Summary
Sirkulerende microRNAs har vist lovende som biomarkers for kardiovaskulære sykdommer og akutt myokardisk infarkt. I denne studien beskriver vi en protokoll for miRNA utvinning, omvendt transkripsjon og digital PCR for den absolutte kvantifiseringen av miRNAs i serum av pasienter med hjerte-og karsykdommer.
Abstract
Sirkulerende serum microRNAs (miRNAs) har vist lovende som biomarkers for hjerte-og karsykdommer og hjerteinfarkt (AMI), blitt løslatt fra hjerte cellene i sirkulasjonen. Sirkulerende miRNAs er svært stabile og kan kvantifiseres. Kvantitativ uttrykk for bestemte miRNAs kan kobles til patologi, og noen miRNAs viser høy vev og sykdom spesifisitet. Finne romanen biomarkers for kardiovaskulære sykdommer er av betydning for medisinsk forskning. Ganske nylig, digitale polymerasekjedereaksjons (dPCR) har oppfunnet. dPCR, kombinert med fluorescerende hydrolyse sonder, kan bestemt direkte absolutt kvantifisering. dPCR utstillinger overlegne tekniske egenskaper, inkludert lav variasjon, høy linearitet og høy sensitivitet sammenliknet med de kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR). Dermed er dPCR en mer nøyaktig og reproduserbar metode for direkte kvantifisere miRNAs, spesielt for bruk i store multi-senter hjerte kliniske forsøk. I denne publikasjonen beskriver vi hvordan å utføre digitale PCR for å vurdere hvor absolutt kopi i serumprøver.
Introduction
Sirkulerende miRNAs har blitt identifisert som lovende markører for en rekke sykdommer, inkludert hjerte sykdom1. MiRNAs er små, ikke-koding single-strandet RNA molekyler (ca 22 nukleotider lang) er involvert i den post-transcriptional forordning via endring av budbringer RNA oversettelsen og påvirker gene expression2, og inn i blodsirkulasjonen i både fysiologiske og patologiske tilstander. Kvantitativ uttrykk for bestemte miRNAs kan kobles til patologi, og noen miRNAs viser høy vev og sykdom spesifisitet1. I kardiovaskulære sykdommer, har miRNAs blitt attraktive kandidater som romanen biomarkers fordi de er bemerkelsesverdig stabil i serum og enkelt kan kvantifiseres ved hjelp av PCR metode3. Den potensielle verdien av miRNAs som biomarkers for hjerteinfarkt er evaluert i små studier, men en validering i store kohorter mangler2. For eksempel miR-499 finnes svært uttrykt i hjerteinfarkt muskler, og det har vist seg å være betydelig økt i en AMI4,5,6. Videre, den regulerer programmert celledød (apoptose) og differensiering av cardiomyocytes og er dermed involvert i flere mekanismer etter en AMI7. Bortsett fra noen små studier rapporterer en overlegenhet og inkrementell verdi av miRNAs for diagnostisering av AMI, har det overlegenhet eller likhet til høy følsomhet cardiac troponins ennå ikke påvist i store studier2,5 ,6,8. Flere prospektive studier i store kohorter er derfor nødvendig å vurdere potensielle diagnostiske verdien av miRNAs. Dessuten metodene for miRNA kvantifisering må optimaliseres og standardisert bruker sammenlignbare protokoller9. Standardisert analyser kan redusere inkonsekvente resultater og kan hjelpe miRNAs å bli potensielle biomarkers for rutinemessige klinisk program, som biomarkers må kvantifiseres i en reproduserbar måte å sikre sine klinisk anvendelse.
DPCR har nylig blitt introdusert som en end-point analyse. Det partisjoner prøven i ca 20.000 personlige reaksjoner10. DPCR systemet så benytter en matematisk statistisk Poisson-analyse av fluorescerende signaler (positive og negative reaksjoner), slik at en absolutt kvantifisering uten en standardkurve10. Når kombinere dPCR med fluorescerende hydrolyse sonder, er den svært spesifikke direkte absolutt kvantifiseringen av miRNAs gjort mulig. Digital polymerasekjedereaksjons har vist å overlegne tekniske egenskaper (inkludert en redusert variasjon, en økt daglige reproduserbarhet, en høy grad av linearitet og en høy følsomhet) for kvantifisering miRNA nivåer i den sirkulasjon sammenlignet med kvantitative sanntid PCR10,11. Disse overlegne tekniske egenskaper kan bidra til å redusere gjeldende begrensninger på bruk av sirkulerende miRNAs som biomarkers og kan føre til etableringen av miRNAs som biomarkers i store multi-senter hjerte kliniske forsøk og som en diagnostisk metode i generelt. I en tidligere studie, vi nylig brukt dPCR for den absolutte kvantifiseringen av sirkulerende miRNAs hos pasienter med en AMI og kunne vise førsteklasses diagnostiske muligheter sammenlignet kvantifisering av miRNAs av qPCR12.
I denne publikasjonen ønsker vi å vise at bruker dPCR er en nøyaktig og reproduserbar metode for direkte kvantifisere sirkulerende hjerte miRNAs. Absolutt kvantifiseringen miRNA nivåer i serum, bruke digitale PCR, viser potensial for bruk i store multi-senter hjerte kliniske studier. I denne beskrive vi i detalj hvordan å utføre digitale PCR og oppdage hvor absolutt miRNA kopi i serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. utvinning av miRNA fra Plasma/Serum
Merk: For å kvantifisere miRNAs riktig, riktig microRNA isolasjon fra plasma/serum er et viktig skritt. En viktig ting å huske på, spesielt fordi forskjellige protokoller finnes, er å følge den samme arbeidsflyten mens prøvene. I denne protokollen, er miRNA Hentet fra 50 µL av serum. Ikke bruk mer enn 200 µL som denne grensen riktig utpakkingen.
- Forberede serum eller tine frosne prøvene.
- Legge til 250 µL (5 volumer) kommersielle lysis reagens 50 µL av serum. Støtte til lysis av vortexing. Sett røret med den lysate på benken ved romtemperatur for 5 min.
- Spike lysate med 3,5 µL av spike-i kontroll (1.6 x 107 Kopier/µL) og bland dem ved vortexing.
- Legge til 50 µL av kloroform (dvs., like mye som starter serum utvalget) for fase separasjon. Rist røret kraftig 15 s. sted røret på benken ved romtemperatur for 2-3 minutter.
- For fase separasjon, sentrifuge røret på 12.000 x g på 4 ° C i 15 min.
Merk: Prøvene er nå delt inn i en øvre vandige fasen inneholder RNA, en hvit interphase og en lavere, rosa organisk fase. - Overføre den øvre vandige fasen (100 µL) som inneholder RNA i en ny tube. Overfør ikke hvit interphase materiale som dette forfalsker riktig RNA greven.
- Legge til 150 µL (dvs.1,5 x antall overførte prøven) av 100% etanol. Bland materialene ved pipettering dem opp og ned. Ikke sentrifuge dem, og raskt gå videre til neste trinn.
- Pipetter 250 µL av utvalget på en kommersiell spinn kolonne i en 2 mL samling rør. Lukk lokket. Sentrifuge kolonnen på > 8000 x g ved romtemperatur for 15 s. kast gjennomflytsenhet.
- Legge til 700 µL av kommersielle vaske bufferen nummer 1 i kolonnen spinn. Lukk dekslet og sentrifuge kolonnen på > 8000 x g ved romtemperatur for 15 s. kast gjennomgang vaske bufferen.
- Legg til 500 µL av kommersielle vaske bufferen nummer 2 kolonnen spinn. Lukk dekslet og sentrifuge kolonnen på > 8, 000 x g ved romtemperatur for 15 s. kast gjennomgang vaske bufferen.
- Pipetter 500 µL av 80% etanol kolonnen spinn. Lukk dekslet, sentrifuge kolonnen på > 8 000 x g ved romtemperatur for 2 min. forkaste samling røret med gjennomflytsenhet.
- Overføre kolonnen spin til en ny 2 mL samling rør. Sentrifuge kolonnen i full fart med en åpen lokk tørke membranen. Kast samling røret med gjennomflytsenhet.
- Overføre kolonnen spin til en ny 1,5 mL samling rør. Elute RNA ved å bruke 30 µL av RNase-fritt vann direkte til sentrum av membranen. Lukk lokket. Sentrifuge kolonnen i full fart for 1 min.
- Lagre RNA på-70 ° C.
Merk: Lagring av renset RNA i RNase-fritt vann-70 ° c til-20 ° C sikrer uten degradering av den for 1 år. Etter produsentens protokollen er minimum av RNase-gratis vann for å fortynne RNA 10 µL. bruker mindre enn 10 µL kan utilstrekkelig hydrat membranen og redusere den totale RNA avkastningen.
2. snu transkripsjon
Merk: Utfyllende DNA (cDNA) ble syntetisert ved hjelp av følgende 15 µL omvendt transkripsjon (RT) protokollen (totalt reaksjon volum).
- Tine RT kit på isen. Holde enzymer i fryseren så lenge som mulig å hindre dem fra nedverdigende og spinne dem ned før bruk. Tine RT primere på is og spinne dem ned før bruk.
- Klargjør master blandingen som beskrevet i tabell 1.
- Kombiner 10 µL av master mix og 5 µL av utdraget per brønn i en 96 godt-plate.
- Sentrifuge godt plate 2000 x g på 4 ° C i 2 minutter.
- Bruke termisk syklus protokollen beskrevet i tabell 2 for omvendt transkripsjon.
Merk: Som beskrevet nedenfor, cDNA kan direkte behandles i digital PCR maskinen (se Tabell for materiale); Alternativt kan det være lagret på 20 ° C.
3. slippverktøy generasjon og Digital PCR
Merk: Digital PCR ble utført ved hjelp av følgende 40 µL protokollen.
- Tine kommersielle dPCR mix, forberedt cDNA og PCR primere på is. Sentrifuge dem kort tid før bruk.
- Klargjør master blandingen som beskrevet i tabell 3.
- Legg 1,33 μL/vel av RT produktet og sentrifuge det kort.
- Pipetter 20 μL av prøven i hver brønn av 8-vel kassetten (middels rad).
Merk: Hvis 8-vel kassetten ikke er fullstendig utfylt, fylle opp de gjenværende brønnene med ikke-mal kontroller (NTCs) som utelater cDNA (dvs., RT produktet med vann i stedet for utdraget RNA) eller dPCR kommersiell buffer. NTC fungerer som en forurensningskontroll. Vann må ikke brukes i gjenværende brønnene, fordi det vil forringe kvaliteten på slippverktøy dannelsen. - Pipetter 70 μL slippverktøy generasjon olje for sonder i oljebrønner (nederste rad) av 8-vel kassetten.
- Plasser en pakning på 8-og kassetten og sett kassetten i slippverktøy generatoren. Lukk slippverktøy generatoren. Vent til 3 statuslysene er lyser grønt.
Merk: Dråper er nå blir generert. - Sakte og forsiktig overføre 40 μL droplet-formet prøven (øverste rad) i separate brønner av en 96-brønns plate av pipettering.
- Etter endt slippverktøy dannelsen på prøvene, forsegle PCR platen med en pierceable dPCR folie på 180 ° C for 4 s.
- Plasser folie-forseglet PCR-platen i cycler og sykle den som beskrevet i Tabell 4, med en rampe hastighet på 2,5 ° C/s.
4. slippverktøy lesing og analysere
- Overføre platen fra den termiske cycler til bunnen av platen abonnenten. Stram PCR platen ved å plassere toppen av platen holderen på PCR platen.
- Start kommersielle dPCR programvare.
- Angi eksempel navnet, navnet på eksperimentet, og målet i oppsettet. Velg den absolutte kvantifiseringen.
- Starte slippverktøyet lese ved å klikke Kjør. Velg FAM/HEX eller FAM/VIC som gjenkjenning kjemi når du arbeider med hydrolyse sonder.
Merk: Kommersielle dPCR programvaren vil deretter auto-analysere dataene. - Sjekk slippverktøy tallene i resultatene tabellen for å sikre en korrekt slippverktøy generasjon.
- Velg alle brønner med den samme kvantifisert miRNA og klikk analyser. Bruk 2D blot å markere positiv dråper og manuelt rette auto-analysert dataene (figur 1).
5. riktig beregninger på prøven
- Normalisere prøven ved å multiplisere prøven med normalisering faktoren (NF).
NF = Median [C. elegans miR-39 mål]alle prøver/ [C. elegans miR-39]gitt utvalg - Beregne siste miRNA serum konsentrasjonen, justering for fortynning faktorer (DF).
[miRNA] siste = [miRNA]råverdi x DFRT x DFdPCR x DFEx
Hvor:
[miRNA] råverdi = miRNA kvantifisert ved kommersielle dPCR programvare;
DFRT = fortynningsfaktoren for malen i omvendt transkripsjon;
DFdPCR = fortynningsfaktoren for malen i dPCR;
DFEx = fortynningsfaktoren i utvinning.
6. syntetisk Oligonucleotide fortynning serien
- Tine lyofilisert syntetisk oligonucleotide på is. Kort sentrifuge det.
- Fortynne den lyofilisert syntetisk oligonucleotide i nuclease-fritt vann til en siste konsentrasjon av 10 pmol / µL. kort sentrifuge det.
- Fortynne den i nuclease-fritt vann som beskrevet i tabell 5. Sentrifuge fortynning kort mellom hvert fortynning trinn 8000 x g for 10 s.
- Fortsett med omvendt transkripsjon som beskrevet i trinn 2, og analysere prøvene med digitale PCR som beskrevet i trinn 3 og 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Digital PCR kombinert med fluorescerende hydrolyse sonder kan forskere å kvantifisere direkte absolutt mengder bestemte miRNAs i Kopier/µL. Som eksemplet i dPCR er partisjonert i ca 20.000 personlige PCR reaksjoner, dPCR krever ikke teknisk replikerer10. DPCR systemet benytter en matematisk Poisson statistisk analyse av fluorescerende signaler (skiller mellom positive og negative reaksjoner) muliggjør en absolutt kvantifisering uten behovet for en standard kurve10. For å beregne konsentrasjonen på riktig måte, en akseptabel dråpe teller er nødvendig (> 15.000). Ingen mal kontroller sikre utelukkelse av betydelig uspesifikke forsterkning. Alle prøver inkludert i analysen behandles med samme volum, metode og PCR-protokollen til å styrke gyldigheten av fått resultatene. De innhentet konsentrasjonene i dPCR normalisert bruke en median normalisering prosedyre på tvers av alle prøver analysert med syntetisk piggete i C. elegans miR-3913. Normalisere dataene som skal måles mengden piggete i C. elegans miR-39 korrigerer for prøve å sample variant i RNA utvinning effektivitet og fungerer som en PCR reaksjon kontroll, videre legger til gyldigheten av resultatene. Det er ingen etablert gull standard for normalisering serum miRNAs; imidlertid eksogene kontroller som de piggete-i C. elegans miR-39 er en elegant løsning for normalisering prosedyrer som endogene miRNAs ofte endres i ulike sykdom stater9.
De analyserte serumprøver anskaffet før en PCI-behandling (PCI), 8 timer etter et PCI, og 16 h etter en PCI, fra pasienter med en akutt ST-segmentet-elevation hjerteinfarkt (STEMI). STEMI pasienter utstillingen alvorlige iskemi og dermed kvalifisere for vurdering av nye iskemi biomarkers. For å evaluere the kinetics av miR-499 utgivelsen og potensielle bruk av miR-499 som en biomarkør for iskemi i hjerte-og karsykdommer, ble miR-499 analysert med dPCR over alle pasienter for de tre ulike tidspunkt poeng14.
Figur 1 viser utvalget av positiv dråper gi endelige miRNA konsentrasjonen beregnet av programvaren. Brøkdel av positive i et utvalg bestemmer konsentrasjonen av Kopier/µL som beregnet av kommersielle dPCR. Resultatene kan også visualiseres i et 2D plott og positive manuelt kan merkes med sirkler. Konsentrasjoner betraktes bare dersom de er over uspesifikke forsterkning av NTCs.
Figur 2 viser linearitet og godhet av fit av en syntetisk miRNA oligonucleotide har-miR-499-5 p fortynning serie i duplikater. En 8-trinns fortynning serien ble utført fra 2500 Kopier/µL 0 Kopier/µL. Den beregnede forventede Kopier/µL antar som beskrevet i tabell 5 100% RT og digital PCR effektivitet. Dette oppsettet, digital PCR demonstrerer en høy grad av linearitet (r2 = 0,99). Grensen for påvisning (LoD = 0,12) og grensen for kvantifisering (LoQ = 0,23) presenteres også i figur 2, viser at selv et lavt miRNA uttrykk kan oppdages med hell. DPCR kan dermed brukes å kvantifisere selv lav serum nivåer av sirkulerende miRNAs. Grensen for påvisning (LoD) og grensen for kvantifisering (LoQ) beregnes etter tilnærming av Forootan et al. 15 og er definert som LoD = LoB + 1.645 x σlavkonsentrasjoneksempel, hvor grensen på tom (LoB) beregnes som LoB = betyrtom + 1.645 x σtom. LoQ er estimert løpende kopiere standard kurver15. For å sikre den reproduserbar kvantifiseringen av miRNAs, regnes bare miRNA konsentrasjoner som ligger over både LoD og LoQ som en gyldig eksakt verdi.
Figur 3 viser representant resultatene av miR-499 pasienter med en ST-elevation hjerteinfarkt (STEMI), n = 16 på hvert tidspunkt. Prøvene ble tatt før en PCI intervensjon (PCI) (t = 0), 8 timer etter et PCI (t = 8), og 16 h etter en PCI (t = 16), og miR-499 nivåene var forhold til miR-499 nivåer av pasienter med stabil koronarsykdom (CAD, n = 20). Pasienten hovedegenskapene kan finnes i tabell 6. Etter den første utgivelsen av miR-499 i serum i første 8 h etter et hjerteinfarkt, reduseres miR-499 nivåer igjen etter 16 h. En trend i økning allerede kan sees i begynnelsen av STEMI (t = 0), og en betydelig økning av miR-499 sammenlignet med pasienter med CAD kan sett 8 timer etter STEMI (t = 8, p < 0,01) når du sammenligner miR-499 nivåer miR-499 nivåer stabil CAD pasienter. Mottakeren opererer kurver (ROC) Vis mulig nytten av miR-499 som en roman biomarkør å skille mellom pasienter med CAD og pasienter med en STEMI [området under kurven (AUC) = 0,62 for prøver tatt før en PCI intervensjon (PCI), AUC = 0,75 for prøver tatt 8 timer etter et PCI og AUC = 0.78 for prøver tatt 16 h etter en PCI sammenlignet med serum nivåer av miR-499 hos pasienter med CAD].
Figur 1: utvalg av positiv dråper i en fortynning serie utført i duplikater. (A) terskelen er angitt manuelt over negative dråpene. (B) resultatene kan visualiseres i et 2D blot, det positive valgt av sirkle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: syntetisk miR-499 oligonucleotide fortynning serien. (A) målingene ble utført i duplikat. Dataene presenteres Logg forvandlet som absolutt eksemplarer per µL. lineære regresjoner og godhet av fit (r2-verdien) vises. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. (B) dette panelet viser grensen for påvisning (LoD) og grensen for kvantifisering (LoQ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kvantifisering av sirkulerende serum miR-499-5 p hos pasienter med ST-elevation hjerteinfarkt (n = 16) før PCI-behandling (PCI), 8 timer etter PCI og 16 h etter PCI, sammenlignet med pasienter med stabil koronar sykdom (n = 20). (A) circulating serum miR-499-5 p representeres som med standard feil av gjsnitt med tilsvarende p-verdi beregnet ved veis VARIANSANALYSE etterfulgt av en Bonferroni innlegget hoc test (p < 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant). (B) en mottaker opererer karakteristiske curve (ROC) analyse utføres på dataene fra panelet A. ROC analyse viser sensitivitet og spesifisitet av biomarkør. Videre tilsvarende området under kurven (AUC) verdiene vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| eksempel beløp | ||||
| n = 1 | / Vel [μl] | |||
| nuclease-fritt vann | 4,16 | |||
| 10 x reversere transkripsjon buffer | 1.5 | |||
| 100nM dNTP | 0,15 | |||
| RNAse hemmer | 0,19 | |||
| bestemt RT Primer | 3 | |||
| Kommersielle Revers transkriptase enzym 50 U/ul | 1 | |||
| Master-Mix total | 10 | |||
Tabell 1: Omvendt transkripsjon reagenser blanding.
| Temperatur | Tid |
| 16 ° C | 30 minutter |
| 42 ° C | 30 minutter |
| 85 ° C | 5 minutter |
| 4 ° C | ∞ |
Tabell 2: Sykling varmeforhold for omvendt transkripsjon.
| eksempel beløp | ||||
| n = 1 | / Vel [μl] | |||
| nuclease-fritt vann | 7.67 | |||
| kommersielle dPCR mix | 10 | |||
| 20 x bestemt hydrolyse primer/sonde | 1 | |||
| Master-Mix total | 18.67 | |||
Tabell 3: Digital PCR reagens blanding.
| Temperatur | Tid |
| 95 ° C | 10 minutter |
| 94 ° C | 30 sekunder (x40) |
| 60 ° C | 1 min |
| 98 ° C | 10 minutter |
| 4 ° C | ∞ |
Tabell 4: Sykling varmeforhold for digital PCR.
| Rør | Overført syntetisk oligonucleotide miR-499 (µL) | Fortynner (µL) | miRNA (Kopier/µL) | Forventet Kopier/µL i RT | Forventet Kopier/µL i dPCR |
| Opprinnelige | 6.022 x 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 x 106 | ||
| 4 | 18,7 | 981.3 | 1.128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150.4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 x 102 | 37.6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
Tabell 5: Syntetisk fortynning serien for miR-499.
| Karakteristisk | Alle | Stabil CAD pasienter (n = 20) | STEMI pasienter (n = 24) | p-verdien |
| Alder | 64,7 ± 11,9 | 66.7 ± 13.1 | 62.2 ± 9,9 | 0.2810 |
| Menn | 77.8% | 65% | 93.8% | 0.0392 |
| DM | 33,3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| HTN | 61.1% | 60% | 62,5% | 0.8785 |
| Dyslipidemi | 38,9% | 65% | 6,3% | 0.0003 |
| Røyker | 47,2% | 55% | 37,5% | 0.3796 |
| Familiens historie | 25% | 35% | 12,5% | 0.1213 |
| Overvekt | 58,3% | 55% | 62,5% | 0.6501 |
| Serum Creatinine (mg/dL) | 0,94 (0,83 - 1) | 0,98 (0,82 - 1.01) | 0.93 (0,83 - 1) | 0.7255 |
| CK Peak (U / jeg) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0,0004 |
| cTnT Peak (ng/L) | 322.5 (23.8-4533) | 18 (7-25.3) | 2492 (240-5586) | 0.0002 |
| LVEF % | 45% (40% - 50%) | 45% (32,5% - 55%) | 45% (45% - 50%) | 0.9596 |
| Verdier vises som betyr ± SD; Median verdien (25-75. persentil område) eller % | ||||
| DM: Diabetes mellitus | ||||
| HTN: hypertensjon | ||||
| CK: kreatin kinase | ||||
| cTnT: Cardiac troponin T | ||||
| LVEF: Venstre ventrikkel utstøting brøk | ||||
Tabell 6: Main pasienten egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Digital PCR er en relativt ny end-point PCR som tillater direkte absolutt kvantifisering av nukleinsyrer i et utvalg. Metoden har spesielle fordeler, inkludert en redusert variasjon, en økt daglige reproduserbarhet og en overlegen følsomhet11,12. Videre, på grunn av partisjonering av utvalget i ca 20.000 enkelt reaksjoner og sluttpunktet analyser, dPCR er mer robust til forstyrrende stoffer i PCR sammenlignet med kvantitative RT PCR16. Disse kvalitetene i dPCR gjør det et attraktivt alternativ til kvantitative RT PCR som et diagnostisk verktøy for kvantifisering. Som sirkulerer miRNAs finnes ofte i lav serum konsentrasjoner så langt, forskere har blitt utfordret til riktig kvantifisere miRNAs av PCR9. På den annen side, kan dPCR riktig kvantifisere selv et lite miRNA uttrykk i serum, begrensende problemene i lavt antall miRNA kvantifisering17. Muligheten for dPCR å direkte gi teller/µL, selv i en svært lav miRNA uttrykk, således gjør det et attraktivt diagnoseverktøyet for hjerte forskningen fellesskapet i miRNA biomarkør studier. Som konsentrasjonen i teller/µL kan multipliseres med fortynningsfaktoren utvinning, RT-reaksjon og dPCR, er det mulig å oppnå nøyaktig antall eksemplarer i 1 µL av serum. Arbeidsflyten presenteres her kan utføres i opptil 96 prøver på en tallerken, derfor gir et verktøy for stort hjerte studier. Selv om dPCR har flere fordeler sammenlignet med kvantitative RT PCR, brukes den ennå rutinemessig ikke for kvantifisering av miRNAs i hjerte forsøk. Videre, standardisert data normalisering prosedyrer mangler.
I denne tilnærmingen viser vi at dPCR, kombinert med fluorescerende hydrolyse sonder, gjør den bestemte direkte absolutt kvantifiseringen av sirkulerende miRNAs knyttet til hjerte-og karsykdommer. Med denne rapporten rettet vi både demonstrere en optimalisert protokoll for miRNA oppdagelsen via dPCR og bekrefte fordelene med dPCR over kvantitative RT PCR.
Vi bekreftet god linearitet dPCR utstillinger og lave grensene for deteksjon og måling av dPCR for kvantifisering av miRNAs. Skyter prøven med en syntetisk oligonucleotide, er normalisering av prøven mulig, justere utvinning effektivitet og prøve å sample variant.
Avslutningsvis digital PCR, som det viser overlegenhet i både teknisk dyktighet og diagnostiske muligheter, er den beste gjeldende metoden miRNA kvantifisering og kan videre brukes for store multi-senter hjerte miRNA biomarkør studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen takk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
