Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generation og On-Demand indledning af akut Ictal aktivitet i gnaver og menneskeligt væv

doi: 10.3791/57952 Published: January 19, 2019

Summary

Akutte anfald modeller er vigtige for at studere de underliggende epileptiform begivenheder mekanismer. Desuden giver evnen til at generere epileptiform begivenheder på efterspørgsel en meget effektiv metode til at studere den nøjagtige rækkefølge af begivenheder ligger til grund for deres indledning. Her beskriver vi de akutte 4-aminopyridine kortikale beslaglæggelse modeller etableret i mus og humant væv.

Abstract

Kontrollere anfald forbliver et udfordrende spørgsmål for den medicinske samfund. For at gøre fremskridt, skal forskerne grundigt studere beslaglæggelse dynamics og undersøge dens underliggende mekanismer. Akut anfald modeller er praktisk, giver mulighed for at udføre elektrofysiologiske optagelser og kan generere en stor mængde af electrographic beslaglæggelse-lignende (ictal) begivenheder. De lovende fund fra akutte anfald modeller kan derefter avancerede til kronisk epilepsi modeller og kliniske forsøg. Således vil at studere anfald i akut modeller, der trofast gentage electrographic og dynamiske underskrifter fra et klinisk anfald være afgørende for at gøre klinisk relevante resultater. Studerer ictal begivenheder i akutte anfald modeller fremstillet af humant væv er også vigtige for at gøre resultaterne, der er klinisk relevant. Det vigtigste fokus i dette papir er på den kortikale 4-AP model på grund af sin alsidighed i generere ictal begivenheder i både i vivo og in vitro- undersøgelser, samt i både mus og humant væv. Metoder i dette papir vil også beskrive en alternativ metode til beslaglæggelse induktion ved hjælp af nul-Mg2 + model og giver en detaljeret oversigt over fordelene og begrænsninger af den epileptiform-lignende aktivitet genereret i de forskellige akutte beslaglæggelse modeller. Derudover ved at udnytte kommercielt tilgængelig optogenetic mus stammer, kan en kort (30 ms) lys puls bruges til at udløse hændelsen ictal identiske med dem, der opstår spontant. 30-100 ms pust af neurotransmittere (Gamma-Amino smørsyre eller glutamat) kan ligeledes anvendes til den menneskelige væv til at udløse ictal begivenheder, der er identiske med dem, der opstår spontant. Evnen til at udløse ictal begivenheder på efterspørgslen i akutte anfald modeller tilbyder den nyfundne evne til at observere den nøjagtige rækkefølge af begivenheder, der ligger til grund for beslaglæggelse indledning dynamics og effektivt vurdere potentielle Anti-beslaglæggelse behandlinger.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akutte anfald modeller kan med held reproducere electrographic underskrifter minder om ictal begivenheder observeret i elektroencefalografi (EEG) af individer oplever en beslaglæggelse. Forskere bruger disse ictal-lignende begivenheder (herefter omtalt som 'ictal events') som surrogater for beslaglæggelse event1. Klinisk, tjene ictal begivenheder som en pålidelig proxy for beslaglæggelse begivenheder siden anfald er en neurologisk lidelse, der stammer fra hjernen. I den overvågning enhed, epilepsi, neurologer er afhængige af påvisning af ictal begivenheder til at bekræfte hjernens epileptogenic region og isolere det for resektion2. I intensiv afdeling overvåge læger ictal aktivitet at vurdere hvis nogen beslaglæggelse aktivitet fortsætter i bedøvet patienter3. Kontrollere anfald er fortsat for at være en udfordrende spørgsmål for den medicinske samfund, som 30% af epilepsi-patienter er resistente til rådighed medicin4,5, og 10% af medicinske tilfælde der involverer narkotika-induceret anfald er unresponsive til standardbehandling3. Dette udgør en alvorlig bekymring for samfundet, som 10% af den amerikanske befolkning er fast hen til erfaring en beslaglæggelse begivenhed i deres levetid og 3% forventes at udvikle epilepsi6.

At studere anfald i kronisk epilepsi modeller er dyre, besværlige og ofte tager måneder at forberede7. Det er også vanskeligt at udføre elektrofysiologiske optagelser i frit flytte dyr. Humane kliniske forsøg står over for lignende problemer, samt yderligere kompleksiteter relateret til patientens samtykke, variation i deltagernes baggrund, og den moralske og etiske overvejelser involveret8. Akut anfald modeller, på den anden side er positiv, fordi de er relativt nem at forberede, omkostningseffektive og kan skabe store mængder af ictal begivenheder for undersøgelse9. Derudover er vævet fast i en stabil stilling, så betingelserne, der er ideelle til at udføre de elektrofysiologiske optagelser nødvendigt at studere beslaglæggelse dynamik og de tilhørende underliggende patofysiologi. Akutte anfald modeller forblive gunstige forhold i siliciummangan (computer) modeller, fordi de er baseret på biologiske materiale består af hjernens konstituerende neuronal netværk med alle dens iboende faktorer og synaptisk forbindelse, der ikke kan hentes af selv de mest detaljerede computer modeller10. Disse funktioner gør akut anfald modeller klar til at være effektiv ved screening for potentielle Anti-beslaglæggelse behandlinger og foretager foreløbige resultater inden man rykkede dem for yderligere undersøgelse i kronisk epilepsi modeller og kliniske forsøg.

Typisk, akut anfald modeller er afledt af det normale hjernevæv, der har været udsat for hyper-overgearet betingelser. For at fremkalde klinisk relevante ictal begivenheder i raske hjernevæv, er det vigtigt at forstå, at hjernen fungerer optimalt i en kritisk tilstand11 hvor excitation (E) og hæmning, (I) er afbalanceret12. En afbrydelse af E-jeg balance kan føre til hyper-overgearet beslaglæggelse tilstand hvor ictal begivenheder bundfald. I overensstemmelse hermed, inden for denne begrebsmæssige ramme, der er to store strategier til at generere ictal begivenheder i hjernen skiver (in vitro-) eller i hele hjernen (i vivo) præparater: enten faldt hæmning ("disinhibition") eller øget excitation ("ikke-disinhibition"). Dog ictal begivenheder er meget bestilt og synkroniseret begivenheder, der kræver indflydelse af GABAergic interneurons til at orkestrere neurale netværk aktivitet13,14. Derfor er ikke-disinhibition modeller den mest effektive for generere ictal begivenheder i isolerede neurale netværk, såsom i en in vitro- hjerne skær15, in vitro- disinhibition modeller almindeligt foere til spiking aktivitet minder om interictal-lignende spiking. Desuden inden for denne begrebsmæssige ramme, kan en momentan synkronisering begivenhed også pålideligt udløse en ictal event16. Faktisk kan en ictal begivenhed udløses ved enhver mindre undertrykkelse af netbårne anvendes til neurale system17 , når det er i en kritisk tilstand overgangen ("bifurcation") punkt18. Traditionelt har blev disse perturbationer fremkaldt af elektrisk stimulation. Den seneste udvikling af optogenetics i neurovidenskab, men tilbyder nu en mere elegant strategi for at fremkalde kritiske tilstand overgange16.

Metoderne beskrevet i denne hvidbog demonstrere hvordan man kan generere ictal begivenheder på efterspørgslen i akutte anfald modeller for både in vitro- (trin 1 i protokol) og i vivo undersøgelser (trin 2 i protokollen). Det drejer sig om valget af område af hjernen, beslaglæggelse induktion metode, undersøgelse type og art; imidlertid vil fokus være på det anbefalede valg af en akut 4-AP kortikale beslaglæggelse model på grund af sin alsidighed i en lang række undersøgelse typer. Akut in vitro- 4-AP beslaglæggelse model er baseret på standard-protokol til at forberede elektrofysiologiske optagelser høj kvalitet hjernen skiver og billedbehandling undersøgelser19. Disse protokoller er allerede blevet brugt til at gøre i vitro koronale hjernen udsnit fra den somatosensoriske-motoriske cortex mus16,20 og mennesker21. Ændringer til at generere ictal begivenheder i disse typer af hjernen skiver har tidligere vist16 og alle detaljer er beskrevet i protokollen under. Akut i vivo 4-AP kortikale beslaglæggelse model er baseret på standard-protokol til at forberede en kraniotomi imaging studier22. Ændringen er, at ingen (glas dias) vinduet er installeret efter kraniotomi. I stedet anvendes proconvulsant agenter (4-AP) topisk til udsatte cortex til at fremkalde ictal begivenheder, mens dyret er under fuld narkose. Til vores viden var vores gruppe først til at udvikle denne akut i vivo kortikale beslaglæggelse model i mus16,23. Den akutte i vivo 4-AP kortikale beslaglæggelse model fremstillet af voksen mus blev udviklet til at supplere den in vitro- skive model fra juvenile væv. Replikering af resultaterne i den voksne i vivo beslaglæggelse model hjælper for at generalisere resultaterne fra Skive modeller ved at løse de iboende bekymringer med hensyn til de ikke-fysiologiske tilstande af en 2D hjernen Skive (versus en 3-D hele-hjerne struktur) og de fysiologiske forskelle mellem unge og voksne væv.

Metoden for on demand ictal begivenhed indledning er påvist ved hjælp af enten pust af neurotransmittere med en picospritzer eller optogenetic strategier. Til bedste af vores viden er vores gruppe først til at indlede ictal begivenheder i humant væv ved hjælp af neurotransmittere via en picospritzer16. For optogenetic strategier er C57BL/6 mus stamme den konventionelle stamme, der bruges til at udtrykke transgener. Udtryk for channelrhodopsin-2 (ChR2) i enten GABAergic interneurons eller glutamatergic pyramideformet celler vil give den valgfri evnen til at generere ictal begivenheder on-demand med korte lyspulser. Egnet optogenetic mus stammer omfatter de kommercielt tilgængelige C57BL/6 variant, der udtrykker ChR2 i enten interneurons, ved hjælp af musen vesikulære GABA transporter promotor (VGAT)24, eller pyramideformet celler, ved hjælp af musen thymus celle antigen 1 promotor (Thy1)25. Disse fås VGAT-ChR2 og Thy1-ChR2 mus tilbyder mulighed for at aktivere GABAergic neuroner eller glutamatergic neuroner, henholdsvis i neocortex med blå (470 nm) lys. Evnen til at generere ictal begivenheder på efterspørgslen i akutte anfald modeller kan tilbyde nye muligheder for at studere beslaglæggelse indledning dynamics og effektivt vurdere potentielle Anti-beslaglæggelse behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle forskning involverer patienter blev udført under en protokol, der er godkendt af University Health Network forskning etik Board i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Procedurer, der involverer dyr var i overensstemmelse med retningslinjer af den canadiske Rådet om dyrs pleje og godkendt af Krembil Research Institute dyr efterbehandling udvalget.

1. protokol I: akut In vitro beslaglæggelse Model

  1. Forberedelse af dissektion løsninger og kunstige cerebrospinalvæske
    1. Carbogenate ultrarent vand (som er vand filtreret med en resistivitet på 18.2 MΩ·cm) med carbogen (95% O2/5% CO2) for 5 min ved hjælp af luft sten boble diffusorer (beluftere til akvarier).
      Bemærk: Air sten kan tilsluttes til carbogen tank regulator via standard silikoneslanger. Hvis luften sten ikke er tilgængelige, seal lukker i slutningen af silikoneslanger og stikke små huller i sæl at tillade carbogen gas til boble ud og carbogenate løsningen.
    2. Forberede en dissektion løsning ved at opløse de opløste stoffer fra tabel 1 i ultrarent vand. Tilføje CaCl2 til en løsning, der har været carbogenated i mindst 5 min. til at hjælpe det opløses.
      Bemærk: Alternativt, Tilføj CaCl2 først, således at det kan opløses let i en umættet opløsning. Løsningen, i flydende form, bør være 300-320 mOsm/L og har en pH-værdi på 7,4 efter at være mættet med carbogen.
      1. Chill dissektion løsning til 0 - 4 ° C. Lad løsningen i køleskabet natten over eller placere løsningen i fryseren i 1 h og løbende overvåge temperaturen.
        Bemærk: Dissektion løsning kan opbevares i op til 3 nætter; Kassér bagefter.
      2. Carbogenate dissektion løsning for 5-10 min før brug.
        Bemærk: Ideelt, løsningen skal enten vises som sjap eller skal skiftes for at slush før brug.
    3. Forberede gnaver kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) ved at opløse de opløste stoffer fra tabel 2 (eller tabel 3 for human ACSF) i ultrarent vand. Carbogenate ACSF løsning samtidig med at det er i et bad med vand opvarmet til 35 ° C indtil brug. Tilføje CaCl2 til en løsning, der har været carbogenated i mindst 5 min. til at hjælpe det opløses.
      Bemærk: Tilføje alternativt CaCl2 først, så det kan opløse lettere i en umættet opløsning. Løsningen, i flydende form, bør være 290-320 mOsm/L og har en pH-værdi på 7,4 efter at være mættet med carbogen. Løsninger bør foretages i 1, 2 eller 4 L mængder afhængigt af varigheden af eksperimenterne. Gøre 4 L for en hel dag (8 h) af eksperimenter. ACSF bør gøres frisk hver dag; Opbevar det ikke længere end 1 d.
  2. Musen dissektion at indsamle hjernevæv
    Bemærk: For humant væv, fortsætte til næste trin (trin 1.3) på at gøre hjernen skiver med vibratome. De terning-formede blokke (1 cm3) af hjernevæv bør indhentes fra neurokirurg ved hjælp af procedurer tidligere beskrevet26,27.
    1. Indsamle alle de værktøjer og materialer nødvendige for dyr dissektioner. Indstille arbejdsområdet til at forberede dyr dissektioner.
      1. Check carbogen tank (95 %O2/5%CO2) for at sikre, at det ikke er tom. Erstatte gasflaske inden eksperimenter, hvis der er mindre end 500 psi pres tilbage.
      2. Kalibrere vibratome (vibrerende klinge væv slicer) ifølge fabrikantens brugsanvisning. Justere vibratome indstilling for at have en skæring amplitude på 1 mm og en skærehastighed 0,12 mm/s.
        Bemærk: De optimale indstillinger kan variere for hver enkelte vibrerende væv klinge cutter; imidlertid i almindelighed, amplitude skal være høj og opskæring hastighed være lav.
      3. Fyld hjernen skive inkubation kammer (dvs., hjernen skive keeper) med ACSF og boble det med carbogen. Derefter placere inkubation kammer i vandbad indstillet på 35 ° C.
        Bemærk: Brug gnaver ACSF for gnavere hjernen skiver og menneskelige ACSF for menneskelige hjerne skiver.
    2. Opnå en juvenil mus af begge køn, mellem en alder af 13 d (p13) til 21 d (p21, hvor p0 er fødselsdato).
    3. Bedøver mus med en intraperitoneal injektion af natrium pentobarbital (55 mg/kg legemsvægt). Når musen er dybt bedøvede, som angivet ved fravær af tå knivspids refleks, hurtigt bruge en vet-godkendt guillotine instrument til at halshugge mus i en hurtig bevægelse.
      Bemærk: Forberede natrium pentobarbital injektion efter de procedurer, der er anbefalet af institutionelle retningslinjer.
    4. Hold musens næse til at stabilisere hovedet og forsigtigt gøre en midterlinjen snit starter mellem den mus øjne og langs hele længden af hovedbunden at eksponere kraniet. Sikre kraniet ikke komprimeres af pression ved at skraberen. Bruge hjørnet af razor's edge til at øge cut præcision.
    5. Spredt fra hinanden sildelapper af musens hovedbunden bruger fingrene til at udsætte kraniet. Brug derefter den friske hjørne af en knivsæg for at gøre et snit langs midterlinjen af kraniet; betale omhyggelig med at undgå enhver kontakt med hjernebarken.
    6. Indsæt splinter pincet til musens øjenhuler at stabilisere hovedet og placere den i en petriskål fyldt med koldt (0 - 4 ° C) dissektion løsning. Sikre, at hovedet er fuldt neddykket i opløsningen dissektion.
    7. Bruge et andet sæt af splinter tang til at forsigtigt skræl væk med musen hovedbunden, fjerne næse knogle ved at skrælle det, og fjern bagsiden (caudale side) af kraniet.
      Bemærk: Næse knoglen af juvenile mus er meget blød og let brudt.
    8. Bruge en mikro spatel til at skære synsnerverne, trigeminus nerver og rygmarv. Brug derefter den mikro spatel til at forsigtigt adskille hjernen fra kraniet. Forlade hjernen fuldt neddykket i petriskålen fyldt med dissektion løsning.
  3. Forberedelse af kortikale udsnit fra den somatosensoriske-motoriske cortex
    1. Fyld den vibratome pufferkar med ~ 150 mL koldt (0 - 4° C) dissektion løsning.
      Bemærk: Hold eventuelt pufferkar i fryseren indtil nødvendig for at opretholde en lav temperatur under proceduren udskæring.
    2. Lim hjernevæv fra mus eller human på vibratome etape (modellen indehaveren/bakke) ved hjælp af instant klæbende lim. For mus, skåret ud en lille caudale del af hjernen (dvs., lillehjernen), så det kan være nemt limet fladt på præparatholderen (tillader den rostralt side af hjernen til at stå over loftet).
      Bemærk: Alternativt vandrette mus hjernen skiver kan være forberedt ved at lime den dorsale side af hjernen på præparatholderen (den ventrale side af hjernen bør stå over loftet)28.
    3. Anbring forsigtigt præparatholderen (med hjernevæv) i pufferkarret. Sørg for, at den dorsale del af hjernen vender de vibratome blade.
      Bemærk: Det er afgørende at minimere mængden tid hjernen er udsat for luft.
  4. Hjernens væv skæring og samling
    1. Skær hjernen i 450 μm tykke skiver ved hjælp af vibratome i den dorsale ventrale retning. Sikre, at hjernen forbliver helt forankret i modellen bakken mens udskæring det.
      1. Skal de første snit i mus hjernen til at fjerne de olfaktoriske pære. Derefter gøre efterfølgende nedskæringer, indtil området somatosensoriske-motor er observeret (placeret omtrent halvvejs mellem olfaktoriske pære og bregma).
        Bemærk: Du kan eventuelt skive hjernen i tyndere (200 μm) skiver indtil corpus callosum vises i visningen koronale i hjernen, som angiver, at området somatosensoriske-motor er tæt.
    2. Brug en wide-bore overførsel pipette til at indsamle koronale skiver (450 μm), der indeholder området somatosensoriske-motor og oversvømme dem i en petriskål, som indeholder kolde (0 - 4 ° C) dissektion løsning.
    3. Brug en ny barberblad og cut off eventuelle overskydende væv fra skiver. Koronale skiver fra mus, udføre en tværgående skære lige under den neocortical commissure (dvs., corpus callosum). Ikke skære i en savning bevægelse; blot lægge pres på klingen ind i vævet og bruge en detaljering børste til forsigtigt adskille væv. Sørg for at minimere bevægelse af den koronale skive.
    4. Brug en wide-bore overførsel pipette til at overføre den dorsale del af de koronale skiver, der indeholder neocortex (lag 1-6) til en anden petriskål fyldt med varm (35 ° C) ACSF et øjeblik (~ 1 s). Derefter, omgående overføre skiver til en inkubation sal som indeholder varm (35 ° C) carbogenated ACSF.
      Bemærk: Formålet med overførslen til petriskål med ACSF er at minimere overførslen af dissektion løsning til inkubation salen mens overføre hjernen skiver med wide-bore pipette. Udnytte inkubation kammerets flere brønde til at holde forskellige hjernen skiver organiseret.
    5. Kassér resten af hjernen og dyr slagtet efter de institutionelle retningslinjer.
  5. Inkubation og vedligeholdelse
    1. Forlade hjernen skiver lidt neddykket i inkubation kammer ved 35 ° C i 30 min. Derefter fjerne inkubation salen fra vandbadet og gør det muligt at vende tilbage til stuetemperatur (20-25 ° C). Vent 1 h for hjernen skiver til at inddrive før du udfører elektrofysiologiske optagelser.
      Bemærk: Sørge for der er ingen luftbobler, der indsamler nedenunder hjernen skiver i salen, inkubation. Luftbobler er luft-grænseflader, der forårsager vævsskader. Mus hjernen skiver kan opretholdes i 6-8 h, mens menneskelige hjernevæv kan opbevares i op til 24 timer i en godt-carbogenated inkubation kammer med den relevante ACSF.
  6. Elektrofysiologiske optagelser af den overfladiske kortikale lag
    Bemærk: Ictal hændelser der observeret i de ekstracellulære lokale felt potentielle (LFP) optagelser fra hjernen skiver. LFP af hjernen skive kan observeres og indspillet med enten en grænseflade type kammer29 eller en neddykket multi elektrode array (MEA) system16. Proceduren har været tidligere beskrevet16 og yderligere detaljer er beskrevet nedenfor.
    1. Bruge en wide-bore overførsel pipette eller en detaljering pensel til at flytte en hjerne skive på lidt større præ-cut linse papir, der holdes på plads ved hjælp af en dental pincet. Overføre linse papiret (det hjernen skive hviler på) til optagelse kammer og sikre det i position med en harpe skærm.
    2. Køre varm (35 ° C), carbogenated ACSF perfusate gennem optagelse kammer over hjernen skive med en hastighed på 3 mL/min. (~ 1 drop/s). Brug et digital termometer til at sikre optagelse kammer er 33-36° C.
    3. Trække glas elektroder med en impedans på 1-3 MΩ fra borsilikatglas rør (med en ydre diameter på 1,5 mm) ved hjælp af en aftrækker. Opfyldning glas elektroder med ACSF (~ 10 µL) ved hjælp af en Hamilton sprøjte. Straks kasseres elektroden hvis spids er beskadiget.
      Bemærk: Bleach sølvtråd (5 min) og kun tillade en minimal del (dvs., spidsen) af sølvtråd at være nedsænket i ACSF back-fyldt glas elektroderne for at minimere støj og drift under optagelserne. Fjern eventuelle overskydende ACSF fra glas elektrode med en Hamilton sprøjte hvis nødvendigt.
    4. Brug en 20 X stereo-mikroskop til præcist guide optagelse glas elektrode til den overfladiske kortikale lag (2/3) ved hjælp af manuel manipulatorer. Post/se den elektriske aktivitet i hjernen skive på en computer med standard-software.
      Bemærk: Levedygtige (høj kvalitet) hjerne skiver vil udstille en robust evoked potentiale som reaktion på den anvendte elektriske stimuli (100 µs, 30-300 μA) eller lysimpulser (30 ms, 10 mW/mm2) til optogenetic væv.
  7. Induktion af beslaglæggelse-lignende aktiviteter
    1. Perfuse ACSF indeholdende 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) over hjernen skive. 80 mg 4-AP i 8,5 mL vand til at gøre en stamopløsning af 100 mM 4-AP. tilsættes 100 µL af 100 mM 4-AP stamopløsning 100 mL af ACSF at opnå en ACSF perfusate med 100 µM 4-AP opløses.
      Bemærk: Alternativt bruge nul-Mg2 + ACSF (tabel 4), en modificeret ACSF løsning som indeholder ingen tilsat Mg2 +, for at perfuse hjerne skive. For humant væv, skal du bruge en kombination af 100 µM 4-AP i nul-Mg2 + menneskelige ACSF (tabel 5) for at opnå optimale resultater. Den gennemsnitlige tid for ictal begivenheder vises er 15 min; Det kan dog tage op til 40 min for nogle hjerne skiver.
  8. Oven på-anfordring beslaglæggelse generation: en optogenetic strategi for optogenetic mus
    1. Anvende en kort (30 ms) puls af blå (470 nm) lys (med et minimum 1 mW/mm2 output intensitet) for at indlede en ictal begivenhed. Brug en manuel manipulator til at placere en 1.000 µm kerne diameter optisk fiber (0.39 NA) direkte over regionen optagelse.
      Bemærk: Indstille rate af foto-stimulation til at matche det ønskede antal ictal begivenhed forekomst (dvs.1 puls hver 50 s). Men satsen kan ikke overdrives overdrevent fra iboende hastigheden hvormed ictal begivenheder opstår.
  9. Oven på-anfordring beslaglæggelse generation: en ikke-optogenetic strategi for menneskelige væv
    1. Placer hjernen skive, så de overfladiske lag er opstrøms, og de dybe lag er downstream til strømmen af perfusate gennem optagelse kammer.
    2. Trække et glas elektrode (den samme type som anvendes til LFP optagelser) og forsigtigt røre spidsen med en delikat opgave visker til at oprette en lille åbning. Opfyldning elektrode med ~ 25 µL af 100 mM GABA (opløst i vand), og fastgør den til picospritzer. Alternativt, opfyldning elektrode med 200 µM glutamat (opløst i vand).
      Bemærk: Du skal vurdere den diskenhed, der pustede fra picospritzer (~ 50 µL), anvende en test pust på en plastik plade (helst inddelte). Derefter anvende en dråbe af kendte mængder (dvs., 10 µL, 20 µL, 50 µL eller 100 µL) med en pipette til en sammenligning med test puff.
    3. Anvende pust af neurotransmitter (GABA eller glutamat) til den menneskelige væv med en picospritzer (10-20 psi for 30-100 ms) for at indlede en ictal begivenhed. Anvende et enkelt pust af 100 mM GABA på den dybe lag (5) af hjernevæv til at generere ictal begivenheder i de overfladiske lag (2/3). Alternativt kan du anvende et enkelt pust af 200 µM glutamat direkte på det overfladiske lag til at generere ictal begivenheder i de overfladiske lag.
      Bemærk: Indstille rate af picospritzer puff til at matche det ønskede antal ictal begivenhed forekomst (dvs.1 puls hver 50 s). Men satsen kan ikke overdrives overdrevent fra iboende hastigheden hvormed ictal begivenheder opstår.

2. protokol II: Akut In vivo beslaglæggelse Model

  1. Kirurgisk forberedelse og kirurgi
    1. Få en voksen mus (p35 - p60) af begge køn.
    2. Dybt bedøver mus med ketamin (95 mg/kg) og xylazin (5 mg/kg). Udfør tå-knivspids refleks test for at sikre, at musen er bedøvet. Alternativt bruge isofluran (4% til induktion, 1,5-2% for kirurgi) til bedøver musen.
      Bemærk: Valget af anæstetika kan påvirke beslaglæggelse aktivitet30,31.
    3. Montere musen ind i et stereotaxisk ramme ved at sikre sit hoved med øre barer. Placere en opvarmet pad nedenunder musen for varigheden af operationen.
    4. Barbere toppen af musens hoved trimmeren gnaver for at eksponere hovedbunden. Indsprøjtes 0,3 mL lidocain med en 25 G 5/8 i nål i periosteum at undgå overdreven blødning eller smerter. Anvende øjet salve til musens øjne til at forhindre dem i at udtørre under eksperimentet.
    5. Knivspids og løft i midten af musens hovedbunden at vurdere, om dens reflekser er væk. Efterfølgende, udføre en horisontal skåret til at udsætte bregma til lambda region af kraniet. Forsigtigt skrabe det hele udsatte område af kraniet med en vatpind til at oprette en tør overflade.
    6. Udføre en kraniotomi 4 mm i diameter på koordinater 2,0 mm lateromedial og-2.0 mm rostrocaudal at udsætte den somatosensoriske cortex. Mark placeringen med en cirkel (4 mm i diameter) med en permanent markør. Drill omkring cirklen med en pneumatisk dental boret indtil de resterende lag af kraniotomi knogle giver let måde når skubbet. Anvende saltvandsopløsning ind på lag af knogler før du fjerner kraniotomi med splinter pincet. Efterfølgende, anvende varme saltopløsning til det udsatte område.
  2. Optagelse metoder og kemiske induktion af anfald
    1. Trække glas elektroder med en impedans på 1-3 MΩ fra borsilikatglas rør (med en ydre diameter på 1,5 mm) ved hjælp af en aftrækker. Opfyldning glas elektroder med ~ 10 µL af ACSF eller saltvand ved hjælp af en Hamilton sprøjten. Straks kasseres elektroden hvis spids er beskadiget.
      Bemærk: Bleach sølvtråd (5 min) og kun tillade en minimal del (dvs., spidsen) af sølvtråd at være nedsænket i ACSF back-fyldt glas elektroderne for at minimere støj og drift under optagelserne. Fjern eventuelle overskydende ACSF fra glas elektrode med en Hamilton sprøjte hvis nødvendigt.
    2. Brug en manuel manipulator til at guide glas elektroden i den overfladiske kortikale lag (2/3) i området somatosensoriske-motor. Post/se den elektriske aktivitet i hjernen skive på en computer med standard-software.
      Bemærk: Layer 2/3 er ca. 0,3 mm dybe fra den overflade32.
    3. Topisk anvendelse ~0.5 mL 1,5 mM 4-AP saltvand på udsatte cortex af musen med en sprøjte, indtil det fuldstændig dækker kraniotomi. Opløses 14 mg 4-AP i 100 mL isotonisk saltvand til at gøre en stamopløsning af 1,5 mM 4-AP saltvand.
      Bemærk: Forberede 4-AP saltvand, inden forsøget påbegyndes. I gennemsnit vises ictal begivenheder 15-30 min efter lokal applikation.
  3. Bestillings-generation af anfald i optogenetic mus
    1. Anvende en kort (30 ms) puls af blå (470 nm) lys (med en minimum 10 mW/mm2 output intensitet) for at indlede en ictal begivenhed. Brug en manuel manipulator til at placere en 1.000 µm kerne diameter optisk fiber (0.39 NA) direkte over regionen optagelse.
      Bemærk: Indstille rate af foto-stimulation til at matche det ønskede antal ictal begivenhed forekomst (dvs.1 puls hver 300 s). Men satsen kan ikke overdrives overdrevent fra iboende hastigheden hvormed ictal begivenheder opstår.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Anvendelse af 100 µM 4-AP til god kvalitet (ubeskadiget) 450 µm mellemstore kortikale hjernen skiver fra en juvenil VGAT-ChR2 pålideligt induceret tilbagevendende ictal musehændelser (> 5 s) indenfor 15 min (figur 1Ai). Anvendelse af 100 µM 4-AP på skiver af dårlig kvalitet resulterede i sprængfyldt begivenheder eller spiking aktivitet (figur 1Aii). I gennemsnit genereret 40% af skiver fra hver dissekeret mus hjernen med succes ictal begivenheder. Derudover resulterede 83% (25/30) af dissekerede musene i mindst én hjerne skive, der med succes genereret ictal begivenheder. I hjernen skiver med spontant forekommende ictal begivenheder, anvendelsen af en kort 30 ms lys puls på hjernen skive pålideligt udløst en ictal begivenhed, der var identisk i morfologi (figur 1Aiii og 1Aiv). De samme konklusioner blev foretaget i hjernen udsnit fra Thy1-ChR2 mus (figur 1B). Således, uanset hvilken neuronal delpopulation blev aktiveret, alle kort synkronisering begivenhed i den isolerede kortikale neurale netværk førte til fremkomsten af en ictal begivenhed. Disse ictal begivenheder var består af en sentinel (preictal) spike (figur 2Aii og 2Bii), tonic-lignende fyring (figur 2Aiii og 2Biii), kloniske-lignende fyring (figur 2Aiv og 2Biv) og bristende aktivitet mod slutningen (figur 2Av og 2Bv); de var samme karakter som de electrographic signaturer forbundet med klinisk anfald33. Desuden var disse unge mus fysiologisk voksen-lignende som tilsætning af 10 µM bumetanid (BUM), en NKCC1 blocker, havde ingen effekt på de resulterende ictal begivenheder (figur 2).

In vitro- 4-AP kortikale skive model genereret pålideligt konsekvent ictal begivenheder for ~ 1 h (figur 1Ai), der henviser til, at nul-Mg2 + model typisk genereres ictal begivenheder for ~ 10 min før hurtigt omdanne til burst-lignende aktivitet ( Figur 3A). Hvis en ikke-4-AP metode til beslaglæggelse induktion er påkrævet, kan nul-Mg2 + modellen kan ændres med tilsætning af 5-10 µM baclofen (en GABAB receptorer agonist) til at omdanne den brister aktivitet tilbage til ictal begivenheder (figur 3B) . I almindelighed, gengivet metoder til ikke-disinhibition at øge ophidselse (dvs., 4-AP eller nul-Mg2 + ACSF) pålideligt ictal begivenheder i kortikale hjernen skiver. Derimod resulterede metoder af disinhibition [i.e., bicuculline (BMI), en GABAA receptor antagonist] i spiking aktivitet minder om interictal aktivitet eller brister aktivitet, snarere end ictal begivenheder (figur 4A). På samme måde, akut anfald modeller fremstillet af 100 µM 4-AP-behandlede hippocampus skiver genereret interictal-lignende spiking aktivitet eller status epilepticus-lignende betingelser i CA3 (figur 4B). I vivo 4-AP kortikale model tilsvarende genereret tilbagevendende ictal begivenheder (> 5 s). Ictal hændelser blev observeret i de overfladiske lag (2/3) inden for ~ 30 min af topisk anvendelse af 1.5 mM 4-AP på udsatte cortex af voksne VGAT-ChR2 mus. Anvendelsen af en kort 30 ms lys puls på udsatte cortex udløst pålideligt ictal begivenheder, der var morfologisk ligner dem spontant forekommende (figur 5).

Anvendelsen af nul-Mg2 + menneskelige ACSF med 100 µM 4-AP til «ikke epileptisk» kortikale hjernen skiver (450 µm) fra frontal-lap epilepsi patienter pålideligt genereret tilbagevendende ictal begivenheder (> 5 s) indenfor ~ 30 min (figur 6Ai og 6Bi). Skiver af dårlig kvalitet genereres enten spiking eller ingen aktivitet (figur 1Aii). Levedygtigheden af hjernen skiver blev anset for 'god kvalitet' når en kort elektrisk stimulering (100 µs, 30-300 µA) induceret en robust, evoked response i LFP i begyndelsen af eksperimentet. Når ictal begivenheder begyndte at udfælde, udløst anvendelsen af en kortfattet puff (75 ms på 20 psi) 100 mm GABA på hjernen skive pålideligt ictal begivenheder, der var identiske i morfologi til dem, der opstår spontant (figur 6Aii og 6Aiii) . En lavere koncentration af GABA, 100-200 µM, vil sandsynligvis være effektiv samt for in vitro- eksperimenter34; en højere koncentration af GABA, 100 mM, anbefales dog for i vivo eksperimenter35. De samme observationer blev gengivet når en korte pust af 200 µM glutamat blev anvendt på menneskelige hjerne skiver (figur 6Bii og 6Biii). Således, uanset hvilken post synaptiske receptorer blev aktiveret, en kort synkronisering begivenhed i det isolerede menneskelige kortikale neurale netværk pålideligt udløst en ictal begivenhed.

Figure 1
Figur 1: Akut in vitro- 4-AP kortikale beslaglæggelse model. De sorte linjer repræsenterer lokale feltet potentielle (LFP) optagelse; de blå linjer repræsenterer lys stimulus. (A) disse paneler er baseret på resultaterne fra en VGAT-ChR2 musen model. De illustrerer ictal begivenheder observeret i LFP optagelse fra det overfladiske lag (2/3) af en høj kvalitet kortikale hjernen skive behandlet med 100 µM 4-AP. jeg) dette panel viser en oversigt over LFP optagelse. ii) disse er eksempler på LFP optagelse fra dårlig kvalitet hjernen skiver. Den lodrette skalalinjen er 0,4 mV, vandrette skalalinjen er 20 s. iii) Dette er en zoomet i visning af en lys-udløst ictal begivenhed. iv) Dette er en zoomet på baggrund af en spontan ictal begivenhed. (B) disse panel er baseret på resultaterne fra en Thy1-ChR2 musen model. De illustrerer ictal begivenheder observeret i LFP optagelse fra det overfladiske lag (2/3) af en kortikale hjernen skive behandlet med 100 µM 4-AP. jeg) dette panel viser en oversigt over LFP optagelse. ii) Dette er en zoomet i visning af en lys-udløst ictal begivenhed. iii) Dette er en zoomet på baggrund af en spontan ictal begivenhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Ictal begivenheder genereret i en hjerne Skive (layer 2/3) fra en juvenil (p13) VGAT-ChR2 musen perfunderet med 4-AP og bumetanid (BUM). De sorte linjer repræsenterer lokale feltet potentielle (LFP) optagelse; de blå linjer repræsenterer lys stimulus. (A) disse paneler viser en spontan ictal begivenhed. jeg) dette panel viser en oversigt over hele ictal begivenheden. De følgende paneler Vis ii) en sentinel spike, iii) tonic-lignende fyring, iv) kloniske-lignende fyring, og v) brister aktivitet. (B) disse paneler viser en lys-udløst ictal begivenhed. jeg) dette panel viser en oversigt over hele ictal begivenheden. De følgende paneler Vis ii) en lys-udløst sentinel spike fra den samme skive optagelse, iii) tonic-lignende fyring, iv) kloniske-lignende fyring, og v) brister aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Akut in vitro- nul-Mg2 + kortikale beslaglæggelse model. De sorte linjer repræsenterer lokale feltet potentielle (LFP) optagelse; de blå linjer repræsenterer lys stimulus. (A) Disse paneler er baseret på resultaterne fra en VGAT-ChR2 musen model. jeg) dette panel viser status epilepticus-lignende betingelser overholdes i LFP optagelse fra det overfladiske lag (2/3) af en kortikale hjernen skive behandlet med nul-Mg2 + ACSF. ii) Dette er en zoomet i visning af en lys-udløst ictal begivenhed. iii) Dette er en zoomet i visning af status epilepticus-lignende bristende aktivitet. (B) disse paneler viser den samme skive optagelse med tilsætning af baclofen. jeg) anvendelse af 5 µM baclofen på nul-Mg2 + ACSF forvandler den brister aktivitet tilbage til særskilt, tilbagevendende ictal begivenheder. ii) Dette er en zoomet i visning af bristende aktiviteten. iii) Dette er en zoomet i visning af den særskilte ictal begivenhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Akut i vitro sprængfyldt/spiking modeller. De sorte linjer repræsenterer lokale feltet potentielle (LFP) optagelse; de blå linjer repræsenterer lys stimulus. (A) disse paneler viser resultaterne fra en kortikale skive fra en VGAT-ChR2mouse, illustrerer den brister aktivitet observeret i de overfladiske lag (2/3) efter tilsætning af 10 µM BMI for 100 µM 4AP. jeg) Dette er en oversigt over LFP optagelse. Den prikkede røde linje angiver, hvornår BMI trådte i kraft. ii) Dette er en zoomet i visning af en lys-udløst ictal begivenhed. iii) Dette er en zoomet i visning af den spontane bristende aktivitet. (B) disse paneler viser resultaterne fra en hippocampus skive fra en VGAT-ChR2 mus, illustrerer en status epilepticus-lignende begivenhed observeret i området CA3 efter anvendelse af 100 µM 4AP. i) Dette er en oversigt over LFP optagelse. ii) Dette er en zoomet i visning af en ictal begivenhed. iii) Dette er en zoomet i visning af lys-udløste og spontane sprængfyldt begivenheder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Akut i vivo 4-AP kortikale beslaglæggelse model. De sorte linjer repræsenterer lokale feltet potentielle (LFP) optagelse; de blå linjer repræsenterer lys stimulus. (A) disse paneler viser resultaterne af en voksen (p56) VGAT-ChR2 musen model med 1,5 mM 4-AP topikalt til udsatte cortex. jeg) dette panel viser en lys-udløst ictal begivenhed observeret i de overfladiske lag (2/3) af området somatosensoriske-motor. ii) Dette er en zoomet i visning af den lys-udløst ictal hændelse fra panelet Ai. iii) Dette er en super zoomet i visning af udbrud af lys-udløst ictal begivenheden (angivet med en sort pil). Dette tal er den ufiltrerede version af en figur fra Chang et al. 16. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Akut in vitro- humane kortikale beslaglæggelse model. De sorte linjer repræsenterer lokale feltet potentielle (LFP) optagelse; de brune linjer repræsenterer picospritzer puff. (A) disse paneler viser resultaterne af en kortikale hjernen skive fra en mediale tindingelappen epilepsi (MTLE) patienten, illustrerer de ictal begivenheder observeret i de overfladiske lag (2/3) følger en perfusion med 100 µM 4-AP og nul-Mg2 + menneskelige ACSF . jeg) Dette er en oversigt over LFP optagelse. De følgende paneler Vis ii) zoomet i udsigt over en 100 mM GABA puff-udløst ictal begivenhed og iii) en zoomet på baggrund af en spontan ictal begivenhed. (B) disse paneler viser resultaterne af en kortikale hjernen skive fra en anden MTLE patient, illustrerer de ictal begivenheder observeret i de overfladiske lag (2/3) følger en perfusion med 100 µM 4-AP og nul-Mg2 + menneskelige ACSF. jeg) Dette er en oversigt over LFP optagelse. De følgende paneler Vis ii) zoomet i udsigt over en 200 µM glutamat puff-udløst ictal begivenhed og iii) en zoomet på baggrund af en spontan ictal begivenhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: opskrift på dissektion løsning. Disse er de instruktioner for at 1 L eller 2 L diskenheder. MW = molekylevægt af opløst stof.

# Reagens Koncentreret [mM] MW (g/mol) 1L (g) 2L (g)
1 Saccharose 248 342.3 84.89 169.78
2 Natriumbicarbonat (NaHCO2) 26 84.01 2.18 4.37
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 1.8 3.6
4 Kaliumchlorid (KCl) 2 74.55 0,15 0,3
5 Magnesium-sulfat (MgSO4·7H2O) 3 246.47 0,74 1,48
6 Natriumfosfat monobasic monohydrat (H2NaPO4· H2O) 1,25 137.99 0,17 0,34
7 Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,15 0,29

Tabel 2: opskrift på gnavere kunstige cerebral spinalvæske (ACSF). Disse er de instruktioner for at 2 L eller 4 L diskenheder. MW = molekylevægt af opløst stof.

# Reagens Koncentreret [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumchlorid (NaCl) 123 58,4 14,37 28.73
2 Natriumbicarbonat (NaHCO2) 26 84.01 4.37 8.74
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7,21
4 Kaliumchlorid (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnesium-sulfat (MgSO4· H2O) 1.3 246.47 0,64 1.28
6 Natriumfosfat monobasic monohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0.66
7 Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0,44 0,88

Tabel 3: opskrift på menneskelige kunstige cerebral spinal væske (human ACSF). Disse er de instruktioner for at 2 L eller 4 L diskenheder. MW = molekylevægt af opløst stof.

# Reagens Koncentreret [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumchlorid (NaCl) 123 58,4 14.38 28.75
2 Natriumbicarbonat (NaHCO2) 25.2 84.01 4.23 8.46
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7,21
4 Kaliumchlorid (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnesium-sulfat (MgSO4· H2O) 1 246.47 0,49 0,99
6 Natriumfosfat monobasic monohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0.66
7 Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,29 0,59

Tabel 4: opskrift på nul-Mg 2 + gnaver kunstige cerebral spinalvæske (nul-Mg2 + ACSF). Disse er de instruktioner for at 2 L eller 4 L diskenheder. MW = molekylevægt af opløst stof.

# Reagens Koncentreret [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumchlorid (NaCl) 123 58,4 14,37 28.73
2 Natriumbicarbonat (NaHCO2) 26 84.01 4.37 8.74
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7,21
4 Kaliumchlorid (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnesium-sulfat (MgSO4· H2O) Nominelt gratis 246.47 0 0
6 Natriumfosfat monobasic monohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0.66
7 Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0,29 0,59

Tabel 5: opskrift på nul-Mg 2 + menneskelige kunstige cerebral spinalvæske (nul-Mg2 + human ACSF). Disse er de instruktioner for at 2 L eller 4 L mængder; MW = molekylevægt af opløst stof.

# Reagens Koncentreret [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumchlorid (NaCl) 123 58,4 14.38 28.75
2 Natriumbicarbonat (NaHCO2) 25.2 84.01 4.23 8.46
3 Dextrose (D-glucose) 10 180.16 3.6 7,21
4 Kaliumchlorid (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnesium-sulfat (MgSO4· H2O) Nominelt gratis 246.47 0 0
6 Natriumfosfat monobasic monohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0.66
7 Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,29 0,59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjernen skiver er behandlet med et proconvulsant lægemiddel eller en ændret ACSF perfusate til at øge det neurale netværk ophidselse og fremme en udfældning af ictal begivenheder (electrographic beslaglæggelse-lignende begivenheder). For mus, bør foretrukne koronale skiver af området somatosensoriske-motor indeholde cingulate cortex, område 2 (CG), men ikke retrosplenial området (RS); disse anatomiske markører hjælpe med at identificere rækken af koronale skiver, der er bedst for inducerende ictal begivenheder. En valgfri modifikation for mus væv er til at skære de to halvdele af hjernen skive i halvdelen af matchede par eksperimentelle design, som de to hjernehalvdele er næsten identisk (lignende eksperimentelle enheder). Når du forbereder hjernen skiver til at generere ictal begivenheder, er det bydende nødvendigt at bevare integriteten af de neurale netværk og dets synaptiske forbindelser, fordi ictal begivenheder er en neurale netværk fænomen. Tre punkter i trin 1 i protokollen, der er kritiske for skive kvalitet er 1) udskæring procedure, 2) inkubation, og 3) iltning. For det første kræver den udskæring procedure en balance mellem hastighed og teknik. Det er afgørende at minimere tiden mellem halshugning (eller kirurgisk resektion) og inkubation, samtidig også være forsigtig med hver kontaktperson og bevægelse af hjernen skive for at undgå skader. For det andet, kvaliteten af væv er meget følsomme over for inkubation temperatur og varighed. Det er vigtigt at bruge en timer og termometer til at sikre inkubationen er ved 35 ° C i 30 min. for det tredje, levedygtigheden af hjernevæv er følsomme over for eksponering til andet end iltet (kunstige) cerebral spinalvæske. Hjernen skive udløber, hvis det ikke er perfunderet med carbogenated ACSF i en længere periode (~ 1 min).

Hjernen skiver fra mus lagret p13 - p16 tilbyder den højeste sandsynlighed af korrekt produktionsanlæggene ictal begivenheder. Årsagen er, at mus ≤ p16 ikke kræver en transcardial perfusion før dissektioner. Dette effektivt reducerer risikoen for fejl og fremskynder dissektion proces, som er en kæmpe fordel, fordi mængden tid mellem halshugning og inkubering er omvendt korreleret med hjernen skive levedygtighed. I mellemtiden, mus > p13 har reduceret beløb af NKCC1, der er sammenlignelige med en voksen36. I almindelighed, juvenil (< p21) væv er mere holdbar end voksne væv på grund af en ekstraordinær evne til at tilbagesøge den skadelige udskæring procedure. Denne uge-lang vindue mellem p13 og p21 tilbyder mulighed for at udnytte mus voksen-lignende fysiologi og juvenile-lignende evne til at nemt generere ictal begivenheder37,38. Men hvis eksperimenter har brug for at studere ictal begivenheder i hjernen skiver fra voksne mus, en NMDG-baseret ACSF med HEPES, thiourinstof og Ascorbat vil bidrage til at fremme levedygtigheden af voksen væv24,39,40, 41. for humant væv, tilsætning af antioxidanter, såsom α-tocopherol, til dissektion løsning kan gavne væv levedygtighed, især under langdistance transport (> 30 min.) mellem operationsstuen og laboratorium for udskæring8,26. For alle hjernen skiver er de gunstige betingelser til at generere ictal begivenheder at optage fra 450 µm tykke skiver på 36 ° C. Hjernen skiver skal være mindst 350 µm tykt indeholder nok neuroner i de neurale netværk til at generere den strukturerede ictal begivenhed. Dog skiver ikke være tykkere end 500 µm, da det vil gøre det vanskeligt for ilt til diffuse ind i midten af væv. Udsnit, der er 450 µm repræsenterer en optimal tykkelse, hvor en rigelig mængde af neuronal netværk connectivity vedligeholdes uden at hæmme perfusion af ilt i vævet. Endelig er udfældning af ictal begivenheder optimal ved 33-36 ° C; Hvis optagelsen kammer ikke er mindst 33 ° C, vil det være vanskeligt for ictal begivenheder at forekomme.

En begrænsning af den akutte anfald model er, at de ikke skaber anfald. De genererer kun ictal begivenheder, som er den electrographic underskrift af en beslaglæggelse. Ictal begivenheder har ingen tilknyttede adfærdsmæssige komponenter, såsom tab af bevidsthed eller motor kramper, der definerer en beslaglæggelse. Derfor kan ikke akut anfald modeller bruges til at bekræfte effektiviteten af potentielle ansøgere, Anti-beslaglæggelse medicin eller få indsigt i epileptogenesis; Sådan forskningsspørgsmål bør behandles af kronisk epilepsi modeller og kliniske forsøg. Akut anfald modeller bør kun anvendes til deres formaal udfører grundlæggende forundersøgelser på beslaglæggelse mekanismer. Kun de mest lovende fund fra akutte anfald modeller bør fremmes på højere modeller, der er dyrere, besværlige at forberede, og kræver meget mere komplekse etiske overvejelser.

For at gøre fremskridt inden for epilepsi og beslaglæggelse forskning, er det afgørende at have en pålidelig akut anfald model, der kan præcist replikerer den electrographic beslaglæggelse aktivitet observeret klinisk i EEG beslaglæggelse patienter. Til at pålideligt reproducere ictal begivenheder i hjernen skiver, er ikke-disinhibition metoder til at øge ophidselse påkrævet, mens metoder af disinhibition (dvs., GABAA receptor antagonist BMI) typisk resultere i spiking aktivitet minder om interictal aktivitet snarere end ictal begivenheder (figur 3A). Den foretrukne metode til ikke-disinhibition bør gælde proconvulsant agent 4-AP, fordi det kan pålideligt generere konsekvent ictal begivenheder for 1 h. Derimod genererer nul-Mg2 + kortikale model ictal begivenheder for kun ~ 10 min før hurtigt omdanne til burst-lignende aktivitet (figur 2A). Hvis nul-Mg2 + modellen, tilsætning af 5-10 µM baclofen, vil en GABAB receptor agonist, bidrage til at omdanne den brister aktivitet tilbage til ictal begivenheder (figur 2B), som tidligere vist i hippocampus skiver42. Derudover foretrækkes in vitro- 4-AP beslaglæggelse model, fordi resultaterne fra denne model kan replikeres i sin i vivo modstykke, i vivo 4-AP kortikale beslaglæggelse model (figur 4). Det er ikke muligt at ændre hele cerebral spinalvæsken af en live voksen mus til at genskabe den akutte i vivo nul-Mg2 + miljø.

Anvendelsen af 4-AP i kortikale hjernen skiver kan nøjagtigt gengive de beslaglæggelse aktivitet observeret klinisk15,33. Derimod er 4-AP-behandlede hippocampus skiver disponeret til at generere interictal-lignende spiking aktivitet43 og status epilepticus-lignende forhold (figur 3B). Således, med henblik på at studere anfald, akut in vitro- 4-AP kortikale model foretrækkes frem for in vitro- 4-AP hippocampus model. Desuden er der stort set ingen muligheder for at optage fra bæredygtige menneskelige hippocampus skiver, som mest hippocampus resektion har CA1 og CA3 beskadiget21. Derimod er ikke-patologiske menneskelige kortikale væv mere let tilgængelige, som er det sekundære resultat af subkortikale neurokirurgiske procedurer såsom frontal-lap epilepsi kirurgi. Non-epileptiske 'kontrol' neocortical væv kan også erhverves fra tumor resektion operationer. Af disse grunde er cortex det foretrukne site for modellering beslaglæggelse aktivitet på grund af dens transporterbart mellem mus og humant væv til at bekræfte klinisk relevans. Endelig, C57BL/6 stamme af mus foretrækkes fordi de let express transgener, og optogenetic varianter er kommercielt tilgængelige. Optogenetic mus modeller giver mulighed for on demand indledningen af ictal begivenheder via en minimalt invasiv, kort lys stimulation. Dette gør studiet af anfald utrolig effektivt ved at fjerne ventetider og giver mulighed for målrettet aktivering af neuronal delpopulationer. Desuden evnen til at udløse anfald on demand giver mulighed for nye måder at endeligt afgrænse det nøjagtige punkt om beslaglæggelse indledning og potentielt undersøgelse af Anti-beslaglæggelse lægemiddelkandidater. En brugervenlig MATLAB-baserede program er specielt udviklet til at registrere og klassificere de forskellige typer af epileptiform hændelser, der opstår i in vitro- og in vivo 4-AP beslaglæggelse modeller. Denne afsløring program er tilgængelig for download fra Valiante Lab's GitHub opbevaringssted (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af canadiske institutter for sundhedsforskning (MOP 119603 Peter L. Carlén og Taufik A. Valiante), Ontario Brain-instituttet (til Taufik A. Valiante) og Mightex studerende forskning tilskud (til Michael Chang). Vi vil gerne takke Liam Long for sin bistand i filme video håndskriftet. Vi vil gerne anerkende Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran og Shadini Dematagoda for deres hjælp i udarbejdelsen af de figurer og tabeller i dette håndskrift. Tal 1A, 3A, 4A, og 6A er alle originale figurer lavet af data offentliggjort i Chang et al. 16.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium pentobarbital N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe N/A N/A Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle N/A N/A Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue N/A N/A Purchased through UT Med Store
Lens paper N/A N/A Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula N/A N/A Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end N/A N/A Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0 N/A N/A Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer N/A N/A Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital) N/A N/A Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2 N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome Leica N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)  Scientific Systems Design Inc N/A
Sodium Chloride (NaCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dextrose N/A N/A Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sucrose N/A N/A Purchased through UT Med Store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19, (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53, (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81, (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342, (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22, (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31, (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511, (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50, (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95, (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30, (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137, (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88, (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55, (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25, (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1, (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61, (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42, (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31, (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7, (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23, (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468, (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7, (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26, (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303, (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410, (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50, (1), 98-110 (2006).
Generation og On-Demand indledning af akut Ictal aktivitet i gnaver og menneskeligt væv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).More

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter