemek önemlidir ben üzerinden kurtarılmış DNA iplikçiklerini kaldırılmasını sağlamak için yalıtım işlemi sırasında hücreler zarar görmüş. DNA parçalarının yapışkan ve Temizleme işlemi (adım 4.4), son aşamalarında arteriyol için uymaları forseps neden kez gemi kaybı sonuçlanan. Gemilerin temizlik Teknik olarak zor ve en yüksek büyütme oranını en iyi olası ucu çapının kapalı forseps (20 X) nazik süpürme hareketleri ile gerçekleştirilir. Temizleyicileri arasında laboratuvar rulo ile forseps temiz.

Vurgulanan daha önce bir anahtar motivasyon arkasında bu el yazması özetlenen protokolleri gelişimi daha iyi kan akımı retinal vasküler hastalıklar sırasında neden bozulur anlamak için oldu. En-in bizim iş bugüne Diyabetik göz hastalığı28,33üzerinde odaklanmıştır. Arteriyoller kemirgen modeller 1 bölümünde açıklanan yöntemleri kullanarak diyabetin Retina izole olabilir. Diyabetik hayvanlardan izole Retina arteriyoller üzerinde deney yakından tarafından damarları vivo içindedeneyimli hiperglisemik koşulları çoğaltmak denemek önemlidir. Bu nedenle, normalde yalıtım ve 25 mM deneysel çözümler D-glikoz seviyelerini yükseltmek. Vasküler Bodrum membranlar kalinlasma diyabet34,35sırasında Retina damarlarında iyi tanınan bir olgudur. Hayvanlar uzun süreli diyabet (> 1 ay hastalık süresi) kullanırken, artan enzim konsantrasyonları veya sindirim kez kez yama-kelepçe kayıt yöntemleri uygulamayı etkinleştirmek için gereklidir.

Ex vivo kullanmanın önemli bir sınırlama retinal vasküler Fizyoloji çalışması için Retina arteriyoller izole ve patofizyolojisi çevreleyen Retina neuropile kayıptır. Kaldırma Retina gliyal ve nöronal hücre hücre fizyolojisi çalışmaları retinal vasküler düz kas hücreleri için kolay erişim sağlar, ancak, gemilerin yanıt vazoaktif arabulucu olarak önemli ölçüde devamsızlık ve Retina varlığı değiştirebilirsiniz doku. Adenozin tri-fosfat (ATP), eylemler Örneğin, bu noktada iyi bir örnek sağlar. İçinde izole kaplar36sağlam bir daralma Retina arteriyoller, ATP Tetikleyicileri eklenmesi sıçan, sağlam bir neuropile varlığı ise37damarlar dilate. Bu nedenle, mümkün olan her yerde, biz genellikle izole arteriyol hazırlıklarımız Retina bütün bağlar- ex vivo ve in vivo ölçümleri damar çapı ve kan akışı16,37 kullanarak anahtar bulgular doğrulamayı deneyin . Belirtmek gerekirse, küçük arteriyoller ve kılcal domuz Retina bütün periosteum ex vivo38,39' eğitimi için yeni yöntemler son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Böyle hazırlıkları büyük ölçüde Retina neuropile Retina arterioler ve kapiller sesi nasıl düzenler ve nasıl nöronal aktivite retina Retina haemodynamics değişimler modüle anlayışımızı geliştirmek muhtemeldir.

Bu makalede açıklanan yordamlar anlama arterioler düz kas hücre fizyolojisi izole sıçan retina arteriyoller kullanımına odaklanmış olsa da, şu anda protokolleri de endotel hücre işlevinde çalışmanın etkinleştirmek için gelişmekte olan Bu gemiler. Ön çalışma, biz Ca2 + görüntüleme ve çalışmalar kayıt patchclamp mükellef bulunmaktadır uygun endotel hücre tüpleri vermeye Retina arterioler segmentlerinin enzimatik sindirim değiştirilmesinde başarılı olmuştur. Cannulation izole arteriyoller intraluminal teslim uyuşturucu sağlayarak her iki ucunda, gelecekte de bu gemiler araştırılması etkinleştir endotel bağımlı vasodilatory yanıt-e doğru olabilir.

Disclosures

Dr. Joanna Kur an işçi-in Medtronic (Kardes sehirleri, Minnesota, ABD), şimdi onun mevcut çalışma değil çatışma burada sunulan ile.

Acknowledgments

Bu raporda açıklanan protokoller geliştirilmesi hibe aşağıdaki finansman kuruluşları tarafından desteklenen: BBSRC (1/I026359/BB), görme (1429 ve 1822), juvenil diyabet araştırma Vakfı (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), için mücadele İngiliz kalp Vakfı (PG/11/94/29169), HSC R & D bölümü (STL/4748/13) ve MRC (MC_PC_15026).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beakers Fisherbrand 15409083 Or any equilavent product
Curved Scissors Fisher Scientific 50-109-3542 Or any equilavent product
Disposable plastic pipette/ transfer Sarstedt 86.1174 6mL is best but other sizes are acceptable; remove tip to widen aperture
Dissecting microscope Brunel Microscopes LTD Or any equilavent product
Forceps World Precision Instruments Dumont #5 14095 Any equivalent fine forceps
Pasteur pipette Fisherbrand 11546963 Fire polished to reduce friction but not enough to narrow the tip
Petri dish Sigma-Aldrich P7741 Or any equilavent 10cm product
Pipette teat Fisherbrand 12426180 Or any equilavent product
Purified water supply Merek Milli-Q Integral Water Purification System Or any equilavent system
Round bottomed test tube Fisherbrand 14-958-10 B 5 mL; any equilavent product
Seratted forceps Fisher Scientific 17-467-230 Or any equilavent product
Single edge blades Agar Scientific T585 Or any equilavent product
Sylgard Dow Corning 184 Or any pliable surface 
Testtube rack Fisherbrand Derlin 10257963 Or any equilavent product
Pressure myography
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  x2 (or any equilavent product)
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software  Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Analysis plugin Myotraker  https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002 Custom plugin for imageJ Freely available for download
Cannulation pipette glass World Percision instruments TW150F-4 Or any equilavent product
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fluo-4-AM Thermo Fisher Scientific F14201 Make 1 mM stock in DMSO
Forceps World Precision Instruments Dumont #7 14097 Any equivalent fine forceps
Fura-2-AM Thermo Fisher Scientific F1221 Make 1 mM stock in DMSO
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Helper pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Manometer Riester LF1459 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W558818 75μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Or any equilavent product
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Video capture software Hypercam version 2.28.01 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Patch clamping
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2411 3 mg disolved daily in 50 μL of DMSO (sonicate to dissolve)
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200a Or any equilavent product
Analogue digital converter Axon Digidata 1440A Or any equilavent product
Collagenase Type 1A Sigma-Aldrich C9891  0.1mg/mL in LCH
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
DNAse I Millipore 260913 Working stock 1 MU mL-1 (10 MU diluted in 10 mL LCH) 
Faraday cage Custom made Any equilavent commerical product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
Headstage Molecular Devices CV203BU Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclypse TE 300 Or any equilavent product
Microelectrode puller Sutter instruments P97 Or any equilavent product
Microforge +  Olympus CX 31 microscope Glassworks Fine Point F-550 Or any equilavent product
Micromanipulator Sutter instruments MP-285 Or any equilavent product
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Patching software Molecular Devices Pclamp v10.2 Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Pipette holder Molecular Devices 1-HL-U Or any equilavent product
Protease Type XIV Sigma-Aldrich P5147  0.01mg/mL in LCH
Single channel pipette glass World Percision instruments IB150F-3 Or any equilavent product
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
USB camera  Logitech  HD Pro Webcam C920 Or any equilavent product
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
Whole cell pipette glass Warner Instruments GC150TF-7.5 Or any equilavent product
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product
x40 lens Nikon 40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2 Or any equilavent product
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Ca2+ imaging
3-way taps Cole-Parmer UY-30600-02 Or any equilavent product
3-axis mechanical manipulator Scientifica LBM-7  Or any equilavent product
Acquisition software  Cairn Research Ltd. Acquisition Engine V1.1.5 Or any equilavent product; microfluorimetry
Air table Technical Manufacturing Corporation  Clean Bench Or any equilavent product
Analysis software for confocal imaging Image J https://downloads.imagej.net/fiji/ Free imaging software
Computer Dell Optiplex 7010 Or any equilavent product
Confocal microscope Leica Geosystems SP5  Or any equilavent product; confocal
Digital Thermometer RS 206-3722 Or any equilavent product
Fine forceps Dumont No. 7 Any superfine forcep
Glass bottomed recording chamber Warner Instruments 64-0759 Or any equilavent product
In-line heater Custom made Commerical equilavent SH-27B Solution In-Line Heater from Harvard Apparatus
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000 Or any equilavent product; microfluorimetry
Monochromator  Cairn Research Ltd. Optoscan Or any equilavent product; microfluorimetry
Multi-channel delivery manifold  Automate Scientific Perfusion Pencil Or any equilavent product
Pipette filler  BD Plastipak 1mL Syringe heated and pulled to internal diameter of pipette
Software for confocal microscope Leica Geosystems LAS-AF version 3.3. Or any equilavent product; confocal
Suction pump Interpet AP1 Converted aeration pump by reversing bellows
Syringe BD Plastipak 20mL Luer-lok Or any equilavent product
Tungsten wire Advent W557418 50μm diameter
Tygon Tubing VWR miscellaneous sizes Any equilavent product to fit
Water bath Grant Sub Aqua 12 Plus Or any equilavent product
x100 lens Nikon x100 N.A. 1.3 oil Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Nikon 20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17 Or any equilavent product; microfluorimetry
x20 lens Leica Geosystems HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/D Or any equilavent product; confocal
x4 lens Nikon 4x/0.10, WD 30, ∞/- Or any equilavent product; microfluorimetry
x63 lens Leica Geosystems HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/E Or any equilavent product; confocal
Y-connectors World Percision Instruments 14012 Or any equilavent product
Pipettes Specifications and settings for fabrication of pipettes for experimentation
Helper pipette World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >10 MΩ
Cannulation pipette World Percision instruments TW150F-4 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 290
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 58
Time: 150
No of cycles: 4
Tip diameter: 3-10 μm
Polishing: no
Final Resistance: <1 MΩ
On-cell patching World Percision instruments IB150F-3 Inner diameter: 0.86 mm
Ramp: 261
Pressure: 300
Heat: 280
Pull : 0
Velocity: 56
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 0.5-2 μm
Polishing: yes
Final Resistance: >5 MΩ
Whole-cell patching Warner Instruments GC150TF-7.5 Inner diameter: 1.17 mm
Ramp: 296
Pressure: 200
Heat: 287
Pull : 0
Velocity: 50
Time: 250
No of cycles: 4
Tip diameter: 2-3 μm
Polishing: helpful but not necessary
Final Resistance: 1-2 MΩ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes. 44, 603-607 (1995).
  2. Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects. American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).
  3. Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis? Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).
  4. Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease). Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).
  5. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).
  6. Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
  7. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).
  8. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  9. Delaey, C., Van de Voorde, J. Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation. Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).
  10. Metea, M. R., Newman, E. A. Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling. Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).
  11. Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).
  12. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  13. Shepro, D., Morel, N. M. Pericyte physiology. The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).
  14. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network. Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  15. Matsushita, K., Puro, D. G. Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes. Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).
  16. Needham, M., et al. The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).
  17. Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles. Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).
  18. Delaey, C., Van de Voord, J. Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).
  19. Kur, J., et al. Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).
  20. Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).
  21. Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).
  22. McGahon, M. K., et al. TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).
  23. Guidoboni, G., et al. Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).
  24. Scholfield, C. N., Curtis, T. M. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina. Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).
  25. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  26. Sakmann, B., Neher, E. Single Channel Recording, Second Edition. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).
  27. Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis. PLoS One. 9, e91791 (2014).
  28. McGahon, M. K., et al. Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle. Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).
  29. Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
  30. Tumelty, J., et al. Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).
  31. Huynh, K. W., et al. Structural insight into the assembly of TRPV channels. Structure. 22 (2), 260-268 (2014).
  32. McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).
  33. McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes. Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).
  34. Ljubimov, A. V., et al. Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).
  35. Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).
  36. Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
  37. Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).
  38. Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level. Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).
  39. P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).

Tags

Biyoloji sayı: 137 Retina arteriyol yalıtım myogenic sesi myography yama-kelepçe arterioler düz kas kan akışını autoregulation kalsiyum görüntüleme
Retina arteriyoller yalıtım <em>Ex Vivo</em> Hücre fizyolojisi çalışmaları için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Curtis, T. M., McLaughlin, D.,… More

Curtis, T. M., McLaughlin, D., O'Hare, M., Kur, J., Barabas, P., Revolta, G., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., McGahon, M. K. Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies. J. Vis. Exp. (137), e57944, doi:10.3791/57944 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter