Summary
وقد أظهرت ميكرورناس تعميم الوعد المؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية وقال عضلة القلب الحاد. في هذه الدراسة، يمكننا وصف بروتوكول لاستخراج ميرنا والنسخ العكسي، وبكر الرقمية للتحديد الكمي المطلق ميرناس في مصل المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية.
Abstract
تعميم المصل ميكرورناس (ميرناس) قد أظهرت الوعد كالمؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية واحتشاء عضلة القلب الحاد (عامي)، الإفراج عنهم من خلايا القلب والأوعية الدموية في الدورة الدموية. ميرناس المتداولة هي مستقرة جداً ويمكن قياسها كمياً. ويمكن ربط التعبير الكمي عن ميرناس محددة لعلم الأمراض، وبعض ميرناس وتظهر الأنسجة عالية وخصوصية المرض. إيجاد رواية المؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية من الأهمية للبحوث الطبية. ومؤخرا جداً، تم اختراع الرقمية البلمرة المتسلسل (دبكر). دبكر، جنبا إلى جنب مع تحقيقات التحلل الفلورسنت، تمكن الكمي المطلق مباشرة محددة. دبكر المعارض متفوقة الصفات التقنية، بما في ذلك تقلب منخفضة وعالية الخطي، وحساسية عالية مقارنة بالكمية البلمرة المتسلسل (قبكر). وهكذا، دبكر أسلوب أكثر دقة واستنساخه للتحديد الكمي لمباشرة ميرناس، خاصة للاستخدام في التجارب السريرية القلبية الوعائية مركز متعدد كبيرة. في هذا المنشور، ونحن تصف كيفية فعالية أداء بكر الرقمية بغية تقييم عدد النسخ المطلق في عينات مصل الدم.
Introduction
وقد حددت ميرناس المتداولة كعلامات تبشر بالخير لعدد من الأمراض، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية1. ميرناس الصغيرة، وغير الترميز جزيئات الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (حوالي 22 النيوكليوتيدات طويلة) وتشارك في التنظيم بوستترانسكريبشونال عن طريق تحوير الحمض النووي الريبي رسول الترجمة والتأثير على التعبير الجيني2، ويتم إصدارها للتداول في الدول الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. التعبير الكمي عن ميرناس معينة يمكن ربطها علم الأمراض، وبعض ميرناس وتظهر الأنسجة عالية و خصوصية المرض1. في أمراض القلب والأوعية الدموية، أصبحت ميرناس جاذبية المرشحين حسب المؤشرات الحيوية رواية كمياً لأنهم استقرارا ملحوظا في المصل ويمكن بسهولة مع المساعدة من منهجية بكر3. وقد تم تقييم القيمة المحتملة ميرناس كالمؤشرات الحيوية لاحتشاء عضلة القلب في دراسات صغيرة، ولكن التحقق من صحة في أفواج كبيرة تفتقر إلى2. على سبيل المثال، يوجد مير-499 أعرب شديدة في عضلة عضلة القلب، وقد ثبت أن تحقيق زيادة كبيرة في أمي4،،من56. علاوة على ذلك، فإنه ينظم برمجة موت الخلايا (المبرمج) والتفريق بين كارديوميوسيتيس وهكذا تشارك في العديد من الآليات التالية عامي7. وبصرف النظر عن بعض الدراسات الصغيرة الإبلاغ التفوق والقيمة الإضافية ميرناس لتشخيص أمي، بالتفوق أو المساواة بحساسية عالية تروبونينس القلب لا بعد ثبت في دراسات واسعة النطاق2،5 ،،من68. ولذلك، المزيد من الدراسات المستقبلية في أفواج كبيرة ضرورية لتقييم قيمة التشخيص المحتملة ميرناس. بالإضافة إلى ذلك، أساليب القياس الكمي ميرنا بحاجة إلى أن يكون الأمثل وموحدة باستخدام المقارنة بروتوكولات9. الاختبارات الموحدة قد يقلل من نتائج غير متناسقة وقد تساعد ميرناس لتصبح المؤشرات الحيوية المحتملة للتطبيق السريري الروتيني، كما تحتاج المؤشرات الحيوية كمياً بطريقة استنساخه لضمان قابليتها للتطبيق السريري.
وقد أدخلت مؤخرا، دبكر كتحليل نقطة نهاية. الأقسام العينة إلى ردود الفعل الفردية 20,000 حوالي الساعة10. ثم يستخدم النظام دبكر رياضية Poisson تحليلاً إحصائيا لإشارات الفلورسنت (ردود الفعل الإيجابية والسلبية)، تمكن القياس الكمي مطلق دون منحنى المعياري10. عند الجمع بين دبكر مع تحقيقات التحلل الفلورسنت، أصبح ممكناً التقدير الكمي المطلق مباشرة محددة للغاية من ميرناس. أظهرت الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل يحمل الصفات التقنية العليا (بما في ذلك تقلب انخفاض، زيادة في إمكانية تكرار نتائج اليومية ودرجة عالية من الخطي وحساسية عالية) لقياس مستويات ميرنا في تداول مقارنة بالكمية في الوقت الحقيقي بكر10،11. هذه الصفات التقنية المتفوقة قد يساعد على التخفيف من القيود المفروضة حاليا على استخدام ميرناس المتداولة كالمؤشرات الحيوية، وقد يؤدي إلى إنشاء ميرناس كالمؤشرات الحيوية في التجارب السريرية القلبية الوعائية مركز متعدد كبيرة وأسلوب تشخيص في العامة. في دراسة سابقة، ونحن مؤخرا تطبيق دبكر للتحديد الكمي المطلق لتعميم ميرناس في المرضى الذين يعانون من أمي وكانت قادرة على إثبات إمكانية التشخيص متفوقة مقارنة بالتحديد الكمي ميرناس قبكر12.
في هذا المنشور، نريد أن ندلل على أن استخدام دبكر طريقة دقيقة واستنساخه للتحديد الكمي لمباشرة تعميم ميرناس القلب والأوعية الدموية. التحديد الكمي المطلق لمستويات ميرنا في مصل الدم، استخدام PCR الرقمية، يظهر المحتملة للاستخدام كبير مركز متعدد التجارب السريرية القلب والأوعية الدموية. في هذا المنشور، ونحن تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ فعالية PCR الرقمية وكيفية الكشف عن عدد نسخ ميرنا المطلق في مصل الدم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-استخراج ميرنا من المصل/بلازما
ملاحظة: من أجل تحديد ميرناس على نحو ملائم، عزل ميكرورنا الصحيح من المصل/البلازما خطوة حاسمة. شيء رئيسي من أن نأخذ في الاعتبار، لا سيما بسبب وجود بروتوكولات مختلفة, على التمسك بنفس سير العمل أثناء معالجة العينات. في هذا البروتوكول، ويتم استخراج ميرنا من 50 ميليلتر من المصل. لا تستخدم أكثر من 200 ميليلتر كهذا الحد عملية الاستخراج الصحيح.
- إعداد مصل أو ذوبان الجليد العينات المجمدة.
- إضافة 250 ميليلتر (5 مجلدات) تحلل التجارية الكاشف إلى 50 ميليلتر من المصل. دعم تحلل فورتيكسينج. ضع الأنبوب مع على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- سبايك مع 3.5 ميليلتر من المصطلحات الخاصة بعنصر التحكم (1.6 × 107 نسخة/ميليلتر) ومزجها فورتيكسينج.
- إضافة 50 ميليلتر من كلوروفورم (أي، مبلغ مماثل فيما يتعلق بعينه المصل انطلاق) لفصل المرحلة. يهز الأنبوب بقوة لمكان س. 15 أنبوب على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
- لفصل المرحلة، الطرد المركزي الأنبوب في س 12,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: يتم فصل العينات الآن إلى مرحلة مائي العلوي يحتوي على الجيش الملكي النيبالي ومن الطور البيني بيضاء، ومرحلة عضوية أقل الوردي. - نقل المرحلة المائية العليا (100 ميليلتر) يحتوي على الجيش الملكي النيبالي في أنبوب جديد. لا يتم تحويل أي مادة بيضاء الطور البيني كهذا تزيف تعداد الجيش الملكي النيبالي الصحيح.
- إضافة 150 ميليلتر (أي1.5 x حجم العينة المنقولة) من الإيثانول 100%. خلط المواد التي بيبيتينج عليها صعودا وهبوطاً. عدم الطرد المركزي لهم، وسرعة الانتقال إلى الخطوة التالية.
- "الماصة؛" 250 ميليلتر من العينة على عمود دوران تجاري في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء. الطرد المركزي العمود في > ز س 8,000 في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15-التدفق عبر.
- إضافة 700 ميليلتر للغسيل التجاري المخزن المؤقت رقم 1 على عمود الدوران. إغلاق الغطاء والطرد المركزي العمود في > ز س 8,000 في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15 المخزن المؤقت الغسيل رونثرو.
- إضافة 500 ميليلتر للغسيل التجاري المخزن المؤقت رقم 2 على عمود الدوران. إغلاق الغطاء والطرد المركزي العمود في > 8، 000 x ز في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15 المخزن المؤقت الغسيل رونثرو.
- "الماصة؛" 500 ميليلتر من الإيثانول 80% على عمود الدوران. إغلاق الغطاء، والطرد المركزي العمود في > 8، تجاهل ز 000 x في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 أنبوب جمع مع التدفق عبر.
- نقل عمود الدوران إلى أنبوب جمع 2 مل جديدة. الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة مع غطاء فتح الجاف للغشاء. تجاهل أنبوب جمع مع التدفق عبر.
- نقل عمود الدوران في أنبوب جمع 1.5 مل جديدة. الوت الجيش الملكي النيبالي بتطبيق 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي مباشرة إلى مركز للغشاء. أغلق الغطاء. الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
- مخزن الجيش الملكي النيبالي في-70 درجة مئوية.
ملاحظة: يضمن التخزين لتنقية الحمض النووي الريبي في المياه خالية من رناسي بين-70 درجة مئوية إلى-20 درجة مئوية لا تدهور للجيش الملكي النيبالي لمدة سنة واحدة. بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، وهو الحد الأدنى لحجم المياه خالية من رناسي تمييع الجيش الملكي النيبالي 10 ميليلتر. استخدام أقل من 10 ميليلتر قد هيدرات الغشاء غير كاف وتقليل إجمالي العائد الجيش الملكي النيبالي.
2-عكس النسخ
ملاحظة: تم تصنيعه الحمض النووي التكميلية (كدنا) استخدام بروتوكول النسخ العكسي (RT) 15 ميليلتر التالية (رد فعل مجموع حجم).
- ذوبان الجليد الطقم RT على الجليد. تبقى الإنزيمات في الثلاجة أطول وقت ممكن منعهم من اللاإنسانية وتدور لهم أسفل قبل الاستخدام. ذوبان الجليد الإشعال RT على الجليد وتدور لهم أسفل قبل الاستخدام.
- إعداد مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 1.
- الجمع بين 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي و 5 ميليلتر من الحمض النووي الريبي المستخرج كل بئر في صفيحة جيدا 96.
- الطرد المركزي لوحة جيدا في 2,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- استخدام بروتوكول الدورة الحرارية المبينة في الجدول 2 للنسخ العكسي.
ملاحظة: كما هو موضح أدناه، كدنا يجوز مباشرة معالجتها في جهاز PCR الرقمية (انظر الجدول للمواد)؛ وبدلاً من ذلك، قد تكون مخزنة في-20 درجة مئوية.
3-الحبرية جيل وبكر الرقمية
ملاحظة: الرقمية تم إجراء PCR باستخدام بروتوكول ميليلتر 40 التالية.
- ذوبان الجليد مزيج دبكر التجارية، وكدنا استعداد والإشعال بكر على الجليد. الطرد المركزي لهم قبل وقت قصير من الاستخدام.
- إعداد مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 3-
- إضافة من المنتج RT 1.33 ميكروليتر/جيدا والطرد المركزي أنه بإيجاز.
- "الماصة؛" 20 ميكروليتر من العينة في كل بئر من كاسيت 8-جيدا (المتوسط الصف).
ملاحظة: إذا لم يتم ملء كاسيت 8-جيدا تماما، تملأ الآبار المتبقية مع الضوابط غير القالب (NTCs) التي تسقط كدنا (أيالمنتج RT أنتجت مع المياه بدلاً من استخراج الحمض النووي الريبي) أو دبكر التجارية المخزن المؤقت. المجلس الوطني الانتقالي بمثابة عنصر تحكم تلوث. يجب عدم استخدام المياه في الآبار المتبقية، لأن ذلك سيضر بنوعية تشكيل الحبرية. - "الماصة؛" ميكروليتر 70 النفط جيل الحبرية للتحقيقات في آبار النفط (الصف السفلي) كاسيت 8-جيدا.
- وضع طوقا على رأس كاسيت 8-جيدا ثم ضع الكاسيت في مولد الحبرية. قم بإغلاق منشئ الحبرية. الانتظار حتى أضواء مؤشر 3 أخضر خالص.
ملاحظة: الآن يتم إنشاء قطرات. - بعناية وبطء نقل 40 ميكروليتر من عينة شكلت الحبرية (الصف العلوي) في آبار منفصلة من صفيحة 96-جيدا قبل بيبيتينج.
- بعد الانتهاء من تشكيل الحبرية في العينات، ختم اللوحة بكر مع إحباط دبكر بيرسيابل عند 180 درجة مئوية 4 s.
- بكر-لوحة مختومة إحباط في cycler ودورة عليه كما هو موضح في الجدول 4، بمعدل 2.5 منحدر ° C/s.
4-الحبرية قراءة وتحليل
- نقل اللوحة من cycler الحرارية لقاعدة حامل اللوحة. تشديد لوحة بكر بوضع الجزء العلوي من صاحب لوحة على لوح PCR.
- بدء تشغيل البرنامج دبكر التجارية.
- أدخل الاسم عينة، واسم التجربة، والهدف في برنامج الإعداد. حدد التحديد الكمي المطلق.
- بدء الحبرية القراءة بواسطة النقر فوق تشغيل. حدد الاتحاد الماليزي/ست عشري أو الاتحاد الماليزي/مركز فيينا الدولي كالكيمياء الكشف عند العمل مع تحقيقات التحلل المائي.
ملاحظة: البرنامج دبكر التجاري سوف ثم السيارات-تحليل البيانات. - التحقق من الأرقام التجميعية في جدول النتائج لضمان جيل الحبرية صحيح.
- حدد جميع الآبار مع ميرنا كمياً نفس ثم انقر فوق تحليل. استخدام 2D وصمة عار لعلامة إيجابية قطرات ويدويًا تصحيح البيانات تحليل السيارات (الشكل 1).
5-تصحيح العمليات الحسابية على عينة
- تطبيع العينة بضرب العينة بعامل تطبيع (NF).
NF = متوسط [C. ايليجانس مير-39 القياسات]جميع عينات/[C. ايليجانس مير-39]نموذج معين - حساب تركيز المصل ميرنا النهائي، ضبط لإضعاف العوامل (مدافع).
[ميرنا] النهائي = [ميرنا]قيمة الخام س مدافعRT × مدافعدبكر × مدافعالسابقين
حيث:
[ميرنا] قيمة الخام = ميرنا كمياً بالبرمجيات دبكر التجارية؛
مدافعRT = عامل تخفيف للقالب في النسخ العكسي؛
مدافعدبكر = عامل تخفيف للقالب في دبكر؛
مدافعت = معامل التخفيف في الاستخراج.
6-الاصطناعية اليغنوكليوتيد تمييع سلسلة
- ذوبان الجليد اليغنوكليوتيد الاصطناعية المجففة بالتبريد بالثلج. باختصار الطرد المركزي.
- تمييع اليغنوكليوتيد الاصطناعية المجففة بالتبريد في المياه خالية من نوكلاس لتركيز نهائي 10 pmol/ميليلتر. بإيجاز الطرد المركزي هو.
- تمييع في المياه خالية من نوكلاس كما هو موضح في الجدول 5. الطرد المركزي التخفيف بإيجاز بين كل خطوة تمييع في 8,000 ز خ ل 10 ق.
- تواصل مع النسخ العكسي كما هو موضح في الخطوة 2 وتحليل العينات مع بكر الرقمية كما هو موضح في الخطوة 3 والخطوة 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بكر الرقمية جنبا إلى جنب مع تحقيقات التحلل الفلورسنت تمكن الباحثين مباشرة تحديد مقدار المبالغ المطلقة من ميرناس محددة في نسخة/ميليلتر. كما تم تقسيم العينة في دبكر في ردود الفعل تقريبا 20,000 PCR الفردية، دبكر لا تتطلب التقنية يتطابق10. يستخدم النظام دبكر بواسون رياضية تحليل إحصائي لإشارات الفلورسنت (اختلاف بين ردود فعل إيجابية وسلبية) تمكين التحديد الكمي مطلق دون الحاجة إلى معيار منحنى10. كي صحيح حساب التركيزات، هناك حاجة إلى حصيلة مقبولة الحبرية (> 15,000). أية عناصر تحكم قالب ضمان استبعاد التضخيم الكبير غير محدد. تتم معالجة جميع العينات المدرجة في التحليل باستخدام نفس وحدة التخزين، والأسلوب، وبروتوكول PCR لتعزيز صحة النتائج المتحصل عليها. يتم تطبيع التركيزات التي يتم الحصول عليها في دبكر استخدام إجراء تطبيع متوسط عبر جميع العينات التي تم تحليلها مع الاصطناعية ارتفعت في C. ايليجانس مير-3913. تطبيع البيانات لقياس مقدار ارتفعت في C. ايليجانس مير-39 بتصحيح لتباين العينة بعينه في كفاءة استخراج الحمض النووي الريبي ويعمل كعنصر تحكم رد فعل بكر، كذلك إضافة إلى صحة النتائج. لا يوجد أي معيار الذهب الراسخة لتطبيع ميرناس المصل؛ ومع ذلك، عناصر خارجية مثل ارتفعت في C. ايليجانس مير-39 حلاً رائعا لإجراءات التطبيع، كما ميرناس الذاتية غالباً ما تتغير في مختلف الدول المرض9.
تم اقتناء عينات المصل تم تحليلها قبل تدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI)، ح 8 بعد PCI، و 16 ح بعد PCI، من المرضى الذين يعانون من حادة قطعة ST ارتفاع احتشاء عضلة القلب (STEMI). STEMI المرضى يحمل الاسكيمية شديدة وهكذا تتأهل لتقييم المؤشرات الحيوية الاسكيمية الجديدة. تقييم الحركية من إطلاق سراح مير-499 والاستخدام المحتمل مير-499 كالعلامات البيولوجية الاسكيمية في أمراض القلب والأوعية الدموية، وقد تم تحليل مير-499 مع دبكر عبر جميع المرضى ل نقاط زمنية مختلفة الثلاثة14.
يوضح الشكل 1 اختيار إيجابية قطرات إعطاء تركيز ميرنا النهائي حسابها بواسطة البرنامج. جزء صغير إيجابيات في عينة يحدد تركيز نسخة/ميليلتر كما حسبها البرمجيات التجارية دبكر. يمكن أيضا تصور النتائج في 2D مؤامرة والإيجابيات يمكن أن يكون علامة يدوياً مع الدوائر. وتعتبر تركيزات فقط إذا كانوا أعلاه التضخيم غير محدد لتتباين.
ويبين الشكل 2 الخطي والخير لصالح سلسلة تمييع ف له-مير-499-5 اليغنوكليوتيد ميرنا الاصطناعية في التكرارات. وأجرى سلسلة الخطوة 8 إضعاف من نسخ 2,500/ميليلتر لنسخ 0/ميليلتر. المتوقعة المحسوبة نسخة/ميليلتر كما هو موضح في الجدول 5 تفترض RT 100% وكفاءة PCR الرقمية. في هذا الإعداد، يوضح بكر الرقمية بدرجة عالية من الخطي (ص2 = 0.99). الحد الأقصى للكشف (اللد = 0.12) والحد الأقصى للتقدير الكمي (لوك = 0.23) وترد أيضا في الشكل 2، تبين أن تعبير ميرنا منخفضة حتى يمكن الكشف عن بنجاح. وهكذا، يمكن استخدام دبكر لقياس مستويات المصل منخفضة حتى تعميم ميرناس. الحد الأقصى للكشف (اللد) والحد الأقصى للتقدير الكمي (لوك) تحسب باتباع نهج فروتن et al. 15 وهي تعرف أنها اللد = لوب + 1.645 x σمنخفضتركيزعينة، حيث يتم حساب الحد الأقصى فارغة (LoB) ك LoB =فارغة يعني + 1.645 x σفارغة. لوك ثم يقدر تكرار التشغيل القياسية منحنيات15. لضمان التحديد الكمي استنساخه من ميرناس، تركيزات ميرنا الماثلة أعلاه في اللد وفي لوك فقط تعتبر كقيمة دقيق صالحة.
ويبين الشكل 3 نتائج تمثيلية لمستويات مير-499 من مرضى ارتفاع ST احتشاء عضلة القلب (STEMI)، n = 16 عند كل نقطة في الوقت. أخذت عينات من قبل بتدخل عن طريق الجلد (PCI) (t = 0)، ح 8 بعد PCI (t = 8)، وح 16 بعد PCI (تي = 16)، ومقارنة مستويات مير-499 إلى مستويات مير-499 من المرضى بمرض الشريان التاجي المستقر (CAD، ن = 20). يمكن الاطلاع على خصائص المريض الرئيسية في الجدول 6. بعد الإصدار الأولى من مير-499 في المصل في ح 8 الأولى التالية احتشاء عضلة القلب، انخفاض مستويات مير-499 مرة أخرى بعد 16 ساعة. الفعل يتبين اتجاه في الزيادة من ستيمي بداية (t = 0)، ويمكن زيادة كبيرة في مستويات مير-499 مقارنة للمرضى مع كندي ح 8 ينظر بعد ستيمي (t = 8، ف < 0.01) عند مقارنة مستويات مير-499 مير-499 مستويات مستقرة كاد المرضى. جهاز الاستقبال تعمل المنحنيات (ROC) إظهار فائدة ممكنة من مير-499 كالعلامات البيولوجية رواية التفريق بين المرضى مع كندي والمرضى الذين يعانون ستيمي [المنطقة تحت المنحنى (AUC) = 0.62 للعينات المأخوذة قبل تدخل عن طريق الجلد (PCI)، أوك = 0.75 لعينات أخذت ح 8 بعد PCI، واوك = 0.78 لعينات أخذت ح 16 بعد المشروع مقارنة بمستويات المصل من مير-499 في المرضى مع كندي].
رقم 1: اختيار قطرات الإيجابية في سلسلة تمييع أداؤها في التكرارات. (أ) الحد الأدنى يتم تعيين يدوياً أعلاه قطرات السلبية. (ب) يتم تصور النتائج في حركتك 2D إيجابيات اختارها الدوران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: سلسلة تمييع الاصطناعية مير-499 اليغنوكليوتيد. (أ) تم إجراء القياسات في التكرارات. وترد البيانات سجل تحول كنسخ المطلق لكل ميليلتر. التراجع الخطي والخير لصالح (ص2-القيمة) ترد. يتم عرض البيانات يعني ± sem. (ب) هذا الفريق يبين الحد من الكشف عن (اللد) والحد الأقصى للتقدير الكمي (لوك). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: القياس الكمي لتعميم ف مير-499-5 المصل في المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب ارتفاع ST (n = 16) قبل التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI)، ح 8 بعد PCI، وح 16 بعد PCI، مقارنة بمرضى الشريان التاجي المستقر المرض (n = 20)- (أ) تعميم المصل مير-499-5 ف يتم تمثيلها يعني مع الخطأ المعياري للوسط مع المقابلة فالقيمه التي تم حسابها بواسطة ANOVA اتجاه واحد متبوعاً باختبار الوظائف المخصصة بونفيروني (ف < اعتبرت 0.05 يعتد به إحصائيا). (ب) جهاز استقبال يعمل تحليل منحنى المميزة (ROC) تتم على البيانات من لوحة A. ويبين تحليل ROC حساسية وخصوصية العلامات البيولوجية. علاوة على ذلك، يبين أن المنطقة المقابلة تحت المنحنى (AUC) القيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| حجم العينة | ||||
| n = 1 | /وأيضا [ميكروليتر] | |||
| المياه خالية من نوكلاس | 4.16 | |||
| 10 x "عكس النسخ" الاحتياطي | 1.5 | |||
| دنتب 100nM | 0.15 | |||
| مثبط رناسي | 0.19 | |||
| محددة RT التمهيدي | 3 | |||
| التجاري المنتسخة العكسية إنزيم 50 ش/ul | 1 | |||
| مجموعة رئيسية--ميكس | 10 | |||
الجدول 1: النسخ العكسي الكواشف المزيج.
| درجة الحرارة | الوقت |
| 16 درجة مئوية | 30 دقيقة |
| 42 درجة مئوية | 30 دقيقة |
| 85 درجة مئوية | 5 دقائق |
| 4 درجة مئوية | ∞ |
الجدول 2: شروط الدراجات الحرارية للنسخ العكسي.
| حجم العينة | ||||
| n = 1 | /وأيضا [ميكروليتر] | |||
| المياه خالية من نوكلاس | 7.67 | |||
| مزيج دبكر التجارية | 10 | |||
| 20 x التحلل المائي محددة التمهيدي/التحقيق | 1 | |||
| مجموعة رئيسية--ميكس | 18.67 | |||
الجدول 3: بكر الرقمية كاشف مزيج.
| درجة الحرارة | الوقت |
| 95 درجة مئوية | 10 دقائق |
| 94 درجة مئوية | 30 ثانية (x40) |
| 60 درجة مئوية | 1 دقيقة |
| 98 درجة مئوية | 10 دقائق |
| 4 درجة مئوية | ∞ |
الجدول 4: الحرارية "الدراجات شروط" PCR الرقمية.
| أنبوب | نقل اليغنوكليوتيد الاصطناعية مير-499 (ميليلتر) | مخفف (ميليلتر) | ميرنا (نسخة/ميليلتر) | نسخة/ميليلتر المتوقعة في الرايت | نسخ المتوقعة/ميليلتر في دبكر |
| اللغة الأصلية | 6.022 × 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 × 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 × 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 × 106 | ||
| 4 | 18.7 | 981.3 | 1.128 × 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 × 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 × 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 × 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 × 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 × 102 | 150.4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 × 102 | 37.6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
الجدول 5: سلسلة تمييع الاصطناعية مير-499.
| مميزة | جميع | مستقرة المرضى كندي (n = 20) | STEMI المرضى (ن = 24) | قيمة p |
| العمر | 64.7 ± 11.9 | 66.7 ± 13.1 | 62.2 ± 9.9 | 0.2810 |
| الذكور | 77.8 في المائة | 65% | 93.8 ٪ | 0.0392 |
| مارك ألماني | 33.3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| هتن | 61.1 في المائة | 60 في المائة | 62.5% | 0.8785 |
| دسليبيدميا | 38.9 في المائة | 65% | 6.3% | 0.0003 |
| مدخن | 47.2 في المائة | 55% | 37.5% | 0.3796 |
| تاريخ الأسرة | 25% | 35% | 12.5 في المائة | 0.1213 |
| زيادة الوزن | 58.3 في المائة | 55% | 62.5% | 0.6501 |
| كرياتينين المصل (mg/dL) | 0.94 (0.83-1) | 0.98 (0.82-1.01) | 0.93 (0.83-1) | 0.7255 |
| ذروة كورونا تشيكية (U/أنا) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0.0004 |
| كتنت الذروة (نانوغرام/لتر) | 322.5 (23.8-4533) | 18 (7-25.3) | 2492 (240-5586) | 0.0002 |
| % لفيف | 45% (40%-50%) | 45% (32.5%-55%) | 45% (45%-50%) | 0.9596 |
| يتم عرض القيم كما يعني ± التنمية المستدامة؛ متوسط القيمة (نطاق القيمة المئوية 25 إلى 75) أو % | ||||
| مارك ألماني: السكري | ||||
| هتن: ارتفاع ضغط الدم | ||||
| كورونا تشيكية: كيناز الكرياتين | ||||
| كتنت: القلب تروبونين تي | ||||
| لفيف: كسر قذفي البطين الأيسر | ||||
الجدول 6: الخصائص الرئيسية المريض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بكر الرقمية هو أسلوب نقطة نهاية جديدة نسبيا من PCR الذي يسمح التحديد الكمي المطلق مباشرة من الأحماض النووية داخل عينة. الأسلوب الذي يملك مزايا خاصة، بما في ذلك تقلب انخفاض، زيادة في إمكانية تكرار نتائج اليومية، و حساسية فائقة11،12. علاوة على ذلك، بسبب تقسيم العينة إلى ردود فعل واحد تقريبا من 20,000 وتحليلات نقطة النهاية، دبكر أكثر متانة لمواد تدخل في PCR مقارنة بالكمية RT-PCR16. تجعل من هذه الصفات في دبكر بديلاً جذاباً للكمية RT-PCR كأداة تشخيصية للقياس الكمي. كتعميم ميرناس غالباً ما حاضرا في تركيزات المصل منخفضة، حتى الآن، قد طعن فيها العلماء على نحو ملائم كمياً ميرناس بكر9. من ناحية أخرى، دبكر مناسب يمكن تحديدها كمياً حتى تعبير ميرنا منخفضة في المصل، التخفيف من حدة المشاكل التي لوحظت في انخفاض عدد ميرنا الكمي17. وبالتالي قدرة دبكر مباشرة إعطاء التهم/ميليلتر، حتى في تعبير ميرنا منخفضة جداً، يجعلها أداة تشخيصية جذابة للمجتمع أبحاث القلب والأوعية الدموية في دراسات العلامات البيولوجية ميرنا. كما يمكن أن يكون تركيز النظر في التهم الموجهة إليه/ميليلتر مضروباً في عامل إضعاف المستخدمة في الاستخراج ورد فعل الرايت دبكر، من الممكن تحقيق العدد الدقيق لنسخ في 1 ميليلتر من المصل. يمكن إجراء سير العمل المقدمة هنا في عينات تصل إلى 96 على لوحة، ومن ثم توفير أداة لدراسات القلب والأوعية الدموية الكبيرة. على الرغم من أن يسلك دبكر العديد من المزايا RT-PCR الكمي، فلن حتى الآن بشكل روتيني يطبق للتحديد الكمي ميرناس في محاكمات القلب والأوعية الدموية. لا توجد بيانات موحدة، وكذلك إجراءات التطبيع.
وفي هذا النهج، نظهر أن دبكر، جنبا إلى جنب مع تحقيقات التحلل الفلورسنت، يتيح التقدير الكمي المطلق مباشرة محددة لتعميم ميرناس المرتبطة بأمراض القلب والأوعية الدموية. مع هذا التقرير، نحن تهدف إلى كل تبرهن على بروتوكول أمثل للكشف عن ميرنا عبر دبكر وتأكيد مزايا دبكر عبر RT-PCR الكمي.
وأكد أننا المعروضات دبكر الخطي جيدة وحدود منخفضة للكشف والتحديد الكمي دبكر للتحديد الكمي ميرناس. بالنتوءات العينة مع اليغنوكليوتيد اصطناعية، تطبيع العينة الممكن، ضبط كفاءة الاستخراج وتباين العينة بالعينة.
وفي الختام، بكر الرقمية، كما أنه يسلك التفوق في الكفاءة التقنية والقدرة التشخيصية، هو الأسلوب الحالي أفضل للقياس الكمي ميرنا وأخرى يمكن استخدامها للدراسات العلامات البيولوجية الكبيرة مركز متعدد ميرنا القلب والأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلفين قد لا إعلامات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
