Summary
MicroRNAs circulación han demostrado promesa como biomarcadores para enfermedades cardiovasculares y los infartos agudos de miocardio. En este estudio, se describe un protocolo para la extracción de miRNA, transcripción inversa y PCR digital para la cuantificación absoluta de miRNAs en el suero de pacientes con enfermedad cardiovascular.
Abstract
Circulación del suero microRNAs (miRNAs) han demostrado promesa como biomarcadores para la enfermedad cardiovascular y el infarto agudo de miocardio (IAM), siendo liberado de las células cardiovasculares a la circulación. Circulación miRNAs son muy estables y pueden cuantificarse. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede vincularse con la patología y algunos miRNAs Mostrar tejido alta y especificidad de la enfermedad. Búsqueda de nuevos biomarcadores de enfermedades cardiovasculares es de importancia para la investigación médica. Recientemente, se ha inventado la reacción en cadena de polimerasa digital (dPCR). dPCR, combinado con sondas de hidrólisis fluorescente, permite la cuantificación absoluta directa específica. dPCR exhibe cualidades técnicas superiores, incluyendo una baja variabilidad, alta linealidad y alta sensibilidad en comparación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Así, la dPCR es un método más exacto y reproducible para cuantificar directamente el miRNAs, particularmente para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación describimos cómo realizar efectivamente la PCR digital para evaluar el número de copia absoluta en muestras de suero.
Introduction
Circulación miRNAs se han identificado como marcadores promisorios para un número de enfermedades, incluyendo enfermedades cardiovasculares1. Los miRNAs son pequeñas, moléculas de ARN monocatenario no codificante (aproximadamente 22 nucleótidos de largo) están implicadas en la regulación postranscripcional mediante la alteración de la traducción del ARN mensajero y que influencia gene expression2, y son liberados a la circulación en los Estados fisiológicos y patológicos. La expresión cuantitativa de miRNAs específicos puede ser vinculada a la patología, y algunos miRNAs tejido alta y especificidad de la enfermedad1. En las enfermedades cardiovasculares, miRNAs se han convertido en candidatos atractivos como nuevos biomarcadores porque son notablemente estables en el suero y puede ser cuantificada con la ayuda de la metodología PCR3. El valor potencial de miRNAs como biomarcadores para infarto de miocardio ha sido evaluado en estudios pequeños, pero carece de una validación en cohortes grandes2. Por ejemplo, miR-499 se encuentra altamente expresada en el músculo miocardio, y se ha demostrado para ser aumentada significativamente en un AMI4,5,6. Además, regula programada muerte celular (apoptosis) y la diferenciación de los cardiomiocitos y así participa de varios mecanismos después de una IAM7. Aparte de algunos pequeños estudios reportando un valor incremental de miRNAs para el diagnóstico de IAM y superioridad, la superioridad o igualdad de troponinas cardiacas de alta sensibilidad no todavía ha probado en estudios de gran escala2,5 ,6,8. Más estudios prospectivos de cohortes grandes son, por lo tanto, necesarios para evaluar el valor potencial de diagnóstico de miRNAs. Además, métodos de cuantificación de miRNA necesitan ser optimizados y estandarizados usando comparables protocolos9. Ensayos estandarizados pueden reducir resultados inconsistentes y los miRNAs para convertirse en potenciales biomarcadores para el uso clínico rutinario, como biomarcadores deben ser cuantificados de una manera reproducible para asegurar su aplicabilidad clínica.
Recientemente, se ha introducido dPCR como un análisis de punto final. Divide la muestra en aproximadamente 20.000 reacciones individuales10. El sistema de dPCR entonces utiliza un Poisson estadístico análisis matemático de señales fluorescentes (reacciones positivas y negativas), lo que permite una cuantificación absoluta sin una curva estándar10. Cuando se combinan dPCR con sondas fluorescentes de hidrólisis, es posible la cuantificación absoluta directa altamente específica de miRNAs. Reacción en cadena de polimerasa digital ha demostrado exhibir cualidades técnicas superiores (incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día, un alto grado de linealidad y una alta sensibilidad) para cuantificar los niveles de miRNA en el circulación en comparación con la PCR en tiempo real cuantitativa10,11. Estas cualidades técnicas superiores podrían ayudar a mitigar las limitaciones actuales en el uso de circulación miRNAs como biomarcadores y pueden conducir al establecimiento de miRNAs como biomarcadores en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros y como método de diagnóstico en general. En un estudio anterior, recientemente aplicada dPCR la cuantificación absoluta de miRNAs en pacientes con un IAM de circulación y fueron capaces de demostrar el potencial diagnóstico superior en comparación con la cuantificación de miRNAs por qPCR12.
En esta publicación, queremos demostrar que el uso de dPCR es un método preciso y reproducible para cuantificar directamente la circulación cardiovascular miRNAs. La cuantificación absoluta de miRNA niveles en suero, utilizando PCR digital, muestra potencial para el uso en grandes ensayos clínicos cardiovasculares múltiples centros. En esta publicación Describimos detalladamente cómo realizar con eficacia la PCR digital y cómo detectar el número de copia absoluto miRNA en suero.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. extracción de miRNA de suero, Plasma
Nota: Para cuantificar apropiadamente miRNAs, el aislamiento correcto microRNA del plasma/suero es un paso crucial. Una cosa fundamental a tener en cuenta, sobre todo porque existen diferentes protocolos, es seguir el mismo flujo de trabajo durante el procesamiento de las muestras. En este protocolo, miRNA se extrae de 50 μl de suero. No use más de 200 μL como este límite el proceso de extracción correcto.
- Preparar suero o descongelar las muestras congeladas.
- Añadir 250 μl (5 volúmenes) de reactivo de lisis comercial a 50 μl de suero. Apoyar la lisis con un vórtex. Coloque el tubo con el lisado en el banquillo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Spike el lisado con 3.5 μl de spike en el control (1.6 x 107 copias/μL) y mezclar con un vórtex.
- Añadir 50 μl de cloroformo (es decir, una cantidad igual a la muestra a partir de suero) para la separación de fase. Agitar el tubo vigorosamente por 15 s. lugar el tubo en el banquillo a temperatura ambiente durante 2-3 min.
- Para la separación de fases, centrifugar el tubo a 12.000 x g a 4 ° C durante 15 minutos.
Nota: Las muestras se dividen ahora en una fase acuosa superior que contiene el ARN, una interfase blanco y una fase orgánica inferior, de color rosado. - Transferir la fase acuosa superior (100 μL) que contiene el RNA en un tubo nuevo. No transferir cualquier material de interfase blanco esto falsea la correcta cuenta de RNA.
- Añadir 150 μL (es decir, 1.5 x el volumen de la muestra transferido) de etanol al 100%. Mezclar los materiales mediante pipeteo les hacia arriba y hacia abajo. No los Centrifugue y pasar rápidamente al siguiente paso.
- Pipetear 250 μl de la muestra en una columna de giro comercial en un tubo de recogida de 2 mL. Cierre la tapa. Centrifugar la columna > 8.000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. descarte el flujo a través.
- Añadir 700 μl de buffer lava comercial 1 a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8.000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. desechar el tampón de lavado de repaso.
- Añadir 500 μl de tampón de lavado comercial 2 a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8, 000 x g a temperatura ambiente durante 15 s. desechar el tampón de lavado de repaso.
- Pipetear 500 μl de etanol al 80% a la columna de vuelta. Cierre la tapa y centrifugar la columna > 8, 000 x g a temperatura ambiente durante 2 minutos deseche el tubo de la colección con el flujo a través.
- Transferencia de la columna de spin a un tubo nuevo de colección de 2 mL. Centrifugar la columna a toda velocidad con una tapa abierta para secar la membrana. Deseche el tubo de la colección con el flujo a través.
- Transferir la columna de la vuelta a un nuevo tubo de recogida de 1,5 mL. Eluir el RNA aplicando 30 μl de agua libre de ARNasa directamente al centro de la membrana. Cierre la tapa. Centrifugar la columna a toda velocidad durante 1 minuto.
- Guardar el ARN a-70 ° C.
Nota: El almacenamiento de ARN purificado en agua libre de ARNasa entre-70 ° C a-20 ° C no asegura la degradación del RNA durante 1 año. Siguiendo el protocolo del fabricante, la cantidad mínima de agua libre de ARNasa a diluir el ARN es de 10 μl. con menos de 10 μl escaso puede hidratar la membrana y reducir la producción de RNA total.
2. transcripción reversa
Nota: El ADN complementario (cDNA) fue sintetizado utilizando el siguiente protocolo de transcripción inversa (RT) de 15 μl (volumen de reacción total).
- Descongelar el kit de RT en el hielo. Mantenga las enzimas en el congelador tanto como sea posible para evitar de degradar y los hace girar hacia abajo antes de usar. Descongelar cartillas de RT en el hielo y los hace girar hacia abajo antes de usar.
- Preparar la mezcla principal como se describe en la tabla 1.
- Mezclar 10 μl de la mezcla principal y 5 μl del ARN extraído por pozo en una placa de 96 pozos.
- Centrifugar la placa bien a 2.000 x g a 4 ° C por 2 min.
- Utilizar el protocolo de ciclo térmico descrito en la tabla 2 para la transcripción inversa.
Nota: Como se describe a continuación, cDNA puede directamente ser procesado en la máquina digital de la PCR (véase Tabla de materiales); Alternativamente, pueden ser almacenada a-20 ° C.
3. gota generación y PCR Digital
Nota: Digital PCR se realizó utilizando el siguiente protocolo de 40 μl.
- Descongelar la mezcla comercial dPCR, el cDNA preparado y los cebadores PCR en hielo. Centrifugue los poco antes de su uso.
- Preparar la mezcla principal como se describe en tabla 3.
- Agregar 1.33 μL/pocillo del producto RT y centrifugar brevemente.
- Pipetear 20 μL de la muestra en cada pocillo de la cassette de 8 bien (fila media).
Nota: Si el cassette 8-bien no está totalmente lleno, llenar los pozos restantes con plantilla no controles (NTSC) que omiten cDNA (es decir, el producto RT producido con agua en lugar de RNA extraído) o almacenador intermediario comercial dPCR. El CNT sirve como un control de la contaminación. Agua no debe utilizarse en los pozos restantes, ya afectará la calidad de la formación de gotas. - Pipetee 70 μL del aceite de generación de gotas para las sondas en los pozos de petróleo (fila inferior) del cassette 8-bien.
- Colocar una junta en la parte superior del cartucho 8-bien y coloque el cartucho en el generador de gotas. Cierre el generador de gotas. Espere hasta que los 3 indicadores luminosos son de color verde.
Nota: Las gotas se están generando ahora. - Cuidadosamente y lentamente transferencia 40 μL de la muestra gota-formado (fila superior) en pocillos distintos de una placa de 96 pocillos mediante pipeteo.
- Después de completar la formación de gotas en las muestras, sellar la placa PCR con una hoja de dPCR perforable a 180 ° C para 4 s.
- Coloque la placa de PCR papel sellado en el cycler y ciclo tal como se describe en la tabla 4, a una tasa de rampa de 2.5 ° C/s.
4. gotita lectura y análisis de
- Transferir la placa del termociclador a la base del soporte de la placa. Ajuste la placa PCR mediante la colocación de la parte superior del porta placa en la placa de la polimerización en cadena.
- Inicie el software de dPCR comercial.
- Introduzca el nombre de la muestra, el nombre del experimento y el objetivo en el programa de instalación. Seleccione la cuantificación absoluta.
- Iniciar la gota de lectura haciendo clic en Ejecutar. Seleccione FAM/HEX o FAM/VIC como química de detección con sondas de hidrólisis.
Nota: El software comercial dPCR entonces auto-analizar los datos. - Compruebe el número de gotas en la tabla de resultados para asegurar una generación correcta gota.
- Seleccione todos los pozos con el mismo miRNA cuantificado y haga clic en analizar. Utilice el blot 2D gotas positivas y corregir manualmente los datos de auto-análisis (figura 1).
5. corregir los cálculos sobre la muestra
- Normalizar la muestra multiplicando la muestra por el factor de normalización (NF).
NF = mediana [C. elegans miR-39 mediciones]todas las muestras/ [C. elegans miR-39]muestra - Calcular la concentración de suero de miRNA final, ajuste para los factores de dilución (DF).
[miRNA] final = [miRNA]valor crudo x DFRT x DFdPCR x DFEx
Donde:
[miRNA] valor bruto = miRNA cuantificado por software comercial dPCR;
DFRT = factor de dilución de la plantilla en reversa de la transcripción;
DFdPCR = factor de dilución de la plantilla de dPCR;
DFEx = el factor de dilución en la extracción.
6. serie de diluciones de oligonucleótidos sintéticos
- Descongelar el oligonucleótido sintético liofilizado en hielo. Centrifugar brevemente lo.
- Diluir el liofilizado oligonucleótidos sintéticos en agua libre de nucleasa para una concentración final de 10 pmol / μl. brevemente Centrifugue lo.
- Diluir en agua libre de nucleasa como se describe en la tabla 5. Centrifugue la dilución brevemente entre cada paso de dilución a 8.000 x g durante 10 s.
- Continuar con la transcripción inversa como se describe en el paso 2 y analizar las muestras con la PCR digital tal como se describe en el paso 3 y paso 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PCR digital combinado con sondas fluorescentes de hidrólisis permite a los investigadores cuantificar directamente las cantidades absolutas de miRNAs específicos en copias/μl. Como la muestra de dPCR se reparte en reacciones de PCR individuales aproximadamente 20.000, dPCR no requiere técnica Replica10. El sistema de dPCR utiliza un análisis estadístico matemático de Poisson de señales fluorescentes (diferencia entre las reacciones positivas y negativas) que permiten una cuantificación absoluta sin la necesidad de un estándar de la curva10. Para calcular correctamente las concentraciones, se necesita una cuenta gota aceptable (> 15.000). No hay controles de plantilla garantizan la exclusión de gran amplificación inespecífica. Todas las muestras incluidas en el análisis son procesadas utilizando el mismo volumen, el método y el protocolo PCR para reforzar la validez de los resultados obtenidos. Las concentraciones obtenidas en dPCR se normalizan mediante un procedimiento de normalización mediana a través de todas las muestras analizadas con el sintético tacon en C. elegans miR-3913. Normalización de los datos a la cantidad medida del tacon en C. elegans miR-39 corrige la variación de muestra a muestra de la eficiencia de extracción de RNA y sirve como un control de la reacción de PCR, adición adicional a la validez de los resultados. Existe ningún estándar establecido de oro para normalizar suero miRNAs; sin embargo, los controles exógenos como el tacon en C. elegans miR-39 son una solución elegante para los procedimientos de normalización, como miRNAs endógenos se alteran a menudo en varios Estados de la enfermedad9.
Las muestras de suero analizadas fueron adquiridas antes de una intervención coronaria percutánea (PCI), 8 h después de un PCI y 16 h después de un PCI, de pacientes con un infarto agudo de miocardio elevación de segmento ST (IAMCEST). Pacientes con IAMCEST presentan isquemia severa y así califican para la evaluación de nuevos marcadores de isquemia. Para evaluar la cinética de liberación de miR-499 y el uso potencial de miR-499 como un biomarcador de isquemia en la enfermedad cardiovascular, miR-499 se analizó con dPCR a través de todos los pacientes para el tres veces diferentes puntos14.
Figura 1 se muestra la selección de gotas positivo dar la concentración final miRNA calculada por el software. La fracción de positivos en una muestra determina la concentración de copias/μl calculado por el software comercial dPCR. Los resultados también se pueden visualizar en un diagrama 2D y los aspectos positivos se pueden marcar manualmente con círculos. Las concentraciones se consideran solamente si están por encima de la amplificación no específica de los NTCs.
La figura 2 muestra la linealidad y la bondad de ajuste de una serie de diluciones de miRNA sintético del oligonucleótido ha-miR-499-5p por duplicado. Se realizó una serie de diluciones de 8 pasos de 2.500 copias/μl a 0 copias/μl. Las copias/μl esperado calculado como se describe en la tabla 5 asume 100% RT y digital eficiencia PCR. En esta configuración, la PCR digital demuestra un alto grado de linealidad (r2 = 0.99). El límite de detección (LoD = 0,12) y el límite de cuantificación (LoQ = 0.23) también se presentan en la figura 2, muestra que incluso una expresión de miRNA baja puede ser detectada con éxito. Así, la dPCR puede utilizarse para cuantificar niveles aun bajos del suero de miRNAs en circulación. El límite de detección (LoD) y el límite de cuantificación (LoQ) se calculan siguiendo el enfoque de Forootan et al. 15 y se definición como LoD = LoB + 1.645 del x σbajoconcentraciónmuestra, donde se calcula el límite de espacio en blanco (LoB) como LoB = mediaen blanco + 1.645 del x σen blanco. El LoQ es entonces Estimado ejecución repetición estándar curvas15. Para asegurar la cuantificación reproducible de miRNAs, solamente las concentraciones de miRNA que se encuentran por encima de la LoD y el LoQ se consideran como un valor exacto válido.
La figura 3 muestra resultados representativos de los niveles de la miR-499 de pacientes con un elevación del segmento ST infarto de miocardio (STEMI), n = 16 en cada momento. Las muestras fueron tomadas antes de una intervención percutánea (PCI) (t = 0), 8 h después de un PCI (t = 8) y 16 h después de un PCI (t = 16), y los niveles de la miR-499 fueron comparados a los niveles de la miR-499 pacientes con estable arteriopatía coronaria (CAD, n = 20). Las principales características de los pacientes pueden encontrarse en la tabla 6. Después del lanzamiento inicial de miR-499 en el suero en las primeras 8 h tras un infarto de miocardio, los niveles de la miR-499 disminuyen otra vez después de 16 h. Ya se aprecia una tendencia en aumento al principio del STEMI (t = 0), y un aumento significativo de los niveles de la miR-499 en comparación a los pacientes con CAD puede ser visto 8 h tras el IAMCEST (t = 8, p < 0.01) cuando se comparan niveles de miR-499 miR-499 niveles de pacientes estables de CAD. El receptor de funcionamiento curvas Mostrar (ROC) la posible utilidad de miR-499 como un nuevo biomarcador para diferenciar entre pacientes con CAD y con un IAMCEST [el área bajo la curva (AUC) = 0.62 para las muestras tomadas antes de una intervención percutánea (PCI), las AUC = 0.75 para muestras tomadas 8 h después de un PCI y un AUC = 0,78 para muestras tomadas 16 h una ICP en comparación con los niveles séricos de miR-499 en los pacientes con CAD].
Figura 1: selección de gotas positivas en una serie de diluciones realizadas por duplicado. (A) el umbral se establece manualmente sobre las gotas negativas. (B) los resultados se visualizan en un 2D blot positivos seleccionados por dando vueltas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: serie de diluciones de oligonucleótidos sintéticos de miR-499. (A) las mediciones se realizaron por duplicado. Los datos se presentan registro transformado como absolutas copias por μl. regresiones lineales y bondad de ajuste (r2-valor) se muestran. Los datos se presentan como media ± SEM. (B) este panel muestra el límite de detección (LoD) y el límite de cuantificación (LoQ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cuantificación de circulantes suero miR-499-5p en pacientes con elevación del segmento ST infarto de miocardio (n = 16) antes de la intervención coronaria percutánea (PCI), 8 h después de la PCI y 16 h después de la PCI, en comparación con pacientes con arteria coronaria estable enfermedad (n = 20). (A) la circulación suero miR-499-5p está representado como medio con el error estándar de la media con la correspondiente p-valor calculado por ANOVA unidireccional seguida de una prueba de post hoc de Bonferroni (p < 0,05 se consideró como estadísticamente significativa). Receptor (B) un análisis de la curva característica (ROC) de funcionamiento se realiza en los datos de panel A. El análisis ROC demuestra la sensibilidad y especificidad de los biomarcadores. Además, se muestra el área correspondiente bajo los valores de la curva (AUC). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| cantidad de muestra | ||||
| n = 1 | / bien [μl] | |||
| agua libre de nucleasas | 4.16 | |||
| 10 x buffer de transcripción inversa | 1.5 | |||
| 100nm dNTP | 0.15 | |||
| Inhibidor de Rnasa | 0.19 | |||
| Primer RT específico | 3 | |||
| Comercial Transcriptase reverso enzima 50 U/ul | 1 | |||
| Master-Mix total | 10 | |||
Tabla 1: Mezcla de reactivos de reversa de la transcripción.
| Temperatura | Tiempo |
| 16 ° C | 30 minutos |
| 42 ° C | 30 minutos |
| 85 ° C | 5 minutos |
| 4 ° C | ∞ |
Tabla 2: Condiciones térmicas de ciclismo para reversa de la transcripción.
| cantidad de muestra | ||||
| n = 1 | / bien [μl] | |||
| agua libre de nucleasas | 7.67 | |||
| mezcla comercial dPCR | 10 | |||
| 20 x hidrólisis específica primer punta de prueba | 1 | |||
| Master-Mix total | 18,67 | |||
Tabla 3: Mezcla de reactivo PCR Digital.
| Temperatura | Tiempo |
| 95 ° C | 10 minutos |
| 94 ° C | 30 segundos (x40) |
| 60 ° C | 1 min |
| 98 ° C | 10 minutos |
| 4 ° C | ∞ |
Tabla 4: Ciclismo condiciones térmicas para PCR digital.
| Tubo | Transferido del oligonucleótido sintético miR-499 (μL) | Diluyente (μL) | miRNA (copias/μL) | Copias/μl que en RT | Copias/μl que en dPCR |
| Texto original en | 6,022 x 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6,022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6,022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6,022 x 106 | ||
| 4 | 18.7 | 981.3 | 1.128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150,4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 x 102 | 37.6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
Tabla 5: Serie de diluciones sintético para miR-499.
| Característica | Todos | Estable CAD pacientes (n = 20) | Pacientes con IAMCEST (n = 24) | valor de p |
| Edad | 64,7 ± 11,9 | 66,7 ± 13.1 | 62.2 ± 9.9 | 0.2810 |
| Machos | 77.8% | 65% | 93.8% | 0.0392 |
| DM | 33.3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| HTN | 61,1% | 60% | 62.5% | 0.8785 |
| Dislipidemia | 38.9% | 65% | 6.3% | 0.0003 |
| Fumador | 47.2% | 55% | 37,5% | 0.3796 |
| Historia de la familia | 25% | 35% | 12.5% | 0.1213 |
| Exceso de peso | 58.3% | 55% | 62.5% | 0.6501 |
| Creatinina sérica (mg/dL) | 0,94 (0.83 - 1) | 0.98 (0.82 - 1.01) | 0,93 (0.83 - 1) | 0.7255 |
| Pico de la CK (U / he) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0,0004 |
| Pico de cTnT (ng/L) | 322.5 (23,8-4533) | 18 (7-25.3) | 2492 (240-5586) | 0.0002 |
| % DE FEVI | 45% (40% - 50%) | 45% (32,5% - 55%) | 45% (45% - 50%) | 0.9596 |
| Los valores se presentan como media ± SD; valor de la mediana (rango de percentil 25 a 75) o % | ||||
| DM: Diabetes mellitus | ||||
| HTN: hipertensión | ||||
| CK: creatina cinasa | ||||
| Reposo: la troponina cardíaca T | ||||
| FEVI: Fracción de eyección ventricular izquierda | ||||
Tabla 6: Características principales del paciente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PCR digital es un método relativamente novedoso punto final de la PCR que permite la cuantificación absoluta directa de ácidos nucleicos dentro de una muestra. El método posee ventajas particulares, incluyendo una variabilidad disminuida, una mayor reproducibilidad día a día y una sensibilidad superior11,12. Además, debido a la partición de la muestra en aproximadamente 20.000 solo reacciones y análisis de punto final, dPCR es más robusto a substancias que interfieren en la polimerización en cadena en comparación con RT-PCR cuantitativa16. Estas cualidades de dPCR lo hacen una atractiva alternativa para RT-PCR cuantitativa como una herramienta de diagnóstico para la cuantificación. Como circulan los miRNAs son a menudo presente en concentraciones bajas de suero, hasta ahora, han desafiado a los científicos cuantificar apropiadamente miRNAs por PCR9. Por otro lado, dPCR puede cuantificar adecuadamente incluso una expresión de miRNA baja en suero, mitigación de los problemas observados en el conteo bajo de cuantificación de miRNA17. La capacidad de dPCR darle directamente las cuentas/μl, incluso en una expresión de miRNA muy baja, así lo hace una atractiva herramienta de diagnóstico para la comunidad de investigación cardiovascular en estudios de biomarcadores miRNA. Como la concentración en cuentas/μl puede multiplicarse por el factor de dilución utilizado en la extracción, RT-reacción y dPCR, es posible conseguir el número exacto de copias en 1 μl de suero. El flujo de trabajo presentado aquí puede realizarse en hasta 96 muestras en una placa, por lo tanto, proporcionar una herramienta para grandes estudios cardiovasculares. Aunque dPCR exhibe varias ventajas sobre el RT-PCR cuantitativa, no es todavía rutinariamente aplicado para la cuantificación de los miRNAs en ensayos cardiovasculares. Carecen de procedimientos de normalización de datos estandarizados y más.
En este enfoque, demostramos eso dPCR, combinado con sondas de hidrólisis fluorescente, permite la cuantificación absoluta directa específica de circulación miRNAs vinculadas a enfermedades cardiovasculares. Con este informe, pretende tanto demostrar un protocolo optimizado para detección a través de dPCR de miRNA y confirman las ventajas de dPCR sobre RT-PCR cuantitativa.
Confirmamos las exposiciones de dPCR buena linealidad y los bajos límites de la detección y cuantificación de dPCR de cuantificación de miRNAs. Por clavar la muestra con un oligonucleótido sintético, la normalización de la muestra es posible, ajustar la eficiencia de la extracción y la variación de muestra a muestra.
En conclusión, PCR digital, muestra superioridad en capacidad técnica y potencial diagnóstico, es el mejor método actual para la cuantificación de miRNA y además puede ser utilizado para estudios de biomarcadores grande multi-centro cardiovascular miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
