Summary
Circulerende microRNAs is gebleken belofte als biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen en acuut myocardiaal infarcten. In deze studie beschrijven we een protocol voor extractie van miRNA, omgekeerde transcriptie en digitale PCR voor de absolute kwantificering van miRNAs in het serum van patiënten met hart-en vaatziekten.
Abstract
Circulerende serum microRNAs (miRNAs) is gebleken belofte als biomarkers voor de hart-en vaatziekten en acuut myocardinfarct (AMI), vrijgelaten uit de cardiovasculaire cellen in de circulatie. Circulerende miRNAs zijn zeer stabiel en kunnen worden gekwantificeerd. De kwantitatieve expressie van specifieke miRNAs kan worden gekoppeld aan de pathologie, en sommige miRNAs Toon hoge weefsel en de specificiteit van de ziekte. Het vinden van nieuwe biomarkers voor cardiovasculaire aandoeningen is van belang voor medisch onderzoek. Vrij recentelijk heeft digitale polymerase-kettingreactie (dPCR) uitgevonden. dPCR, gecombineerd met fluorescerende hydrolyse sondes, kan specifieke directe absolute kwantificering. dPCR vertoont superieure technische kwaliteiten, met inbegrip van een lage variabiliteit, hoge lineariteit en hoge gevoeligheid ten opzichte van de kwantitatieve polymerase chain reaction (qPCR). DPCR is dus een meer nauwkeurige en reproduceerbare methode voor rechtstreeks het kwantificeren van miRNAs, met name voor het gebruik in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven. In deze publicatie beschrijven we het effectief uitvoeren van digitale PCR teneinde de absolute exemplaaraantal in serummonsters.
Introduction
Circulerende miRNAs hebben geïdentificeerd als veelbelovende markers voor een aantal ziekten, waaronder hart-en vaatziekten1. De miRNAs zijn kleine, niet-coderende single-stranded RNA moleculen (ongeveer 22 nucleotiden lang) betrokken zijn in de post-transcriptional verordening via de wijziging van de boodschapper-RNA vertaling en beïnvloeden gene expression2, en worden vrijgegeven in de circulatie in zowel fysiologische en pathologische staten. De kwantitatieve expressie van specifieke miRNAs kan worden gekoppeld aan de pathologie, en sommige miRNAs tonen hoog weefsel en ziekte specificiteit1. Cardiovasculaire aandoeningen, miRNAs geworden aantrekkelijke kandidaten als nieuwe biomarkers omdat ze opmerkelijk stabiel in het serum zijn en gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd met behulp van PCR methode3. De potentiële waarde van miRNAs als biomarkers voor myocardiaal infarct is geëvalueerd in kleine studies, maar een validatie in grote cohorten ontbreekt2. Bijvoorbeeld, miR-499 komt sterk uitgedrukt in de myocardiale spier, en het is aangetoond dat aanzienlijk worden verhoogd in een AMI4,5,6. Verder regelt het geprogrammeerde celdood (apoptose) en de differentiatie van cardiomyocytes en gaat dus in verschillende mechanismen na een AMI-7. Afgezien van enkele kleine studies rapporteren een superioriteit en incrementele waarde van miRNAs voor de diagnose van AMI, is de superioriteit of gelijkheid aan hoog-gevoeligheids cardiale troponins niet nog bewezen in grootschalig onderzoek2,5 ,6,8. Meer prospectieve studies in grote cohorten zijn, daarom, nodig voor de beoordeling van de potentiële diagnostische waarde van miRNAs. Bovendien, methoden van miRNA kwantificering moeten worden geoptimaliseerd en9gestandaardiseerde met behulp van vergelijkbare protocollen. Gestandaardiseerde testen inconsistente resultaten kunnen verminderen en kunnen helpen miRNAs te worden van mogelijke biomarkers voor de routinematige klinische toepassing, zoals biomarkers worden gekwantificeerd in een reproduceerbare manier moeten om hun klinische toepasbaarheid.
Onlangs, dPCR is ingevoerd als een eindpunt analyse. Het partities van het monster in ongeveer 20.000 individuele reacties10. Vervolgens het dPCR-systeem maakt gebruik van een wiskundige Poisson statistische analyse van fluorescerende signalen (positieve en negatieve reacties), waardoor een absolute kwantificering zonder een standaard curve10. Bij het combineren van dPCR met fluorescerende hydrolyse sondes, is de zeer specifieke directe absolute kwantificering van miRNAs mogelijk gemaakt. Digitale polymerase-kettingreactie heeft aangetoond dat het vertonen van superieure technische kwaliteiten (met inbegrip van een verminderde variabiliteit, een grotere dagelijkse reproduceerbaarheid, een hoge mate van lineariteit en een hoge gevoeligheid) voor het kwantificeren van miRNA niveaus in de verkeer in vergelijking met kwantitatieve real-time PCR10,11. Deze superieure technische kwaliteiten kunnen helpen verlichten van de huidige beperkingen op het gebruik van de circulerende miRNAs als biomarkers en kunnen leiden tot de oprichting van miRNAs als biomarkers in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven en als een diagnostische methode in algemene. In een eerdere studie, wij onlangs toegepast dPCR voor de absolute kwantificering van de circulerende miRNAs bij patiënten met een AMI en waren in staat om aan te tonen van superieure diagnostische mogelijkheden in vergelijking met de kwantificering van miRNAs door qPCR12.
In deze publicatie willen we aantonen dat het gebruik van dPCR een nauwkeurige en reproduceerbare methode is voor rechtstreeks kwantificeren cardiovasculaire miRNAs circuleren. De absolute kwantificering van miRNA niveaus in het serum, met behulp van digitale PCR, toont het potentieel voor het gebruik in grote multi center cardiovasculaire klinische proeven. In deze publicatie beschrijven we in detail hoe effectief uitvoeren van digitale PCR en hoe om te ontdekken de absolute miRNA exemplaaraantal in serum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. extractie van miRNA van Plasma/Serum
Opmerking: Om te kwantificeren miRNAs op de juiste manier, het juiste microRNA isolement van het plasma/serum is een cruciale stap. Een belangrijkste ding in gedachten te houden, vooral omdat verschillende protocollen bestaan, is zich te houden aan dezelfde werkstroom tijdens de verwerking van de monsters. In dit protocol wordt de miRNA geëxtraheerd uit 50 µL van de serum. Gebruik niet meer dan 200 µL als deze limiet de juiste extractieproces.
- Bereiden van serum of ontdooien van bevroren monsters.
- Voeg toe 250 µL (5 volumes) commerciële lysis reagens aan 50 µL van de serum. Steun de lysis van vortexing. Plaats de buis met de lysate op de Bank bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Spike de lysate met 3,5 µL van spike-controle (1.6 x 107 kopieën/µL) en meng ze door vortexing.
- Voeg 50 µL chloroform (dat wil zeggen, een gelijke hoeveelheid over het eerste serummonster) voor de fase-separatie zichtbaar. Goed schudden de buis voor 15 s. plaats de buis op de Bank bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
- Voor de fasescheiding, centrifugeer de buis bij 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
Opmerking: De monsters zijn nu opgedeeld in een bovenste waterige fase met de RNA, een witte interfase en een lagere, roze organische fase. - Overdracht van de bovenste waterfase (100 µL) met de RNA in een nieuwe buis. Witte interfase materiaal niet overdragen als dit de juiste RNA-telling geschrift.
- Voeg 150 µL (d.w.z., 1.5 x de hoeveelheid van de overgebrachte monster) van 100% ethanol. Meng de materialen door pipetteren hen op en neer. Geen Centrifugeer ze en snel gaan naar de volgende stap.
- Pipetteer 250 µL van het monster op een commerciële spin-kolom in een collectie tube van 2 mL. Sluit het deksel. Centrifugeer de kolom > 8000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de doorstroming.
- 700 µL van commerciële wassen buffer nummer 1 aan de spin kolom toevoegen. Sluit het deksel en centrifugeer de kolom > 8000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de run-through wassen buffer.
- Voeg toe 500 µL van commerciële wassen buffer nummer 2 aan de spin-kolom. Sluit het deksel en centrifugeer de kolom > 8, 000 x g bij kamertemperatuur voor 15 s. negeren de run-through wassen buffer.
- Pipetteer 500 µL van 80% ethanol naar de spin-kolom. Sluit het deksel, de kolom Centrifugeer > 8, 000 x g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten negeren de buis van de collectie met de doorstroming.
- De spin kolom overbrengen in een nieuwe collectie-tube van 2 mL. Centrifugeer de kolom op volle snelheid met een geopende deksel te drogen van het membraan. Gooi de buis van de collectie met de doorstroming.
- Breng de spin-kolom in een nieuwe 1,5 mL collectie buis. Elueer de RNA door toepassing van de 30 µL van RNase-gratis water rechtstreeks naar het midden van het membraan. Sluit het deksel. Centrifugeer de kolom op volle snelheid voor 1 min.
- Opslag van RNA bij 70 ° C.
Opmerking: De opslag van gezuiverde RNA in RNase-gratis water tussen-70 ° C tot-20 ° C garandeert geen afbraak van het RNA voor 1 jaar. Na het protocol van de fabrikant is de minimale hoeveelheid water RNase-vrij om te verdunnen van het RNA 10 µL. met behulp van minder dan 10 µL kan onvoldoende hydrateren het membraan en verminderen de totale opbrengst van RNA.
2. omgekeerde transcriptie
Opmerking: CDNA (cDNA) werd gesynthetiseerd met behulp van de volgende 15 µL omgekeerde transcriptie (RT) protocol (totale reactie volume).
- Ontdooi de RT kit op ijs. Houd de enzymen in de vriezer, zolang mogelijk om te verhinderen dat ze vernederende en draai ze naar beneden vóór gebruik. RT inleidingen op ijs ontdooien en draai ze naar beneden vóór gebruik.
- De master mix bereiden zoals beschreven in tabel 1.
- Combineer 10 µL van master mix en 5 µL van uitgepakte RNA per putje in een 96 well-plate.
- Centrifugeer het goed plaat bij 2.000 x g bij 4 ° C gedurende 2 minuten.
- Het protocol van de thermische cyclus wordt beschreven in tabel 2 voor de omgekeerde transcriptie gebruiken.
Opmerking: Zoals hieronder beschreven, cDNA kan direct worden verwerkt in de digitale PCR machine (Zie Tabel van materialen); Als alternatief kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C.
3. droplet generatie en digitale PCR
Opmerking: Digitale PCR werd uitgevoerd met behulp van het volgende 40 µL-protocol.
- Ontdooi de commerciële dPCR-mix, bereid cDNA en de PCR inleidingen op ijs. Centrifugeer ze kort voor gebruik.
- De master mix bereiden zoals beschreven in tabel 3.
- Voeg 1,33 μl per putje van de RT-product en het kort centrifugeren.
- Pipetteer 20 μL van het monster in elk putje van de 8-well cassette (middellange rij).
Opmerking: Als de 8-well cassette niet volledig is gevuld, vul de resterende putjes met niet-template besturingselementen (NTC) die weglaten van cDNA (dat wil zeggen, het product van de RT geproduceerd met water in plaats van uitgepakte RNA) of commerciële buffer dPCR. De NTC dient als een controle van de besmetting. Water mag niet worden gebruikt in de overige wells, want dat zal afbreuk doen aan de kwaliteit van de vorming van de druppel. - Pipetteer 70 μL van de druppel generatie olie voor de sondes in de oliebronnen (onderste rij) van de 8-well-cassette.
- Plaats een pakking op de top van de 8-well cassette en plaats de cassette in de droplet-generator. Sluit de droplet-generator. Wacht totdat de 3 indicatorlampjes stevige groen zijn.
Opmerking: Druppels nu worden gegenereerd. - Zorgvuldig en langzaam Pipetteer 40 μL van de druppel gevormde monster (bovenste rij) in aparte wells van een 96-wells-plaat door pipetteren.
- Na het voltooien van de vorming van de druppel op de monsters, het zegel van de PCR-plaat met een pierceable dPCR folie bij 180 ° C voor 4 s.
- Plaats de folie-verzegeld PCR-plaat in de cycler en cyclus het zoals beschreven in tabel 4, met een snelheid van de helling van 2,5 ° C/s.
4. droplet lezen en analyseren
- De plaat van de thermische cycler overbrengen aan de basis van de houder van de plaat. Draai de PCR-plaat door het plaatsen van de bovenkant van de plaat houder op het bord van de PCR.
- Start de commerciële dPCR software.
- Voer de naam van het monster, de naam van het experiment, en het doel in de setup. Selecteer de absolute kwantificering.
- Start de druppel lezen door te klikken op uitvoeren. Selecteer FAM/HEX of FAM/VIC als detectie chemie bij het werken met hydrolyse sondes.
Opmerking: De commerciële dPCR software zal vervolgens auto-analyseren van de gegevens. - Controleer de nummers van de druppel in de tabel van de resultaten om ervoor te zorgen een juiste druppel-generatie.
- Selecteer alle putjes met de dezelfde gekwantificeerde miRNA en klik op analyseren. Gebruik de 2D vlek om te markeren van positieve druppels en handmatig corrigeren de auto-geanalyseerd gegevens (Figuur 1).
5. de juiste berekeningen van de steekproef
- Normaliseren van het monster door het monster met de normalisatie-factor (NF) te vermenigvuldigen.
NF = mediaan [C. elegans miR-39 metingen]alle samples/ [C. elegans miR-39]monster - Bereken de definitieve miRNA serum-concentratie, aanpassen voor verdunningsfactoren (DF).
[miRNA] laatste = [miRNA]ruwe waarde x DFRT x DFdPCR x DFEx
Waar:
[miRNA] ruwe waarde = de miRNA gekwantificeerd door commerciële dPCR software;
DFRT = de verdunningsfactor van de sjabloon in omgekeerde transcriptie;
DFdPCR = de verdunningsfactor van de sjabloon in dPCR;
DFEx = de verdunningsfactor bij de extractie.
6. synthetische Oligonucleotide verdunningsreeks
- Ontdooi gelyofiliseerd synthetische oligonucleotide op ijs. Kort na het centrifugeren.
- Verdun de gelyofiliseerd synthetische oligonucleotide in nuclease-gratis water met een eindconcentratie van 10 pmol / µL. kort centrifugeren het.
- Verdun het in nuclease-gratis water zoals beschreven in tabel 5. Centrifugeer de verdunning kort tussen elke verdunning stap bij 8.000 x g gedurende 10 s.
- Doorgaan met de omgekeerde transcriptie, zoals beschreven in stap 2 en analyseren van de monsters met digitale PCR, zoals beschreven in stap 3 en stap 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Digitale PCR gecombineerd met fluorescerende hydrolyse sondes kan onderzoekers de absolute bedragen van specifieke miRNAs in kopieën/µL rechtstreeks te kwantificeren. Als het monster in dPCR is gepartitioneerd in ongeveer 20.000 afzonderlijke PCR reacties, dPCR vereist geen technische repliceert10. Het dPCR-systeem maakt gebruik van een wiskundige Poisson statistische analyse van fluorescerende signalen (verschillen tussen positieve en negatieve reacties) een absolute kwantificering inschakelen zonder de behoefte aan een standaard curve10. Om correct berekenen de concentraties, een aanvaardbare druppel tellen nodig (> 15.000). Geen sjabloon-besturingselementen zorgen ervoor dat de uitsluiting van aanzienlijke niet-specifieke versterking. Bij alle monsters die zijn opgenomen in de analyse worden verwerkt met hetzelfde volume, methode en PCR protocol ter versterking van de geldigheid van de verkregen resultaten. De verkregen concentraties in dPCR worden genormaliseerd met een mediane normalisatie procedure via alle monsters geanalyseerd met de synthetische spiked-in C. elegans miR-3913. Normaliseren van de gegevens aan de gemeten hoeveelheid spiked-in C. elegans miR-39 corrigeert voor de monster-naar-sample variatie in het RNA extractie-efficiëntie en fungeert als een PCR reactie controle, verder toe te voegen aan de geldigheid van de resultaten. Er is geen gevestigde gold-standaard voor het normaliseren van serum miRNAs; echter exogene besturingselementen zoals de spiked-in C. elegans miR-39 zijn een elegante oplossing voor normalisatie procedures, zoals het endogene miRNAs worden vaak gewijzigd in verschillende ziekte staten9.
De geanalyseerde serummonsters werden verworven vóór een percutane coronaire interventie (PCI), na een PCI, 8u en 16u na een PCI, van patiënten met een acuut ST-segment met elevatie myocardinfarct (STEMI). STEMI patiënten vertonen ernstige ischemie en dus in aanmerking komen voor de evaluatie van nieuwe biomarkers voor ischemie. Om te beoordelen de kinetiek van miR-499 introductie en het potentiële gebruik van miR-499 als een biomarker voor ischemie in hart-en vaatziekten, werd miR-499 geanalyseerd met dPCR over alle patiënten voor de drie verschillende keer punten14.
Figuur 1 toont de selectie van positieve druppels geven de laatste miRNA concentratie berekend door de software. De Fractie van de positieven in een monster bepaalt de concentratie van kopieën/µL zoals berekend door de commerciële dPCR software. De resultaten kunnen ook worden gevisualiseerd in een 2D plot en de positieven kunnen handmatig worden gemarkeerd met cirkels. Concentraties worden alleen beschouwd als ze boven de niet-specifieke versterking van de NTC.
Figuur 2 toont de lineariteit en goedheid-van-pasvorm van een verdunningsreeks van synthetische miRNA oligonucleotide heeft-miR-499-5 p in duplicaten. Een 8-stap verdunningsreeks werd van 2.500 exemplaren/µL naar 0 kopieën/µL uitgevoerd. De berekende verwachte kopieën/µL stel zoals beschreven in tabel 5 100% RT en digitale PCR-efficiëntie. In deze opstelling toont digitale PCR een hoge mate van lineariteit (r2 = 0.99). De limiet van detectie (LoD = 0,12) en de bepaalbaarheidsgrens (LoQ = 0.23) worden ook gepresenteerd in Figuur 2, waaruit blijkt dat zelfs een lage miRNA expressie met succes kan worden gedetecteerd. Dus, dPCR kan worden gebruikt om te kwantificeren zelfs lage serum niveaus van circulerende miRNAs. De limiet aantoonbaarheidsgrens (LoD) en de grens voor kwantificering (LoQ) worden berekend volgens de benadering van Forootan et al. 15 en zijn gedefinieerd als LoD = LoB + 1.645 x σlageconcentratiemonster, waar de grenswaarde van blanco (LoB) wordt berekend als de LoB = gemiddeldeleeg + 1.645 x σleeg. De LoQ is dan de geschatte lopende repliceren standaard curven,15. Om ervoor te zorgen de reproduceerbare kwantificering van miRNAs, worden alleen de miRNA concentraties die boven de LoD zowel de LoQ liggen beschouwd als een geldig exacte waarde.
Figuur 3 toont representatieve resultaten van miR-499 niveaus van patiënten met een ST-elevatie myocardinfarct (STEMI), n = 16 op elk tijdstip. Monsters werden genomen voordat een percutane interventie (PCI) (t = 0), 8 h na een PCI (t = 8), en 16 h na een PCI (t = 16), en de niveaus van de miR-499 werden vergeleken met de miR-499 niveaus van patiënten met stabiele coronaire hartziekten (CAD, n = 20). De hoofdkenmerken van de patiënt kunnen worden gevonden in tabel 6. Na de eerste introductie van miR-499 in het serum in de eerste 8 uur na een myocardinfarct, dalen miR-499 niveaus weer na 16 h. Een trend in de toename kan al worden gezien aan het begin van de STEMI (t = 0), en een significante toename van de miR-499 niveaus ten opzichte van patiënten met CAD kan worden gezien 8 h na de STEMI (t = 8, p < 0.01) bij het vergelijken van miR-499 niveaus miR-499 niveaus van stabiele CAD patiënten. De ontvanger die curven (ROC) Toon, het mogelijke nut van miR-499 als een roman biomarker onderscheid maken tussen patiënten met CAD en patiënten met een STEMI [het gebied onder de curve (AUC) = 0.62 voor monsters die zijn genomen vóór een percutane interventie (PCI), AUC = 0,75 voor monsters van 8 h na een PCI en AUC = 0.78 voor monsters 16 h na een PCI in vergelijking met serum niveaus van miR-499 bij patiënten met CAD].
Figuur 1: selectie van positieve druppels in een verdunningsreeks uitgevoerd in duplicaten. (A) de drempel is handmatig ingesteld boven de negatieve druppels. (B) de resultaten zijn gevisualiseerd in een 2D blot, de positieven geselecteerd door het cirkelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: synthetische miR-499 oligonucleotide verdunningsreeks. (A) de metingen werden uitgevoerd in tweevoud. De gegevens worden gepresenteerd log omgezet als absolute kopieën per µL. lineaire regressies en goedheid-van-fit (r2-waarde) worden weergegeven. De gegevens worden gepresenteerd zoals gemiddelde ± SEM. (B) dit paneel de limiet aantoonbaarheidsgrens (LoD) en de grens voor kwantificering (LoQ toont). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Kwantificering van circulerende serum miR-499-5 p bij patiënten met ST-elevatie myocardinfarct (n = 16) en dan pas percutane coronaire interventie (PCI), 8 h na PCI 16 h na PCI, vergeleken met patiënten met stabiele coronaire ziekte (n = 20). (A) de circulerende serum miR-499-5 p wordt vertegenwoordigd als gemiddelde met de standaardfout van het gemiddelde met de bijbehorende p-waarde berekend door one-way ANOVA gevolgd door een test van de post-hoc Bonferroni (p < 0.05 werd beschouwd als statistisch significant). (B) een ontvanger die karakteristieke curve (ROC) analyse wordt uitgevoerd op de gegevens van paneel A. De ROC-analyse blijkt dat de gevoeligheid en de specificiteit van de biomerker. Verder, het overeenkomstige gebied onder de curve (AUC) waarden worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| monster bedrag | ||||
| n = 1 | / Nou [l] | |||
| Nuclease-gratis water | 4.16 | |||
| 10 x Reverse transcriptie buffer | 1.5 | |||
| 100nM dNTP | 0,15 | |||
| RNAse remmer | 0.19 | |||
| specifieke RT Primer | 3 | |||
| Commerciële Reverse-Transcriptase enzym 50 U/ul | 1 | |||
| Master-Mix totaal | 10 | |||
Tabel 1: Omgekeerde transcriptie reagentia Mix.
| Temperatuur | Tijd |
| 16 ° C | 30 minuten |
| 42 ° C | 30 minuten |
| 85 ° C | 5 minuten |
| 4 ° C | ∞ |
Tabel 2: Thermische fietsen voorwaarden voor omgekeerde transcriptie.
| monster bedrag | ||||
| n = 1 | / Nou [l] | |||
| Nuclease-gratis water | 7.67 | |||
| commerciële dPCR mix | 10 | |||
| 20 x specifieke hydrolyse primer/sonde | 1 | |||
| Master-Mix totaal | 18.67 | |||
Tabel 3: Digitale PCR reagens Mix.
| Temperatuur | Tijd |
| 95 ° C | 10 minuten |
| 94 ° C | 30 seconden (x40) |
| 60 ° C | 1 min |
| 98 ° C | 10 minuten |
| 4 ° C | ∞ |
Tabel 4: Thermische fietsen voorwaarden voor digitale PCR.
| Buis | Overgedragen van synthetische oligonucleotide miR-499 (µL) | Verdunningsmiddel (µL) | miRNA (kopieën/µL) | Verwachte kopieën/µL in RT | Verwachte kopieën/µL in dPCR |
| Origineel | 6.022 x 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 x 106 | ||
| 4 | 18,7 | 981.3 | 1.128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150,4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 x 102 | 37,6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
Tabel 5: Synthetische verdunningsreeks voor miR-499.
| Karakteristiek | Alle | Stabiele CAD patiënten (n = 20) | STEMI patiënten (n = 24) | p-waarde |
| Leeftijd | 64,7 ± 11,9 | 66,7 ± 13.1 | 62.2 ± 9,9 | 0.2810 |
| Mannetjes | 77.8% | 65% | 93,8% | 0.0392 |
| DM | 33.3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| HTN | 61,1% | 60% | 62,5% | 0.8785 |
| Dyslipidemia | 38,9% | 65% | 6.3% | 0.0003 |
| Roker | 47.2% | 55% | 37,5% | 0.3796 |
| Familiegeschiedenis | 25% | 35% | 12,5% | 0.1213 |
| Overgewicht | 58.3% | 55% | 62,5% | 0.6501 |
| Serum Creatinine (mg/dL) | 0.94 (0.83 - 1) | 0.98 (0.82 - 1.01) | 0.93 (0.83 - 1) | 0.7255 |
| CK piek (U / I) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0.0004 |
| cTnT Peak (ng/L) | 322.5 (23.8-4533) | 18 (7-25.3) | 2492 (240-5586) | 0.0002 |
| LVEF % | 45% (40% - 50%) | 45% (32,5% - 55%) | 45% (45% - 50%) | 0.9596 |
| Waarden worden gepresenteerd zoals bedoel ± SD; mediaan waarde (25e aan 75ste percentiel bereik) of % | ||||
| DM: Diabetes mellitus | ||||
| HTN: hypertensie | ||||
| CK: Creatine kinase | ||||
| cTnT: Cardiac troponine T | ||||
| LVEF: Linker ventriculaire ejectie Fractie | ||||
Tabel 6: Belangrijkste patiënt kenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Digitale PCR is een relatief nieuwe eindpunt methode van PCR waarmee de directe absolute kwantificering van nucleïnezuren binnen een steekproef. De methode heeft bepaalde voordelen, zoals een verminderde variabiliteit, een grotere dagelijkse reproduceerbaarheid en een superieure gevoeligheid11,12. Verder, als gevolg van het partitioneren van het monster in ongeveer 20.000 enkele reacties en eindpunt analyses, dPCR is robuuster aan storende stoffen in PCR in vergelijking met kwantitatieve RT-PCR-16. Deze kwaliteiten in dPCR maken het een aantrekkelijk alternatief voor kwantitatieve RT-PCR als een diagnostisch hulpprogramma voor kwantificering. Als de circulerende miRNAs zijn vaak aanwezig op lage serum concentraties, tot nu toe wetenschappers zijn aangevochten te miRNAs op de juiste wijze te kwantificeren door PCR9. Aan de andere kant, kan dPCR op passende wijze zelfs een lage miRNA expressie in serum, de problemen die zijn waargenomen in lage telling miRNA kwantificering17beperkende kwantificeren. De mogelijkheid van dPCR om direct de tellingen/µL, zelfs in een zeer lage miRNA expressie, dus maakt het een aantrekkelijke diagnostisch hulpprogramma voor de cardiovasculaire onderzoekswereld miRNA biomerker studies. Als de concentratie gegeven in graven/µL vermenigvuldigd kan worden de verdunningsfactor gebruikt in de extractie, RT-reactie en dPCR, is het mogelijk om het exacte aantal exemplaren in 1 µL van de serum. De werkstroom hier gepresenteerd kan worden uitgevoerd in maximaal 96 monsters op een plaat, vandaar het verstrekken van een instrument voor grote cardiovasculaire studies. Hoewel dPCR diverse voordelen ten opzichte van kwantitatieve RT-PCR exposeert, is het nog niet routinematig toegepast voor de kwantificering van miRNAs bij cardiovasculaire proeven. Verdere, gestandaardiseerde gegevens normalisatie procedures ontbreken.
In deze aanpak, we laten zien dat dPCR, gecombineerd met fluorescerende hydrolyse sondes, kan de specifieke directe absolute kwantificering van de circulerende miRNAs gekoppeld aan hart-en vaatziekten. Met dit verslag wilde we zowel tonen een geoptimaliseerde protocol voor de detectie van miRNA via dPCR en bevestigen van de voordelen van dPCR over kwantitatieve RT-PCR.
We hebben bevestigd de goede lineariteit dPCR opstellingen en de lage grenzen van de detectie en kwantificering van dPCR voor het kwantificeren van de miRNAs. Door het monster met een synthetische oligonucleotide spiking, kan de normalisering van het monster aanpassen voor de extractie-efficiëntie en monster-naar-sample variatie.
Kortom, digitale PCR, zoals het superioriteit in zowel technische vaardigheid en diagnostische mogelijkheden exposeert, is de beste huidige methode voor de kwantificering van de miRNA en verder kan worden gebruikt voor grote multi center cardiovasculaire miRNA biomerker studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
