Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

啮齿类动物和人体组织急性 ictal 活性的产生及按需启动

doi: 10.3791/57952 Published: January 19, 2019

Summary

急性癫痫发作模型对研究癫痫发作事件的机制很重要。此外, 按需生成癫痫形成事件的能力提供了一种高效的方法来研究其启动背后的事件的确切顺序。在这里, 我们描述了在小鼠和人体组织中建立的急性 4-氨基吡啶皮质发作模型。

Abstract

控制癫痫发作仍然是医学界面临的一个具有挑战性的问题。为了取得进展, 研究人员需要一种方法来广泛研究癫痫发作的动态和研究其潜在的机制。急性癫痫发作模型很方便, 提供了进行电生理记录的能力, 并能产生大量的电测事件。然后, 急性癫痫发作模型的有希望的发现可以推广到慢性癫痫模型和临床试验。因此, 研究急性模型中的癫痫发作, 忠实地复制临床癫痫发作的电特征和动态特征, 对于得出临床相关的发现至关重要。研究从人体组织制备的急性癫痫发作模型中的冰毒事件对于得出临床相关的结果也很重要。本文的重点是皮质4-ap 模型, 因为它在体内体外研究中, 以及在小鼠和人体组织中产生冰体事件的多功能性。本文中的方法还将描述使用零 mg2 +模型进行癫痫发作诱导的另一种方法, 并详细概述不同急性中产生的癫痫样活动的优点和局限性。扣押模型。此外, 通过利用市售的光遗传小鼠菌株, 可以使用短暂 (30 毫秒) 的光脉冲来触发与自发发生的相同的冰体事件。同样, 30-100 毫秒的神经递质 (伽玛-氨基酸或谷氨酸) 可应用于人体组织, 以引发与自发发生的事件相同的冰门事件。在急性癫痫发作模型中按需触发冰门事件的能力提供了新发现的能力, 可以观察作为癫痫发作起始动力学基础的事件的确切序列, 并有效地评估潜在的抗癫痫疗法。

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

急性癫痫发作模型可以成功地再现断层特征, 使人想起在癫痫发作者的脑电图 (eeg) 中观察到的冰毒事件。研究人员使用这些类似于冰的事件 (这里称为 "冰形事件") 作为癫痫发作事件1的代孕者。临床上, 冰体事件是癫痫发作事件的可靠代名词, 因为癫痫发作是一种源于大脑的神经紊乱。在癫痫监测单位, 神经学家依靠对伊卡事件的检测来确认大脑的癫痫发生区, 并将其分离出, 使其切除2。在重症监护室, 医生监测精神病活动, 以评估是否有任何癫痫发作的病人持续的癫痫发作活动3。控制癫痫发作仍然是医学界面临的一个挑战问题, 因为30% 的癫痫患者对现有药物45和10% 的涉及药物引起的癫痫发作的病例具有耐药性。对标准治疗没有反应3。这引起了社会的严重关切, 因为10% 的美国人在一生中被预测会经历一次癫痫发作事件, 3% 的人预计会患上癫痫.

研究慢性癫痫模型中的癫痫发作是昂贵的, 费力的, 往往需要几个月的时间来准备7。在自由移动的动物中进行电生理记录也是很困难的。人体临床试验面临着类似的问题, 以及与患者同意、参与者背景的差异以及涉及道德和伦理方面的考虑等额外的复杂性。另一方面, 急性癫痫发作模型是有利的, 因为它们的制备相对方便, 成本效益高, 能够产生大量的冰毒事件用于研究9。此外, 组织被固定在一个稳定的位置, 所以条件是理想的执行必要的电生理记录, 研究癫痫发作动力学和相关的潜在病理生理学。急性癫痫发作模型在硅胶(计算机) 模型中仍然是有利的, 因为它们是基于由大脑组成的神经网络组成的生物材料及其所有固有的因素和突触连接, 这些物质可能无法捕获即使是最详细的计算机型号10。这些特点使急性癫痫发作模型能够有效地筛选潜在的抗癫痫疗法, 并在推进这些疗法以进一步调查慢性癫痫模型和临床试验之前作出初步调查。

通常情况下, 急性癫痫发作模型来自正常的脑组织, 已遭受高度兴奋的条件。要诱导健康脑组织中的临床相关的冰体事件, 重要的是要了解大脑在静态11中的最佳功能, 在这种状态, 兴奋 (e) 和抑制 (i) 是平衡的 12。e-i 平衡的中断可能会导致高度可激发的发作状态, 在这种状态下, 冰体事件会沉淀。因此, 在这一概念框架内, 有两种主要策略可以在大脑切片 (体外) 或全脑 (体内) 制剂中产生冰毒事件: 要么减少抑制 ("抑制"), 要么增加抑制。激励 ("非抑制")。然而, 冰印象事件是高度有序和同步的事件, 需要 gaba中西神经元的影响来协调神经网络活动13,14。因此, 非抑制模型是在孤立的神经网络中产生冰毒事件的最有效的模型, 例如在体外大脑切片15中, 而体外抑制模型通常会导致尖峰活动让人想起像兴趣的尖峰此外, 在此概念框架内, 瞬时同步事件还可以可靠地触发 ictal 事件16。事实上, 当在临界状态转换 ("分叉") 第18点时, 应用于神经系统 17的任何微小扰动都可能触发冰形事件.传统上, 这些扰动是由电刺激引起的。然而, 最近神经科学中光遗传学的发展, 现在为诱导临界状态转变提供了更优雅的策略.

本文所述的方法演示了如何在体外 ( 《议定书》第1步) 和体内研究 (《议定书》第2步) 的急性发作模型中按需生成冰毒事件。它们涉及大脑区域的选择、癫痫诱导方法、研究类型和物种;然而, 重点将是推荐的选择急性4-ap 皮质癫痫发作模型, 因为它的多功能性在广泛的研究类型。急性体外 4-ap癫痫发作模型是基于标准的方案, 为电生理记录和成像研究准备高质量的脑片19。这些方案已经被用来从 16,20和人类21的体生长运动皮层的外冠状大脑切片。在这些类型的大脑切片中产生冰毒事件的修改以前已经演示过16 , 下面的《议定书》描述了全部细节。急性体内4-ap 皮质发作模型是基于标准的协议, 准备开颅术的影像学研究22。修改是, 开颅后没有安装 (玻璃滑梯) 窗口。相反, 前惊厥药物 (4-ap) 局部应用于暴露的皮层, 以诱导在动物全身麻醉期间的冰毒事件。据我们所知, 我们的小组是第一个在1 623 小鼠体内开发这种急性皮质癫痫发作模型的人。建立了以成年小鼠为研究对象的体内急性4-ap 皮质发作模型, 以补充幼龄组织的体外切片模型。在成人体内癫痫发作模型中复制发现有助于通过解决2d 脑切片 (三维全脑) 非生理条件的内在担忧来概括切片模型的发现结构) 和幼体与成人组织之间的生理差异。

按需的气门事件启动方法被证明使用的神经递质与皮科斯普利或光遗传学策略。据我们所知, 我们的小组是第一个通过皮科普利策16使用神经递质在人体组织引发冰毒事件的组织。在光遗传策略中, c57bl6 小鼠菌株是用于表达转基因的常规菌株。通道罗多普辛-2 (chr2) 在 gabaep 能间质间质细胞或谷氨酰胺锥体细胞中的表达将提供可选的能力, 在短暂的光脉冲下按需生成冰门事件。合适的光遗传学小鼠菌株包括商业上可获得的 c57bl6 变种, 该变种使用小鼠泡状 gaba 转运体启动子 (vgat) 24 或锥体细胞, 使用小鼠胸腺细胞抗原 1,在任何一个神经元中表达 chr2促销员 (thy1)25。这些市售的 vgate-chr2 和 thy1-chr2 小鼠提供了机会, 分别激活 gabaep 神经元或谷氨酸神经元, 在新皮层与蓝色 (470 纳米) 光。在急性癫痫发作模型中, 按需生成冰毒事件的能力可以为研究癫痫发作的启动动力学和有效评估潜在的抗癫痫疗法提供新的机会。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

所有涉及病人的研究都是根据大学卫生网络研究伦理委员会根据《赫尔辛基宣言》批准的一项议定书进行的。涉及动物的程序符合加拿大动物护理理事会的准则, 并得到克雷姆比尔研究所动物护理委员会的批准。

1. 第一议定书: 急性体外缉获模型

  1. 解剖溶液与人工脑脊液的制备
    1. 使用气石气泡扩散器 (水轮空气炉), 用碳原 (95% o2/5% co2) 过滤碳化水 (电阻率为18.2 mωcm) 5分钟。
      注: 空气结石可通过标准硅胶管连接到碳罐调节器。如果没有空气石, 请密封硅胶管的末端, 并在密封中戳小孔, 以允许碳气起泡, 并将溶液碳化。
    2. 通过将表 1中的溶质溶解在超纯水中, 准备一个解剖溶液。将 ccl2添加到经过加氢处理至少5分钟以帮助其溶解的溶液中。
      注意: 或者, 先添加 ccl2 , 以便它可以很容易地溶解在不饱和溶液中。液体形式的溶液在被碳原饱和后, 应为 300-320 momsl, ph 值为7.4。
      1. 将解剖溶液冷却到0-4°c。将溶液放在冰箱里过夜, 或将溶液放在冰柜中 1小时, 并持续监测温度。
        注意: 解剖解决方案最多可以存放3晚;丢弃之后。
      2. 使用前将解剖溶液碳化5-10分钟。
        注意: 理想情况下, 解决方案应在使用前显示为 slush 或转换为 slush。
    3. 通过将表 2 (或表 3中的人的溶质) 溶解在超纯水中, 制备啮齿类动物的人工脑脊液 (acsf)。在水浴中加热至35°c 直至使用时, 对 acsf 溶液进行碳化。将 ccl2添加到经过加氢处理至少5分钟以帮助其溶解的溶液中。
      注意: 或者, 首先添加 ccl2 , 以便它可以更容易地溶解在不饱和溶液中。液体形式的溶液应为 290-320 momsl, 在与碳原饱和后的 ph 值为7.4。根据实验的持续时间, 应以1、2或4升卷进行解决方案。做一整天 (8小时) 的实验4升。acsf 应该每天都保持新鲜;不要将其存储时间超过 1 d。
  2. 小鼠解剖收集脑组织
    注意: 对于人体组织, 请继续下一步 (步骤 1.3), 用振动体制作大脑切片。脑组织的立方体块 (1 厘米3) 应该从神经外科医生那里获得, 使用前面描述的 26,27
    1. 收集动物解剖所需的所有工具和材料。设置工作区, 为动物解剖做准备。
      1. 检查加气罐 (95%O o2/5co2), 以确保它不是空的.如果剩余压力小于 500 psi, 请在实验前更换气瓶。
      2. 根据制造商的说明书校准振动体 (振动刀片组织切割机)。调整振动组设置, 使其切割振幅为1毫米, 切削速度为 0.12 mm/s。
        注: 每个振动组织刀片切割机的最佳设置可能不同;但是, 一般来说, 振幅应该是高的, 切割速度应该是低的。
      3. 用 acsf 填充脑片培养室 (脑片守护者), 并用碳原泡泡。然后将孵化器放置在35°c 的水浴中。
        注: 使用啮齿类动物 acsf 为啮齿类动物的脑片和人的大脑切片的人 acsf。
    2. 获得一只男女少年老鼠, 年龄在13岁至 21岁 (第21页, 其中第21页是出生日期)。
    3. 用腹腔注射戊巴比妥钠 (体重 55 mg/kg) 对小鼠进行麻醉。一旦鼠标被深度麻醉, 如没有脚趾捏反射表明, 迅速使用一个功能批准的断头台仪器, 以一个快速的运动斩首小鼠。
      注: 根据机构指南建议的程序准备戊巴比妥钠注射液。
    4. 抓住老鼠的鼻子来稳定被斩首的头, 轻轻地做一个中线切口, 从老鼠的眼睛之间开始, 沿着整个头皮长度, 露出头骨。确保头骨没有被剃须刀施加的压力压扁。使用剃须刀边缘的一角, 以提高切割精度。
    5. 用手指将老鼠头皮的皮瓣分开, 露出头骨。然后, 用剃须刀边缘的新角, 沿着头骨中线做一个切口;注意避免与大脑皮层有任何接触。
    6. 将裂片钳插入鼠标的眼窝中, 以稳定被斩首的头部, 并将其放入充满冷 (0-4°c) 解剖溶液的 petri 培养皿中。确保头部完全淹没在解剖溶液中。
    7. 使用第二套裂片钳轻轻剥去鼠标的头皮, 通过剥皮去除鼻骨, 并删除头骨的背部 (尾侧)。
      注意: 幼鼠的鼻骨非常柔软, 容易骨折。
    8. 使用微型铲子切割视神经、三叉神经和脊髓。然后, 用微型铲子轻轻地将大脑与头盖骨分开。让大脑完全淹没在充满解剖溶液的培养皿中。
  3. 体生长运动皮层皮质切片的制备
    1. 用 ~ 150 毫升的冷 (0 4°C) 解剖溶液填充振动体的缓冲盘。
      注意: (可选) 将缓冲盘保存在冰柜中, 直到在切片过程中需要保持低温。
    2. 使用即时粘合胶将小鼠或人体的脑组织粘附到振动阶段 (标本 holder/托盘)。对于小鼠, 切掉大脑的一个小尾端部分 (小脑), 这样就可以很容易地将其固定在标本持有人身上 (让大脑的左侧面对天花板)。
      注意: 或者, 可以通过将大脑的背侧粘在标本持有人 (大脑的腹侧应该面对天花板) 28 来制备水平小鼠大脑切片。
    3. 轻轻地将标本夹 (带脑组织) 放入缓冲托盘中。确保大脑的背侧部分面对振动体的刀片。
      注意: 最大限度地减少大脑暴露在空气中的时间是至关重要的。
  4. 脑组织切片和收集
    1. 使用背侧到腹侧方向的振动体将大脑切割成450微米厚的切片。在切片时, 确保大脑完全固定在标本托盘上。
      1. 在老鼠大脑中做第一个切割, 以去除嗅球。然后, 进行后续切割, 直到观察到体生长传感器-马达区域 (位于嗅球和布雷玛之间的大约一半)。
        注意: (可选) 将大脑切成更薄的切片 (200 微米), 直到黄体出现在大脑的冠状视图中, 这表明体生长运动区域是接近的。
    2. 使用宽孔转移移液器收集含有体生长传感器运动区的冠状切片 (450 微米), 并将其淹没在含有冷 (0-4°c) 解剖溶液的 petri 培养皿中。
    3. 使用新的剃须刀片, 并切断任何多余的组织从切片。对于小鼠的冠状切片, 执行横向切割正下方的新皮质共 (, 黄体)。不要在锯切运动中切割;只需将压力施加到刀片的组织中, 并使用详细的刷子轻轻分离组织。确保最大限度地减少日冕切片的运动。
    4. 使用宽孔转移移液器将包含新皮层 (第1层-6 层) 的日冕切片的背侧部分转移到充满温暖 (35°c) acsf 的第二个培养皿上, 时间为1秒。然后, 及时将切片转移到含有温暖 (35°c) 碳化 acsf 的培养室。
      注: 利用 acsf 转移到培养皿中的目的是在使用广孔移液器转移大脑切片的同时, 最大限度地减少解剖溶液转移到培养室。利用孵化器的多口井, 使不同的脑片保持有序。
    5. 根据机构指南, 丢弃大脑和动物的其他部分。
  5. 孵化和维护
    1. 将大脑切片稍微淹没在35°c 的孵化室30分钟内。然后, 将孵化器从水浴中取出, 使其恢复到室温 (20-25°c)。等待 1小时, 大脑切片恢复, 然后再进行电生理记录。
      注意: 确保在孵化室的脑片下面没有气泡聚集。气泡是导致组织损伤的空气界面。小鼠的脑片可以保持 6-8小时, 而人脑组织可以储存在一个良好的加成质孵化器与适当的 acsf 室长达24小时。
  6. 浅层皮质层的电生理记录
    注: 在从大脑切片的细胞外局部场电位 (lfp) 记录中观察到了病例。大脑切片的 lfp 可以用接口类型腔 29或浸入的多电极阵列 (mea) 系统16进行观察和记录。该程序先前已描述16 , 下文介绍了更多细节。
    1. 使用宽孔转移移液器或详细的刷子将大脑切片移动到稍大的预切镜头纸上, 该纸张使用牙科推拿器固定在适当的位置。将镜头纸 (大脑切片在记录室休息) 转移到记录室, 并用竖琴屏将其固定在固定位置。
    2. 以 3 mL/min (~ 1°c) 的速度在大脑切片上的记录室中运行温暖 (35°c)、碳化 acsf。使用数字温度计, 以确保记录室是 33-36°C。
    3. 从硼硅酸盐玻璃管 (外径为 1.5 mm) 中拉出阻抗为 1-3 mω的玻璃电极。使用哈密顿注射器, 用 acsf (~ 10μl) 回填玻璃电极。如果尖端损坏, 请立即丢弃电极。
      注意: 漂白银丝 (5分钟), 只允许将银丝的最小部分 (尖端) 浸入 acsf 回填充玻璃电极中, 以最大限度地减少录音过程中的噪音和漂移。如有必要, 用哈密顿注射器从玻璃电极上取出多余的 acsf。
    4. 使用20x 立体显微镜, 使用手动机械手将记录玻璃电极精确地引导到浅层皮质层 (2) 中。使用标准软件查看计算机上大脑切片的电活动。
      注: 可活 (高质量) 脑片将表现出强大的诱发电位, 以响应应用的电刺激 (100μs, 30-300μa) 或光脉冲 (30 毫秒, 10 mW/mm2) 的光遗传组织。
  7. 类似癫痫发作的活动的归纳
    1. 在脑片上含有 100μm 4-氨基吡啶 (4-ap) 的完美 acsf。在8.5 毫升的水中溶解80毫克的 4-ap, 使库存溶液为 100 mL 4-ap. 在100毫升的 acsf 中加入100μl 的100微米4-ap 库存溶液, 以实现 100μm 4-ap 的 acsf 性能。
      注意: 或者, 使用零 mg2 + acsf (表 4), 一种不添加 mg2 +的改进 acsf 溶液, 以填充大脑切片。对于人体组织, 在零镁 2 + 人体 acsf (表 5)中使用 100μm 4-ap 的组合, 以获得最佳效果。冰形事件出现的平均时间为 15分钟;然而, 对于一些大脑切片来说, 可能需要长达 4 0分钟的时间。
  8. 按需癫痫发作产生: 一种光发生小鼠的光遗传学策略
    1. 应用蓝色 (470 nm) 光的短暂 (30 毫秒) 脉冲 (最小为 1 mW/mm输出强度) 以启动冰上事件。使用手动机械手将 1, 000μm 芯直径光纤 (0.39 na) 直接放置在记录区域上方。
      注意: 设置光刺激的速率, 以匹配所需的冰体事件发生率 (, 每 50秒1个脉冲)。然而, 从发生冰毒事件的内在速度来看, 不能过分夸大这一比率。
  9. 按需癫痫发作产生: 人体组织的非光遗传学策略
    1. 定位大脑切片, 使表层上游, 深层下游的流动的香水通过记录室。
    2. 拉一个玻璃电极 (与 lfp 录音使用的类型相同), 用精致的任务雨刷轻轻触摸它的尖端, 以创建一个小开口。用 ~ 25μl 100 mm gaba (溶于水) 回填电极, 并将其连接到皮索普利策。或者, 用200μm 谷氨酸 (溶于水) 回填电极。
      注意: 要估计从皮科斯普利策 (~ 50μl) 吹气的体积, 请在塑料板 (最好是网格化) 上施加测试吹气。然后, 将已知体积的液滴 (10μl、20μl、50μl 或 100μl) 与移液器一起涂上, 以便与试验吹气进行比较。
    3. 用皮科斯普利策 (10-20 psi 为30-100 毫秒) 将神经递质 (gaba 或谷氨酸) 吹气涂在人体组织上, 以引发冰毒事件。在脑组织的深层 (5) 上涂抹 100 mm gaba, 在浅层 (2/) 产生冰囊事件。或者, 将200μm 谷氨酸直接施加到浅层上, 在浅层产生冰体事件。
      注意: 设置 picospritzer 吹气率, 使其与所需的冰形事件发生率相匹配 (每 50秒1个脉冲)。然而, 从发生冰毒事件的内在速度来看, 不能过分夸大这一比率。

2. 第二议定书: 急性体内癫痫发作模型

  1. 外科准备和手术
    1. 获取成年老鼠 (35-p60) 的任何一种性别。
    2. 用氯胺酮 (95 mg/kg) 和 xylazine (5 mg/kg) 对小鼠进行深度麻醉。执行脚趾夹紧反射测试, 以确保鼠标被镇静剂。或者, 使用异氟醚 (4% 用于诱导, 1.5-2% 用于手术) 麻醉小鼠。
      注意: 麻醉剂的选择会影响癫痫发作活动3031
    3. 用耳杆固定鼠标的头部, 将鼠标安装到立体定向框架中。在手术期间, 在鼠标下面放置一个加热垫。
    4. 用老鼠修剪器暴露头皮, 把老鼠的头顶剪断。将0.3 毫升利多卡因注入骨膜, 针头为 25 g 8, 以避免过度出血或疼痛。在实验过程中, 在鼠标上涂抹眼药膏, 以防止它们干涸。
    5. 捏并抬起鼠标头皮的中心, 以评估其反射是否消失。随后, 执行一个水平切割, 以暴露布雷格马到颅骨的 lambda 区域。用棉签轻轻刮掉头骨的整个裸露区域, 形成干燥的表面。
    6. 在坐标 2.0 mm 侧流膜和-2.0 毫米的转子孔进行直径为4毫米的开颅手术, 以暴露体感皮层。用永久标记用圆圈 (直径4毫米) 标记位置。用气动牙科钻头在圆圈周围钻, 直到开颅骨的剩余层在推倒时很容易让路。用裂片钳取出开颅手术前, 先将盐水涂在骨层上。随后, 对暴露区域应用温盐溶液。
  2. 癫痫发作的记录方法和化学诱导
    1. 从硼硅酸盐玻璃管 (外径为 1.5 mm) 中拉出阻抗为 1-3 mω的玻璃电极。用汉密尔顿注射器用 ~ 10μl 的 acsf 或生理盐水回填玻璃电极。如果尖端损坏, 请立即丢弃电极。
      注意: 漂白银丝 (5分钟), 只允许将银丝的最小部分 (尖端) 浸入 acsf 回填充玻璃电极中, 以最大限度地减少录音过程中的噪音和漂移。如有必要, 用哈密顿注射器从玻璃电极上取出多余的 acsf。
    2. 使用手动机械手引导玻璃电极进入体生长传感器电机区域的浅层皮质层 (2)。使用标准软件查看计算机上大脑切片的电活动。
      注: 第2层距离表面32约0.3 毫米深。
    3. 局部应用 ~ 0.5 ml 1.5 mm 4-ap 生理盐水与注射器暴露在小鼠的皮层, 直到它完全覆盖开颅。在100毫升的同位素盐水中溶解14毫克的 4-ap, 制成 1.5 mm 4-ap 盐水的库存溶液。
      注意: 在实验开始前准备4-ap 盐水。平均而言, 在局部应用15-30分钟后, 会出现冰体事件。
  3. 光发生小鼠癫痫发作的按需生成
    1. 应用蓝色 (470 nm) 光的短暂 (30 毫秒) 脉冲 (最小为 10 mW/mm2 输出强度) 以启动冰上事件。使用手动机械手将 1, 000μm 芯直径光纤 (0.39 na) 直接放置在记录区域上方。
      注意: 设置光刺激的速率, 以匹配所需的冰体事件发生率 (, 每 300秒1个脉冲)。然而, 从发生冰毒事件的内在速度来看, 不能过分夸大这一比率。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

将 100μm 4-ap 应用于来自幼龄 vgat-chr2 小鼠的高质量 (无损坏) 的大脑片, 可在15分钟内可靠地诱导复发性的冰门事件 (> 5秒) (图 1 ai)。将 100μm 4-ap 应用于劣质切片, 导致了爆裂事件或尖峰活动 (图 1Aii)。平均而言, 每个解剖的老鼠大脑中的40% 的切片成功地产生了冰毒事件。此外, 83% (25/) 的解剖小鼠导致至少一个大脑切片成功地产生了细胞事件。在自发发生的冰毒事件的脑片中, 在脑片上应用一个短暂的30毫秒的光脉冲可靠地触发了形态上相同的冰斑事件 (图 1Aiii1Aiii)。在 thy1-chr2 小鼠的脑片中也有相同的发现 (图 1b)。因此, 无论哪个神经元亚群被激活, 孤立的皮质神经网络中的任何短暂同步事件都会导致一个事件的发生。这些冰体事件包括一个哨兵 (预特雷) 尖峰 (图 2Aii2Aii)、类似于吨的射击 (图 2Aii和 2Aii)、类似克隆的射击 (图 2Aii2Aii) 和爆裂活动(图 2av2Av);它们在本质上与与临床癫痫发作有关的电特征相似,33。此外, 这些幼小鼠在生理上与成人相似, 因为添加 10μm bumetanide (bum), 即 nkcc1 阻滞剂, 对由此产生的冰体事件没有影响 (图 2)。

体外4-ap 皮质切片模型可靠地生成了 ~ 1小时 (图 1ai)的一致的冰体事件, 而 zer-mg2 +模型通常生成 ~ 10分钟的冰体事件, 然后迅速转化为类似爆料的活性 (图 3 a)。但是, 如果需要非4-ap 的癫痫诱导方法, 则可以修改零-mg2 +模型, 添加 5-10μm baclofen (gabab受体激动剂), 将爆裂活动转化为冰上事件 (图 3b).一般来说, 非抑制的方法, 以增加兴奋性 (, 4-ap 或零镁 2 + acsf)可靠地再现了皮质脑片中的冰事件。相反, 抑制的方法 [即双核 (bmi), gaba 受体拮抗剂] 导致了激增的活动, 让人想起间部活动或爆裂活动, 而不是冰印象事件 (图 4 a)。同样, 从 100μm 4-ap 处理的海马片制备的急性癫痫发作模型在 ca3 中产生了类似兴趣的尖峰活动或癫痫状态样的发作 (图 4b)。在体内4-ap 皮质模型相应地产生复发的冰毒事件 (> 5秒)。在局部将 1.5 mm 4-ap 应用于成年 vgat-chr2 小鼠暴露的皮层 ~ 30分钟内观察到浅层 (2/) 的肿瘤事件。将一个短暂的30毫秒光脉冲应用到暴露的皮层可以可靠地触发与自发发生的事件形态相似的冰毒事件 (图 5)。

将 010μm4-ap的零镁 2 +人 acsf 应用于颞叶癫痫患者的 "非癫痫" 皮质脑片 (450 微米), 在 ~ 30分钟内可靠地产生复发性的细胞瘤事件 (> 5 s) (图6ai 和 6Ai)。质量差的切片产生的不是尖峰活动就是没有活性 (图 1Aii)。当一个短暂的电刺激 (100μs, 30-300μa) 在实验开始时在 lfp 中引起了一个稳健的、诱发的反应时, 大脑切片的生存能力被认为是 "良好的质量"。一旦冰体事件开始沉淀, 在大脑切片上应用 100 mm gaba 的短暂喷口 (75 毫秒, 20 psi) 可靠地触发了在形态上与自发发生的事件相同的冰囊事件 (图 6Aii6Aii).较低浓度的 gaba, 100-200μm, 很可能对体外实验34也有效;然而, 在体内实验 35, 建议使用浓度较高的 gaba 100 mm.当在人脑切片上应用了一个200μm 谷氨酸的短暂喷吹时, 也复制了同样的观察结果 (图 6bii6Bii)。因此, 无论哪种突触后受体被激活, 孤立的人类皮质神经网络中的短暂同步事件都能可靠地触发一个冰上事件。

Figure 1
图 1: 急性体外4-ap 皮质发作模型。黑线代表局部场电位 (lfp) 记录;蓝线代表光刺激。(a) 这些面板基于 vgat-chr2 鼠标模型的结果。他们说明了在 lfp 记录中观察到的冰毒事件, 从一个高质量的皮质大脑切片的表层 (2/) 处理 100μm 4-ap. i) 这个面板显示了 lfp 记录的概述。ii) 这些都是 lfp 记录从劣质大脑切片的例子。垂直刻度条是 0.4 mv, 水平刻度条是 20s. iii) 这是一个光触发的冰体事件的放大视图。iv) 这是一个自发的冰体事件的放大视图。(b) 这些面板基于 thy1-chr2 鼠标模型的结果。他们说明了在 lfp 记录中观察到的冰毒事件, 从用 100μm4-ap. i 处理的皮质脑片的表层(2/) 中观察到的冰毒事件。ii) 这是一个光触发的冰体事件的放大视图。(iii) 这是一个自发的冰体事件的放大视图。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 幼鼠 (p13) 中的脑片 (第2层) 中产生的 ictal 事件, vgate-chr2 小鼠与4-ap 和 bumetanide (bum) 灌注.黑线代表局部场电位 (lfp) 记录;蓝线代表光刺激。(a) 这些面板显示一个自发的冰上事件。i) 此面板显示整个 ictal 事件的概述。下面的面板显示一个哨兵尖峰, (三) 像吨一样的射击, () 像克隆的射击, 和v) 爆裂活动。(b)这些面板显示光触发的冰形事件。i) 此面板显示整个 ictal 事件的概述。下面的面板显示了一个光触发的哨兵尖峰从相同的切片记录,) 像吨的射击, (iv) 克隆样射击, 和v) 爆裂活动。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 急性体外镁 2 +皮质癫痫发作模型.黑线代表局部场电位 (lfp) 记录;蓝线代表光刺激。()这些面板基于 vgat-chr2 鼠标模型的结果。i) 本面板从使用零 mg 2 + acsf 处理的皮质脑片的浅层 (2) 显示了 lfp记录中观察到的癫痫样状态。ii) 这是一个光触发的冰体事件的放大视图。iii) 这是一个放大视图的癫痫状态样爆裂活动。(b) 这些面板显示相同的切片记录, 并添加巴氯芬。i) 5μm 巴氯芬在零镁2 + acsf 中的应用将爆裂活动转化为不同的、反复出现的冰体事件。(ii) 这是一个放大的爆破活动视图。iii) 这是一个放大视图的独特的冰体事件。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 急性体外毛刺模型。黑线代表局部场电位 (lfp) 记录;蓝线代表光刺激。(a) 这些面板显示了 vgate-chr2mob 的皮质切片的结果, 说明了在将 10μm bmi 添加到 100μm 4ap i 之后在浅层 (2/) 中观察到的爆裂活动, 这是 lfp 记录的概述。虚线表示 bmi 何时生效。ii) 这是一个光触发的冰体事件的放大视图。iii) 这是一个放大的自发爆裂活动的看法。(b) 这些面板显示了来自 vgat-chr2 鼠标的海马切片的结果, 说明了在应用 100μm 4ap i 后在 ca3 区域观察到的类似癫痫持续状态的事件) 这是对lfp 记录的概述。ii) 这是一个放大视图的一个冰形事件。iii) 这是一个放大的光触发和自发的爆裂事件的视图。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:体内急性4-ap 皮质发作模型。黑线代表局部场电位 (lfp) 记录;蓝线代表光刺激。(a) 这些面板显示成人 (p56) vgat-chr2 小鼠模型的结果, 该模型局部应用于暴露的皮层。i) 这个面板说明了在体生长传感器运动区的表层 (2/) 中观察到的光触发的冰体事件。ii) 这是一个放大视图的光触发的冰形事件从面板aiiii) 这是一个超级放大视图的光触发的冰门事件的开始 (由黑色箭头表示)。这个数字是 chang 等人的一个数字的未经过滤的版本.16.请点击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 急性体外人类皮质癫痫发作模型.黑线代表局部场电位 (lfp) 记录;棕色的线条代表了皮科斯普利策的吹气。(a) 这些面板显示内侧颞叶癫痫 (mtle) 患者的皮质脑片的结果, 说明在与 100μm 4-ap 和零 mg 2 + 人类 acsf灌注后, 在浅层 (2) 中观察到的冰上事件.i) 这是 lfp 录制的概述。下面的面板显示了 ii) 放大视图的 100 mm gaba 喷口触发的冰体事件和iii) 放大视图的自发的冰体事件。(b) 这些面板显示另一个 mtle 患者的皮质脑片的结果, 说明在与 100μm 4-ap 和零 mg 2 + 人类 acsf灌注后, 在浅层 (2) 中观察到的冰毒事件。i) 这是 lfp 录制的概述。下面的面板显示了 ii) 放大视图200μm 谷氨酸喷口触发的冰体事件和iii) 放大视图的自发冰体事件。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1: 解剖溶液的配方.这些是制作1升或2升卷的说明。mw = 溶质的分子量。

# 试剂 conc. [mm] 兆瓦 (g/mol) 1l (g) 2l (g)
1 蔗糖 248 32.4. 3 84.89 169.78
2 碳酸氢钠 (nahco2) 26 84.01 2.18 4.37
3个 右旋糖 (d-葡萄糖) 10 180.16 1。8 3。6
4个 氯化钾 (kcl) 2 74.55 0.15 0。3
5 硫酸镁 (mgso4·7h2o) 3个 246.47 0.74 1.48
6 磷酸钠一水 (h2napo 4·h2 o) 1.25 137.99 0.17 0.34
7。 氯化钙 (ccl2·2h2o) 1 147.01 0.15 0.29

表 2: 啮齿类动物人工脑脊液 (acsf) 配方.这些是制作2升或4升卷的说明。mw = 溶质的分子量。

# 试剂 conc. [mm] 兆瓦 (g/mol) 2l (g) 4l (g)
1 氯化钠 (氯化钠) 123 58。4 14.37 28.73
2 碳酸氢钠 (nahco2) 26 84.01 4.37 8.74
3个 右旋糖 (d-葡萄糖) 10 180.16 3。6 7.21
4个 氯化钾 (kcl) 4个 74.55 0。6 1.19
5 硫酸镁 (mgsoh2 o) 1。3 246.47 0.64 1.28
6 磷酸钠一水 (hnapoh2 o) 1。2 137.99 0.33 0.66
7。 氯化钙 (ccl2·2h2o) 1。5 147.01 0.44 0.88

表 3: 人人工脑脊液配方.这些是制作2升或4升卷的说明。mw = 溶质的分子量。

# 试剂 conc. [mm] 兆瓦 (g/mol) 2l (g) 4l (g)
1 氯化钠 (氯化钠) 123 58。4 14.38 28.75
2 碳酸氢钠 (nahco2) 25。2 84.01 4.23 8.46
3个 右旋糖 (d-葡萄糖) 10 180.16 3。6 7.21
4个 氯化钾 (kcl) 4个 74.55 0。6 1.19
5 硫酸镁 (mgsoh2 o) 1 246.47 0.49 0.99
6 磷酸钠一水 (hnapoh2 o) 1。2 137.99 0.33 0.66
7。 氯化钙 (ccl2·2h2o) 1 147.01 0.29 0.59

表 4: 零镁的配方2 +啮齿类动物人工脑脊液 (零 mg2 + acsf).这些是制作2升或4升卷的说明。mw = 溶质的分子量。

# 试剂 conc. [mm] 兆瓦 (g/mol) 2l (g) 4l (g)
1 氯化钠 (氯化钠) 123 58。4 14.37 28.73
2 碳酸氢钠 (nahco2) 26 84.01 4.37 8.74
3个 右旋糖 (d-葡萄糖) 10 180.16 3。6 7.21
4个 氯化钾 (kcl) 4个 74.55 0。6 1.19
5 硫酸镁 (mgsoh2 o) 名义上免费 246.47 0 0
6 磷酸钠一水 (hnapoh2 o) 1。2 137.99 0.33 0.66
7。 氯化钙 (ccl2·2h2o) 1。5 147.01 0.29 0.59

表 5: 零镁的配方2 +人人工脑脊液 (零镁2 + 人 acsf).这些是制作2升或4升卷的说明;mw = 溶质的分子量。

# 试剂 conc. [mm] 兆瓦 (g/mol) 2l (g) 4l (g)
1 氯化钠 (氯化钠) 123 58。4 14.38 28.75
2 碳酸氢钠 (nahco2) 25。2 84.01 4.23 8.46
3个 右旋糖 (d-葡萄糖) 10 180.16 3。6 7.21
4个 氯化钾 (kcl) 4个 74.55 0。6 1.19
5 硫酸镁 (mgsoh2 o) 名义上免费 246.47 0 0
6 磷酸钠一水 (hnapoh2 o) 1。2 137.99 0.33 0.66
7。 氯化钙 (ccl2·2h2o) 1 147.01 0.29 0.59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

脑片用亲惊厥药物或改变的 acsf 灌注剂治疗, 以增加神经网络的兴奋性, 促进冰门事件的沉淀 (电图癫痫发作事件)。对于小鼠, 体质运动区的首选冠状切片应包含扣带回皮层, 区域 2 (cg), 但不包含视网膜平底区 (rs);这些解剖标记有助于确定最适合诱发冰毒事件的冠状切片的范围。小鼠组织的一个可选的修改是将大脑切片的两个半球切成两半, 用于匹配对实验设计, 因为这两个半球几乎是相同的 (类似的实验单位)。在准备大脑切片以产生冰形事件时, 必须保持神经网络及其突触连接的完整性, 因为冰体事件是一种神经网络现象。《议定书》第1步中对切片质量至关重要的三点是 1) 切片程序、2) 孵育和 3) 氧合。首先, 切片过程需要速度和技术之间的平衡。至关重要的是, 要尽量减少斩首 (或手术切除) 和孵化之间的时间, 同时也要小心大脑切片的每一次接触和运动, 以避免损坏。其次, 组织的质量对培养温度和持续时间非常敏感。重要的是要使用计时器和温度计, 以确保孵育是在 35°c 30分钟. 第三, 脑组织的活力是敏感的接触任何东西, 而不是含氧 (人工) 脑脊液。如果长时间 (~ 1分钟) 不与加碳性 acsf 灌注, 大脑切片将过期。

来自 p13-p16 年龄的小鼠的脑片是成功产生冰门事件的最高概率。原因是小鼠≤p16 在解剖前不需要经心灌注。这有效地减少了出错的机会, 并加快了解剖过程, 这是一个巨大的好处, 因为斩首和孵化之间的时间与大脑切片的生存能力成反比。同时, p13 > 的小鼠减少了与成人36只相当的nkcc1 的数量。一般来说, 幼体 (< p21) 组织比成人组织更有生命力, 因为它具有从破坏性切片过程中恢复的特殊能力。这个为期一周的窗口之间的 p13 和 p13 提供了一个机会, 利用老鼠的成人般的生理和青少年般的能力, 很容易产生冰上事件 37,38。然而, 如果实验需要研究成年小鼠脑切片中的冰毒事件, 基于 nmdg 的带有 hepes、硫脲和抗坏血酸的 acsf 将有助于促进成人组织24,39,40的活力.41. 对于人体组织, 在解剖溶液中添加抗氧化剂, 如α-生育酚, 可有利于组织的生存能力, 特别是在手术室和实验室之间的长途运输 (> 30分钟) 期间。切片8,26。对于所有的大脑切片, 产生冰囊事件的有利条件是在36°c 下记录450μm 厚的切片。大脑切片的厚度必须至少为350微米, 才能在神经网络中包含足够的神经元, 才能生成结构化的冰形事件。然而, 切片的厚度不能超过500微米, 因为这将使氧气难以扩散到组织的中心。450微米的切片代表了最佳厚度, 在这种情况下, 在不妨碍氧气在整个组织中的灌注的情况下, 保持了大量的神经网络连接。最后, 在33-36°c 时, 冰体事件的降水是最佳的;如果记录室不是至少 33°c, 则很难发生冰形事件。

急性发作模型的一个局限性是, 它们不会产生癫痫发作。它们只会产生冰形事件, 这是癫痫发作的电特征。癫痫发作没有相关的行为成分, 如失去意识或运动抽搐, 定义癫痫发作。因此, 急性癫痫发作模型不能用来确认潜在的抗癫痫药物候选药物的有效性, 也不能深入了解癫痫的发生;这样的研究问题应该通过慢性癫痫模型和临床试验来解决。急性缉获模型只能用于对缉获机制进行基本初步研究的预期目的。只有最有希望的发现从急性癫痫发作模型应该先进到更高的模型, 更昂贵, 费力地准备, 并需要更复杂的道德考虑。

为了在癫痫和癫痫发作研究中取得进展, 必须有一个可靠的急性癫痫发作模型, 能够准确复制临床上观察到的癫痫发作患者脑电图中的电图癫痫发作活动。为了可靠地再现大脑切片中的细胞介素事件, 需要采用非抑制方法来提高兴奋性, 而抑制方法 (gaba a 受体拮抗剂 bmi) 通常会导致尖峰活动让人想起间质事件, 而不是冰层事件 (图 3 a)。非抑制的首选方法是应用促惊厥剂 4-ap, 因为它可以可靠地产生1小时的一致的冰体事件。相反, 零 mg2 +皮质模型在快速转化为类似突发的活动之前, 只生成 ~ 10分钟的冰毒事件 (图 2a)。如果使用零 mg2 +模型, 添加 5-10μm baclofen, gaba b 受体激动剂, 将有助于将爆裂活动转化为冰体事件 (图 2b), 如前面在海马片42中所示。此外,体外4-ap 发作模型是首选, 因为该模型的结果可以在其体内对应的, 在体内复制4-ap 皮质发作模型 (图 4)。对活体成年小鼠的整个脑脊液进行修饰, 再现体内急性零 mg2 +环境是不可行的。

4-ap 在皮质脑片中的应用可以准确地再现临床观察到的癫痫发作活动15,33。相反, 4-ap 处理的海马切片倾向于产生类似兴趣的尖峰活性43和癫痫状态样的情况 (图 3b)。因此, 为了研究癫痫发作,急性体外4-ap 皮质模型优于体外4-ap 海马模型。此外, 几乎没有机会记录从可行的人类海马切片, 因为大多数海马切除有 ca1 和 ca3 损坏21。相反, 非病理人类皮质组织更容易获得, 因为这是皮质下神经外科手术的次要结果, 如颞叶癫痫手术。非癫痫的 "控制" 新皮质组织也可以从肿瘤切除手术中获得。由于这些原因, 皮层是首选的地点, 以建立癫痫发作活动的首选部位, 因为它在小鼠和人体组织之间具有可移植性, 以确认临床相关性。最后, c57bl6 菌株的小鼠是首选, 因为他们很容易表达转基因, 和光遗传变异是在商业上可用。光遗传学小鼠模型允许通过微创、短暂的光刺激按需启动冰门事件。这使得癫痫发作的研究非常有效, 消除了等待时间, 并允许有针对性地激活神经元亚群。此外, 由于能够按需触发癫痫发作, 可以采用新的方法来明确划分癫痫发作起始的确切点, 并有可能研究抗癫痫药物候选候选人的有效性。一个用户友好的 matlab 为基础的程序被专门开发, 以检测和分类在体外和体内发生的各种类型的癫痫样事件4-ap 扣押模型。此检测程序可从瓦利特实验室的 github 存储库 (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018) 下载。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了加拿大卫生研究所 (mop 119003 至 peter l. carlen 和 taufik a. valiante)、安大略省大脑研究所 (致 taufik a. valiante) 和 mititex 学生研究补助金 (给 michael chang) 的支持。我们要感谢利亚姆·龙在拍摄视频手稿方面的协助。我们要感谢 paria Baharikhoob、abeeshan selvabaskaran 和 shadini dematagoda 协助汇编这份手稿中的数字和表格。图 1a、 3 a4 a6 a都是根据 chang 等人公布的数据得出的原始数字.16岁

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium pentobarbital N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe N/A N/A Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle N/A N/A Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue N/A N/A Purchased through UT Med Store
Lens paper N/A N/A Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula N/A N/A Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end N/A N/A Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0 N/A N/A Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer N/A N/A Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital) N/A N/A Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2 N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome Leica N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)  Scientific Systems Design Inc N/A
Sodium Chloride (NaCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dextrose N/A N/A Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sucrose N/A N/A Purchased through UT Med Store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19, (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53, (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81, (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342, (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22, (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31, (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511, (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50, (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95, (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30, (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137, (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88, (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55, (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25, (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1, (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61, (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42, (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31, (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7, (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23, (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468, (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7, (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26, (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303, (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410, (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50, (1), 98-110 (2006).
啮齿类动物和人体组织急性 ictal 活性的产生及按需启动
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).More

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter