Summary
Plasmoniche nanorod oro possono essere intrappolati in liquidi e ruotato a frequenze kHz utilizzando pinzette ottiche polarizzata circolarmente. L'introduzione di strumenti per l'analisi dinamica browniano e luce scatteringspectroscopy conduce ad un potente sistema di ricerca e applicazione in numerosi campi della scienza.
Abstract
La possibilità per generare e misurare la rotazione e la coppia a scala nanometrica è di fondamentale interesse allo studio e all'applicazione di nanomotori biologico e artificiale e può fornire nuove rotte verso analisi unicellulare, studi di non-equilibrio termodinamica e azionamento meccanico dei sistemi su nanoscala. Un modo facile per rotazione consiste nell'utilizzare la luce polarizzata circolarmente laser concentrata in pinzette ottiche. Utilizzando questo approccio, nanoparticelle metalliche possono funzionare come altamente efficienti motori rotanti scattering-driven filatura alle frequenze di rotazione senza precedenti in acqua.
In questo protocollo, abbiamo delineare la costruzione e l'esercizio di pinzette ottiche circolarmente polarizzati per rotazione di nanoparticelle e descrivere la strumentazione necessaria per la registrazione il dynamics browniano e Rayleigh scattering delle particelle intrappolate. Il movimento di rotazione e gli spettri di dispersione fornisce informazioni indipendenti sulle proprietà della nanoparticella e l'ambiente circostante. La piattaforma sperimentale si è dimostrato utile come un misuratore nanoscopica di viscosità e temperatura locale, per tenere traccia delle modifiche morfologiche di nanorod e rivestimenti molecolari e come un trasduttore e sonda di photothermal e processi termodinamici.
Introduction
I metodi presentati in questo articolo consente di replicare quelli utilizzati nel nostro precedente lavoro1 per studiare gli effetti di photothermal su scala nanometrica che influenzano motori rotanti basati su luce oro nanorod. Varianti della piattaforma sperimentale è stato utilizzato in albergo diverse pubblicazioni relative2,3,4,5,6,7,8, 9.
Pinzette ottiche sono ampiamente utilizzate per il controllo di posizione, forza e momento lineare trasferimento a scale di lunghezza piccola in fisica, biologia e ingegneria10,11,12,13,14 . Quantità di moto angolare trasportato da luce circolarmente polarizzata può essere impiegato per ulteriori motion control perché continuamente trasferire coppia a oggetti intrappolati15. Combinando il trasferimento ottico lineare e angolare, è quindi possibile costruire nanomotori invasivo rotativo con potenziale per diverse applicazioni, come ad esempio la somministrazione di farmaci in singole cellule16,17, su scala nanometrica Chirurgia18e nanofluidica attivo19, tra gli altri.
Usando nanoparticelle metalliche come oggetto di manipolazione guidato luce, uno in grado di sfruttare i vantaggi della risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPR), che forniscono grandi sezioni trasversali ottiche, elevata sensibilità ai cambiamenti ambientali e grande campo miglioramenti20,21,22,23. Ciò ha portato ad una ricchezza degli studi al confine tra la plasmonica e manipolazione ottica8,24,25,26,27. L'interazione luce-materia forte fornito da LSPR ci ha permesso di progettare una piattaforma dove sono in grado di pilotare oro nanorod a girare alle frequenze di rotazione record in acqua2pinzette laser polarizzata circolarmente. Registrando il moto browniano di un rotazione nanorod, dettagliate informazioni su ambiente e temperatura ottenibile3,5. L'analisi spettroscopica simultanea fornisce un canale di ulteriori informazioni indipendenti per analisi temperatura locale e la stabilità morfologica del nanorod rotante1. Una gamma di sistemi e configurazioni sono stati utilizzati per lo studio e l'applicazione di movimento rotatorio a Pinzetta ottica, generando importanti intuizioni entro il campo15,28,29,30 , 31 , 32. Tuttavia, la maggior parte di questi studi hanno trattati con oggetti parecchi micrometri di diametro mentre un singolo nanorod dà accesso al regime di dimensione nanometrica. Inoltre, quando oro nanorod sono usati come il nanomotore rotativo, coppia di torsione è efficientemente trasferiti principalmente tramite dispersione2,33. Questo diminuisce il rischio di surriscaldamento delle particelle intrappolate3,34,35.
Nel metodo riportato di seguito, abbiamo delineare i passaggi necessari per costruire un sistema capace di intrappolamento ottico efficiente e rotazione di nanoparticelle metalliche. L'oro nanorod considerato in questi studi hanno alta dispersione sezioni trasversali, e la pressione di radiazione risulta per essere più forte della forza di gradiente contrastando in direzione di propagazione. Per ancora confinare le particelle in 3D, utilizziamo la forza dell'equilibrio tra repulsione di Coulomb da una superficie di vetro e la forza di dispersione di laser nella direzione di propagazione. Questa configurazione di 2D-intrappolamento espande notevolmente la gamma di particelle intercettabile, rispetto alla Pinzetta ottica 3D standard, e può essere facilmente combinato con spettroscopia e imaging ottico campo scuro.
Una nanoparticella di metallo intrappolata e rotazione interagisce con l'ambiente, e informazioni dettagliate su questa interazione sono contenuti nel suo movimento e le proprietà spettrali. Dopo aver descritto come costruire la pinzetta ottica polarizzata circolarmente, abbiamo pertanto anche delineare come integrare strumentazione per sondare la dinamica di rotazione e misurare gli spettri di scattering di Rayleigh nel setup sperimentale. Il risultato è una piattaforma versatile per lo studio di fenomeni di rotazione su scala nanometrica in fisica, chimica e biologia.
Questo protocollo si presuppone che il ricercatore abbia accesso alle nanoparticelle di metallo colloidale adatte, preferibilmente singolo nanorod di oro cristallino. Nanorod oro possono essere acquistati da aziende specializzate o sintetizzato in casa utilizzando metodi di bagnato-chimica. Nanorod utilizzato nei nostri esperimenti sono state fatte con il metodo di crescita mediata dal seme descritto in Ye et al. 201336. È vantaggioso se la morfologia e le proprietà ottiche delle nanoparticelle sono ben caratterizzate, ad esempio mediante misure di estinzione ottica e microscopia elettronica a scansione (SEM). Figura 1 Visualizza i dati registrati da tali misure per nanorod rappresentante tipi1.
Un contorno del protocollo è come segue: nella prima sezione, descriviamo la costruzione di pinzette ottiche basate su polarizzazione circolare. Nella seconda sezione, descriviamo come estrarre informazioni dal nanomotore registrando le sue proprietà di scattering e la dinamica di rotazione. La frequenza di rotazione e la rotazione moto browniano delle particelle intrappolate è misurata utilizzando la spettroscopia a correlazione di fotoni da proiettare luce retrodiffusa laser filtrata attraverso un polarizzatore lineare su un veloce singolo pixel detector3. Inserendo i dati a una funzione di autocorrelazione teorica, sia la frequenza di rotazione e il tempo di decadimento della diffusione rotazionale browniano possono essere estratti2,3. Le proprietà ottiche della nanoparticella intrappolata e rotante sono misurate usando la spettroscopia del campo scuro, che fornisce informazioni complementari sulla particella ed il relativo ambiente. Nella terza sezione, descriviamo la procedura sperimentale per l'intrappolamento e la rotazione di nanorod oro.
Il protocollo descritto fino a questo punto è un percorso semplice per un sistema funzionante di Pinzetta ottica polarizzata circolarmente per rotazione delle nanoparticelle. Tuttavia, a volte problemi che richiedono ulteriore attenzione. Nella quarta sezione, descriviamo alcuni dei problemi comuni che abbiamo incontrato e come risolverli. Questi includono questioni relative alla proprietà ottiche delle nanoparticelle che conducono alla stabilità trappola poveri (4.1), basse frequenze di rotazione a causa della polarizzazione circolare suboptimale causato da beamsplitter birifrangenza (4.2), attaccando delle nanoparticelle sulla superficie di vetro a causa di insufficiente repulsione di Coulomb (4.3) e la deviazione dal segnale caratteristico autocorrelazione (4.4).
Protocol
1. circolarmente polarizzati pinzette ottiche per la rotazione delle nanoparticelle
- Costruire l'installazione intorno un microscopio invertito adatto e utilizzare un laser visibile a rosso (660 nm). Un disegno schematico dell'apparato sperimentale è presentato nella Figura 2. Assicurarsi di scegliere un laser con un'uscita stabile di potenza fino a 500 mW (producendo una potenza sul piano di campione di circa 50 mW). Anche di garantire che il resto dei componenti svolgere bene la lunghezza d'onda del laser di intrappolamento.
- Utilizzare un obiettivo asciutto con un'apertura numerica (NA) di 0.95 e 40 ingrandimenti.
- Sempre indossare occhiali di sicurezza e mantenere la buona laser sicurezza (soprattutto se utilizza i laser non visibili). Eseguire l'allineamento sulla potenza minima laser. Incapsulare il percorso intero laser per la sicurezza e per evitare derive termiche e polvere nel percorso della luce.
Nota: A seconda dello stato di polarizzazione dell'uscita del laser, le pinzette ottiche potrebbero beneficiare di un polarizzatore lineare come il componente ottico iniziale di immissione. Se la polarizzazione del laser è già lineare, questo componente può essere omesso. - Usare un paio di lenti positive in una configurazione di telescopio kepleriano (lenti inferiore della Figura 2) per espandere il raggio laser, tale che il diametro del fascio è leggermente più grande l'apertura posteriore dell'obiettivo dell'intrappolamento.
Nota: Questo consente di utilizzano del NA intero dell'obiettivo e produrranno un focus di diffrazione limitata del trappola11, conseguente rigidità ottimale dell'intrappolamento. - Assicurarsi che il laser di intrappolamento è collimato correttamente dopo l'espansore del fascio. Questo può essere fatto facendo in modo che la dimensione del fascio è chiudere a invariato durante la propagazione all'obiettivo (o usando un interferometro di taglio).
- Utilizzare due specchi (M1 e M2 in Figura 2), montati su specchio cinematica Monti (e, se necessario, una fase di traduzione), per dirigere il fascio laser nel setup del microscopio.
Nota 1: Mantenere uno spazio sufficiente tra specchi laser e microscopio per essere in grado di aggiungere elementi ottici supplementari quali birifrangenti e beamsplitters.
Nota 2: Assicurarsi che il laser è sempre filtrato dall'oculare o qualsiasi altra luce accessibile uscendo al microscopio. - Utilizzare un beamsplitter (trasmissione/riflessione parziale 50/50 è usato qui, ma un dicroico potrebbe anche funzionare bene) dentro il microscopio a luce nell'obiettivo, senza perdere funzionalità di imaging e misura nel setup del microscopio laser in coppia.
- Includono una fotocamera (Vedi Figura 2) nel setup per successiva osservazione sperimentale e per la registrazione dei dati. Se si usa un sistema senza un oculare, questo è vitale per qualsiasi allineamento.
- Fuoco il laser su una lastra di vetro o uno specchio. Se il laser è allineato ed entra l'obiettivo ad una corretta angolazione, il modello di intensità laser è radialmente simmetrico quando cambiare la messa a fuoco sopra e sotto il punto focale.
- Ottimizzare gli angoli degli specchi laser (M1 e M2 in Figura 2) per ottenere l'allineamento ottimale del laser (come descritto in 1,9).
- Circolarmente polarizzare la luce laser.
- Il percorso della luce all'obiettivo, passare il laser attraverso una piastrina quarto d'onda (QWP; λ/4 nella Figura 2) orientato con l'asse veloce a 45 ° per la polarizzazione lineare del laser luce per convertire la luce polarizzata linearmente in luce polarizzata circolarmente alla l'aereo di campione.
- Impostare un polarizzatore lineare ruotabile a 360° e un misuratore di potenza davanti all'obiettivo.
- Verifica polarizzazione ruotando il polarizzatore lineare e rilevando la potenza massima e minima, corrispondente all'asse principale e secondario o l'ellisse di polarizzazione.
Nota: Il rapporto dovrebbe essere superiore a 0,9 per prestazioni ottimali rotazioni. Se questo non viene raggiunto, vedere il punto 4.2 per una soluzione.
- Misurare la potenza del laser sul piano del campione.
- Utilizzare un misuratore di potenza ottica per sondare la potenza del laser sul piano del campione. Fate attenzione a raccogliere tutta la luce passata attraverso l'obiettivo per una corretta misurazione del potere di intrappolamento.
- Eseguire una scansione lineare di potenze laser e registrare i corrispondenti poteri sul piano del campione per la successiva conversione in densità di potenza nella trappola.
- Impostare un sistema di campo scuro (DF) in Köhler illuminazione utilizzando un olio immerso condensatore DF per abilitare la visualizzazione delle particelle ed intercettazione degli eventi. Ciò consentirà di misurazioni sia imaging e spettroscopiche delle nanoparticelle intrappolate.
2. Strumentazione per misurazioni di rotazione, la rotazione dinamica browniana e proprietà spettroscopiche
- Spettroscopia di correlazione di fotone mediante un rivelatore di singolo pixel.
- Inserire il percorso ottico di un beamsplitter (30R/70T) al fine di estrarne luce retrodiffusa nanoparticella.
- Collegare un fotodiodo Si veloce singolo pixel a una scheda di acquisizione dati per consentire la registrazione dei segnali.
Nota: È importante avere un fotodiodo/DAQ che è in grado di misurare le frequenze di rotazione prevede (diverse decine di kHz). - Focalizzare la luce su una fibra collezione fissata in un xy-Monte di traduzione. Inserire un polarizzatore lineare prima la fibra di raccolta.
- Per allineamento della fibra insieme, coppia luce visibile all'estremità di uscita della fibra per illuminare il substrato. Questo consente la visualizzazione e l'analisi della regione raccolta della fibra.
- Regolare la posizione della fibra utilizzando il xy-traduzione montare, affinché la sua regione di raccolta coincide con la posizione della trappola ottica. Collegare l'estremità di uscita della fibra al Si-rivelatore e regolare la posizione della fibra per massimizzare la schiena raccolta segnale sparsi.
- Installazione di spettroscopia del campo scuro.
- Tenete a mente che la cura deve essere presa nella scelta di tutti i componenti ottici nel percorso tra il campione e lo spettrometro, in modo da non bloccare la luce all'interno della gamma spettrale di interesse.
- Prendere le dovute precauzioni come luce diretta laser sparsi e/o riflessa potrebbe danneggiare il sensore di spettrometro. Bloccare la luce laser utilizzando filtri appropriati e/o dicroici beamsplitters. Sempre eseguire l'allineamento del setup sulla potenza minima.
- Inserire un beamsplitter/specchio nel percorso ottico per reindirizzare la luce allo spettrometro (nel presente protocollo, uno spettrometro accoppiato di spazio libero viene utilizzato). Uno dei microscopi uscita porte potrebbero anche essere utilizzati, se adatto.
- Utilizzare filtri notch per rimuovere la luce di laser di intrappolamento intenso (filtri del totale OD12 alla lunghezza d'onda del laser sono stati necessari per bloccaggio sufficiente nel nostro caso), che in altro caso nasconderà la risposta spettrale della nanoparticella di interesse.
- Regolare la posizione di pinzette ottiche dagli specchi guida (M1 e M2 in Figura 2) modo coincide con la posizione della fessura spettrometro.
Nota 1: Le variazioni nella posizione della trappola ottica richiederà il riallineamento del sistema di misura di correlazione di fotone (istruzioni 2.1.4-2.1.5).
Nota 2: La nuova posizione di pinzette ottiche, istruzioni 1.9-1.10 devono essere ripetute per raggiungere una trappola ottica ben allineata.
3. procedura sperimentale
- Preparazione di particelle per esperimenti.
- Diluire le particelle in acqua deionizzata. Una concentrazione appropriata di nanorod dovrebbe essere in un range tra 0.1-0.01 pM. Sonicare la soluzione diluita in un bagno di pulita ad ultrasuoni per 2 min di break apart possibili aggregati e omogeneizzare la soluzione.
- Ottimizzare la concentrazione di nanorod nella diluizione al fine di evitare l'intrappolamento delle particelle più. Il più a lungo l'esperimento che verrà eseguita, più bassa la concentrazione necessaria per ridurre il rischio di intrappolare più particelle o contaminazioni.
- Preparazione della cella del campione.
- Lavare un vetrino da microscopio e una copertura in vetro (n. 1.5) in acetone e successivamente isopropanolo sotto sonicazione per cinque minuti, rispettivamente.
Nota: Assicurarsi che la carica superficiale della diapositiva vetro durante l'esperimento ha la stessa polarità come le nanoparticelle colloidali. Le nanoparticelle stabilizzate dal bromuro di esadeciltrimetilammonio tensioattivo (CTAB) sono caricati positivamente. - Inserire un nastro distanziatore di 100 µm bene sul vetrino.
- Disperdere 2 µ l della soluzione diluita di nanoparticelle sul vetrino da microscopio all'interno del pozzo e 2 µ l il vetro di copertura. Soluzione su entrambe le superfici permette un assemblaggio più controllabile della cella del campione.
- Collegare insieme le due parti della cella del campione, evitando di formare bolle d'aria all'interno della camera.
- Posizionare la cella sul palco di microscopio e mettere una goccia di olio di indice pari (immersione) sopra il campione ed una goccia sul condensatore. Gocce su bolle di evitare ogni lato nell'olio che disperde la luce e riduce il contrasto dell'illuminazione DF.
- Lavare un vetrino da microscopio e una copertura in vetro (n. 1.5) in acetone e successivamente isopropanolo sotto sonicazione per cinque minuti, rispettivamente.
- Esecuzione di un esperimento.
- Individuare una particella attraverso l'osservazione del sistema di imaging DF. Un singolo nanorod di solito possono essere identificati attraverso l'osservazione delle sue moto browniano (più irregolare rispetto aggregati) e colore (corrispondente alla più forte risonanza LSPR).
- Inizio/sbloccare il laser di intrappolamento.
- Attraverso una serie di movimento scenico e correzioni di messa a fuoco, spingere le particelle selezionate tramite pressione di radiazione esercitata nella direzione di propagazione del laser verso l'interfaccia acqua-vetro. A livello di interfaccia, la z-movimento è vincolato da un equilibrio tra la pressione di radiazione e repulsione di Coulomb fra CTAB molecole sulla superficie delle nanoparticelle e la superficie di caricata positivamente. Xy-fluttuazioni sono limitate dalle forze di gradiente nella Pinzetta ottica.
- Attraverso correzioni piccolo fuoco, massimizzare velocità stabilità o rotazione dell'intrappolamento, desunta dai dati di autocorrelazione (come descritto di seguito in istruzione 3.4).
- A questo punto, registrare la dinamica di rotazione sia proprietà spettroscopiche del nanorod intrappolati. Vedere istruzioni 3.4 e 3.5 sotto su come questi della sonda. Questo può essere fatto per lunghi periodi di tempo, fino a diverse ore se necessario.
- Misure la dinamica di rotazione.
- Assicurarsi di avere un'area di raccolta dalla fibra che è abbastanza grande da racchiudere sempre l'immagine della particella durante il suo moto traslazionale.
- Raccogliere intensità segnale di oscillazione con la cellula fotoelettrica Si a una data frequenza e raccolta sondaggio appropriata. Scegliere 65536 Hz e tempo di acquisizione 1 s per cominciare e regolare se necessario.
Nota: Frequenza di sondaggio deve essere almeno due (e in modo ottimale dieci) volte più grande rispetto alla frequenza di rotazione moltiplicata per il grado di simmetria di rotazione rilevabile (N, vedi sotto). Tempo di raccolta dovrebbe essere abbastanza a lungo per essere in grado di ottenere frequenze significativamente inferiore alla frequenza di rotazione. - Dopo aver raccolto un set di dati di fluttuazione di intensità da una nanoparticella rotante, calcolare l'autocorrelazione della fluttuazione di intensità. Questo viene fatto calcolando la correlazione del segnale con una copia ritardata di sé per ogni ritardo tempo τ (i.e.,C(τ) = {ho(τ) · Ho(0)}).
- Eseguire una misura della funzione di autocorrelazione teorica
dove ho0 è l'intensità media, ho1 è l'ampiezza della fluttuazione intensità e N è il grado di simmetria di rotazione rilevabile (per asta-come le particelle N = 2)2,3. - Dal fit, estrarre l'ora dimarcire e decadimento di rotazione frequenza fdi autocorrelazione segnale τ0 (legate alla dinamica rotazionale moto browniano).
- Misure spettroscopiche.
- Registrare uno spettro di luce bianco (iobianco(λ)) attraverso la raccolta di illuminazione luce. Questo può essere fatto mediante dispersione densamente uniformemente scattering perle di polistirolo su una superficie e raccogliendo la loro risposta di scattering.
- Registrare uno spettro di sfondo (hobkg(λ)) raccogliendo la luce parassita al posto di intrappolamento quando una particella non viene intrappolata.
Nota 1: Questo dovrebbe essere fatto per ogni singola misurazione, poiché la proprietà dello sfondo può variare notevolmente fra le cellule differenti del campione e posizioni all'interno di un campione.
Nota 2: Registrazione di spettri di sfondo dovrebbe essere fatto per la stessa potenza laser usato per optical trapping. Questo permette di rimuovere qualsiasi possibile auto-fluorescenza dal vetrino, eccitato dall'intensità del laser di alta nel fuoco. - Registrare uno spettro scuro (hoscuro(λ)), quando tutta la luce venuta al rivelatore di blocco. Quindi, registrare un spettro grezzo di una nanoparticella intrappolato (hocrudo(λ)).
- Accedere lo spettro di dispersione delle nanoparticelle effettivo calcolando
- Per estrarre informazioni circa le posizioni di picco LSPR, forma lo spettro di diffusione di DF in scala di energia con una funzione di raccordo bi-Lorentzian compreso un termine di correzione lineare per transizioni interbanda in oro. La funzione di modello si legge:
dove E è l'energia, B è un intensità della linea di base, k la pendenza della correzione lineare, iomi sono massimi di intensità, Γho la larghezza piena a metà maxima (FWHM) e E0, i le posizioni di picco dei due picchi Lorentziana.
4. risoluzione dei problemi e soluzione ai problemi più comuni
- Problemi legati alla proprietà di nanorod oro.
- Stabilità di scarsa abbondanza.
- Assicurarsi che la risonanza principale (solitamente longitudinale risonanza in caso di nanorod) sia sul lato di lunghezza d'onda blu di lunghezza d'onda del laser di intrappolamento. In caso contrario, la forza di gradiente diventerà ripugnante invece di attraente37.
- Come dimensione di un nanorod diminuisce, il movimento da aumenti di fluttuazioni browniano e allo stesso tempo la forza di stabilizzazione da trascinamento Stokes diminuisce. Assicurare nanorod sono abbastanza grandi per xy-Forza sfumatura per superare queste forze di destabilizzare.
- Caratteristiche spettrali sovrapposti o ampia.
- Canne da bisogno di avere un rapporto di aspetto abbastanza grande per i picchi LSPR essere sufficientemente separati per essere risolto individualmente (cfr. Figura 1b).
Nota: La lunghezza d'onda laser mette un limite superiore per l'anisotropia di forma, poiché i redshifts LSPR longitudinali per aste più lunghe. - Le nanoparticelle dovrebbero preferibilmente essere abbastanza piccole da non supportare modalità LSPR di ordine superiore nel regime del visibile, dato che questo complica l'analisi. Selezione delle nanoparticelle è un equilibrio tra questa considerazione e il problema di stabilità di intrappolamento nell'istruzione 4.1.1.2.
- Canne da bisogno di avere un rapporto di aspetto abbastanza grande per i picchi LSPR essere sufficientemente separati per essere risolto individualmente (cfr. Figura 1b).
- Stabilità di scarsa abbondanza.
- Polarizzazione circolare inadeguata del laser di intrappolamento.
Nota: Per ottenere le prestazioni ottimali di rotazione della nanoparticella intrappolata, la luce laser, raggiungendo il piano dell'oggetto dovrebbe essere polarizzata circolarmente. Beamsplitters e altri componenti ottici possono essere polarizzazione dipendente, che potrebbe comportare l'impossibilità di ottenere la polarizzazione circolare perfetta utilizzando solo un QWP.- Inserire una piastra semionda (HWP; λ/2 nella Figura 2) dopo il QWP nel percorso, per compensare il beamsplitter birifrangenza.
- Impostare il polarizzatore lineare e la configurazione del misuratore di alimentazione ed eseguire un'analisi dello stato di polarizzazione del laser (come istruzioni 1.11.2-1.11.3).
- Per ciascuna posizione in incrementi di cinque gradi del QWP, ruotare il HWP attraverso la sua intera gamma angolo (90°) a cinque gradi e misurare il rapporto di potenza per ogni posizione. Sforzarsi di trovare gli angoli di QWP e HWP che massimizzare il rapporto tra potenza massima e minima.
Nota: Nella nostra esperienza, il rapporto massimo tra le potenze massime e minime era 0,75 senza e 0,98 con la correzione HWP.
- Particelle che attacca all'interfaccia a laser di potenza insufficiente per confinare le particelle in xy-aereo.
- Ottimizzare la concentrazione di tensioattivo, attraverso una particella procedura e successiva ri-dispersione di nanorod di lavaggio in una concentrazione controllata di CTAB di stabilizzazione.
- Centrifugare la soluzione madre di nanoparticelle fino al sedimento di particelle (~ 5 min a 600g).
- Rimuovere il liquido della sospensione.
- Ri-disperdere in acqua. Questo diluisce il contenuto CTAB della soluzione madre.
- Ripetere i passaggi da 4.3.1.1. e 4.3.1.2. una volta di più.
Nota: Poiché CTAB agisce come agente di stabilizzazione coloida, evitare eccessiva centrifugazione tempo e velocità nelle successive fasi di lavaggio, poiché aumenta il rischio di aggregazione come il CTAB è lavato via. - La maggior parte dei tensioattivi CTAB nella soluzione colloidale originale viene rimosso e una nuova, ben controllata, concentrazione di CTAB può essere introdotto al colloide. Dalla nostra esperienza, disperdendo la soluzione di riserva in acqua con 20 µM di CTAB e successiva acqua DI diluizione per i risultati di concentrazione di soluzione sperimentale in una copertura superficiale che produce sufficiente repulsione di Coulomb.
- Possibile messa a punto della concentrazione CTAB potrebbe essere necessario creare repulsione di particelle/superficie appropriata per il batch particolare delle nanoparticelle utilizzate. Ripetere la procedura sopra descritta e leggermente alterare la concentrazione CTAB per trovare un posto adeguato.
- Superficie di vetro di lavaggio alla superficie di carica negativamente.
Nota: Questa procedura di lavaggio produce una superficie carica negativa che sarà rivestita con molecole CTAB nella soluzione sperimentale, rendendolo elettrostaticamente ripugnante per la particella e positivo durante la cattura 2D.- Prendere un vetrino da microscopio e pulirlo in una miscela di acqua e 2% in peso di base detergente riscaldato a 80 ° C per circa 10 minuti fino a quando la superficie è visibilmente idrofila.
Nota: Evitare di lavare vetrini troppo lungo o troppo duramente, poiché questo può rendere la superficie di vetro poroso e produrre un gran numero di particelle di contaminazione.
- Prendere un vetrino da microscopio e pulirlo in una miscela di acqua e 2% in peso di base detergente riscaldato a 80 ° C per circa 10 minuti fino a quando la superficie è visibilmente idrofila.
- Ottimizzare la concentrazione di tensioattivo, attraverso una particella procedura e successiva ri-dispersione di nanorod di lavaggio in una concentrazione controllata di CTAB di stabilizzazione.
- Problemi con spettroscopia di autocorrelazione di fotoni.
- Bassa ampiezza del segnale rumoroso o oscillazioni di intensità.
- Inserire un filtro passa-banda (BP filtro nella Figura 2) prima la fibra di raccolta, che passa la luce laser e la luce di illuminazione in campo scuro di blocchi.
Nota: In linea di principio, la misurazione funziona quando si raccolgono tutte le luce pure. Tuttavia, illuminazione a luce bianca non polarizzato DF eccita in modo efficiente dalla modalità aereo, e poiché un nanorod ruota attorno al proprio asse corto in un piano normale all'asse ottico, questo è il fuori trasversale aereo LSPR. Questa modalità non comporta alcuna anisotropia di forma durante la rotazione e solo raccogliendo la luce da esso riduce il segnale di rumore della misurazione.
- Inserire un filtro passa-banda (BP filtro nella Figura 2) prima la fibra di raccolta, che passa la luce laser e la luce di illuminazione in campo scuro di blocchi.
- Supplementari di deperimento in funzione di autocorrelazione.
- Assicurarsi che la dimensione del nucleo della fibra insieme è abbastanza grande per contenere l'immagine della nanoparticella durante tutte le sue escursioni a causa del moto browniano traslazionale.
- Se viene utilizzata una fibra con una dimensione troppo piccolo nucleo, sostituirlo con uno più grande.
- Controllare l'allineamento della nuova fibra, come in 2.1.4-2.1.5 di istruzioni.
- Bassa ampiezza del segnale rumoroso o oscillazioni di intensità.
Representative Results
La rotazione e il moto browniano rotazionale di un oro nanorod che correttamente viene intercettato nelle pinzette laser circolarmente polarizzata può essere sondata registrando fluttuazioni di intensità di dispersione della luce (Figura 3a) utilizzando un rivelatore di singolo pixel. Uno spettro di autocorrelazione di questo segnale contiene un componente oscillatorio, simile a quella mostrata nella Figura 3b. che può essere in forma per una funzione di autocorrelazione teorica. Il raccordo consente l'estrazione della frequenza di rotazione e il tempo di decadimento di autocorrelazione, che è legato alle fluttuazioni browniana rotazionale, dei nanorod.
Come accennato nel protocollo (istruzioni 4.4.2), è essenziale utilizzare un nucleo di fibra sufficientemente spessa per raccogliere la luce retrodiffusa laser per spettroscopia a correlazione di fotoni. Se questo non è il caso, un termine ulteriore decadimento legato alla traduzione delle particelle dentro e fuori il volume sonda sarà presente nella funzione di correlazione, vedere la Figura 4. Attraverso un'attenta analisi, questo potrebbe fornire ulteriori informazioni sul sistema; Tuttavia, complica l'analisi della dinamica rotazionale browniana contenuta nei dati.
Per ottenere gli spettri di dispersione DF corretti da nanoparticelle intrappolate, come descritto nella sezione 3.5, i dati spettrali crudi devono essere calibrato. Ciò avviene registrando lo spettro di lampada di illuminazione, nonché un spettro di fondo (Figura 5a). Messa a fuoco di luce laser intensa a una superficie di vetro, come il substrato contro cui sono intrappolati nanorod, quando alcuni fluorescenza potrebbe essere generato (si veda il contributo spettrale rosso nello spettro sfondo della Figura 5a). Questa contaminazione di fluorescenza può essere ridotto utilizzando substrati di silice fusa. Tuttavia, in ogni caso è altamente consigliato per registrare uno spettro di sfondo con pinzette ottiche vuote presso la potenza del laser corretta. Quando viene registrato uno spettro di scattering e tutte le componenti spettrali non legate alla dispersione delle nanoparticelle effettivo sono state compensate per, lo spettro può essere montato in scala di energia con una funzione di raccordo bi-Lorentzian per estrarre le informazioni relative alla Posizioni di picco LSPR (Figura 5b).
Figura 1: immagini al SEM e spettri di estinzione ensemble per due lotti rappresentativo nanoparticella. un) Barra della scala è di 200 nm. b) il blu/rosso bordered immagini al SEM in un) corrispondono allo spettro rosso/blu, rispettivamente. I picchi spettrali relazionati al LSPRs trasversali e longitudinali sono chiaramente distinguibili. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: illustrazione schematica del programma di installazione di pinzette ottiche per misure di rotazione di nanoparticella. Luce laser è collimata e ampliato attraverso un telescopio kepleriano e successivamente guidato l'obiettivo attraverso l'uso di due specchi mobili (M1, M2) e un beamsplitter (BS). Due birifrangenti nel percorso del laser ottimizzano la polarizzazione circolare delle pinzette ottiche (λ/2, λ/4). Luce laser backscattered possa essere ritirate dopo un polarizzatore lineare per spettroscopia a correlazione di fotoni e la dinamica di rotazione misurazioni. Dopo aver rimosso la luce laser, luce bianca diffusa è guidata da uno spettrometro o una macchina fotografica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: dati rappresentativi di intensità e autocorrelazione con curva adattano per una trappola e rotante nanorod. un) Fluttuazioni di intensità registrate dal rivelatore singolo pixel dopo un polarizzatore lineare per 1s e una trama ingrandita delle fluttuazioni. b) dati di autocorrelazione di fluttuazione di intensità per un nanorod oro rotante (punti blu), raccolti da luce retrodiffusa laser. I dati mostrano un'oscillazione che decade dopo alcuni periodi. L'oscillazione è relativo alla frequenza di rotazione di nanorod, considerando che il decadimento è movimento browniano rotatorio. Viene eseguita una misura della funzione di autocorrelazione teorico (linea rossa) per estrarre una frequenza di rotazione di f = 24285 ± 45 Hz e una correlazione decadimento tempo τ0 = 40,9 ± 1.06 µs. Le incertezze di0 f e τrappresentano gli intervalli di confidenza del 95% della fit, che ha un coefficiente di determinazione (R2) di 0.9877. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: problema con un volume troppo piccola sonda in correlazione fotone. misure di spettroscopia un) Dati di autocorrelazione per un nanorod oro rotante, raccolti tramite una spessa (400 µm, blu dati) e una sottile (62,5 µm, dati rossi) della fibra. Insieme utilizzando una fibra spessa assicura che il nanorod è sempre limitato all'interno del volume di sonda e che la funzione di autocorrelazione misure solo la dinamica di rotazione. Un termine ulteriore decadimento dovuto traslazionale browniano è presente quando il volume di sonda è insufficiente. In b) e c), illustrazioni schematiche dell'effetto vengono mostrate immagini della regione collezione retro-illuminato. Barre della scala sono 2 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: spettri di dispersione del campo scuro esemplare registrato per un oro nanorod otticamente intrappolati dalla luce di laser 660 nm. La regione spettrale 630-670 nm (1.85-1,97 eV) è distorto a causa di filtri notch necessari per bloccare la luce del laser di intrappolamento. un) spettri Raw scattering (blu scuro) presentano caratteristiche che non sono inerenti alla dispersione della particella e devono essere calibrati per. Questi includono lo spettro di sfondo (rosso), che contiene autofluorescence eccitato dalla luce di laser altamente concentrati, e lo spettro di eccitazione di luce bianca (arancione, registrato senza filtro notch). Dopo la calibrazione, lo spettro di dispersione corretto (blu chiaro) Mostra due picchi distinti LSPR come previsto. Le frecce indicano la scala per ogni spettro. b) spettro di Scattering per un nanorod intrappolati (punti blu) insieme a una vestibilità alla funzione del modello bi-Lorentzian (rossa) con i suoi componenti (azzurro e arancio). La regione spettrale distorta è ignorata nel raccordo dei dati e la fit ha un R2 di 0.9975. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
L'installazione di intrappolamento ottico descritto in questo protocollo è costruito intorno a un microscopio invertito commerciale e utilizza la luce laser rosso. Tuttavia, le tecniche descritte sono versatili e possono essere utilizzate per costruire la pinzetta ottica polarizzata circolarmente intorno più commerciale o casa costruita microscopi, entrambi in posizione verticale e invertito, con solo lievi alterazioni. La lunghezza d'onda del laser di registrazione dei colori possa essere scelti all'interno di uno spettro NIR largo visibile–, come il resto dei componenti ottici e rivelatori sono funzionali a questa lunghezza d'onda specifica. Tuttavia, quando si sceglie una lunghezza d'onda del laser, le dimensioni e la spettrale vicinanza alle risonanze delle particelle per essere manipolato dovrebbe essere considerati perché questo influenzerà le forze di intrappolamento ottico e rotazione prestazioni2,5, la grandezza di photothermal effetti1e la stabilità di intrappolamento26. In precedenza abbiamo lavorato con successo con pinzette laser circolarmente polarizzata utilizzando lunghezze d'onda laser di 660, 785, 830 e 1064 nm.
Uno dei più importanti componenti del setup dell'intrappolamento ottico è l'obiettivo del microscopio. L'obiettivo in questo protocollo è un obiettivo asciutto con NA = 0,95. L'uso di un obiettivo asciutto è sperimentalmente una realizzazione più semplice dell'installazione; Tuttavia, comporta aberrazioni ottiche a causa di rifrazione nelle interfacce delle cellule del campione. Nel caso di specie, il risultato è un punto di messa a fuoco leggermente allargata (~1.2 µm) rispetto al limite di diffrazione (~0.4 µm), ma questo non cambia in modo significativo le prestazioni generali o rotativa della piattaforma. In linea di principio, una vasta gamma di obiettivi del microscopio può essere utilizzato, a condizione che abbiano buona trasmissione a lunghezza d'onda di intrappolamento, polarizzazione buona manutenzione e abbastanza lunga distanza di lavoro per eseguire la registrazione dei colori attraverso un microscopio vetrini coprioggetto e strato d'acqua. In caso di intrappolamento 2D, il NA può essere relativamente basso, che rende l'intero esperimento più semplice e fornisce un pulitore polarizzazione circolare nel fuoco. Tuttavia, potenze laser superiori potrebbero essere richiesti che in caso di un alto obiettivo di NA. Nella nostra esperienza, le migliori prestazioni per il trapping, spettroscopia di rotazione e campo scuro è ottenuta con obiettivi con NA 0,7-0.95, ma è possibile utilizzare obiettivi NA inferiori così come superiori.
Per ottenere buona fotone misure di correlazione di moto rotatorio, è necessario un veloce singolo-detector. Scegliere un rivelatore con una larghezza di banda di almeno due, preferibilmente dieci, volte superiore rispetto alla frequenza di rotazione prevista moltiplicata per il fattore di degenerazione di forma e alta sensibilità alla lunghezza d'onda di registrazione dei colori utilizzati. Amplificato Si fotorivelatori, singolo fotone conteggio APDs e PMTs sono stati utilizzati con successo in diverse configurazioni di memoria nei nostri laboratori. Ulteriori informazioni, ad esempio sulla rigidità di trappola, possono essere ottenuti misurando ed analizzando cilindrata translational delle particelle usando tecniche consolidate come l'analisi spettrale di potere5. Un numero di precedenti pubblicazioni descriva diverse varianti di questa tecnica38,39. Spettroscopia di DF può essere eseguita utilizzando un vasta gamma dello spazio libero o fibra accoppiata spettrometri e la scelta dovrebbe essere basata sull'intervallo spettrale e la lunghezza d'onda e la risoluzione temporale necessario per lo studio pianificato.
Quando si esegue un esperimento di intrappolamento, ulteriori particelle possono entrare accidentalmente la trappola. Questo può essere rilevato mediante il monitoraggio della frequenza di rotazione, che fluttuerà fortemente dovuto la dispersione. Ispezione visiva da microscopia DF può essere utilizzato per verificare la presenza di una particella aggiuntiva, nel qual caso la fase può essere spostata per evitare ulteriori disturbi o l'esperimento deve essere riavviato.
Il sistema sopra descritto è un modo semplice ed efficiente per realizzare confinamento 2D e rotazione di nanoparticelle metalliche. Tuttavia, per alcune applicazioni, il grado di libertà supplementare per la manipolazione che viene fornito con intrappolamento 3D è importante, e la configurazione attuale è pertanto una limitazione. Tuttavia, rotazione e confinamento 3D potrebbe essere realizzabile utilizzando contatore propagazione pinzette laser o configurazioni di intrappolamento più esotiche.
Anche se i parametri delle particelle e sistema discussi qui possono essere ottimizzati per ridurre photothermal riscaldamento a ~ 15 K4, l'aumento di temperatura connesso con eccitazione plasmoniche di nanoparticelle metalliche può essere problematico in alcuni applicazioni. Un possibile percorso verso ulteriore riduzione di calore consiste nell'utilizzare nanoparticelle dielettriche ad alto indice anziché particelle plasmoniche. Tali particelle forti risonanze di scattering di Mie-tipo di supporto, ma allo stesso tempo presentano coefficienti di basso assorbimento intrinseco. Recentemente siamo stati in grado di produrre nanoparticelle Si risonante colloidali che potrebbero rivelarsi utili in questo rispetto40,41.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Knut e Alice Wallenberg Foundation, Consiglio di ricerca svedese e la zona di Chalmers di Advance nanoscienza e nanotecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gold nanoparticles | Purchased or home-grown | ||
| Commersial inverted microscope | Nikon | Eclipse TI | |
| Trapping laser | Cobolt | Flamenco 05-01 | 660 nm |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 40X | |
| Laser safety googles | Thorlabs | LG4 | |
| Assorted optomechanical components for mounting optics. | A range of mounts, posts and components from any company | ||
| Lens 1 Keplarian telescope | Thorlabs | AC254-035-A-ML | |
| Lens 2 Keplarian telescope | Thorlabs | LA1725-A-ML | |
| Silver coated mirrors | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | |
| Translation stage | Thorlabs | PT1/M | Quantity: 2 |
| 50/50 R/T Beamsplitter | Chroma | 21000 | |
| CMOS camera | Andor | Zyla 5.5 | |
| Quarter waveplate (QWP, λ/4) | Thorlabs | AQWP05M-600 | |
| Power meter | Thorlabs | PM100USB | |
| Photodiode Power Sensors | Thorlabs | S121C | |
| Linear polarizer | Thorlabs | LPVIS050 | For laser polarization measurement |
| 360° rotation mount | Thorlabs | RSP1/M | |
| Half waveplate (HWP, λ/2) | Thorlabs | AHWP05M-600 | Used if polarization is not sufficient with only QWP |
| Oil DF condenser | Nikon | C-DO Dark Field Condenser Oil | |
| 30/70 R/T Beamsplitter | Chroma | 21009 | |
| Fast Si detector | Thorlabs | PDA36A-EC | |
| Data Acquisition Module | National Instruments | USB-6361 | |
| Fiber 400 µm core size | Thorlabs | M74L01 | |
| xy-translation mount | Thorlabs | LM1XY/M | |
| Linear polarizer | Thorlabs | LPVIS050 | |
| Spectrometer | Princeton Instruments | IsoPlane SCT320 | |
| CCD camera for spectrometer | Princeton Instruments | PyLoN | |
| Notch filter | Semrock | NF03-658E-25 | |
| Notch filter | Thorlabs | NF658-26 | |
| Ultrasonic cleaner bath | Branson | Branson 3510 | |
| Microscope slide | Ted Pella | 260202 | |
| No. 1.5 Coverslips | VWR | 630-2873 | |
| Aceton | |||
| Isopropanol | |||
| Basic detergent | Hellma | Hellmanex III | Cleaning if particle sticking is an issue |
| Secure-Seal Spacer | Thermo Fisher | S24735 | Spacer tape with hole, for making sample cell |
| Immersion Oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
| PS beads | Microparticles GmbH | PS-R-5.0 | |
| Spectrophotometer | Agilent | Cary 5000 UV-Vis-NIR | |
| SEM | Zeiss | Ultra 55 FEG SEM | |
| Tweezers | Any brand |
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