Summary
Cirkulerende MicroRNA har vist lovende som biomarkører for hjerte-kar-sygdomme og akut myokardieinfarkt hjertet. I denne undersøgelse beskriver vi en protokol for miRNA udvinding, reverse transkription og digital PCR for den absolutte kvantificering af miRNAs i serum hos patienter med hjerte-kar-sygdom.
Abstract
Cirkulerende serum MicroRNA (miRNAs) har vist lovende som biomarkører for Kardiovaskulær sygdom og akut myokardieinfarkt (AMI), frigøres fra hjerte-kar-cellerne i omløb. Cirkulerende miRNAs er meget stabil og kan kvantificeres. Den kvantitative udtryk for specifikke miRNAs kan knyttes til patologi, og nogle miRNAs Vis høj væv og sygdom specificitet. Finde roman biomarkører for hjerte-kar-sygdomme er af betydning for medicinsk forskning. Ganske nylig, digital polymerase kædereaktion (dPCR) er blevet opfundet. dPCR, kombineret med fluorescerende hydrolyse sonder, giver mulighed for en specifik direkte absolutte kvantificering. dPCR udstiller overlegne tekniske kvaliteter, herunder en lav variabilitet, høj linearitet og høj følsomhed i forhold til den kvantitative Polymerasekædereaktionen (qPCR). DPCR er således en mere nøjagtig og reproducerbar metode til direkte kvantificere miRNAs, især til brug i store multicenter kardiovaskulære kliniske forsøg. I denne publikation beskriver vi, hvordan du effektivt udføre digital PCR for at vurdere den absolutte eksemplarnummer i serumprøver.
Introduction
Cirkulerende miRNAs er blevet identificeret som lovende markører for en række sygdomme, herunder hjerte-kar-sygdom1. MiRNAs er små, ikke-kodende enkeltstrenget RNA molekyler (ca 22 nukleotider lange) er involveret i post-transcriptional forordning via ændring af messenger RNA oversættelse og påvirke gen expression2, og frigives til omsætning i både fysiologiske og patologiske stater. Den kvantitative udtryk for specifikke miRNAs kan være knyttet til patologi, og nogle miRNAs Vis høj væv og sygdom specificitet1. I hjerte-kar-sygdomme blevet miRNAs attraktive kandidater som roman biomarkører fordi de er bemærkelsesværdigt stabilt i serum og kan nemt kvantificeres ved hjælp af PCR metode3. Den potentielle værdi af miRNAs som biomarkører for myokardieinfarkt er blevet evalueret i små undersøgelser, men en validering i store kohorter mangler2. For eksempel, miR-499 er fundet stærkt udtrykt i Myokardie musklen, og det har vist sig at være steget betydeligt i en AMI4,5,6. Yderligere, det regulerer programmeret celledød (apoptose) og differentiering af cardiomyocytes og er således involveret i flere mekanismer efter et AMI7. Bortset fra nogle små undersøgelser rapportering en trinvis værdi af miRNAs til diagnosticering af AMI og overlegenhed, overlegenhed eller ligestilling til Højfølsom hjerte troponins ikke endnu er blevet bevist i omfattende studier2,5 ,6,8. Flere prospektive studier i store kohorter behøves derfor, at vurdere den potentielle diagnostiske værdi af miRNAs. Derudover metoder miRNA bestemmelsesgrænsen skal optimeres og standardiseret bruger sammenlignelige protokoller9. Standardiseret assays kan reducere inkonsistente resultater og kan hjælpe miRNAs bliver potentielle biomarkører for rutinemæssig klinisk anvendelse, som biomarkører skal kvantificeres på en reproducerbar måde at sikre deres kliniske anvendelighed.
DPCR er for nylig blevet indført som end-point analyse. Det partitioner prøven i ca 20.000 individuelle reaktioner10. DPCR-systemet anvender derefter en matematisk Poisson statistisk analyse af fluorescerende signaler (positive og negative reaktioner), gør det muligt for en absolut kvantificering uden en standardkurve10. Når man kombinerer dPCR med fluorescerende hydrolyse sonder, muliggøres en meget specifik direkte absolutte kvantificering af miRNAs. Digital polymerase kædereaktion har vist sig for at udstille overlegne tekniske kvaliteter (herunder en nedsat variabilitet, en øget daglige reproducerbarhed, en høj grad af linearitet og en høj følsomhed) for kvantificering miRNA niveauer i de omsætning i forhold til kvantitative real-time PCR10,11. Disse overlegne tekniske kvaliteter kan bidrage til at afbøde nuværende begrænsninger på ved hjælp af cirkulerende miRNAs som biomarkører og kan føre til etablering af miRNAs som biomarkører i store multicenter kardiovaskulære kliniske forsøg og som diagnostisk metode i generelle. I en tidligere undersøgelse, vi for nylig anvendt dPCR til den absolutte kvantificering af cirkulerende miRNAs hos patienter med en AMI og kunne demonstrere superior diagnostiske potentiale i forhold til kvantificering af miRNAs af qPCR12.
I denne publikation vil vi vise, at ved hjælp af dPCR er en nøjagtig og reproducerbar metode til direkte kvantificering af cirkulerende kardiovaskulære miRNAs. Den absolutte kvantificering af miRNA niveauer i serum, ved hjælp af digital PCR, viser potentiale for brug i store multicenter kardiovaskulære kliniske forsøg. I denne publikation beskriver vi i detaljer hvordan man effektivt udføre digital PCR og hvordan man kan opdage absolutte miRNA kopi nummer i serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. udvinding af miRNA fra Plasma/Serum
Bemærk: For at kvantificere miRNAs korrekt, den korrekte mikroRNA isolation fra plasma/serum er et afgørende skridt. En vigtig ting at huske, især fordi der findes forskellige protokoller, er at overholde de samme arbejdsproces, mens behandling af prøverne. I denne protokol, er miRNA udvundet fra 50 µL serum. Brug ikke mere end 200 µL som denne grænse korrekte udpakningsprocessen.
- Forberede serum eller optø frosne prøver.
- Tilføje 250 µL (5 bind) kommerciel lysis reagens til 50 µL serum. Støtte lysering af vortexing. Placere røret med den lysate på bænken ved stuetemperatur i 5 min.
- Spike lysate med 3,5 µL af spike-objektet (1,6 x 107 kopier/µL) og bland dem ved vortexing.
- Tilføje 50 µL chloroform (dvs., et tilsvarende beløb, start serumprøven) for faseadskillelse. Rystes glasset kraftigt for 15 s. sted rør på bænken ved stuetemperatur i 2-3 min.
- Til faseadskillelse, der centrifugeres tube på 12.000 x g ved 4 ° C i 15 min.
Bemærk: Prøverne er nu opdelt i en øvre vandig fase indeholder RNA, en hvid interphase og en lavere, pink organiske fase. - Overføre den øverste vandfasen (100 µL) indeholdende RNA ind i et nyt rør. Overføre ikke hvide interphase materiale, som dette forfalsker de korrekte RNA count.
- Tilsæt 150 µL (dvs.1,5 x den overførte prøvemængden) 100% ethanol. Bland materialerne af pipettering dem op og ned. Ikke centrifugeres dem, og hurtigt gå videre til næste trin.
- Tilsæt 250 µL af prøven en kommerciel spin kolonne i et 2 mL collection tube. Luk låget. Centrifugeres kolonnen på > 8.000 x g ved stuetemperatur for 15 s. udsmid gennemstrømnings-.
- Tilføje 700 µL af kommercielle vask buffer nummer 1 til kolonnen spin. Luk låget og centrifugeres kolonnen på > 8.000 x g ved stuetemperatur for 15 s. udsmid gennemgangen vask buffer.
- Tilføje 500 µL af kommercielle vask buffer nummer 2 til kolonnen spin. Luk låget og centrifugeres kolonnen på > 8, 000 x g ved stuetemperatur for 15 s. udsmid gennemgangen vask buffer.
- Tilsæt 500 µL 80% ethanol til kolonnen spin. Luk låget, centrifugeres kolonnen på > 8, 000 x g ved stuetemperatur i 2 min. kassere collection tube med gennemstrømnings-.
- Overfør kolonnen spin til et nyt 2 mL collection tube. Der centrifugeres kolonnen ved fuld hastighed med en åbnede låget tørre membranen. Kassér collection tube med gennemstrømnings.
- Overfør kolonnen spin i en ny 1,5 mL collection tube. Elueres RNA ved at anvende 30 µL af RNase-fri vand direkte til centrum af membranen. Luk låget. Der centrifugeres kolonnen ved fuld hastighed i 1 minut.
- Gemme RNA ved-70 ° C.
Bemærk: Opbevaring af oprenset RNA i RNase-fri vand mellem 70 ° C-20 ° c sikrer ingen nedbrydning af RNA for 1 år. Efter fabrikantens protokol er minimum af RNase-fri vand til at fortynde RNA 10 µL. bruger mindre end 10 µL kan ikke tilstrækkelig hydrat membranen og reducere den samlede RNA udbytte.
2. reverse transkription
Bemærk: Supplerende DNA (cDNA) blev syntetiseret ved hjælp af følgende 15 µL reverse transkription (RT) protokollen (samlede reaktion volumen).
- Tø RT kit på is. Holde enzymerne i fryseren så længe som muligt at forhindre nedværdigende og dreje dem ned før brug. Tø RT primere på is og dreje dem ned før brug.
- Forberede den master mix, som beskrevet i tabel 1.
- Kombiner 10 µL af master mix og 5 µL af ekstraheret RNA pr. brønd i en 96 godt-plade.
- Der centrifugeres godt pladen på 2.000 x g ved 4 ° C i 2 min.
- Bruge varmecyklus protokollen beskrevet i tabel 2 til reverse transkription.
Bemærk: Som beskrevet nedenfor, cDNA kan direkte blive behandlet i den digitale PCR maskine (Se Tabel af materialer); Alternativt, det kan opbevares ved-20 ° C.
3. droplet Generation og Digital PCR
Bemærk: Digitalt PCR blev udført ved hjælp af de følgende 40 µL protokol.
- Optø den kommercielle dPCR mix, den forberedte cDNA og PCR-primere på is. Der centrifugeres dem kort før brug.
- Forberede den master mix som beskrevet i tabel 3.
- Tilføje 1,33 μL/brønd af varens RT og centrifugeres det kort.
- Med pipette overfoeres 20 μL af prøven til hver brønd af 8-godt kassette (mellemlang række).
Bemærk: Hvis den 8-godt kassette ikke er helt fyldt, fylde de resterende brønde med ikke-skabelon kontrol (NTCs), der udelader cDNA (dvs., RT produkt fremstillet med vand i stedet for ekstraheret RNA) eller dPCR kommerciel buffer. NTC fungerer som en forurening kontrol. Vandet må ikke anvendes i de resterende brønde, da der vil forringe kvaliteten af droplet-dannelse. - Der afpipetteres 70 μL af droplet generation olie til sonderne i oliekilder (nederste række) i 8-godt kassetten.
- Placere en pakning på toppen af 8-godt kassette og Placer kassetten i droplet generator. Luk droplet generator. Vent, indtil 3 indikatorlamperne er konstant grøn.
Bemærk: Dråber nu bliver genereret. - Forsigtigt og langsomt overføre 40 μL af droplet-dannet prøven (øverste række) i separate brønde i en 96-brønd plade af pipettering.
- Efter endt droplet-dannelse på prøverne, forsegle PCR pladen med en punktérbar dPCR folie på 180 ° C til 4 s.
- Folie-forseglet PCR-pladen anbringes i cycler og cykle det som beskrevet i tabel 4, på en rampe på 2,5 ° C/s.
4. droplet læsning og analysere
- Overføre pladen fra den termiske cycler til bunden af plade-indehaveren. Stramme PCR-plade ved at placere toppen af plade-indehaveren på PCR-pladen.
- Start den kommercielle dPCR software.
- Indtast prøve navn, navnet på eksperimentet, og målet i opsætningen. Vælg den absolutte kvantificering.
- Starte en droplet læsning ved at klikke på Kør. Vælg FAM/HEX eller FAM/VIC som påvisning kemi, når du arbejder med hydrolyse sonder.
Bemærk: Den kommercielle dPCR software vil derefter auto-analysere dataene. - Check droplet numre i resultattabellen for at sikre en korrekt droplet generation.
- Vælg alle brønde med de samme kvantificerede miRNA og klik på analyser. Bruge den 2D skamplet at markere positive dråber og manuelt korrigere den auto-analyseret data (figur 1).
5. korrekte beregninger på prøve
- Normalisere prøven ved at multiplicere prøven med normalisering faktor (NF).
NF = Median [C. elegans miR-39 målinger]alle prøver/ [C. elegans miR-39]given prøve - Beregne den endelige miRNA serum koncentration, justering for fortynding faktorer (DF).
[miRNA] endelige = [miRNA]rå værdi x DFRT x DFdPCR x DFEx
Hvor:
[miRNA] rå værdi = miRNA kvantificeres ved kommerciel dPCR software;
DFRT = fortyndingsfaktoren af skabelonen i reverse transkription;
DFdPCR = fortyndingsfaktoren af skabelonen i dPCR;
DFEx = fortyndingsfaktoren i udvinding.
6. syntetisk oligonukleotid fortyndingsrække
- Tø frysetørrede syntetiske oligonukleotid på is. Kort centrifugeres det.
- Fortynd den frysetørrede syntetiske oligonukleotid i nukleasen-gratis vand til en slutkoncentration på 10 pmol / µL. kort centrifugeres det.
- Fortynde det i nukleasen-gratis vand som beskrevet i tabel 5. Centrifugeres fortynding kort mellem hver fortynding trin ved 8.000 x g i 10 s.
- Fortsætte med reverse transkription som beskrevet i trin 2 og analysere prøver med digital PCR, som beskrevet i trin 3 og trin 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Digital PCR kombineret med fluorescerende hydrolyse sonder gør det muligt for forskere at direkte kvantificere de absolutte mængder af specifikke miRNAs i kopier/µL. Som eksemplet i dPCR er adskilt i ca 20.000 individuelle PCR reaktioner, dPCR kræver ikke teknisk replikater10. DPCR-systemet anvender en matematisk Poisson statistisk analyse af fluorescerende signaler (forskellige mellem positive og negative reaktioner) giver en absolut kvantificering uden behov for en standard kurve10. For at korrekt beregne koncentrationerne, er behov for en acceptabel droplet count (> 15.000). Ingen skabelon kontrol sikre udelukkelse af betydelige uspecifik forstærkning. Alle prøver inkluderet i analysen behandles ved hjælp af den samme lydstyrke, metode og PCR-protokol til at styrke gyldigheden af de opnåede resultater. De opnåede koncentrationer i dPCR normaliseres ved hjælp af en median normalisering procedure på tværs af alle prøver analyseres med syntetisk spidse i C. elegans miR-3913. Normalisering af data til den målte mængde af spidse i C. elegans miR-39 korrigerer for prøve til prøve variation i RNA udvinding effektivitet og fungerer som en PCR reaktion kontrol, yderligere øger gyldigheden af resultaterne. Der findes ingen etableret guld standard for normalisering serum miRNAs; dog eksogene kontrol som den spidse i C. elegans miR-39 er en elegant løsning til normalisering procedurer, som endogene miRNAs er ofte ændret i forskellige sygdom stater9.
De analyserede serumprøver er anskaffet før en perkutan koronar intervention (PCI), 8 h efter en PCI, og 16 h efter en PCI, fra patienter med en akut ST-segment elevation myokardieinfarkt (STEMI). STEMI patienter udviser alvorlige iskæmi og dermed kvalificerer sig til vurdering af nye iskæmi biomarkører. For at evaluere kinetik af miR-499 frigivelse og den potentielle anvendelse af miR-499 som en biomarkør for iskæmi i hjerte-kar-sygdom, blev miR-499 analyseret med dPCR på tværs af alle patienter for tre forskellige tid point14.
Figur 1 viser udvalg af positive dråber at give endelige miRNA koncentrationen beregnes af softwaren. Brøkdel af positive i en stikprøve bestemmer koncentrationen af kopier/µL som beregnet af kommerciel dPCR software. Resultaterne kan også visualiseres i en 2D plot og positive kan markeres manuelt med cirkler. Koncentrationer betragtes kun, hvis de er over den uspecifikke forstærkning af NTCs.
Figur 2 viser linearitet og godhed af anfald af en syntetisk miRNA oligonukleotid har-miR-499-5 p fortyndingsrække i dubletter. En 8-trins fortyndingsrække blev udført fra 2.500 kopier/µL til 0 kopier/µL. Den beregnede forventede kopier/µL som beskrevet i tabel 5 påtage sig 100% RT og digital PCR effektivitet. I denne opsætning, digital PCR viser en høj grad af linearitet (r2 = 0,99). Detektionsgrænsen (LoD = 0,12) og bestemmelsesgrænsen (LoQ = 0,23) er også præsenteret i figur 2, viser, at selv en lav miRNA udtryk kan påvises med succes. Således kan dPCR bruges til at kvantificere selv lav serumniveauer af cirkulerende miRNAs. Detektionsgrænsen (LoD) og bestemmelsesgrænsen (LoQ) beregnes efter tilgangen af Forootan et al. 15 og er defineret som LoD = LoB + 1.645 x σlavkoncentrationprøve, hvor grænsen for blank (LoB) beregnes som LoB = gennemsnitligTom + 1.645 x σTom. LoQ er så anslåede kører replikat standard kurver,15. For at sikre reproducerbare kvantificering af miRNAs, betragtes kun miRNA koncentrationer, der ligger over både LoD og LoQ som en gyldig nøjagtige værdi.
Figur 3 viser repræsentative resultater af miR-499 niveauer af patienter med en ST-elevation myokardieinfarkt (STEMI), n = 16 på hvert tidspunkt. Prøverne blev taget før en perkutan intervention (PCI) (t = 0), 8 h efter en PCI (t = 8), og 16 h efter en PCI (t = 16), og miR-499 niveauer blev sammenlignet med miR-499 niveauer af patienter med stabil koronar arteriesygdom (CAD, Nielsen = 20). De vigtigste patient kendetegn kan findes i tabel 6. Efter den første udgave af miR-499 i serum i de første 8 timer efter et myokardieinfarkt, falder miR-499 niveauet igen efter 16 h. En tendens til stigning ses allerede i begyndelsen af STEMI (t = 0), og en væsentlig forøgelse af miR-499 niveauer i forhold til patienter med CAD kan ses 8 timer efter STEMI (t = 8, p < 0,01) når man sammenligner miR-499 niveauer til miR-499 niveauer af stabil CAD patienter. Modtageren opererer kurver (ROC) Vis den mulige nytte af miR-499 som en roman biomarkør at skelne mellem patienter med CAD og patienter med en STEMI [arealet under kurven (AUC) = 0,62 for prøver taget før en perkutan intervention (PCI), AUC = 0,75 for prøver taget 8 h efter en PCI, og AUC = 0,78 for prøver taget 16 h efter en PCI i forhold til serumniveauer af miR-499 hos patienter med CAD].
Figur 1: udvælgelse af positive dråber i en fortyndingsrække udført i dubletter. (A) tærsklen, der er indstillet manuelt ovenfor de negative dråber. (B) resultater er visualiseret i en 2D skamplet, det positive, valgt af kredser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: syntetisk miR-499 oligonukleotid fortyndingsrække. (A) målingerne blev udført i to eksemplarer. Dataene præsenteres log omdannet som absolutte kopier pr. µL. lineær regressionsanalyse og godhed af fit (r2-værdi) vises. Dataene præsenteres som gennemsnit ± SEM. (B) dette panel viser detektionsgrænsen (LoD) og bestemmelsesgrænsen (LoQ). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantificering af cirkulerende serum miR-499-5 p hos patienter med ST-elevation myokardieinfarkt (n = 16) før perkutan koronar intervention (PCI), 8 h efter PCI og 16 h efter PCI, sammenlignet med patienter med stabil koronararterie sygdom (n = 20). (A) den cirkulerende serum miR-499-5 p er repræsenteret som middelværdi med standard fejl af middelværdien med tilhørende p-værdi beregnet ved en-vejs ANOVA efterfulgt af en Bonferroni post hoc test (p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant). (B) en receiver opererer karakteristiske kurve (ROC) analyse er udført på data fra panelet A. ROC analyse viser stor følsomhed og specificitet af en biomarkør. Yderligere, det tilsvarende areal under kurven (AUC) værdier er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| prøven beløb | ||||
| n = 1 | / godt [μl] | |||
| nukleasen-frit vand | 4.16 | |||
| 10 x Reverse transkription buffer | 1.5 | |||
| 100nM dNTP | 0,15 | |||
| RNAse hæmmer | 0,19 | |||
| specifikke RT Primer | 3 | |||
| Kommercielle Reverse transkriptase enzym 50 U/ul | 1 | |||
| Master-Mix i alt | 10 | |||
Tabel 1: Reverse transkription reagenser Mix.
| Temperatur | Tid |
| 16 ° C | 30 mins |
| 42 ° C | 30 mins |
| 85 ° C | 5 mins |
| 4 ° C | ∞ |
Tabel 2: Termisk cykling betingelser til Reverse transkription.
| prøven beløb | ||||
| n = 1 | / godt [μl] | |||
| nukleasen-frit vand | 7,67 | |||
| kommercielle dPCR mix | 10 | |||
| 20 x specifikke hydrolyse primer/sonde | 1 | |||
| Master-Mix i alt | 18.67 | |||
Tabel 3: Digital PCR reagens Mix.
| Temperatur | Tid |
| 95 ° C | 10 mins |
| 94 ° C | 30 sek (x40) |
| 60 ° C | 1 min |
| 98 ° C | 10 mins |
| 4 ° C | ∞ |
Tabel 4: Termisk cykling betingelser for digital PCR.
| Tube | Overført syntetiske oligonukleotid miR-499 (µL) | Fortyndingsvæsken (µL) | miRNA (kopier/µL) | Forventede kopier/µL i RT | Forventede kopier/µL i dPCR |
| Oprindelige | 6.022 x 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 x 106 | ||
| 4 | 18.7 | 981.3 | 1,128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150.4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1,128 x 102 | 37.6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
Tabel 5: Syntetisk fortyndingsrække af miR-499.
| Karakteristisk | Alle | Stabil CAD patienter (n = 20) | STEMI patienter (n = 24) | p-værdi |
| Alder | 64.7 ± 11,9 | 66,7 ± 13.1 | 62.2 ± 9,9 | 0.2810 |
| Hanner | 77,8% | 65% | 93.8% | 0.0392 |
| DM | 33,3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| HTN | 61.1% | 60% | 62,5% | 0.8785 |
| Dyslipidæmi | 38,9% | 65% | 6,3% | 0,0003 |
| Ryger | 47,2% | 55% | 37,5% | 0.3796 |
| Slægtshistorie | 25% | 35% | 12,5% | 0.1213 |
| Overvægt | 58,3% | 55% | 62,5% | 0.6501 |
| Serum kreatinin (mg/dL) | 0,94 (0,83 - 1) | 0,98 (0,82 - 1,01) | 0,93 (0,83 - 1) | 0.7255 |
| CK Peak (U / jeg) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0,0004 |
| cTnT Peak (ng/L) | 322.5 (23,8-4533) | 18 (7-25,3) | 2492 (240-5586) | 0.0002 |
| LVEF % | 45% (40% - 50%) | 45% (32,5% - 55%) | 45% (45% - 50%) | 0.9596 |
| Værdier er præsenteret som betyder ± SD; Median værdi (25 til 75 percentil range) eller % | ||||
| DM: Diabetes mellitus | ||||
| HTN: Hypertension | ||||
| CK: kreatinkinase | ||||
| cTnT: hjerte troponin T | ||||
| LVEF: Venstre ventrikel uddrivningsfraktion | ||||
Tabel 6: Main patient karakteristika.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Digital PCR er en relativt ny farveprøve metode til PCR, der giver mulighed for direkte absolutte kvantificering af nukleinsyrer i en prøve. Metoden besidder særlige fordele, herunder en nedsat variabilitet, en øget daglige reproducerbarhed og en overlegen følsomhed11,12. Yderligere, på grund af partitionering af prøven i ca 20.000 enkelt reaktioner og slutpunkt analyser, dPCR er mere robust over for interfererende stoffer i PCR sammenlignet med kvantitativ RT-PCR16. Disse kvaliteter i dPCR gør det til et attraktivt alternativ til kvantitativ RT-PCR som et diagnostisk redskab for kvantificering. Som cirkulerer miRNAs er ofte til stede ved lavt serumkoncentrationer, hidtil, forskere har været udfordret til passende kvantificere miRNAs af PCR9. På den anden side kan dPCR passende kvantificere selv lave miRNA udtryk i serum, afbøde de problemer, der er observeret i lavt antal miRNA kvantificering17. DPCR evne til direkte give tæller/µL, selv i en meget lav miRNA udtryk, således gør det et attraktivt diagnostisk redskab for hjerte-kar-forskersamfundet i miRNA biomarkør undersøgelser. Da koncentrationen i tæller/µL kan multipliceres med fortyndingsfaktoren bruges i udvinding, RT-reaktion og dPCR, er det muligt at opnå det nøjagtige antal eksemplarer i 1 µL serum. Arbejdsprocessen præsenteres her kan udføres i op til 96 prøver på en tallerken, dermed at yde et redskab for stort hjerte-kar-undersøgelser. Selvom dPCR udstiller flere fordele i forhold til kvantitativ RT-PCR, anvendes det endnu ikke rutinemæssigt for kvantificering af miRNAs i hjerte-kar-forsøg. Yderligere, standardiserede data normalisering procedurer mangler.
I denne tilgang viser vi, at dPCR, kombineret med fluorescerende hydrolyse sonder, giver den specifikke direkte absolutte kvantificering af cirkulerende miRNAs forbundet med hjerte-kar-sygdom. Med denne betænkning, vi havde til formål at både vise en optimeret protokol for miRNA registrering via dPCR og bekræfte fordelene ved dPCR over kvantitativ RT-PCR.
Vi bekræftede god linearitet dPCR udstillinger og de lave grænser for påvisning og kvantificering af dPCR for kvantificering miRNAs. Ved spiking prøve med en syntetisk oligonukleotid, er normalisering af prøven muligt, justering for ekstraktionseffektivitet og prøve til prøve variation.
Afslutningsvis digital PCR, som det udviser overlegenhed i både tekniske færdigheder og diagnostiske potentiale, er den bedste nuværende metode for miRNA kvantificering og kan yderligere anvendes til store multicenter kardiovaskulære miRNA biomarkør undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen anerkendelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
