Summary
מחזורי מיקרו Rna הראו הבטחה כמו סמנים ביולוגיים עבור infarctions אוטם אקוטי ומחלות לב וכלי דם. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול miRNA החילוץ, שעתוק במהופך של PCR דיגיטלי עבור כימות מוחלטת של miRNAs בנסיוב של חולים עם מחלות לב וכלי דם.
Abstract
סרום מחזורי מיקרו Rna (miRNAs) הראו הבטחה כמו סמנים למחלות לב וכלי דם, אוטם אקוטי (עמי), ששוחרר מן התאים וכלי דם למחזור. MiRNAs מחזורי יציב מאוד, ניתן לכמת. ביטוי כמותי של miRNAs מסוים אפשר לקשר את הפתולוגיה, ואני קצת miRNAs הצג רקמות גבוהה וספציפיות המחלה. מציאת סמנים חדשניים למחלות לב וכלי דם יש חשיבות למחקר רפואי. די מזמן, הומצאה תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי (dPCR). dPCR, בשילוב עם הגששים הידרוליזה פלורסנט, מאפשר מסוים כימות מוחלטת ישירה. dPCR תערוכות איכויות טכני מעולה, כולל השתנות נמוך, ליניאריות גבוהה, רגישות גבוהה בהשוואה את תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). לפיכך, dPCR היא שיטה לשחזור ומדויקת יותר ישירות לכימות תנועת miRNAs, במיוחד לשימוש רב מרכזי גדול לניסויים קליניים לב וכלי דם. בפרסום זה, אנו מתארים כיצד לבצע ביעילות PCR דיגיטלי כדי להעריך את המספר המוחלט עותק הדוגמאות סרום.
Introduction
מחזורי miRNAs זוהו כסמני מבטיח עבור מספר מחלות, כולל מחלות לב וכלי דם1. MiRNAs קטנות, ללא קידוד מולקולות RNA חד-גדילי (ארוך כ 22 נוקלאוטידים) מעורבים ב תקנת post-transcriptional ויה משינוי של RNA שליח תרגום וביטוי כמשפיע ג'ין2, הם שוחרר לתוך מחזור הדם במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים. ביטוי כמותי של miRNAs מסוימת יכולה להיות קשורה הפתולוגיה, ולהראות כמה miRNAs רקמות גבוה ומחלת ירידה לפרטים1. מחלות לב וכלי דם, miRNAs הפכו מועמדים אטרקטיביים כמו סמנים ביולוגיים הרומן כי הם יציב להפליא הנסיוב, יכול בקלות ניתן לכמת בעזרת PCR מתודולוגיה3. הערך הפוטנציאלי של miRNAs כמו סמנים ביולוגיים של אוטם שריר הלב יוערכו במחקרים קטנים, אך אימות בקוהורטות גדולות חסר2. לדוגמה, מיר-499 נמצא ביטוי מאוד שריר שריר הלב, זה הוכח להיות גדל באופן משמעותי ב-5,4,עמי6. עוד, זה מווסת מתוכנת מוות תאי (אפופטוזיס), את הבידול של cardiomyocytes, ובכך מעורב במספר מנגנונים בעקבות של עמי7. מלבד מספר מחקרים קטנים דיווח על עליונות של ערך מצטבר של miRNAs לאבחון של עמי, עליונות או מתוך שוויון רגישות גבוהה הלב troponins לא טרם הוכח מחקרים בקנה מידה גדול2,5 6, ,8. עוד מחקרים פוטנציאליים קוהורטות גדולות, לכן, נדרשים להעריך את ערכה אבחון פוטנציאל של miRNAs. בנוסף, שיטות של כימות miRNA צריך להיות מותאם, מתוקננת באמצעות השוואה פרוטוקולים9. מבחני סטנדרטית עשויה להפחית תוצאות לא עקביות, עשוי לסייע miRNAs להפוך פוטנציאל סמנים ביולוגיים עבור יישום קליני שגרתי, כמו סמנים ביולוגיים צריך ניתן לכמת באופן לשחזור כדי להבטיח שלהם ישימות קלינית.
לאחרונה, dPCR כבר הציג כמו ניתוח מובילים. זה מחיצות המדגם לתוך תגובות בודדות כ 20,00010. מערכת dPCR ואז מנצל מתמטית פואסון ניתוח סטטיסטי של אותות פלואורסצנט (תגובות חיוביות ושליליות), הפעלת של כימות מוחלט ללא עקומת תקן10. בעת שילוב dPCR עם הגששים הידרוליזה פלורסנט, כימות ספציפי מאוד מוחלטת ישירה של miRNAs התאפשר. תגובת שרשרת פולימראזית דיגיטלי הראה שהפגינו מעולה טכנית איכויות (כולל השתנות ירד, של הפארמצבטית היומיומית מוגברת, רמה גבוהה של ליניאריות, רגישות גבוהה) עבור לכימות רמות miRNA מחזור הדם בהשוואה כמותית בזמן אמת PCR10,11. מעולה טכנית יכול לעזור להקל על המגבלות הנוכחי על שימוש במחזור miRNAs סמנים ביולוגיים ואף עלולה להוביל הקמת miRNAs סמנים גדולים רב מרכזי ניסויים קליניים לב וכלי דם וכן שיטת אבחון ב כללי. במחקר הקודם, אנו לאחרונה חלה dPCR עבור כימות מוחלטת של מחזורי miRNAs בחולים עם עמי, הצליחו להדגים פוטנציאל אבחון מעולה בהשוואה כימות של miRNAs-qPCR12.
בפרסום זה, אנחנו רוצים להראות כי באמצעות dPCR היא שיטה לשחזור ומדויקים עבור ישירות לכימות במחזור miRNAs לב וכלי דם. כימות מוחלטת של רמות miRNA בסרום, באמצעות PCR דיגיטלי, פוטנציאל לשימוש רב מרכזי גדול לניסויים קליניים לב וכלי דם. בפרסום זה, נתאר בפירוט כיצד לבצע ביעילות PCR דיגיטלי וכיצד לזהות את המספר עותק miRNA מוחלטת בנסיוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חילוץ של miRNA של פלזמה/סרום
הערה: על מנת לכמת miRNAs כראוי, הבידוד microRNA הנכון של הסרום/הפלזמה היא שלב חיוני. דבר המפתח שיש לזכור, במיוחד כי פרוטוקולים שונים קיימים, היא לדבוק אותה זרימת עבודה בעת עיבוד הדגימות. ב פרוטוקול זה, miRNA מופק µL 50 של נסיוב. אל תשתמש יותר מ-200 µL כמו מגבלה זו תהליך תקינה.
- להכין סרום או להפשיר דגימות קפוא.
- להוסיף 250 µL (5 כרכים) פירוק מסחריות ריאגנט µL 50 של נסיוב. התמיכה של פירוק על ידי vortexing. במקום ברכבת התחתית עם lysate על הספסל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- ספייק lysate עם 3.5 µL של ספייק-אין שליטה (1.6 x 107 עותקים/µL) ומערבבים אותם על-ידי vortexing.
- מוסיפים 50 µL של כלורופורם (קרי, סכום השווה לגבי המדגם סרום ההתחלתי) ההפרדה שלב. לנער את הצינור נמרצות למקום ס' 15 הצינורית על הספסל בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
- לצורך הקמת מכשול ההפרדה שלב, centrifuge את הצינור ב g 12,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הערה: הדגימות מופרדים עכשיו לשלב מימית העליון המכיל את הרנ א לאטמוספרה לבן, שלב אורגני התחתון, ורוד. - העברת העליון מימית השלב (100 µL) המכילה את הרנ א לתוך צינור חדש. לא להעביר כל חומר לבן לאטמוספרה כמו זה תשריט הרוזן RNA הנכון.
- להוסיף 150 µL (קרי, 1.5 x הנפח של המדגם שהועברו) של 100% אתנול. מערבבים את החומרים על-ידי pipetting אותן למעלה ולמטה. לא centrifuge אותם, ולעבור במהירות הצעד הבא.
- פיפטה µL 250 המדגם על עמודה ספין מסחרי בשפופרת אוסף 2 מ"ל. . סגור את המכסה Centrifuge את העמודה ב > g 8,000 x בטמפרטורת החדר במשך 15 ס' להשליך הזרימה דרך.
- להוסיף 700 µL של כביסה מסחרי מאגר מספר 1 לעמודה ספין. סגור את המכסה, centrifuge את העמודה ב > g 8,000 x בטמפרטורת החדר במשך 15 ס' ביטול המאגר הניסיוני כביסה.
- להוסיף 500 µL של כביסה מסחרי מאגר מספר 2 העמודה ספין. סגור את המכסה, centrifuge את העמודה ב > 8, 000 x g בטמפרטורת החדר במשך 15 ס' ביטול המאגר הניסיוני כביסה.
- פיפטה 500 µL של 80% אתנול לעמודה ספין. סגור את המכסה, centrifuge את העמודה ב > 8, 000 x g בטמפרטורת החדר במשך 2 דק למחוק ברכבת התחתית אוסף עם הזרימה דרך.
- להעביר את העמודה ספין צינור אוסף 2 מ"ל. Centrifuge את העמודה במלוא המהירות עם מכסה נפתח לייבש את הקרום. למחוק את הצינור אוסף עם הזרימה דרך.
- להעביר את העמודה ספין לתוך צינור אוסף חדש של 1.5 mL. Elute את הרנ א על-ידי החלת 30 µL של מים נטולי RNase ישירות אל המרכז של הקרום. . סגור את המכסה Centrifuge את העמודה במלוא המהירות עבור 1 דקות.
- לאחסן את הרנ א ב-70 מעלות צלזיוס.
הערה: האחסון של RNA מטוהרים במים נטולי RNase בין-70 ° C ל-20 ° C מבטיחה אין השפלה של RNA אחריות לשנה. בעקבות הפרוטוקול של היצרן, הכמות המינימלית של RNase ללא מים כדי לדלל את הרנ א הוא 10 µL. שימוש פחות ממה עשוי 10 µL דיו מימה הקרום ולהפחית את התשואה הכוללת של RNA.
2. שעתוק במהופך
הערה: ה-DNA משלימים (cDNA) סונתז באמצעות פרוטוקול שעתוק במהופך (RT) 15 µL הבאים (התגובה סה כ נפח).
- להפשיר את הקיט RT על קרח. שמור את אנזימי במקפיא ארוכה ככל האפשר למנוע מהם משפיל ולסובב אותם למטה לפני השימוש. RT תחל על הקרח להפשיר ולסובב אותם למטה לפני השימוש.
- מכינים את תערובת הבסיס כפי שמתואר בטבלה 1.
- לשלב 10 µL של מיקס מאסטר µL 5 של RNA שחולצו לכל טוב בצלחת-ובכן 96.
- Centrifuge את הצלחת היטב ב g x 2,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
- השתמש בפרוטוקול המחזור התרמי המתוארות בטבלה מס ' 2 עבור שעתוק לאחור.
הערה: כפי שמתואר להלן, cDNA ייתכן ישירות יעובדו במכונת ה-PCR דיגיטלי (ראה טבלה של חומרים); לחלופין, זה ניתן לאחסן ב-20 ° C.
3. droplet דור ו- PCR דיגיטלי
הערה: דיגיטלי PCR בוצעה באמצעות פרוטוקול 40 µL הבאים.
- להפשיר את המיקס dPCR מסחרי את cDNA מוכן, תחל את ה-PCR על קרח. Centrifuge להם זמן קצר לפני השימוש.
- מכינים את תערובת הבסיס כפי שמתואר טבלה 3-
- הוסף 1.33 μL טוב של המוצר RT ' centrifuge אותו בקצרה.
- פיפטה 20 μL של המדגם לתוך כל טוב של הקלטת. ובכן 8 (שורה בינונית).
הערה: אם הקלטת 8-ובכן לא מתמלא לגמרי, מלא את הבארות הנותרים עם פקדים שאינם מתבנית (NTCs) להשמיט cDNA (כלומר, המוצר RT הפיק עם מים במקום מחולץ RNA) או המאגר המסחרי dPCR. המעבר הלאומית משמשת פקד זיהום. מים חייב להיות בשימוש הבארות הנותרים, כי זה יפגום ביכולת האיכות של היווצרות droplet. - פיפטה 70 μL של השמן דור droplet הגששים לתוך בארות נפט (שורה תחתונה) בקלטת 8-. טוב.
- למקם אטם על גבי קלטת 8-ובכן ולמקם את הקלטת בגנרטור droplet. סגור את הגנרטור droplet. לחכות עד שהאור 3 מחוון ירוק קבוע.
הערה: טיפות עכשיו להיות נוצרים. - לאט ובזהירות להעביר μL 40 המדגם מעוצב-droplet (שורה עליונה) לתוך בארות נפרדים של צלחת 96-ובכן מאת pipetting.
- לאחר השלמת היווצרות droplet על הדגימות, לאטום את הצלחת ה-PCR בנייר כסף pierceable dPCR ב 180 מעלות צלזיוס במשך 4 s.
- מניחים נייר כסף אטום PCR-הצלחת הצנטרפוגה ו מחזור זה כפי שמתואר בטבלה 4, בקצב הרמפה של 2.5 ° C/s.
4. droplet קריאה וניתוח
- להעביר את הצלחת הצנטרפוגה תרמי הבסיס של בעל צלחת. להדק את הצלחת ה-PCR על-ידי הצבת העליון של בעל לוחית לצלחת PCR.
- הפעל את תוכנת dPCR מסחרי.
- הזן את השם לדוגמה, את השם של הניסוי, ואת המטרה תוכנית ההתקנה. בחר כימות מוחלטת.
- התחל ה-droplet קריאה על-ידי לחיצה על הפעל. בחר FAM/HEX או FAM/ויק כמו כימיה זיהוי בעת עבודה עם הגששים הידרוליזה.
הערה: התוכנה dPCR מסחר אוטומטי-תנתח את הנתונים. - בדוק את המספרים droplet בטבלת התוצאות כדי להבטיח דור droplet הנכון.
- בחר כל בארות עם miRNA כימות באותו ' ולחץ על ' ניתוח'. השתמש את האבן החשופה 2D לסמן טיפות חיובי ולתקן באופן ידני את הנתונים מנותח אוטומטי (איור 1).
5. לתקן חישובים על הדגימה
- לנרמל את הדגימה על ידי הכפלת המדגם פקטור הנירמול (NF).
NF = חציון [C. elegans מיר-39 מדידות]כל דוגמאות/ [C. elegans מיר-39]מדגם נתון - חשב את ריכוז סרום miRNA הסופי, התאמת דילול גורמים (DF).
[miRNA] סופי = [miRNA]raw ערך x DFRT x DFdPCR x DFEx
איפה:
[miRNA] ערך raw = את miRNA לכמת על-ידי תוכנת dPCR מסחרי;
DFRT = הגורם דילול של התבנית בשעתוק במהופך;
DFdPCR = הגורם דילול של התבנית ב- dPCR;
DFEx = הגורם דילול החילוץ.
6. סדרת דילול Oligonucleotide סינתטי
- הפשרת lyophilized oligonucleotide סינתטי על קרח. בקצרה centrifuge זה.
- לדלל את oligonucleotide סינתטי lyophilized במים נטולי נוקלאז כדי ריכוז סופי של 10 pmol / µL. בקצרה centrifuge זה.
- למהול אותו במים נטולי נוקלאז כפי שמתואר בטבלה 5. Centrifuge הדילול בקצרה בין שלב לשלב דילול ב 8000 g x 10 s.
- להמשיך שעתוק במהופך כפי שמתואר בשלב 2 ולנתח את הדגימות עם ה-PCR דיגיטלית כפי שמתואר בשלב 3, שלב 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PCR דיגיטלי משולב עם הגששים הידרוליזה פלורסנט מאפשר לחוקרים ישירות לכמת בכמויות המוחלטות ספציפי miRNAs בהתפתחות של עותקים/µL. כפי המדגם של dPCR מחולק למחיצות כ 20,000 תגובות PCR בודדים, dPCR אינה דורשת טכני משכפל10. מערכת dPCR מנצל ניתוח סטטיסטי פואסון מתמטי של אותות פלואורסצנט (שונות בין תגובות חיוביות ושליליות) המאפשר כימות מוחלטת ללא הצורך תקן עקומת10. על מנת לחשב נכונה הריכוזים, נדרש של הרוזן droplet מקובל (> 15,000). אין פקדים בתבנית להבטיח את החרגת ניכרת הגברה לא ספציפית. כל הדגימות כלולים בניתוח מעובדים שימוש באותו אמצעי אחסון, שיטה, ו- PCR פרוטוקול כדי לחזק את תוקפו של התוצאות שהושג. הריכוזים שהושג ב- dPCR הם מנורמל באמצעות הליך נורמליזציה החציוני בכל הדוגמאות ניתח עם סינטטי עלה ב- C. elegans מיר-3913. נירמול הנתונים על כמות מדודה עלה ב- C. elegans מיר-39 מתקנת עבור הווריאציה מדגם-כדי-sample יעילות החילוץ RNA והוא משמש פקד התגובה PCR, הוספת עוד יותר תוקפו של התוצאות. יש אין תקן זהב הוקמה עבור נרמול סרום miRNAs; עם זאת, פקדים אקסוגני כגון עלה-in של C. elegans מיר-39 הם פתרון אלגנטי נורמליזציה הליכים, כפי miRNAs אנדוגני משתנים לעיתים קרובות מחלה שונים הברית9.
הדוגמאות סרום שנותחה נרכשו לפני התערבות כלילית מלעורית (PCI), 8 שעות לאחר PCI, ו- 16 h לאחר PCI, מחולים עם חריפה ST-קטע העלאת אוטם שריר הלב (STEMI). STEMI חולים שהפגינו איסכמיה חמורה, ובכך להעפיל הערכת סמנים ביולוגיים איסכמיה חדש. כדי להעריך את קינטיקה של שחרור מיר-499, להשתמש הפוטנציאל של מיר-499 כמו סמן על איסכמיה של מחלות לב וכלי דם, מיר-499 ניתחנו עם dPCR על פני כל המטופלים עבור נקודות זמן שונות שלושה14.
איור 1 מדגים את מבחר טיפות חיובי נותן את הריכוז miRNA הסופי מחושב על ידי התוכנה. השבר של תוצאות חיוביות במדגם קובע את הריכוז של עותקים/µL כפי שמחשבת התוכנה dPCR מסחרי. התוצאות ניתן לאבחן גם בחלקה 2D, החיוביים ניתן לסמן באופן ידני עם עיגולים. ריכוזי נחשבים רק אם הם מעל הגברה לא ספציפית של NTCs.
איור 2 מציג את ליניאריות ובכושר הטוב-של-סדרה דילול p יש-מיר-499-5 oligonucleotide miRNA סינתטי כפילויות. סדרות 8 צעדים דילול בוצעה מ 2,500 עותקים/µL כדי עותקים 0/µL. מחושבת הצפויה העותקים/µL כפי שמתואר בטבלה 5 נניח 100% RT ויעילות PCR דיגיטלי. בהגדרת הזה, מדגים PCR דיגיטלי רמה גבוהה של ליניאריות (r2 = 0.99). המגבלה של זיהוי (לוד = 0.12) ואת המגבלה של כימות (LoQ = 0.23) מוצגות באיור 2, מראה כי אפילו ביטוי miRNA נמוך ניתן להבחין בהצלחה. לפיכך, dPCR ניתן לכמת בסרום נמוך אפילו רמות של מחזורי miRNAs. המגבלה של זיהוי (לוד), המגבלה של כימות (LoQ) מחושבים בעקבות הגישה של. Forootan et al. 15 . והם מגדירים לוד = LoB + 1.645 x σנמוךריכוזלדוגמה, איפה הגבול של ריק (LoB) מחושבת LoB = רשעריק + 1.645 x σריק. LoQ היא אז מוערך שכפול פועל רגיל ' עקומות '-15. כדי להבטיח כימות לשחזור של miRNAs, רק ריכוזי miRNA שנמצאים מעל של לוד והן את LoQ נחשבים המדויק ערך חוקי.
איור 3 מראה תוצאות נציג של מיר-499 רמות של חולים עם ST-העלאת אוטם שריר הלב (STEMI), n = 16 בכל נקודה בזמן. דוגמאות צולמו לפני התערבות מלעורית (PCI) (t = 0), 8 שעות לאחר PCI (t = 8), ו- h 16 לאחר PCI (t = 16), רמות מיר-499 הושוו מיר-499 רמות של חולים עם מחלת עורקים כללית יציבה (CAD, n = 20). החולה המאפיינים העיקריים ניתן למצוא טבלה 6. לאחר הפרסום הראשון של מיר-499 לתוך הסרום ב ה 8 הראשונה בעקבות אוטם שריר הלב, רמות מיר-499 ירידה שוב לאחר 16 שעות. ניתן לראות מגמה להגדיל בתחילת STEMI (t = 0), עלייה משמעותית של רמות מיר-499 לעומת חולים עם CAD ניתן לראות 8 שעות לאחר STEMI (t = 8, p < 0.01) בהשוואת רמות מיר-499 miR-499 רמות של חולים CAD יציב. המקלט פועל מתעקם הצג (ROC) השירות אפשרי של מיר-499 כמו סמן הרומן להבחין בין חולים עם CAD בחולים עם STEMI [השטח מתחת לעקומה (AUC) = 0.62 עבור דגימות שנלקחו לפני התערבות מלעורית (PCI), חאן אל = 0.75 עבור דגימות שנלקחו 8 שעות לאחר PCI וחאן אל = 0.78 עבור דגימות שנלקחו 16 h לאחר PCI לעומת רמות של מיר-499 בחולים עם CAD].
איור 1: מבחר טיפות חיובי בסדרה דילול הופיעה כפילויות. (א) הסף מוגדר באופן ידני מעל טיפות שלילי. (B) התוצאות הם דמיינו ב אבן חשופה 2D, החיוביים שנבחרו על ידי מקיפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: סדרת דילול סינתטי מיר-499 oligonucleotide. (א) המדידות בוצעו ב כפילויות. הנתונים מוצגים יומן טרנספורמציה כעותקים מוחלטת לכל µL. regressions ליניארית ובכושר הטוב-של (r2-ערך) מוצגים. הנתונים מוצגים כמו זאת אומרת ± ב- SEM (B) לוח זה מראה את הגבול של זיהוי (לוד), המגבלה של כימות (LoQ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: כימות של מחזורי סרום p מיר-499-5 בחולים עם ST-העלאת אוטם שריר הלב (n = 16) לפני התערבות כלילית מלעורית (PCI), 8 שעות לאחר PCI ו- h 16 לאחר PCI, בהשוואה לחולים עם עורקים יציב המחלה (n = 20). (א) מחזורי סרום מיר-499-5 p מיוצג כ אומר עם שגיאת התקן של הממוצע עם המקביל p-הערך המחושב על-ידי חד-כיווני אנובה ואחריו מבחן פוסט הוק Bonferroni (p < 0.05 נחשב סטטיסטית). מקלט (B) A הפועלים האופיינית עקומה (ROC) ניתוח מתבצע על נתוני פאנל A. הניתוח ROC מדגים את רגישות וסגוליות של סמן. יתר על כן, האזור המתאים תחת הערכים עקומה (AUC) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| כמות הדגימה | ||||
| n = 1 | / טוב [μl] | |||
| נוקלאז ללא מים | 4.16 | |||
| 10 x שעתוק לאחור מאגר | 1.5 | |||
| 100nM dNTP | 0.15 | |||
| RNAse מעכב | 0.19 | |||
| פריימר RT ספציפי | 3 | |||
| מסחרי רוורס טרנסקריפטאז אנזים 50 U/ul... | 1 | |||
| סה כ מאסטר-מיקס | 10 | |||
טבלה 1: שעתוק במהופך ריאגנטים שילוב.
| טמפרטורה | זמן |
| 16 ° C | כשעתיים וחצי |
| 42 ° C | כשעתיים וחצי |
| 85 ° C | 5 דקות |
| 4 ° C | ∞ |
טבלה 2: תנאי הרכיבה תרמית עבור שעתוק במהופך.
| כמות הדגימה | ||||
| n = 1 | / טוב [μl] | |||
| נוקלאז ללא מים | 7.67 | |||
| מיקס dPCR מסחרי | 10 | |||
| 20 x הידרוליזה ספציפי פריימר/בדיקה | 1 | |||
| סה כ מאסטר-מיקס | 18.67 | |||
טבלה 3: PCR דיגיטלי ריאגנט שילוב.
| טמפרטורה | זמן |
| 95 ° C | 10 דקות |
| 94 ° C | 30 שניות (x40) |
| 60 ° C | 1 דקות |
| 98 ° C | 10 דקות |
| 4 ° C | ∞ |
טבלה 4: תרמית רכיבה על אופניים תנאים PCR דיגיטלי.
| שפופרת | הועבר oligonucleotide סינתטי מיר-499 (µL) | Diluent (µL) | miRNA (עותקים/µL) | הצפוי עותקים µL ב RT | הצפוי עותקים µL ב dPCR |
| המקורי | 6.022 x 1012 | ||||
| 1 | 10 | 990 | 6.022 x 1010 | ||
| 2 | 10 | 990 | 6.022 x 108 | ||
| 3 | 10 | 990 | 6.022 x 106 | ||
| 4 | 18.7 | 981.3 | 1.128 x 105 | 37600 | 2500 |
| 5 | 40 | 60 | 4.511 x 104 | 15040 | 1000 |
| 6 | 50 | 50 | 2.256 x 104 | 7520 | 500 |
| 7 | 40 | 160 | 4.511 x 103 | 1504 | 100 |
| 8 | 50 | 50 | 2.256 x 103 | 752 | 50 |
| 9 | 40 | 160 | 4.511 x 102 | 150.4 | 10 |
| 10 | 50 | 150 | 1.128 x 102 | 37.6 | 2.5 |
| 11 | 0 | 50 | 0 | 0 | 0 |
טבלה 5: סדרת דילול סינתטי מיר-499.
| מאפיין | כל | יציבה CAD חולים (n = 20) | STEMI חולים (n = 24) | ערך-p |
| גיל | 64.7 ± 11.9 | 66.7 ± 13.1 | 62.2 ± 9.9 | 0.2810 |
| זכרים | 77.8% | 65% | 93.8% | 0.0392 |
| מיט | 33.3% | 40% | 25% | 0.3428 |
| HTN | 61.1% | 60% | 62.5% | 0.8785 |
| Dyslipidemia | 38.9% | 65% | 6.3% | 0.0003 |
| מעשן | 47.2% | 55% | 37.5% | 0.3796 |
| היסטוריה משפחתית | 25% | 35% | 12.5% | 0.1213 |
| עודף משקל | 58.3% | 55% | 62.5% | 0.6501 |
| סרום קריאטינין (מ"ג/ד"ל) | 0.94 (0.83 - 1) | 0.98 (0.82 - 1.01) | 0.93 (0.83 - 1) | 0.7255 |
| שיא CK (U / אני) | 161 (102-611) | 126 (81-161) | 492 (228-3208) | 0.0004 |
| cTnT שיא (ng/L) | 322.5 (23.8-4533) | 18 (7-25.3) | 2492 (240-5586) | 0.0002 |
| LVEF % | 45% (40% - 50%) | 45% (32.5% - 55%) | 45% (45% - 50%) | 0.9596 |
| הערכים מוצגים אומר ± SD; חציון ערך (טווח אחוזון 25 ל-75) או % | ||||
| מיט: סוכרת | ||||
| HTN: יתר לחץ דם | ||||
| CK: קריאטין קינאז | ||||
| cTnT: לב טרופונין T | ||||
| LVEF: שבר שמאלה הוצאה ventricular | ||||
טבלה 6: ראשי מאפייני המטופל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PCR דיגיטלית היא שיטה יחסית הרומן מובילים של ה-PCR המאפשר כימות מוחלטת ישירה של חומצות גרעין בתוך מדגם. השיטה בעלת יתרונות מסוימים, כולל השתנות ירד, הפארמצבטית היומיומית מוגברת של רגישות מעולה11,12. יתרה מזאת, בשל חלוקת המדגם לתוך תגובות יחיד כ 20,000 וניתוחים קצה, dPCR היא איתנה יותר כדי חומרים מפריעות ב- PCR בהשוואה ל- RT-PCR כמותי16. תכונות אלה ב- dPCR להצליח חלופה אטרקטיבית RT-PCR כמותי בתור כלי אבחון על כימות. כמו במחזור miRNAs נוכחים בריכוזים נמוכים סרום, עד כה, מדענים כבר ערערו כראוי לכמת miRNAs מאת PCR9. מצד שני, dPCR כראוי יכול לכמת אפילו ביטוי miRNA נמוכה בסרום, מקלים את הבעיות נצפו ספירה נמוכה miRNA כמת17. היכולת של dPCR לתת ישירות את ספירות/µL, אפילו בביטוי miRNA נמוך מאוד, ובכך הופכת אותו כלי אבחון אטרקטיבי עבור קהילת המחקר וכלי דם במחקרים סמן miRNA. כמו יכול להכפיל את הריכוז נתון ספירות/µL הגורם דילול בשימוש החילוץ RT-תגובה, dPCR, זה אפשרי להשיג את המספר המדויק של עותקים ב 1 µL של נסיוב. זרימת העבודה המוצגת כאן ניתן לבצע בדגימות עד 96 על צלחת, לכן מתן כלי ללימודי לב וכלי דם גדולים. למרות dPCR מוצגים כמה יתרונות על פני RT-PCR כמותי, היא לא עדיין באופן שגרתי חלה על כימות של miRNAs בניסויים לב וכלי דם. נתונים נוספים, מתוקננת נורמליזציה נהלים חסרים.
בגישה זו, נדגים את dPCR, בשילוב עם הגששים הידרוליזה פלורסנט, מאפשר כימות מוחלטת ישיר ספציפיים של מחזורי miRNAs קשורה למחלות לב וכלי דם. בדו ' ח, כיוונו להדגים פרוטוקול ממוטב עבור זיהוי miRNA ויה dPCR והן לאשר את היתרונות של dPCR מעל RT-PCR כמותי.
וידאנו המוצגים dPCR ליניאריות טובה, את הגבולות נמוכה של זיהוי, כימות של dPCR עבור לכימות miRNAs... מאת spiking הדגימה עם oligonucleotide סינתטי, נירמול המדגם הוא אפשרי, התאמת עבור חילוץ ויעילות וריאציה מדגם-כדי-sample.
לסיכום, PCR דיגיטלית, כמו זה מוצגים עליונות בקיאות טכנית והן אבחון פוטנציאל, הוא השיטה הנוכחית הטובה ביותר על כימות miRNA והוא עשוי עוד יותר לשמש ללימודי סמן miRNA לב וכלי דם רב מרכזי גדול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים יש אין התודות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA-Extraction | |||
| miRNeasy Serum/Plasma Kit (50) | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 217184 | Kit for microRNA extraction. Kit contains commercial buffer RWT (called number one in the manuscript) and RPE (called number two in manuscript). |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol | Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland | 219610 | Spike-in for normalisation , Sequence: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3' |
| Reverse Transcription | |||
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reactions) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4366597 | Kit for microRNA reverse transcription |
| TaqMan MicroRNA Assays M | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in reverse transcription |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352 |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200 |
| PCR Plate, 96-well, segmented, semi-skirted | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AB0900 | 96 well plate for reverse transcription |
| Microseal ‘B’ seal Seals | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | MSB1001 | Foil to ensure proper storage |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for reverse transcription |
| Droplet Digital PCR | |||
| 100 nmole RNA oligo hsa-miR-499-5p | Integrated DNA Technologies | Custom | Sequence: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863024 | Supermix used in droplet generation |
| TaqMan MicroRNA Assays | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assays used in digital PCR (fluorescent hydrolysis probe) |
| hsa-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 001352, commercial primers |
| cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns) | Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA | 4440887 | Assay Number 000200, commercial primers |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864007 | Cartridge takes up to 8 samples for droplet generation |
| DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863051 | Holds cartridges in droplet generation |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863005 | Oil used in droplet generation |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 12001925 | 96 well plate for ddPCR |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814040 | Pierceable foil, compatible with droplet reader |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863004 | Oil used in droplet reading |
| QX100 or QX200 Droplet Generator | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863002 | Droplet Generator, generates the droplets from sample/oil emulsion |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1814000 | Seals the plate before PCR |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1851196 | Cycler used for ddPCR |
| QX100 or QX200 Droplet Reader | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863003 | Reads PCR-positive and PCR-negative droplets with an optical detector |
| ddPCR Buffer Control for Probes | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1863052 | Blank control and to fill up the remaining wells of 8-well cassette |
| Software | |||
| QuantaSof Software | Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA | 1864011 | Program for droplet reading |
| Prism Windows 5 | GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA | Program for statistical analysis |
References
- Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
- Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
- Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
- Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
- Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
- Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
- Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
- Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
- Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
- D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
