Summary
MicroRNAs circulantes têm mostrado promessa como biomarcadores para doenças cardiovasculares e aguda do miocárdio. Neste estudo, descrevemos um protocolo para extração de miRNA, a transcrição reversa e PCR digital para a quantificação absoluta dos miRNAs no soro de pacientes com doença cardiovascular.
Abstract
Circulação soro microRNAs (miRNAs) mostraram a promessa como biomarcadores para a doença cardiovascular e infarto agudo do miocárdio (iam), sendo liberada a partir das células cardiovasculares para a circulação. Os miRNAs circulantes são altamente estáveis e pode ser quantificados. A expressão quantitativa dos miRNAs específicos pode ser vinculada a patologia e alguns miRNAs mostrar tecido alta e especificidade da doença. Encontrar novos biomarcadores para doenças cardiovasculares é de importância para a pesquisa médica. Muito recentemente, reação em cadeia da polimerase digital (dPCR) foi inventada. dPCR, combinado com sondas fluorescentes de hidrólise, permite uma quantificação absoluta direta específica. dPCR exibe qualidades técnicas superiores, incluindo uma baixa variabilidade, alta linearidade e alta sensibilidade em comparação com a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR). Assim, dPCR é um método mais preciso e reprodutível para quantificar diretamente os miRNAs, particularmente para o uso em grandes multi centro de ensaios clínicos cardiovasculares. Nesta publicação, descrevemos como efetivamente realizar PCR digital a fim de avaliar o número de cópia absoluta em amostras de soro.
Introduction
MiRNAs circulantes foram identificados como marcadores promissoras para uma série de doenças, incluindo doenças cardiovasculares1. Os miRNAs são pequenos, não-codificantes single-stranded RNA moléculas (aproximadamente 22 nucleotides longas) são envolvidas no Regulamento pós-transcricional através da alteração da tradução do RNA mensageiro e influenciando da expressão do gene2, e são liberados na circulação em Estados fisiológicos e patológicos. A expressão quantitativa dos miRNAs específicos pode ser vinculada a patologia, e alguns miRNAs mostram tecido alto e especificidade de doença1. Em doenças cardiovasculares, os miRNAs tornaram-se candidatos atraentes como biomarcadores novela porque são notavelmente estáveis no soro e pode facilmente ser quantificada com a ajuda da metodologia PCR3. O valor potencial dos miRNAs como biomarcadores para infarto do miocárdio foi avaliado em estudos pequenos, mas uma validação em grandes coortes está faltando2. Por exemplo, miR-499 encontra-se altamente expressa no músculo do miocárdio, e isso foi mostrado para aumentar significativamente em um AMI4,5,6. Além disso, regula programada morte celular (apoptose) e a diferenciação dos cardiomyocytes e, portanto, está envolvida em vários mecanismos seguindo um AMI7. Além de alguns pequenos estudos relatando uma superioridade e valor incremental de miRNAs para o diagnóstico da AMI, a superioridade ou igualdade de alta sensibilidade cardíacas troponinas não ainda foi comprovada em estudos em grande escala2,5 ,6,8. Mais estudos prospectivos de coortes grandes são, portanto, necessários para avaliar o valor potencial de diagnóstico dos miRNAs. Além disso, métodos de quantificação de miRNA precisam ser otimizadas e padronizado usando comparáveis protocolos9. Ensaios padronizados podem reduzir resultados inconsistentes e podem ajudar os miRNAs tornar-se potenciais biomarcadores para a aplicação clínica de rotina, como biomarcadores precisam ser quantificado de forma reprodutível para garantir sua aplicabilidade clínica.
Recentemente, dPCR foi introduzido como uma análise de ponto de extremidade. Ele particiona a amostra em aproximadamente 20.000 reações individuais10. O sistema dPCR então utiliza uma matemático Poisson análise estatística de sinais fluorescentes (reações positivas e negativas), permitindo uma quantificação absoluta sem uma curva padrão de10. Ao combinar dPCR com sondas fluorescentes de hidrólise, a quantificação absoluta direta altamente específica de miRNAs é tornada possível. Reação em cadeia da polimerase digital tem demonstrado que exibem qualidades técnicas superiores (incluindo uma diminuição da variabilidade, uma maior reprodutibilidade do dia a dia, um alto grau de linearidade e uma sensibilidade elevada) para quantificação dos níveis de miRNA na circulação comparada a PCR em tempo real quantitativa10,11. Estas qualidades técnicas superiores podem ajudar a atenuar as limitações atuais sobre o uso de miRNAs circulantes como biomarcadores e podem levar ao estabelecimento de miRNAs como biomarcadores em grandes multi centro de ensaios clínicos cardiovasculares e como um método de diagnóstico em geral. Em um estudo anterior, recentemente aplicada dPCR para a quantificação absoluta de miRNAs em pacientes com um AMI em circulação e foram capazes de demonstrar o potencial de diagnóstico superior em comparação com a quantificação dos miRNAs por qPCR12.
Nesta publicação, queremos demonstrar que o uso dPCR é um método exacto e reprodutível para quantificar diretamente a circulação cardiovasculares miRNAs. A quantificação absoluta de miRNA níveis no soro, utilizando PCR digital, mostra o potencial para o uso em grandes multi centro ensaios clínicos cardiovasculares. Nesta publicação, descrevemos em detalhe como efetivamente realizar PCR digital e como detectar o número de cópia de miRNA absoluto, no soro.
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Protocol
1. extração de miRNA de Plasma/soro
Nota: A fim de quantificar os miRNAs apropriadamente, o microRNA correto isolamento do plasma/soro é um passo crucial. Uma chave para manter em mente, especialmente porque existem diferentes protocolos, é aderir ao mesmo fluxo de trabalho durante o processamento das amostras. Neste protocolo, miRNA é extraído de 50 µ l de soro. Não utilize mais de 200 µ l como este limite, o processo de extração correta.
- Preparar o soro ou descongelar as amostras congeladas.
- Adicione 50 µ l de soro reagente de Lise comercial 250 µ l (5 volumes). Suporte a Lise vortexing. Coloca o tubo com o lisado no banco na temperatura ambiente por 5 min.
- Spike o lisado com 3,5 µ l de pico-no controle (1.6 x 107 cópias / µ l) e misturá-los vortexing.
- Adicione 50 µ l de clorofórmio (ou seja, uma quantidade igual quanto a amostra de soro inicial) para a separação de fases. Agite o tubo vigorosamente por 15 s. lugar o tubo no banco na temperatura ambiente por 2-3 min.
- Para a separação de fases, centrifugar o tubo a 12.000 x g a 4 ° C por 15 min.
Nota: As amostras são separadas agora em uma fase aquosa superior contendo o RNA, uma interfase branco e uma fase orgânica inferior, rosa. - Transferi a fase aquosa superior (100 µ l), contendo o RNA em um tubo de novo. Não transfira qualquer material branco interfase como este falsifica a contagem correta do RNA.
- Adicione 150 µ l (isto é, 1,5 x o volume da amostra transferido) de 100% de etanol. Misture os materiais pipetando-los acima e para baixo. Não centrifugue-los e passar rapidamente para a próxima etapa.
- Pipete 250 µ l da amostra para uma coluna de rotação comercial em um tubo de coleta de 2 mL. Feche a tampa. Centrifugue a coluna no > 8.000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descarte o escoamento.
- Adicione 700 µ l de número de tampão de lavagem comercial 1 para a coluna de rotação. Feche a tampa e centrifugar a coluna no > 8.000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descartar o buffer de lavar roupa de ensaio.
- Adicione 500 µ l do número de tampão de lavagem comercial 2 à coluna de rotação. Feche a tampa e centrifugar a coluna no > 8, 000 x g em temperatura ambiente por 15 s. descartar o buffer de lavar roupa de ensaio.
- Pipete 500 µ l de etanol 80% para a coluna de rotação. Feche a tampa, centrifugar a coluna no > 8, 000 x g em temperatura ambiente por 2 min. deite fora o tubo de coleta com o escoamento.
- Transferi a coluna de rotação para um novo tubo de coleta de 2 mL. Centrifugue a coluna em velocidade máxima com uma tampa aberta para secar a membrana. Descarte o tubo de coleta com o escoamento.
- Transferi a coluna de rotação para um novo tubo de coleta de 1,5 mL. Eluir o RNA aplicando 30 µ l de água livre de RNase diretamente para o centro da membrana. Feche a tampa. Centrifugue a coluna a toda a velocidade para 1 min.
- Armazenar o RNA a-70 ° C.
Nota: O armazenamento de RNA purificado em água livre de RNase entre-70 ° C a-20 ° C não garante nenhuma degradação do RNA por 1 ano. Seguindo o protocolo do fabricante, a quantidade mínima de água livre de RNase para diluir o RNA é 10 µ l. usando menos do que 10 µ l insuficientemente pode hidratar a membrana e reduzir o rendimento total do RNA.
2. inverter a transcrição
Nota: O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado utilizando o seguinte protocolo de transcrição reversa (RT) de 15 µ l (volume de reação total).
- Descongele o kit RT no gelo. Manter as enzimas no freezer tanto quanto possível para impedir a degradação e girá-los para baixo antes de usar. Descongelar as primeiras demão RT no gelo e girá-los para baixo antes de usar.
- Prepare a mistura de mestre, conforme descrito na tabela 1.
- Combine 10 µ l de mistura de mestre e 5 µ l de RNA extraído por alvéolo em uma placa-96.
- Centrifugue a placa bem a 2.000 x g a 4 ° C por 2 min.
- Use o protocolo de ciclo térmico descrito na tabela 2 para a transcrição reversa.
Nota: Conforme descrito abaixo, cDNA pode diretamente ser processado na máquina de PCR digital (ver Tabela de materiais); Alternativamente, ele pode ser armazenado a-20 ° C.
3. gota geração e PCR Digital
Nota: Digital PCR foi realizado utilizando o seguinte protocolo de 40 µ l.
- Descongele o mix comercial dPCR, o cDNA preparado e os primers PCR no gelo. Centrifugá-los logo antes do uso.
- Preparar a mistura de mestre, conforme descrito no tabela 3.
- Adicionar 1,33 μL/poço do produto RT e centrifugá-lo brevemente.
- Pipete 20 μL da amostra para cada poço da fita 8 poços (linha média).
Nota: Se a fita de 8 poços não estiver completamente cheio, encher os poços restantes com controles não-modelo (NTCs) que omitem cDNA (isto é, o produto RT produzido com água em vez de RNA extraído) ou dPCR comercial buffer. A NTC serve como um controle de contaminação. Água não deve ser usada em poços restantes, porque isso vai prejudicar a qualidade da formação da gota. - Pipete 70 μL do óleo gota geração para as sondas para os poços de petróleo (linha inferior) da fita 8 poços.
- Colocar uma junta em cima da gaveta de 8 poços e coloque a fita no gerador da gota. Feche o gerador da gota. Espere até que as luzes de 3 indicador verde sólido.
Nota: As gotas agora estão sendo geradas. - Lentamente e com cuidado transferi 40 μL da amostra da gota-formado (linha superior) em separado poços de uma placa de 96 poços, pipetando.
- Depois de completar a formação de gotículas nas amostras, selar a placa PCR com uma folha de dPCR perfurável a 180 ° C por 4 s.
- Coloque a folha-selado do PCR-placa no cycler e ciclo-lo conforme descrito na tabela 4, a uma taxa de rampa de 2.5 ° C/s.
4. gota leitura e análise
- Transferi a placa do termociclador à base do titular da chapa. Aperte a placa do PCR, colocando a parte superior do porta-placa na chapa de PCR.
- Inicie o software comercial dPCR.
- Digite o nome da amostra, o nome do experimento e o alvo no setup. Selecione a quantificação absoluta.
- Começa a gota lendo clicando em executar. Selecione FAM/HEX ou FAM/VIC como química de deteção ao trabalhar com sondas de hidrólise.
Nota: O software comercial dPCR autoanalisará os dados. - Verifique os números de gotículas na tabela de resultados para garantir uma geração de gotículas correto.
- Selecione todos os poços com a mesma miRNA quantificado e clique em analisar. Use o blot 2D para marcar gotículas positivas e corrigir manualmente os dados de autoanálise (Figura 1).
5. corrigir os cálculos sobre a amostra
- Normalize a amostra multiplicando o fator de normalização (NF) da amostra.
NF = mediana [c. elegans medições de miR-39]todas as amostras/ [c. elegans miR-39]determinada amostra - Calcule a concentração de soro de miRNA final, ajuste para fatores de diluição (DF).
[miRNA] final = [miRNA]valor bruto x DFRT x DFdPCR x DFEx
Onde:
[miRNA] valor bruto = o miRNA quantificada pelo software dPCR comercial;
DFRT = factor de diluição do modelo na transcrição reversa;
DFdPCR = factor de diluição do modelo em dPCR;
DF,Ex = factor de diluição na extração.
6. série de diluição do Oligonucleotide sintético
- Descongele o liofilizado do oligonucleotide sintético no gelo. Brevemente, centrifugar.
- Diluir o oligonucleotide sintético liofilizado em água nuclease livre para uma concentração final de 10 pmol / µ l. resumidamente, centrifugar.
- Diluí-la em água livre de nuclease, conforme descrito na tabela 5. Centrifugue a diluição brevemente entre cada etapa de diluição a 8.000 x g por 10 s.
- Continuar com a transcrição reversa, conforme descrito na etapa 2 e análise das amostras com PCR digital conforme descrito nas etapas 3 e 4.
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Representative Results
PCR digital combinado com sondas fluorescentes hidrólise permite que os pesquisadores quantificar diretamente a quantidade absoluta de miRNAs específicos em cópias / µ l. Como a amostra em dPCR é particionada em aproximadamente 20.000 individuais reações de PCR, dPCR não requer técnica Replica10. O sistema dPCR utiliza uma análise estatística matemática de Poisson de sinais fluorescentes (diferindo entre reações positivas e negativas) permitindo uma quantificação absoluta, sem a necessidade de um padrão curva10. Para calcular corretamente as concentrações, é necessária uma contagem de gotículas aceitável (> 15.000). Não há controles de modelo garantem a exclusão de considerável amplificação inespecífica. Todas as amostras incluídas na análise são processadas usando o mesmo volume, método e protocolo PCR para reforçar a validade dos resultados obtidos. As concentrações obtidas no dPCR são normalizadas com um procedimento de normalização mediana através de todas as amostras analisadas com o sintético cravado em c. elegans miR-3913. Normalizar os dados para a quantidade medida de cravado em c. elegans miR-39 corrige para a variação da amostra-para-amostra da eficiência de extração de RNA e serve como um controle de reação de PCR, além de estímulo para a validade dos resultados. Não há nenhuma norma de ouro estabelecida para normalizar os miRNAs soro; no entanto, controles exógenos como cravado a c. elegans miR-39 são uma solução elegante para procedimentos de normalização, como endógenos miRNAs são muitas vezes alterados em vários Estados de doença9.
As amostras de soro analisadas foram adquiridas antes de uma intervenção coronária percutânea (PCI), 8 h após uma PCI e 16 h após uma PCI, de pacientes com um segmento ST elevação infarto agudo do miocárdio (iam). STEMI pacientes apresentam isquemia severa e, assim, qualificar-se para a avaliação de novos biomarcadores de isquemia. Para avaliar a cinética de liberação de miR-499 e o uso potencial de miR-499 como um biomarcador para isquemia na doença cardiovascular, miR-499 foi analisada com dPCR através de todos os pacientes para o tempo de três diferentes pontos14.
A Figura 1 demonstra a seleção de gotículas positivas dando a concentração final de miRNA calculada pelo software. A fração de positivos em uma amostra determina a concentração de cópias / µ l, calculada pelo software comercial dPCR. Os resultados também podem ser visualizados em um plano 2D e os positivos podem ser manualmente marcados com círculos. As concentrações são consideradas apenas se eles estão acima da amplificação inespecífica dos NTCs.
A Figura 2 mostra a linearidade e a bondade de ajuste de uma série de diluição do miRNA sintético do oligonucleotide tem-miR-499-5 p em duplicatas. Uma série de diluições de 8-passo foi realizada de 2.500 cópias / µ l para 0 cópias / µ l. As cópias / µ esperados calculados l conforme descrito na tabela 5 assumir RT 100% e eficiência PCR digital. Nesta configuração, o PCR digital demonstra um alto grau de linearidade (r2 = 0,99). O limite de detecção (LoD = 0,12) e o limite de quantificação (LoQ = 0,23) também são apresentados na Figura 2, mostrando que mesmo uma expressão de miRNA baixa pode ser detectada com êxito. Assim, dPCR pode ser usado para quantificar níveis séricos nem baixa de miRNAs de circulação. O limite de detecção (LoD) e o limite de quantificação (LoQ) são calculadas seguindo a abordagem de Sara Filipa et al 15 e são definiram como LoD = LoB + 1.645 x σbaixoconcentraçãoamostra, onde o limite de espaço em branco (LoB) é calculado como LoB = médiaem branco + 1.645 x σem branco. O LoQ é então estimado replicar execução padrão curvas15. Para garantir que a quantificação pode ser reproduzida de miRNAs, somente as concentrações de miRNA que se encontram acima o LoD e o LoQ são consideradas como um valor válido de exato.
A Figura 3 mostra resultados representativos de miR-499 níveis de pacientes com um infarto do miocárdio-supradesnivelamento do segmento ST (STEMI), n = 16 em cada ponto de tempo. As amostras foram colhidas antes de uma intervenção percutânea (PCI) (t = 0), 8 h após uma PCI (t = 8) e 16 h após uma PCI (t = 16), e os níveis de miR-499 foram comparados aos níveis de miR-499 de pacientes com doença coronariana estável (CAD, n = 20). As principais características do pacientes podem ser encontradas na tabela 6. Após o lançamento inicial do miR-499 no soro nas primeiras 8 horas após um infarto do miocárdio, miR-499 níveis diminuem novamente após 16 h. Uma tendência no aumento já pode ser vista no início do STEMI (t = 0), e um aumento significativo dos níveis de miR-499, em comparação com pacientes com DAC pode ser visto 8 h após o STEMI (t = 8, p < 0,01) ao comparar níveis de miR-499 a miR-499 níveis de pacientes com DAC estáveis. O receptor operam curvas mostrar (ROC) a possível utilidade do miR-499 como biomarcador para diferenciar entre pacientes com DAC e pacientes com um STEMI romance [a área sob a curva (AUC) = 0,62 para amostras colhidas antes de uma intervenção percutânea (PCI), AUC = 0,75 para amostras colhidas de 8 h após uma PCI e AUC = 0,78 para amostras colhidas 16 h após um PCI em comparação com os níveis séricos de miR-499 em pacientes com DAC].
Figura 1: seleção de gotículas positivas em uma série de diluição realizada em duplicatas. (A) o limite é definido manualmente acima as gotas negativas. (B) os resultados são visualizados em um borrão 2D, os positivos selecionados pelo circulando. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: série de diluição sintético do oligonucleotide miR-499. (A) as medições foram realizadas em duplicata. Os dados são apresentados log transformado como absolutas cópias por µ l. regressões lineares e bondade de ajuste (r2-valor) são mostrados. Os dados são apresentados como média ± SEM. (B), este painel mostra o limite de detecção (LoD) e o limite de quantificação (LoQ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação de soro miR-499-5 p em pacientes com infarto do miocárdio supradesnivelamento do segmento ST em circulação (n = 16) antes da intervenção coronária percutânea (PCI), 8 h após a PCI e 16 h depois da PCI, em comparação com pacientes com coronariana estável doença (n = 20). (A) o circular soro miR-499-5 p é representado como média com o erro padrão da média com o correspondente p-valor calculado por One-Way ANOVA seguido de um teste de post hoc de Bonferroni (p < 0,05 foi considerado como estatisticamente significativa). Receptor (B) A análise da curva característica (ROC) de funcionamento é executada sobre os dados de painel A. A análise ROC demonstra a sensibilidade e especificidade do biomarcador. Além disso, a área correspondente sob os valores da curva (AUC) são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| quantidade de amostra | ||||
| n = 1 | / Bem [μl] | |||
| água livre de nuclease | 4.16 | |||
| 10x buffer de transcrição reversa | 1.5 | |||
| dNTP 100nm | 0.15 | |||
| Inibidor de RNAse | 0,19 | |||
| Primer específico do RT | 3 | |||
| Comercial Transcriptase reversa enzima 50 U/ul | 1 | |||
| Master-Mix total | 10 | |||
Tabela 1: Mistura de reagentes de transcrição reversa.
| Temperatura | Tempo |
| 16 ° C | 30 mins |
| 42 ° C | 30 mins |
| 85 ° C | 5 min. |
| 4 ° C | ∞ |
Tabela 2: Condições de ciclagem térmicas para transcrição reversa.
| quantidade de amostra | ||||
| n = 1 | / Bem [μl] | |||
| água livre de nuclease | 7,67 | |||
| mistura de dPCR comercial | 10 | |||
| 20 x hidrólise específica da primeira demão/sonda | 1 | |||
| Master-Mix total | 18.67 | |||
Tabela 3: PCR Digital Mix de reagente.
| Temperatura | Tempo |
| 95 ° C | 10 min. |
| 94 ° C | 30 segundos (x40) |
| 60 ° C | 1 min |
| 98 ° C | 10 min. |
| 4 ° C | ∞ |
Tabela 4: Ciclismo condições térmicas para PCR digital.
| Tubo | Transferido do oligonucleotide sintético miR-499 (µ l) | Diluente (µ l) | miRNA (cópias / µ l) | Esperado cópias / µ l em RT | Esperado cópias / µ l em dPCR |
| Original | 6.022 x 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 x 106 | ||
| 4 | 18,7 | 981.3 | 1.128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150,4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 x 102 | 37,6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
Tabela 5: Série de diluição sintético para miR-499.
| Característica | Todos os | Estáveis de pacientes com DAC (n = 20) | STEMI pacientes (n = 24) | p-valor |
| Idade | 64,7 ± 11,9 | 66,7 ± 13,1 | 62,2 ± 9,9 | 0.2810 |
| Machos | 77,8% | 65% | 93,8% | 0.0392 |
| DM | 33,3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| HTN | 61,1% | 60% | 62,5% | 0.8785 |
| Dislipidemia | 38,9% | 65% | 6,3% | 0.0003 |
| Fumante | 47,2% | 55% | 37,5% | 0.3796 |
| História da família | 25% | 35% | 12,5% | 0.1213 |
| Excesso de peso | 58,3% | 55% | 62,5% | 0.6501 |
| Creatinina sérica (mg/dL) | 0,94 (0,83 - 1) | 0,98 (0,82 - 1.01) | 0,93 (0,83 - 1) | 0.7255 |
| Pico CK (U / eu) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0,0004 |
| Pico de miocardite (ng/L) | 322,5 (23,8-4533) | 18 (7-25,3) | 2492 (240-5586) | 0,0002 |
| % DE FEVE | 45% (40% - 50%) | 45% (32,5% - 55%) | 45% (45% - 50%) | 0.9596 |
| Valores são apresentados como média ± DP; o valor mediano (faixa de 25 a 75 percentil) ou % | ||||
| DM: Diabetes mellitus | ||||
| HTN: hipertensão | ||||
| CK: Creatina quinase | ||||
| Miocardite: troponina cardíaca T | ||||
| FEVE: Fração de ejeção do ventrículo esquerdo | ||||
Tabela 6: Principais características de paciente.
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Discussion
Digital PCR é um método relativamente novo de ponto de extremidade do PCR que permite a quantificação absoluta direta de ácidos nucleicos dentro de uma amostra. O método possui vantagens específicas, incluindo uma diminuição da variabilidade, uma maior reprodutibilidade diária e uma sensibilidade superior11,12. Além disso, devido o particionamento da amostra em aproximadamente 20.000 reações simples e análises de ponto de extremidade, dPCR é mais robusta para substâncias interferentes na PCR em comparação com o de RT-PCR quantitativo16. Estas qualidades em dPCR torná-lo uma alternativa atraente para RT-PCR quantitativo como uma ferramenta diagnóstica para quantificação. Como circulam os miRNAs são frequentemente presentes em concentrações baixas de soro, até agora, os cientistas têm sido desafiados quantificar adequadamente os miRNAs por PCR9. Por outro lado, dPCR apropriadamente pode quantificar nem uma expressão de miRNA baixa no soro, atenuar os problemas observados em miRNA de baixa contagem quantificação17. A capacidade de dPCR diretamente dar as contagens / µ l, mesmo em uma expressão de miRNA muito baixa, assim, torna uma atraente ferramenta de diagnóstico para a comunidade de pesquisa cardiovascular em estudos de biomarcador de miRNA. Como a concentração no contagens / µ l pode ser multiplicada pelo factor de diluição utilizado na extração, RT-reação e dPCR, é possível atingir o número exato de cópias em 1 µ l de soro. O fluxo de trabalho aqui apresentado pode ser executado em até 96 amostras em uma placa, portanto, fornecendo uma ferramenta para grandes estudos cardiovasculares. Embora dPCR apresenta várias vantagens sobre a RT-PCR quantitativo, não é ainda rotineiramente aplicada para a quantificação dos miRNAs em ensaios cardiovasculares. Procedimentos de normalização de dados padronizado, mais estão faltando.
Nesta abordagem, demonstramos que dPCR, combinado com sondas fluorescentes de hidrólise, permite a quantificação absoluta direta específica circulantes de miRNAs ligados à doença cardiovascular. Com este relatório, tivemos como objetivo demonstrar um protocolo otimizado para a deteção de miRNA através de dPCR e confirmar as vantagens do dPCR em RT-PCR quantitativo.
Confirmamos as exposições de dPCR boa linearidade e os baixos limites de detecção e quantificação de dPCR para quantificar os miRNAs. Subindo a amostra com um sintético do oligonucleotide, a normalização da amostra é possível, ajustando para a eficiência de extração e variação da amostra-para-amostra.
Em conclusão, PCR digital, como exibe superioridade em proficiência técnica e diagnóstico potencial, é o melhor método atual para quantificação de miRNA e ainda pode ser utilizado para estudos de biomarcador de grandes multi centro cardiovascular miRNA.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores têm sem confirmações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
