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Neuroscience

उत्पादन और मांग पर मूषक और मानव ऊतक में तीव्र Ictal गतिविधि की दीक्षा

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/57952
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2,3,5,6, 1,2,3,4
1Division of Fundamental Neurobiology, Krembil Research Institute, 2Institute of Medical Science, Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Division of Neurosurgery, Department of Surgery, University of Toronto, 5Division of Neurology, Department of Medicine, University of Toronto, 6Department of Physiology, University of Toronto

Summary

तीव्र जब्ती मॉडल epileptiform घटनाओं अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, पर epileptiform घटनाओं उत्पंन करने की क्षमता मांग एक उच्च कुशल विधि को अपनी दीक्षा अंतर्निहित घटनाओं के सटीक अनुक्रम का अध्ययन प्रदान करता है । यहां, हम तीव्र 4-aminopyridine cortical जब्ती मॉडल माउस और मानव ऊतक में स्थापित वर्णन ।

Abstract

जब्ती नियंत्रण चिकित्सा समुदाय के लिए एक चुनौतीपूर्ण मुद्दा बना हुआ है । प्रगति करने के लिए, शोधकर्ताओं के लिए एक तरह से बड़े पैमाने पर अध्ययन की गतिशीलता और इसकी अंतर्निहित तंत्र की जांच की जरूरत है । तीव्र जब्ती मॉडल सुविधाजनक हैं, electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने की क्षमता प्रदान करते हैं, और electrographic जब्ती की तरह (ictal) की घटनाओं की एक बड़ी मात्रा उत्पंन कर सकते हैं । तीव्र जब्ती मॉडल से आशाजनक निष्कर्षों तो पुरानी मिर्गी मॉडल और नैदानिक परीक्षणों के लिए उन्नत किया जा सकता है । इस प्रकार, तीव्र मॉडलों में बरामदगी का अध्ययन है कि ईमानदारी से electrographic और एक नैदानिक जब्ती के गतिशील हस्ताक्षर दोहराने चिकित्सकीय प्रासंगिक निष्कर्षों को बनाने के लिए आवश्यक हो जाएगा । तीव्र जब्ती मानव ऊतक से तैयार मॉडल में ictal घटनाओं का अध्ययन निष्कर्ष है कि नैदानिक प्रासंगिक बनाने के लिए भी महत्वपूर्ण है । इस पेपर में प्रमुख फोकस cortical 4 पर है-एपी दोनों में vivo और इन विट्रो स्टडीज में ictal घटनाओं पैदा करने में अपनी बहुमुखी प्रतिभा के कारण मॉडल, के रूप में अच्छी तरह के रूप में दोनों माउस और मानव ऊतक में । इस पत्र में तरीके भी जब्ती की एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करेंगे शूंय का उपयोग-मिलीग्राम2 + मॉडल और लाभ और epileptiform की सीमाओं के विभिंन तीव्र में उत्पंन गतिविधि की एक विस्तृत सिंहावलोकन प्रदान जब्ती मॉडल । इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध optogenetic माउस उपभेदों का लाभ लेने के द्वारा, एक संक्षिप्त (30 एमएस) प्रकाश पल्स एक ictal घटना सहज होने वाले लोगों के लिए समान ट्रिगर किया जा सकता है । इसी प्रकार, 30-100 एमएस puffs के न्यूरोट्रांसमीटर (गामा अमीनो Butyric एसिड या ग्लूटामेट) मानव ऊतक करने के लिए लागू किया जा सकता ictal घटनाओं है कि सहज होने वाले लोगों के लिए समान हैं ट्रिगर करने के लिए. तीव्र जब्ती मॉडल में मांग पर ictal घटनाओं को ट्रिगर करने की क्षमता newfound घटनाओं है कि आबाद जब्ती दीक्षा गतिशीलता और कुशलता से संभावित विरोधी जब्ती चिकित्सा का मूल्यांकन के सटीक अनुक्रम का पालन करने की क्षमता प्रदान करता है ।

Introduction

तीव्र जब्ती मॉडल सफलतापूर्वक electrographic हस्ताक्षर ictal घटनाओं की याद ताजा प्रतिलिपि कर सकते है इलॅक्ट्रोसेफेलॉग्राम में मनाया (ईईजी) व्यक्तियों के एक जब्ती का अनुभव । शोधकर्ताओं ने इन ictal की तरह घटनाओं का उपयोग करें (इस के साथ साथ ' के रूप में संदर्भित ictal ' घटनाओं) जब्ती घटना1के लिए किराए के रूप में । चिकित्सकीय, ictal घटनाओं जब्ती की घटनाओं के लिए एक विश्वसनीय प्रॉक्सी के रूप में की सेवा के बाद से बरामदगी एक स्नायविक विकार जो मस्तिष्क से उत्पंन होती हैं । मिर्गी निगरानी इकाई में, न्यूरोलॉजिस्ट मस्तिष्क के epileptogenic क्षेत्र की पुष्टि करने के लिए ictal घटनाओं का पता लगाने और इसे लकीर2के लिए अलग करने पर भरोसा करते हैं । गहन देखभाल इकाई में, चिकित्सकों ictal गतिविधि पर नजर रखने के आकलन के लिए अगर किसी भी जब्ती गतिविधि बेहोश रोगियों में3बनी हुई है । बरामदगी को नियंत्रित करने के लिए चिकित्सा समुदाय के लिए एक चुनौतीपूर्ण मुद्दा बना हुआ है, के रूप में मिर्गी के रोगियों के 30% दवा उपलब्ध दवा के लिए प्रतिरोधी रहे हैं4,5, और दवा प्रेरित बरामदगी शामिल चिकित्सा मामलों के 10% कर रहे हैं मानक उपचार के लिए अप्रतिसादी3। यह समाज के लिए एक गंभीर चिंता का विषय है, के रूप में अमेरिकी आबादी का 10% के लिए अपने जीवनकाल में एक जब्ती घटना अनुभव और 3% के लिए मिर्गी6विकसित होने की उंमीद कर रहे है संभावना है प्रस्तुत करता है ।

पुरानी मिर्गी के मॉडल में बरामदगी का अध्ययन महंगा है, श्रमसाध्य, और अक्सर7तैयार करने के लिए महीनों लग । यह भी मुक्त रूप से चलती जानवरों में electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल है । मानव नैदानिक परीक्षणों के समान मुद्दों का सामना, साथ ही अतिरिक्त रोगी सहमति से संबंधित जटिलताओं, प्रतिभागियों की पृष्ठभूमि में परिवर्तनशीलता, और नैतिक और नैतिक विचार शामिल8। तीव्र जब्ती मॉडल, दूसरी ओर, क्योंकि वे अपेक्षाकृत तैयार, लागत कुशल, और9अध्ययन के लिए ictal घटनाओं की बड़ी मात्रा में पैदा करने में सक्षम सुविधाजनक है अनुकूल हैं । इसके अतिरिक्त, ऊतक एक स्थिर स्थिति में तय हो गया है, तो शर्तों electrophysiological जब्ती गतिशीलता और संबंधित अंतर्निहित pathophysiology अध्ययन करने के लिए आवश्यक रिकॉर्डिंग प्रदर्शन के लिए आदर्श होते हैं । तीव्र जब्ती मॉडल silico (कंप्यूटर) मॉडल में अधिक अनुकूल रहना है क्योंकि वे अपने सभी अंतर्निहित कारकों और synaptic कनेक्टिविटी, कि कब्जा नहीं किया जा सकता है के साथ मस्तिष्क के घटक न्यूरॉन नेटवर्क के शामिल जैविक सामग्री पर आधारित हैं द्वारा भी सबसे विस्तृत कंप्यूटर10मॉडल । इन सुविधाओं तीव्र जब्ती मॉडल बनाने के लिए संभावित विरोधी जब्ती चिकित्सा के लिए स्क्रीनिंग में कुशल हो और उंहें पुरानी मिर्गी मॉडल और नैदानिक परीक्षणों में आगे की जांच के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रारंभिक निष्कर्षों बनाने की ओर अग्रसर ।

आमतौर पर, तीव्र जब्ती मॉडल सामांय मस्तिष्क ऊतक है कि अति उत्तेजित स्थितियों के अधीन किया गया है से प्राप्त कर रहे हैं । स्वस्थ मस्तिष्क के ऊतकों में नैदानिक प्रासंगिक ictal घटनाओं को प्रेरित करने के लिए, यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि मस्तिष्क कार्य एक महत्वपूर्ण राज्य11 में बेहतर जहां उत्तेजना (ई) और निषेध (I)12संतुलित कर रहे हैं । ई के एक व्यवधान-मैं संतुलन अति उत्तेजित जब्ती राज्य में नेतृत्व कर सकते है जिसमें ictal घटनाओं हाला । तदनुसार, इस वैचारिक ढांचे के भीतर, वहां दो प्रमुख रणनीतियों मस्तिष्क स्लाइस में ictal घटनाओं उत्पंन करने के लिए कर रहे है (इनविट्रो में) या पूरे मस्तिष्क में (vivo में) की तैयारी: या तो कम निषेध ("निषेध") या वृद्धि हुई उत्तेजना ("गैर-निषेध") । हालांकि, ictal घटनाओं अत्यधिक आदेश दिया और सिंक्रनाइज़ घटनाओं है कि GABAergic के प्रभाव की आवश्यकता होती है ंयूरॉंस तंत्रिका नेटवर्क गतिविधि आर्केस्ट्रा13,14। इस कारण के लिए, गैर बाधा मॉडल है ictal घटनाओं में पैदा करने के लिए सबसे प्रभावी अलग तंत्रिका नेटवर्क, जैसे एक में इन विट्रो में मस्तिष्क15, जबकि इन विट्रो में निषेध मॉडल आमतौर पर spiking गतिविधि के लिए नेतृत्व interictal की याद ताजा-जैसे spiking. इसके अलावा, इस वैचारिक ढांचे के भीतर, एक क्षणिक तुल्यकालन घटना भी मज़बूती से एक ictal घटना16ट्रिगर कर सकते हैं । वास्तव में, एक ictal घटना किसी भी मामूली तंत्रिका प्रणाली17 पर लागू गड़बड़ी द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है जब यह एक महत्वपूर्ण राज्य संक्रमण ("विभाजन")18बिंदु पर है । परंपरागत रूप से, इन perturbations विद्युत उत्तेजना से प्रेरित थे । तंत्रिका विज्ञान में optogenetics के हाल ही में विकास, तथापि, अब एक और अधिक सुरुचिपूर्ण रणनीति के लिए महत्वपूर्ण राज्य संक्रमण16प्रेरित प्रदान करता है ।

इस पत्र में वर्णित तरीके प्रदर्शित कैसे पर ictal घटनाओं उत्पंन करने के लिए तीव्र जब्ती मॉडल में दोनों विट्रो में मांग ( प्रोटोकॉलके चरण 1) और vivo अध्ययन में ( प्रोटोकॉलके चरण 2) । वे मस्तिष्क क्षेत्र, जब्ती प्रेरण विधि, अध्ययन के प्रकार, और प्रजातियों की पसंद शामिल; हालांकि, ध्यान एक तीव्र 4 की सिफारिश की पसंद पर होगा-एपी cortical जब्ती मॉडल की वजह से अपनी बहुमुखी प्रतिभा के अध्ययन के प्रकार की एक विस्तृत विविधता में । इन विट्रो 4-एपी जब्ती मॉडल में तीव्र electrophysiological रिकॉर्डिंग और इमेजिंग अध्ययन19के लिए उच्च गुणवत्ता वाले मस्तिष्क स्लाइसें तैयार करने के लिए मानक प्रोटोकॉल पर आधारित है । इन प्रोटोकॉल पहले से ही इन विट्रो कोरोनर मस्तिष्क स्लाइसें में बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है somatosensory से16चूहों की मोटर प्रांतस्था,20 और मनुष्यों21. संशोधन मस्तिष्क स्लाइसें के इन प्रकार में ictal घटनाओं उत्पंन करने के लिए पहले16 का प्रदर्शन किया गया है और पूर्ण विवरण के नीचे प्रोटोकॉल में वर्णित हैं । vivo 4-AP cortical जब्ती मॉडल में तीव्र इमेजिंग अध्ययन22के लिए एक craniotomy तैयार करने के लिए मानक प्रोटोकॉल पर आधारित है । संशोधन है कि कोई (ग्लास स्लाइड) विंडो craniotomy के बाद स्थापित किया गया है । इसके बजाय, proconvulsant एजेंटों (4 एपी) सामयिक उजागर प्रांतस्था करने के लिए लागू कर रहे है ictal घटनाओं प्रेरित जबकि पशु सामांय संज्ञाहरण के तहत है । हमारे ज्ञान के लिए, हमारे समूह पहले चूहों16,23में vivo cortical जब्ती मॉडल में इस तीव्र विकसित करने के लिए किया गया था । vivo 4 में एक्यूट-एपी cortical जब्ती मॉडल वयस्क चूहों से तैयार में इन विट्रो पूरक किशोर ऊतक से मॉडल के लिए विकसित किया गया था । vivo जब्ती मॉडल में वयस्क में निष्कर्षों की प्रतिकृति एक 2d मस्तिष्क टुकड़ा की गैर शारीरिक स्थितियों के बारे में निहित चिंताओं को संबोधित करके स्लाइस मॉडल से निष्कर्षों को सामान्य करने में मदद करता है (एक 3 डी पूरे मस्तिष्कबनाम संरचना) और किशोर और वयस्क ऊतक के बीच शारीरिक मतभेद ।

पर मांग ictal घटना दीक्षा की विधि एक picospritzer या optogenetic रणनीतियों के साथ न्यूरोट्रांसमीटर के या तो कश का उपयोग कर प्रदर्शन किया है. हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, हमारे समूह में एक picospritzer16 के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर का उपयोग मानव ऊतक में ictal घटनाओं शुरू करने के लिए पहली बार है. optogenetic रणनीतियों के लिए, C57BL/6 चूहों तनाव transgenes व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया पारंपरिक तनाव है । या तो GABAergic न्यूरॉन्स या glutamatergic पिरामिडीय कोशिकाओं में channelrhodopsin-2 (ChR2) की अभिव्यक्ति संक्षिप्त प्रकाश दालों के साथ मांग पर ictal घटनाओं उत्पन्न करने के लिए वैकल्पिक क्षमता प्रदान करेगा. उपयुक्त optogenetic चूहों उपभेदों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध C57BL/6 संस्करण शामिल है जो या तो न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त करता है, माउस vesicular गाबा ट्रांसपोर्टर मोटर (VGAT)24, या पिरामिडीय कोशिकाओं का उपयोग कर, माउस थाइमस सेल प्रतिजन 1 का उपयोग कर मोटर (Thy1)25. ये व्यावसायिक रूप से उपलब्ध VGAT-ChR2 और Thy1-ChR2 चूहों को GABAergic न्यूरॉन्स या glutamatergic न्यूरॉन्स को सक्रिय करने का अवसर प्रदान करते हैं, क्रमशः, नीले (४७० एनएम) प्रकाश के साथ neocortex में. तीव्र जब्ती मॉडल में मांग पर ictal घटनाओं उत्पंन करने की क्षमता उपंयास अवसर जब्ती दीक्षा गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए और कुशलता से संभावित विरोधी जब्ती चिकित्सा का मूल्यांकन की पेशकश कर सकते हैं ।

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Protocol

सभी रोगियों को शामिल अनुसंधान हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य नेटवर्क अनुसंधान नैतिकता बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया गया । पशुओं को शामिल प्रक्रियाओं कनाडा के पशु देखभाल पर परिषद द्वारा दिशा निर्देशों के अनुसार थे और Krembil अनुसंधान संस्थान पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित ।

1. प्रोटोकॉल मैं: भारी इन विट्रो जब्ती मॉडल

  1. विच्छेदन समाधान और कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव की तैयारी
    1. Carbogenate ultrapure पानी (जो १८.२ MΩ · cm की प्रतिरोधकता के साथ फ़िल्टर किया गया पानी है) carbogen के साथ (९५% O2/5% सह2) 5 मिनट के लिए एयर स्टोन बुलबुला विसारक (एक्वैरियम के लिए aerators) का उपयोग कर ।
      नोट: एयर पत्थर मानक सिलिकॉन टयूबिंग के माध्यम से carbogen टैंक के नियामक से जोड़ा जा सकता है । यदि हवा पत्थर उपलब्ध नहीं हैं, सील सिलिकॉन टयूबिंग के अंत बंद और सील में छोटे छेद प्रहार करने के लिए carbogen गैस बाहर बुलबुला और समाधान carbogenate अनुमति देते हैं ।
    2. ultrapure पानी में 1 टेबल से solutes भंग करके एक विच्छेदन समाधान तैयार करें । CaCl2 जोड़ने के लिए एक समाधान है कि में मदद करने के लिए कम से 5 मिनट के लिए carbogenated गया है भंग ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, CaCl2 पहले जोड़ें, ताकि यह आसानी से एक संतृप्त समाधान में भंग कर सकते हैं । समाधान, तरल रूप में, होना चाहिए ३००-३२० mOsm/L और carbogen के साथ संतृप्त होने के बाद ७.४ के एक पीएच है.
      1. 0-4 डिग्री सेल्सियस के लिए विच्छेदन समाधान ठंडा । रात भर फ्रिज में हल छोड़ दें या 1 घंटे के लिए फ्रीजर में समाधान जगह और लगातार तापमान की निगरानी ।
        नोट: विच्छेदन समाधान 3 रातों तक के लिए संग्रहित किया जा सकता है; बाद में छोड़ें ।
      2. उपयोग करने से पहले 5-10 मिनट के लिए विच्छेदन समाधान Carbogenate ।
        नोट: आदर्श रूप में, समाधान या तो कीचड़ के रूप में दिखाई देते है या करने के लिए उपयोग करने से पहले कीचड़ में संक्रमण होना चाहिए ।
    3. ultrapure पानी में 2 टेबल (या मानव ACSF के लिए तालिका 3 ) से solutes को भंग करके कुतर कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) तैयार करें । Carbogenate ACSF समाधान है, जबकि यह एक पानी के लिए गरम ३५ ° c उपयोग तक स्नान में है । CaCl2 जोड़ने के लिए एक समाधान है कि में मदद करने के लिए कम से 5 मिनट के लिए carbogenated गया है भंग ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, CaCl2 पहले इतना है कि यह आसान एक unsaturat समाधान में भंग कर सकते है जोड़ें । समाधान, तरल रूप में, होना चाहिए २९०-३२० mOsm/L और carbogen के साथ संतृप्त होने के बाद ७.४ के एक पीएच है. समाधान 1, 2, या 4 एल संस्करणों में प्रयोगों की अवधि के आधार पर किया जाना चाहिए । प्रयोगों के एक पूरे दिन (8 ज) के लिए 4 एल बनाओ । ACSF प्रत्येक दिन ताजा किया जाना चाहिए; इसे 1 डी से अधिक समय तक संग्रहीत न करें ।
  2. माउस विच्छेदन मस्तिष्क ऊतक इकट्ठा करने के लिए
    नोट: मानव ऊतक के लिए, vibratome के साथ मस्तिष्क स्लाइस बनाने पर अगले कदम (कदम १.३) के लिए आगे बढ़ें । घन के आकार का ब्लॉक (1 सेमी3) मस्तिष्क ऊतक की प्रक्रियाओं का उपयोग कर न्यूरोसर्जन से प्राप्त किया जाना चाहिए पहले26,27वर्णित है ।
    1. पशु विच्छेदन के लिए आवश्यक सभी उपकरण और सामग्री ले लीजिए । पशु विच्छेदन के लिए तैयार करने के लिए कार्यक्षेत्र सेट करें ।
      1. carbogen टैंक की जांच करें (95% O2/5%CO2) यह सुनिश्चित करने के लिए खाली नहीं है । प्रयोग से पहले गैस सिलेंडर बदलें अगर वहां दबाव शेष के ५०० से कम साई है ।
      2. निर्माता के निर्देश पुस्तिका के अनुसार vibratome (ब्लेड ऊतक स्लाइसर हिल) जांचना । 1 मिमी के काटने के आयाम और ०.१२ mm/s की एक काटने की गति के लिए vibratome सेटिंग को समायोजित करें ।
        नोट: इष्टतम सेटिंग्स प्रत्येक व्यक्ति हिल ऊतक ब्लेड कटर के लिए अलग हो सकता है; हालांकि, सामान्य रूप में, आयाम उच्च होना चाहिए और काटने की गति कम होना चाहिए ।
      3. ACSF के साथ मस्तिष्क स्लाइस मशीन चैंबर (यानी, मस्तिष्क टुकड़ा कीपर) भरें और carbogen के साथ बुलबुला । फिर एक पानी स्नान ३५ डिग्री सेल्सियस पर सेट में मशीन चैंबर जगह है ।
        नोट: मानव मस्तिष्क स्लाइसों के लिए मूषक मस्तिष्क स्लाइस और मानव ACSF के लिए मूषक ACSF का उपयोग करें ।
    2. या तो सेक्स के एक किशोर माउस प्राप्त 13 डी (p13) की उंर के बीच 21 डी (p21, जहां p0 जंम की तारीख है) ।
    3. Anesthetize सोडियम pentobarbital के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस (शरीर के वजन के ५५ मिलीग्राम/ एक बार माउस गहरी anesthetized है, के रूप में पैर की अंगुली चुटकी पलटा के अभाव द्वारा संकेत दिया, तुरंत एक डॉक्टर-अनुमोदित गिलोटिन साधन का उपयोग करने के लिए एक तेज आंदोलन में माउस decapitate ।
      नोट: संस्थागत दिशानिर्देशों द्वारा अनुशंसित प्रक्रियाओं के अनुसार सोडियम pentobarbital इंजेक्शन तैयार करें.
    4. माउस की नाक पकड़ो decapitated सिर को स्थिर करने और धीरे से एक midline चीरा माउस की आंखों के बीच शुरू करने और खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए खोपड़ी की पूरी लंबाई के साथ बनाने के लिए । सुनिश्चित करें कि खोपड़ी रेजर द्वारा लागू दबाव से संकुचित नहीं है । कट परिशुद्धता बढ़ाने के लिए उस्तरा के किनारे के कोने का उपयोग करें ।
    5. उंगलियों का उपयोग कर खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए माउस खोपड़ी के फ्लैप के अलावा फैला. फिर, खोपड़ी के midline के साथ एक चीरा बनाने के लिए एक उस्तरा के किनारे के ताजा कोने का उपयोग करें; मस्तिष्क प्रांतस्था के साथ किसी भी संपर्क से बचने के लिए सावधान ध्यान देना ।
    6. decapitated सिर को स्थिर करने और ठंडे (0-4 ° c) भंग समाधान के साथ भरा एक पेट्री डिश में जगह के लिए माउस की आंख कुर्सियां में किरच संदंश डालें । सुनिश्चित करें कि सिर विच्छेदन समाधान में पूरी तरह से जलमग्न है ।
    7. किरच संदंश के एक दूसरे सेट का उपयोग करने के लिए धीरे दूर है माउस खोपड़ी छील, नाक की हड्डी इसे छील द्वारा हटाने के लिए, और खोपड़ी के पीछे (caudal पक्ष) हटा दें ।
      नोट: किशोर चूहों की नाक की हड्डी बहुत नरम और आसानी से टूट जाता है ।
    8. ऑप्टिक नसों, रंग नसों, और रीढ़ की हड्डी में कटौती करने के लिए एक माइक्रो का उपयोग करें । फिर, सूक्ष्म रंग का उपयोग करने के लिए धीरे cranium से मस्तिष्क को अलग । विच्छेदन समाधान से भरी पेट्री डिश में मस्तिष्क को पूरी तरह से जलमग्न छोड़ दें ।
  3. somatosensory-मोटर प्रांतस्था से cortical स्लाइस की तैयारी
    1. vibratome के बफर ट्रे के साथ भरें ~ ठंड (0-4 ° c) के १५० एमएल विच्छेदन समाधान ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया के दौरान एक कम तापमान बनाए रखने के लिए जरूरत तक फ्रीजर में बफर ट्रे रखें ।
    2. गोंद vibratome मंच (नमूना धारक/तत्काल चिपकने वाला गोंद का उपयोग कर पर माउस या मानव से मस्तिष्क ऊतक । चूहों के लिए, मस्तिष्क के एक छोटे से caudal भाग (यानी, सेरिबैलम) में कटौती ताकि यह आसानी से नमूना धारक पर फ्लैट चिपके जा सकता है (मस्तिष्क के rostral पक्ष को छत का सामना करने की अनुमति) ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, क्षैतिज माउस मस्तिष्क स्लाइसें नमूना धारक पर मस्तिष्क के पृष्ठीय पक्ष gluing द्वारा तैयार किया जा सकता है (मस्तिष्क के ventral पक्ष छत का सामना करना चाहिए)28.
    3. धीरे बफर ट्रे में (मस्तिष्क ऊतक के साथ) नमूना धारक जगह है । सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क के पृष्ठीय भाग vibratome के ब्लेड का सामना करना पड़ रहा है ।
      नोट: यह समय मस्तिष्क हवा के संपर्क में है की मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  4. मस्तिष्क ऊतक अनुभाग और संग्रह
    1. पृष्ठीय ventral दिशा में vibratome का उपयोग कर ४५० माइक्रोन मोटी स्लाइस में मस्तिष्क स्लाइस । सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क पूरी तरह से नमूना ट्रे के लिए लंगर डाला रहता है, जबकि यह टुकड़ा करने की क्रिया ।
      1. घ्राण बल्ब को हटाने के लिए माउस ब्रेन में पहली कटौती करें । फिर, जब तक somatosensory-मोटर क्षेत्र मनाया जाता है (लगभग घ्राण बल्ब और bregma के बीच आधे रास्ते में स्थित) बाद में कटौती करते हैं ।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, मस्तिष्क के कोरोनरी दृश्य में प्रकट होता है, जो इंगित करता है कि somatosensory-मोटर क्षेत्र के करीब है जब तक कि कॉर्पस (२०० माइक्रोन) स्लाइस में ब्रेन स्लाइस ।
    2. कोरोनरी स्लाइस (४५० माइक्रोन) एकत्र करने के लिए वाइड-बोर ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करें जिसमें somatosensory-मोटर क्षेत्र शामिल है और उन्हें पेट्री डिश जिसमें कोल्ड (0-4 ° c) विच्छेदन समाधान में विलीन करना है ।
    3. एक नया उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें और स्लाइस से किसी भी अतिरिक्त ऊतक काट । चूहों से कोरोनरी स्लाइस के लिए, बस neocortical संयोजिका के नीचे एक अनुप्रस्थ कटौती प्रदर्शन (यानी, कॉर्पस महासंयोजिका). एक काटने का कार्य गति में कटौती मत करो; बस ऊतक में ब्लेड पर दबाव लागू करते है और एक का ब्यौरा ब्रश का उपयोग करने के लिए धीरे ऊतक अलग । करने के लिए राज्याभिषेक टुकड़ा के आंदोलन को कम करने के लिए सुनिश्चित करें ।
    4. neocortex (परत 1-6) वाले एक दूसरे पेट्री डिश (३५ ° c) एक पल के लिए ACSF (~ 1 s) के लिए एक दूसरे को गर्म करने के लिए शामिल है कि राज्याभिषेक स्लाइस के पृष्ठीय भाग हस्तांतरण करने के लिए एक व्यापक बोर हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें । तो, तुरंत एक मशीन गर्म (३५ डिग्री सेल्सियस) carbogenated ACSF युक्त कक्ष में स्लाइस हस्तांतरण ।
      नोट: ACSF के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरण के प्रयोजन के लिए मशीन कक्ष के लिए विच्छेदन समाधान के हस्तांतरण को कम करने के लिए है, जबकि व्यापक बोर पिपेट के साथ मस्तिष्क स्लाइस हस्तांतरण । विभिंन मस्तिष्क स्लाइस व्यवस्थित रखने के लिए मशीन चैंबर के कई कुओं का उपयोग ।
    5. संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार शेष मस्तिष्क और पशु लोथ को त्यागें.
  5. मशीन और रखरखाव
    1. मस्तिष्क स्लाइसें थोड़ा ३५ ° c पर 30 मिनट के लिए मशीन कक्ष में जलमग्न छोड़ दें । फिर, पानी स्नान से गर्मी चैंबर निकालें और यह कमरे के तापमान (20-25 डिग्री सेल्सियस) पर लौटने के लिए अनुमति देते हैं । electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन से पहले ठीक करने के लिए मस्तिष्क स्लाइस के लिए 1 घंटे रुको.
      नोट: सुनिश्चित करें कि वहां कोई हवा बुलबुले कि मशीन चैंबर में मस्तिष्क स्लाइसें के नीचे इकट्ठा कर रहे हैं । एयर बुलबुले हवा इंटरफेस है कि ऊतकों को नुकसान का कारण हैं । माउस मस्तिष्क स्लाइसें 6-8 ज के लिए बनाए रखा जा सकता है, जबकि मानव मस्तिष्क के ऊतकों को उचित ACSF के साथ एक अच्छी तरह से carbogenated मशीन चैंबर में 24 घंटे के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  6. सतही cortical लेयर की Electrophysiological रिकॉर्डिंग
    नोट: Ictal घटनाओं मस्तिष्क स्लाइस से extracellular स्थानीय क्षेत्र संभावित (LFP) रिकॉर्डिंग में मनाया जाता है । मस्तिष्क टुकड़ा के LFP और देखा जा सकता है या तो एक अंतरफलक प्रकार चैंबर29 या एक जलमग्न बहु इलेक्ट्रोड सरणी (मेे)16प्रणाली के साथ दर्ज की गई । प्रक्रिया पहले16 वर्णित किया गया है और अतिरिक्त विवरण नीचे वर्णित हैं ।
    1. एक व्यापक बोर हस्तांतरण पिपेट या एक का ब्यौरा ब्रश का प्रयोग थोड़ा बड़ा पूर्व कट लेंस कागज कि जगह में आयोजित किया जाता है पर एक मस्तिष्क टुकड़ा स्थानांतरित करने के लिए एक दंत नोचना का उपयोग । लेंस पेपर स्थानांतरण (है कि मस्तिष्क टुकड़ा पर आराम कर रहा है) रिकॉर्डिंग चैंबर के लिए और एक वीणा स्क्रीन के साथ स्थिति में सुरक्षित ।
    2. चलाएं गर्म (३५ ° c), carbogenated ACSF perfusate रिकॉर्डिंग चैंबर के माध्यम से 3 मिलीलीटर/मिनट की दर पर मस्तिष्क टुकड़ा पर (~ 1 ड्रिप/ ३३-36 डिग्री सेल्सियस रिकॉर्डिंग चैंबर सुनिश्चित करने के लिए एक डिजिटल थर्मामीटर का प्रयोग करें ।
    3. borosilicate ग्लास टयूबिंग से 1-3 MΩ के एक प्रतिबाधा के साथ ग्लास इलेक्ट्रोड खींचो (१.५ मिमी के एक बाहरी व्यास के साथ) एक खींचने का उपयोग कर. Backfill ACSF के साथ कांच इलेक्ट्रोड (~ 10 µ एल) एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर. टिप क्षतिग्रस्त है, तो तुरंत इलेक्ट्रोड छोड़ें ।
      नोट: ब्लीच चांदी के तार (5 मिनट) और केवल एक ंयूनतम भाग की अनुमति (यानी, चांदी के तार के टिप) वापस ACSF में जलमग्न हो गिलास इलेक्ट्रोड को शोर और रिकॉर्डिंग के दौरान बहाव को कम करने के लिए भरा हुआ है । यदि आवश्यक हो तो एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ कांच इलेक्ट्रोड से किसी भी अतिरिक्त ACSF निकालें.
    4. एक 20X स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सही रिकॉर्डिंग गिलास सतही cortical परत (2/3) में इलेक्ट्रोड मैनुअल जोड़तोड़ का उपयोग गाइड । रिकॉर्ड/मानक सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर पर मस्तिष्क टुकड़ा की विद्युत गतिविधि देखें ।
      नोट: व्यवहार्य (उच्च गुणवत्ता) मस्तिष्क स्लाइसें लागू विद्युत उत्तेजनाओं के जवाब में एक मजबूत पैदा की क्षमता का प्रदर्शन करेंगे (१०० µs, 30-300 μA) या हल्की दालें (30 ms, 10 मेगावाट/mm2) optogenetic ऊतक के लिए ।
  7. बरामदगी की तरह गतिविधियों की प्रेरण
    1. Perfuse ACSF युक्त १०० µ एम 4-मस्तिष्क स्लाइस पर aminopyrimidine (4 एपी) । भंग ८० 4 के मिलीग्राम-एपी पानी की ८.५ मिलीलीटर में १०० मिमी 4-एपी का एक शेयर समाधान बनाने के लिए । १०० mm 4 के १०० µ l जोड़ें-एपी स्टॉक समाधान १०० मिलीलीटर ACSF के लिए १०० µ m 4-एपी के साथ एक ACSF perfusate प्राप्त करने के लिए ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, का उपयोग करें शूंय मिलीग्राम2 + ACSF (तालिका 4), एक संशोधित ACSF समाधान शामिल नहीं जोड़ा मिलीग्राम2 +, perfuse करने के लिए मस्तिष्क टुकड़ा । मानव ऊतक के लिए, शून्य में १०० µ m 4-एपी का एक संयोजन का उपयोग करें-मिलीग्राम2 + मानव ACSF (तालिका 5) इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए. ictal ईवेंट्स को प्रकट होने के लिए औसत समय 15 min; हालांकि, यह कुछ मस्तिष्क स्लाइस के लिए ४० मिनट तक लग सकते हैं ।
  8. मांग पर जब्ती जनरेशन: optogenetic चूहों के लिए एक optogenetic रणनीति
    1. एक ictal घटना शुरू करने के लिए (एक न्यूनतम 1 मेगावाट/मिमी2 उत्पादन तीव्रता के साथ) नीले (४७० एनएम) प्रकाश की एक संक्षिप्त (30 एमएस) पल्स लागू करें । एक १,००० µm कोर व्यास ऑप्टिकल फाइबर (०.३९ ना) सीधे रिकॉर्डिंग क्षेत्र के ऊपर की स्थिति के लिए एक मैनुअल जोड़तोड़ का प्रयोग करें ।
      नोट: ictal घटना पुनरावृत्ति की वांछित दर से मेल करने के लिए फोटो-उत्तेजना की दर निर्धारित (यानी, 1 पल्स हर ५० s). हालांकि, दर पीढ़ी से नहीं किया जा सकता है कि आंतरिक दर पर ictal घटनाओं हो अतिरंजित ।
  9. मांग पर जब्ती पीढ़ी: एक गैर मानव ऊतक के लिए optogenetic रणनीति
    1. स्थिति मस्तिष्क टुकड़ा इतना है कि सतही परतों नदी के ऊपर हैं, और गहरी परतों रिकॉर्डिंग चैंबर के माध्यम से perfusate के प्रवाह के लिए बहाव कर रहे हैं ।
    2. एक गिलास इलेक्ट्रोड खींचो (LFP रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल के रूप में एक ही प्रकार) और धीरे एक छोटे से खोलने बनाने के लिए एक नाजुक कार्य वाइपर के साथ अपनी टिप को छूने. Backfill के साथ इलेक्ट्रोड ~ 25 µ l के १०० mM गाबा (पानी में भंग) और यह picospritzer करने के लिए संलग्न. वैकल्पिक रूप से, backfill इलेक्ट्रोड के साथ २०० µ m ग्लूटामेट (पानी में भंग) ।
      नोट: मात्रा अनुमान picospritzer (~ ५० µ एल) से फूला जा रहा है, एक प्लास्टिक की थाली पर एक परीक्षण कश लागू (अधिमानतः gridded) । फिर, ज्ञात खंड (यानी, 10 µ एल, 20 µ एल, ५० µ एल, या १०० µ एल) की एक छोटी बूंद परीक्षण पफ के साथ एक तुलना के लिए एक पिपेट के साथ लागू होते हैं ।
    3. एक ictal घटना शुरू करने के लिए एक picospritzer (30-100 ms के लिए 10-20 साई) के साथ न्यूरोट्रांसमीटर के puffer (गाबा या ग्लूटामेट) मानव ऊतक के लिए लागू होते हैं । सतह परत (2/3) में ictal घटनाओं उत्पन्न करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों की गहरी परत (5) पर १०० mM गाबा का एक एकल कश लागू करें । वैकल्पिक रूप से, सतही परत में ictal घटनाओं को उत्पन्न करने के लिए सतही परत पर सीधे २०० µ एम ग्लूटामेट का एक पफ लागू करें ।
      नोट: ictal घटना पुनरावृत्ति (यानी, 1 पल्स हर ५० s) की वांछित दर मैच के लिए picospritzer पफ की दर निर्धारित करें । हालांकि, दर पीढ़ी से नहीं किया जा सकता है कि आंतरिक दर पर ictal घटनाओं हो अतिरंजित ।

2. प्रोटोकॉल द्वितीय: vivo जब्ती मॉडल में तीव्र

  1. सर्जिकल तैयारी और सर्जरी
    1. या तो सेक्स के एक वयस्क माउस (p35-p60) प्राप्त करें ।
    2. Ketamine के साथ गहराई से anesthetize माउस (९५ मिलीग्राम/) और Xylazine (5 मिलीग्राम/ माउस को बेहोश कर रहा है सुनिश्चित करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी पलटा परीक्षण प्रदर्शन । वैकल्पिक रूप से, उपयोग isoflurane (प्रेरण के लिए 4%, शल्य चिकित्सा के लिए १.५-2%) माउस anesthetize करने के लिए ।
      नोट: निश्चेतक की पसंद जब्ती गतिविधि30,31को प्रभावित कर सकते हैं ।
    3. कान सलाखों के साथ अपने सिर को सुरक्षित करके एक stereotaxic फ्रेम में माउस माउंट । सर्जरी की अवधि के लिए माउस के नीचे एक गर्म पैड रखें ।
    4. है माउस सिर के ऊपर एक चूहा trimmer का उपयोग करने खोपड़ी बेनकाब दाढ़ी । अत्यधिक रक्तस्राव या दर्द से बचने के लिए periosteum में सुई में 25 ग्राम 5/8 के साथ lidocaine के ०.३ मिलीलीटर सुई । प्रयोग के दौरान बाहर सुखाने से रोकने के लिए माउस की आंखों के लिए आंख मरहम लागू करें ।
    5. चुटकी और माउस खोपड़ी के केंद्र लिफ्ट का आकलन करने के लिए अगर अपनी सजगता चले गए हैं । इसके बाद, खोपड़ी के लैंब्डा क्षेत्र के लिए bregma को बेनकाब करने के लिए एक क्षैतिज कटौती करते हैं । धीरे एक सूखी सतह बनाने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ खोपड़ी के पूरे उजागर क्षेत्र परिमार्जन ।
    6. craniotomy में 4 मिमी व्यास में निर्देशांक २.० मिमी lateromedial और-२.० मिमी rostrocaudal somatosensory प्रांतस्था को बेनकाब करने के लिए प्रदर्शन. एक चक्र के साथ स्थान चिह्नित (व्यास में 4 मिमी) एक स्थायी मार्कर का उपयोग. craniotomy हड्डी की शेष परत को आसानी से जब नीचे धकेल दिया जब तक एक वायवीय चिकित्सकीय ड्रिल के साथ सर्कल के आसपास ड्रिल । किरच संदंश के साथ craniotomy को हटाने से पहले हड्डी की परत पर खारा समाधान लागू करें । बाद में, उजागर क्षेत्र के लिए गर्म खारा समाधान लागू होते हैं ।
  2. रिकॉर्डिंग तरीकों और रासायनिक बरामदगी के प्रेरण
    1. borosilicate ग्लास टयूबिंग से 1-3 MΩ के एक प्रतिबाधा के साथ ग्लास इलेक्ट्रोड खींचो (१.५ मिमी के एक बाहरी व्यास के साथ) एक खींचने का उपयोग कर. Backfill एक हैमिल्टन सिरिंज का उपयोग कर ACSF या खारा के ~ 10 µ एल के साथ कांच इलेक्ट्रोड । टिप क्षतिग्रस्त है, तो तुरंत इलेक्ट्रोड छोड़ें ।
      नोट: ब्लीच चांदी के तार (5 मिनट) और केवल एक ंयूनतम भाग की अनुमति (यानी, चांदी के तार के टिप) वापस ACSF में जलमग्न हो गिलास इलेक्ट्रोड को शोर और रिकॉर्डिंग के दौरान बहाव को कम करने के लिए भरा हुआ है । यदि आवश्यक हो तो एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ कांच इलेक्ट्रोड से किसी भी अतिरिक्त ACSF निकालें.
    2. somatosensory-मोटर क्षेत्र में सतही cortical लेयर (2/3) में ग्लास इलेक्ट्रोड का मार्गदर्शन करने के लिए एक मैन्युअल हेर-फेर का उपयोग करें. रिकॉर्ड/मानक सॉफ्टवेयर के साथ एक कंप्यूटर पर मस्तिष्क टुकड़ा की विद्युत गतिविधि देखें ।
      नोट: 2/3 परत लगभग ०.३ मिमी सतह३२से गहरी है ।
    3. सामयिक लागू ~ ०.५ मिलीलीटर १.५ मिमी 4-एक सिरिंज के साथ माउस के उजागर प्रांतस्था पर एपी खारा जब तक यह पूरी तरह से craniotomy को शामिल किया गया । भंग 14 4 के मिलीग्राम-एपी isotonic खारा के १०० मिलीलीटर में १.५ मिमी 4-एपी खारा के एक शेयर समाधान करने के लिए ।
      नोट: प्रयोग शुरू होने से पहले 4-एपी खारा तैयार करें । औसत पर, ictal घटनाओं 15-30 मिनट के बाद सामयिक आवेदन दिखाई देते हैं ।
  3. optogenetic चूहों में बरामदगी की मांग पर पीढ़ी
    1. एक ictal घटना शुरू करने के लिए (एक न्यूनतम 10 मेगावाट/मिमी2 उत्पादन तीव्रता के साथ) नीले (४७० एनएम) प्रकाश की एक संक्षिप्त (30 एमएस) पल्स लागू करें. एक १,००० µm कोर व्यास ऑप्टिकल फाइबर (०.३९ ना) सीधे रिकॉर्डिंग क्षेत्र के ऊपर की स्थिति के लिए एक मैनुअल जोड़तोड़ का प्रयोग करें ।
      नोट: ictal घटना पुनरावृत्ति की वांछित दर से मेल करने के लिए फोटो-उत्तेजना की दर निर्धारित (यानी, 1 पल्स हर ३०० s). हालांकि, दर पीढ़ी से नहीं किया जा सकता है कि आंतरिक दर पर ictal घटनाओं हो अतिरंजित ।

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Representative Results

१०० µ एम 4 के आवेदन-एपी अच्छी गुणवत्ता (नुकसान) ४५० µM-एक किशोर VGAT-ChR2 माउस से cortical मस्तिष्क स्लाइस के आकार का मज़बूती से प्रेरित आवर्तक ictal घटनाओं (> 5 एस) 15 मिनट के भीतर (चित्रा 1Ai) । १०० µ एम 4 के आवेदन-एपी गरीब गुणवत्ता के स्लाइस को फट घटनाओं या spiking गतिविधि (चित्रा 1Aii) के परिणामस्वरूप । औसतन, प्रत्येक विच्छेदित माउस मस्तिष्क से स्लाइस का ४०% सफलतापूर्वक ictal घटनाओं उत्पंन । इसके अलावा, विच्छेदित चूहों के ८३% (25/30) के परिणामस्वरूप एक मस्तिष्क टुकड़ा है कि सफलतापूर्वक ictal घटनाओं उत्पंन की । सहज रूप से होने वाली ictal घटनाओं के साथ मस्तिष्क स्लाइस में, मस्तिष्क टुकड़ा पर एक संक्षिप्त 30 ms प्रकाश पल्स के आवेदन मज़बूती से एक ictal घटना है कि आकृति विज्ञान (चित्रा 1Aiii और 1Aiv) में समान था ट्रिगर. इसी निष्कर्ष Thy1-ChR2 चूहों (चित्रा 1b) से ब्रेन स्लाइस में किए गए थे. इस प्रकार, जो की परवाह किए बिना जो न्यूरॉन-उपजनसंख्या सक्रिय था, अलग cortical तंत्रिका नेटवर्क में किसी भी संक्षिप्त तुल्यकालन घटना एक ictal घटना की शुरुआत करने के लिए नेतृत्व किया. इन ictal घटनाओं में एक प्रहरी (preictal) स्पाइक (फिगर 2Aii और 2Bii), टॉनिक जैसे फायरिंग (फिगर 2Aiii और 2Biii), क्लोनल जैसी फायरिंग (फिगर 2Aiv और 2Biv), और फटा हुआ गतिविधि शामिल थे अंत की ओर (चित्रा 2Av और 2Bv); वे प्रकृति में नैदानिक बरामदगी३३के साथ जुड़े electrographic हस्ताक्षर करने के लिए समान थे । इसके अलावा, इन किशोर चूहों शारीरिक वयस्क थे 10 µ एम bumetanide (नितंब), एक NKCC1 अवरोधक के अलावा के रूप में की तरह, जिसके परिणामस्वरूप ictal घटनाओं (चित्रा 2) पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा ।

इन विट्रो 4-एपी cortical स्लाइस मॉडल मज़बूती से ~ 1 ज (चित्रा 1Ai) के लिए लगातार ictal घटनाओं उत्पन्न, जबकि शून्य मिलीग्राम2 + मॉडल आम तौर पर तेजी से फट की तरह गतिविधि में बदलने से पहले ~ 10 मिनट के लिए ictal घटनाओं उत्पन्न ( चित्र 3ए) । हालांकि, अगर जब्ती प्रेरण की एक गैर-4 एपी विधि की आवश्यकता है, शूंय मिलीग्राम2 + मॉडल 5-10 µ एम baclofen (एक गाबाबी रिसेप्टर्स एगोनिस्ट) के अलावा के साथ संशोधित किया जा सकता है ictal घटनाओं में वापस फट गतिविधि बदलने के लिए (चित्र3 बी) . सामांय में, गैर निषेध के तरीकों को उत्तेजित करने के लिए (यानी, 4 एपी या शूंय-मिलीग्राम2 + ACSF) मज़बूती से cortical मस्तिष्क स्लाइस में ictal घटनाओं reproduced वृद्धि हुई है । इसके विपरीत, संकोचन के तरीके [यानी, bicuculline (बीएमआई), एक गाबाएक रिसेप्टर प्रतिपक्षी] spiking गतिविधि या फट गतिविधि की याद ताजा गतिविधियों के परिणामस्वरूप, के बजाय ictal घटनाओं (संख्या 4a). इसी तरह, तीव्र जब्ती मॉडल से तैयार १०० µ एम 4-एपी-इलाज हिप्पोकैम्पस स्लाइस उत्पन्न interictal-जैसे spiking गतिविधि या स्थिति एपिलेप्टिकस-CA3 (चित्रा 4B) में स्थितियों की तरह. में vivo 4-एपी cortical मॉडल तदनुसार उत्पंन आवर्तक ictal घटनाओं (> 5 एस) । Ictal घटनाओं को सतही परत में मनाया गया (2/3) ~ 30 मिनट के भीतर सामयिक आवेदन १.५ mM 4-एपी वयस्क VGAT-ChR2 चूहों के उजागर प्रांतस्था पर । उजागर प्रांतस्था पर एक संक्षिप्त 30 एमएस प्रकाश पल्स के आवेदन मज़बूती से ictal घटनाओं है कि सहज रूप से होने वाली उन लोगों के लिए इसी तरह आकृति विज्ञान थे ट्रिगर (चित्रा 5).

शूंय के आवेदन-मिलीग्राम2 + १०० µ एम 4 के साथ मानव ACSF-एपी के लिए ' गैर मिरगी ' cortical मस्तिष्क स्लाइसें (४५० µM) लौकिक पालि मिर्गी रोगियों से मज़बूती से आवर्तक उत्पंन ictal घटनाओं (> 5 एस) के भीतर ~ 30 मिनट (चित्रा 6Ai और 6Bi) । गरीब गुणवत्ता के स्लाइस या तो spiking गतिविधि या कोई गतिविधि (चित्रा 1Aii) उत्पंन । मस्तिष्क स्लाइस की व्यवहार्यता ' समझा अच्छी गुणवत्ता ' था जब एक संक्षिप्त विद्युत उत्तेजना (१०० µs, 30-300 µA) प्रयोग की शुरुआत में LFP में एक मजबूत, पैदा की प्रतिक्रिया प्रेरित किया । एक बार ictal घटनाओं को तेज करने के लिए शुरू हुआ, एक संक्षिप्त कश के आवेदन (७५ ms 20 psi पर) १०० mM गाबा के मस्तिष्क पर एक टुकड़ा मज़बूती से ictal घटनाओं है कि सहज रूप से होने वाली उन लोगों के लिए आकृति विज्ञान में समान थे ट्रिगर (चित्रा 6Aii और 6Aiii) . गाबा, १००-२०० µ एम के एक कम एकाग्रता, संभावना के रूप में अच्छी तरह के रूप में इन विट्रो प्रयोगों३४के लिए प्रभावी हो जाएगा; हालांकि, गाबा के एक उच्च एकाग्रता, १०० मिमी, vivo प्रयोगों ३५ में के लिएसिफारिश की है. जब २०० µ एम ग्लूटामेट का एक संक्षिप्त कश मानव मस्तिष्क स्लाइस (चित्रा 6Bii और 6Biii)के लिए लागू किया गया था एक ही टिप्पणियों reproduced थे । इस प्रकार, जो के बाद synaptic रिसेप्टर्स सक्रिय थे, अलग मानव cortical तंत्रिका नेटवर्क में एक संक्षिप्त तुल्यकालन घटना मज़बूती से एक ictal घटना ट्रिगर ।

Figure 1
चित्र 1: तीव्र इन विट्रो 4-एपी cortical जब्ती मॉडल । काली रेखाएं स्थानीय फ़ील्ड संभावित (LFP) रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं; ब्लू लाइनों प्रकाश उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करते हैं । (a) ये पैनल एक VGAT-ChR2 माउस मॉडल से परिणामों पर आधारित होते हैं । वे ictal घटनाओं LFP रिकॉर्डिंग में एक उच्च गुणवत्ता cortical मस्तिष्क टुकड़ा १०० µ एम 4 के साथ इलाज किया की सतही परत (2/3) से मनाया वर्णन-एपी. i) इस पैनल LFP रिकॉर्डिंग का अवलोकन दिखाता है । ii) ये खराब गुणवत्ता वाले ब्रेन स्लाइस से LFP रिकॉर्डिंग के उदाहरण हैं । ऊर्ध्वाधर पैमाने पर बार है ०.४ एमवी, क्षैतिज पैमाने पर पट्टी है 20 एस iii) यह एक जूम-एक प्रकाश ट्रिगर ictal घटना का दृश्य है । iv) यह एक सहज ictal घटना का एक ज़ूम-इन दृश्य है । (ख) ये पैनल एक Thy1-ChR2 माउस मॉडल से परिणामों पर आधारित हैं. वे ictal घटनाओं LFP रिकॉर्डिंग में एक cortical मस्तिष्क स्लाइस की सतही परत (2/3) से मनाया १०० µ एम 4 के साथ इलाज किया-एपी. i) इस पैनल LFP रिकॉर्डिंग का अवलोकन दिखाता है । ii) यह एक हल्का-ट्रिगर ictal इवेंट के दृश्य में ज़ूम-इन है । iii) यह एक सहज ictal घटना का एक जूम-इन दृश्य है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Ictal एक किशोर (p13) से एक मस्तिष्क टुकड़ा (परत 2/3) में उत्पंन घटनाओं 4-एपी और perfused (नितंब) के साथ VGAT-ChR2 माउस bumetanide । काली रेखाएं स्थानीय फ़ील्ड संभावित (LFP) रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं; ब्लू लाइनों प्रकाश उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करते हैं । (क) ये पैनल एक सहज ictal घटना दिखाते हैं. i) यह पैनल संपूर्ण ictal इवेंट का अवलोकन दिखाता है । निंनलिखित पैनलों शो ii) एक प्रहरी स्पाइक, iii) टॉनिक की तरह फायरिंग, iv) क्लोनिंग की तरह गोलीबारी, और v) गतिविधि फटा । (ख) इन पैनलों एक प्रकाश ट्रिगर ictal घटना दिखा । i) यह पैनल संपूर्ण ictal इवेंट का अवलोकन दिखाता है । निम्नलिखित पैनलों शो द्वितीय) एक ही टुकड़ा रिकॉर्डिंग से एक प्रकाश ट्रिगर प्रहरी स्पाइक, iii) टॉनिक की तरह फायरिंग, iv) क्लोनल की तरह गोलीबारी, और वी) गतिविधि फटा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: इन विट्रो शूंय-मिलीग्राम2 + cortical जब्ती मॉडल में तीव्र । काली रेखाएं स्थानीय फ़ील्ड संभावित (LFP) रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं; ब्लू लाइनों प्रकाश उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करते हैं । (क) इन पैनलों एक VGAT-ChR2 माउस मॉडल से परिणामों पर आधारित हैं । i) इस पैनल की स्थिति एपिलेप्टिकस-की तरह स्थितियों को दर्शाता है एक cortical मस्तिष्क टुकड़ा के सतही परत (2/3) से LFP रिकॉर्डिंग में मनाया शूंय के साथ इलाज-मिलीग्राम2 + ACSF । ii) यह एक हल्का-ट्रिगर ictal इवेंट के दृश्य में ज़ूम-इन है । iii) यह एक ज़ूम-स्थिति एपिलेप्टिकस का दृश्य है-जैसे कि पटाखे की गतिविधि । (ख) इन पैनलों baclofen के अलावा के साथ एक ही टुकड़ा रिकॉर्डिंग दिखाते हैं । i) 5 µ एम baclofen के शूंय-मिलीग्राम2 + ACSF के आवेदन को अलग, आवर्तक ictal घटनाओं में वापस फट गतिविधि बदल देती है । ii) यह एक जूम-इन गतिविधि को देखने में है । iii) यह एक जूम-इन अलग ictal घटना का दृश्य है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: तीव्र इन विट्रो में फटा/spiking मॉडल । काली रेखाएं स्थानीय फ़ील्ड संभावित (LFP) रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं; ब्लू लाइनों प्रकाश उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करते हैं । (क) इन पैनलों एक VGAT-ChR2mouse से एक cortical टुकड़ा से परिणामों को दिखाने के लिए, फट गतिविधि को दर्शाती है सतही परत में मनाया (2/3) 10 µ एम बीएमआई के अलावा के बाद १०० µ मी 4AP. i) यह LFP रिकॉर्डिंग का अवलोकन है । बिंदीदार लाल रेखा जब बीएमआई प्रभाव लिया इंगित करता है । ii) यह एक हल्का-ट्रिगर ictal इवेंट के दृश्य में ज़ूम-इन है । iii) यह एक जूम-इन सहज फट गतिविधि को देखने में है । (ख) इन पैनलों एक VGAT-ChR2 माउस से एक हिप्पोकैम्पस टुकड़ा से परिणाम दिखाने के लिए, एक स्थिति एपिलेप्टिकस की तरह CA3 क्षेत्र में मनाया घटना १०० µ एम 4AP के आवेदन के बाद illustrated. i) यह LFP रिकॉर्डिंग का एक सिंहावलोकन है । ii) यह एक ictal घटना का एक जूम-इन दृश्य है । iii) यह एक तेजी से प्रकाश ट्रिगर और सहज फट घटनाओं के दृश्य में है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: vivo 4 में एक्यूट-एपी cortical जब्ती मॉडल । काली रेखाएं स्थानीय फ़ील्ड संभावित (LFP) रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं; ब्लू लाइनों प्रकाश उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करते हैं । (एक) इन पैनलों १.५ mM 4-एपी सामयिक उजागर प्रांतस्था के लिए लागू के साथ एक वयस्क (p56) VGAT-ChR2 माउस मॉडल के परिणाम दिखाते हैं । i) इस पैनल के एक प्रकाश ट्रिगर ictal somatosensory-मोटर क्षेत्र के सतही परत (2/3) में मनाया घटना को दर्शाता है । ii) यह एक ज़ूम-पैनल एअर इंडियासे प्रकाश ट्रिगर ictal घटना के मद्देनजर है. iii) यह एक सुपर ज़ूम-प्रकाश ट्रिगर ictal घटना (काले तीर से संकेत) की शुरुआत के मद्देनजर है । यह आंकड़ा चांग एट अल से एक आंकड़ा के अनफ़िल्टर्ड संस्करण है । 16. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: तीव्र इन विट्रो मानव cortical जब्ती मॉडल । काली रेखाएं स्थानीय फ़ील्ड संभावित (LFP) रिकॉर्डिंग का प्रतिनिधित्व करती हैं; ब्राउन लाइनों picospritzer पफ प्रतिनिधित्व करते हैं । (एक) इन पैनलों एक औसत दर्जे का लौकिक पालि मिर्गी (MTLE) रोगी से एक cortical मस्तिष्क टुकड़ा के परिणामों को दिखाने के लिए, ictal की घटनाओं को दर्शाते हुए सतही परत में मनाया (2/3) १०० µ एम 4 के साथ एक छिड़काव के बाद-एपी और शूंय-मिलीग्राम2 + मानव ACSF . i) यह LFP रिकॉर्डिंग का अवलोकन है । निंनलिखित पैनलों शो द्वितीय) एक zoomed-एक १०० mM गाबा कश के मद्देनजर-ट्रिगर ictal घटना और iii) एक ज़ूम-एक सहज ictal घटना के दृश्य में । (ख) इन पैनलों एक और MTLE रोगी से एक cortical मस्तिष्क टुकड़ा के परिणामों को दिखाने के लिए, सतही परत में मनाया ictal घटनाओं illustrating (2/3) १०० µ एम 4 के साथ एक छिड़काव के बाद-एपी और शूंय-मिलीग्राम2 + मानव ACSF । i) यह LFP रिकॉर्डिंग का अवलोकन है । निंनलिखित पैनलों शो द्वितीय) एक zoomed-में एक २०० µ एम ग्लूटामेट पफ-ट्रिगर ictal घटना और iii) के एक ज़ूम-एक सहज ictal घटना के मद्देनजर देखते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1: विच्छेदन समाधान के लिए नुस्खा । ये 1 l या 2 l खंड बनाने के निर्देश हैं. मेगावाट = घुला हुआ का आणविक भार.

# अभिकर्मक [mM] मेगावाट (जी/ 1L (छ) 2L (छ)
1 Sucrose २४८ ३४२.३ ८४.८९ १६९.७८
2 सोडियम बिकारबोनिट (NaHCO2) 26 ८४.०१ २.१८ ४.३७
3 डेक्सट्रोज (डी-ग्लूकोज) 10 १८०.१६ १.८ ३.६
4 पोटेशियम क्लोराइड (KCl) 2 ७४.५५ ०.१५ ०.३
5 मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4· 7H2O) 3 २४६.४७ ०.७४ १.४८
6 सोडियम फॉस्फेट monobasic मोनोहाइडे (ज2नापो4· एच2ओ) १.२५ १३७.९९ ०.१७ ०.३४
7 कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2· 2H2O) 1 १४७.०१ ०.१५ ०.२९

तालिका 2: के लिए नुस्खा कुतर कृत्रिम सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी का द्रव (ACSF) । ये 2 l या 4 l खंड बनाने के निर्देश हैं. मेगावाट = घुला हुआ का आणविक भार.

# अभिकर्मक [mM] मेगावाट (जी/ 2L (छ) 4L (छ)
1 सोडियम क्लोराइड (NaCl) १२३ ५८.४ १४.३७ २८.७३
2 सोडियम बिकारबोनिट (NaHCO2) 26 ८४.०१ ४.३७ ८.७४
3 डेक्सट्रोज (डी-ग्लूकोज) 10 १८०.१६ ३.६ ७.२१
4 पोटेशियम क्लोराइड (KCl) 4 ७४.५५ ०.६ १.१९
5 मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4· एच2ओ) १.३ २४६.४७ ०.६४ १.२८
6 सोडियम फॉस्फेट monobasic मोनोहाइडे (HNaPO4· एच2ओ) १.२ १३७.९९ ०.३३ ०.६६
7 कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2· 2H2O) १.५ १४७.०१ ०.४४ ०.८८

तालिका 3: मानव कृत्रिम सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ (मानव ACSF) के लिए नुस्खा । ये 2 l या 4 l खंड बनाने के निर्देश हैं. मेगावाट = घुला हुआ का आणविक भार.

# अभिकर्मक [mM] मेगावाट (जी/ 2L (छ) 4L (छ)
1 सोडियम क्लोराइड (NaCl) १२३ ५८.४ १४.३८ २८.७५
2 सोडियम बिकारबोनिट (NaHCO2) २५.२ ८४.०१ ४.२३ ८.४६
3 डेक्सट्रोज (डी-ग्लूकोज) 10 १८०.१६ ३.६ ७.२१
4 पोटेशियम क्लोराइड (KCl) 4 ७४.५५ ०.६ १.१९
5 मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4· एच2ओ) 1 २४६.४७ ०.४९ ०.९९
6 सोडियम फॉस्फेट monobasic मोनोहाइडे (HNaPO4· एच2ओ) १.२ १३७.९९ ०.३३ ०.६६
7 कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2· 2H2O) 1 १४७.०१ ०.२९ ०.५९

तालिका 4: शूंय के लिए नुस्खा-मिलीग्राम 2 + मूषक कृत्रिम सेरेब्रल स्पाइनल द्रव (शून्य मिलीग्राम2 + ACSF). ये 2 l या 4 l खंड बनाने के निर्देश हैं. मेगावाट = घुला हुआ का आणविक भार.

# अभिकर्मक [mM] मेगावाट (जी/ 2L (छ) 4L (छ)
1 सोडियम क्लोराइड (NaCl) १२३ ५८.४ १४.३७ २८.७३
2 सोडियम बिकारबोनिट (NaHCO2) 26 ८४.०१ ४.३७ ८.७४
3 डेक्सट्रोज (डी-ग्लूकोज) 10 १८०.१६ ३.६ ७.२१
4 पोटेशियम क्लोराइड (KCl) 4 ७४.५५ ०.६ १.१९
5 मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4· एच2ओ) नाममात्र मुक्त २४६.४७ 0 0
6 सोडियम फॉस्फेट monobasic मोनोहाइडे (HNaPO4· एच2ओ) १.२ १३७.९९ ०.३३ ०.६६
7 कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2· 2H2O) १.५ १४७.०१ ०.२९ ०.५९

तालिका 5: शूंय के लिए नुस्खा-मिलीग्राम 2 + मानव कृत्रिम सेरेब्रल रीढ़ की हड्डी का द्रव (शूंय मिलीग्राम2 + मानव ACSF) । ये 2 l या 4 l खंड बनाने के निर्देश हैं; मेगावाट = घुला हुआ का आणविक भार.

# अभिकर्मक [mM] मेगावाट (जी/ 2L (छ) 4L (छ)
1 सोडियम क्लोराइड (NaCl) १२३ ५८.४ १४.३८ २८.७५
2 सोडियम बिकारबोनिट (NaHCO2) २५.२ ८४.०१ ४.२३ ८.४६
3 डेक्सट्रोज (डी-ग्लूकोज) 10 १८०.१६ ३.६ ७.२१
4 पोटेशियम क्लोराइड (KCl) 4 ७४.५५ ०.६ १.१९
5 मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO4· एच2ओ) नाममात्र मुक्त २४६.४७ 0 0
6 सोडियम फॉस्फेट monobasic मोनोहाइडे (HNaPO4· एच2ओ) १.२ १३७.९९ ०.३३ ०.६६
7 कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2· 2H2O) 1 १४७.०१ ०.२९ ०.५९

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Discussion

मस्तिष्क स्लाइस एक proconvulsant दवा या एक बदल ACSF perfusate तंत्रिका नेटवर्क की उत्तेजितता बढ़ाने के लिए और ictal घटनाओं की एक वर्षण को बढ़ावा देने के साथ इलाज कर रहे है (electrographic बरामदगी की तरह घटनाओं) । चूहों के लिए, somatosensory-मोटर क्षेत्र के पसंदीदा राज्याभिषेक स्लाइस सिंगुलेट प्रांतस्था, क्षेत्र 2 (तटरक्षक), लेकिन नहीं retrosplenial क्षेत्र (रुपये) शामिल होना चाहिए; इन संरचनात्मक मार्करों ictal घटनाओं उत्प्रेरण के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं कि राज्याभिषेक स्लाइस की सीमा की पहचान करने में मदद । चूहों के ऊतकों के लिए एक वैकल्पिक संशोधन के दो गोलार्द्धों लगभग समान (समान प्रयोगात्मक इकाइयों) कर रहे हैं के रूप में मिलान जोड़ी प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आधे में मस्तिष्क टुकड़ा के दो गोलार्द्धों में कटौती करने के लिए है । जब मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी ictal घटनाओं उत्पंन करने के लिए, यह तंत्रिका नेटवर्क और उसके synaptic कनेक्शन की अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, क्योंकि ictal घटनाओं तंत्रिका नेटवर्क घटना कर रहे हैं । प्रोटोकॉल है कि स्लाइस की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है के चरण 1 में तीन अंक है 1) टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया, 2) मशीन, और 3) ऑक्सीजन । सबसे पहले, टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया गति और तकनीक के बीच एक संतुलन की आवश्यकता है । यह decapitation (या शल्य लकीर) और मशीन के बीच समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि भी नुकसान से बचने के लिए हर संपर्क और मस्तिष्क टुकड़ा के आंदोलन के साथ सावधान किया जा रहा है । दूसरे, ऊतक की गुणवत्ता की मशीन तापमान और अवधि के लिए बहुत संवेदनशील है । यह एक टाइमर और थर्मामीटर का उपयोग करने के लिए गर्मी सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है ३५ ° c पर 30 मिनट के लिए है । तीसरे, मस्तिष्क ऊतक की व्यवहार्यता oxygenated (कृत्रिम) मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव के अलावा अंय कुछ के लिए जोखिम के प्रति संवेदनशील है । यह एक विस्तारित अवधि (~ 1 मिनट) के लिए carbogenated ACSF के साथ perfused नहीं है, तो मस्तिष्क स्लाइस समाप्त हो जाएगी ।

मस्तिष्क p13 आयु वर्ग के चूहों से स्लाइसें-p16 सफलतापूर्वक ictal घटनाओं पैदा करने की उच्चतम संभाव्यता प्रदान करते हैं. कारण यह है कि चूहों ≤ p16 को विच्छेदन से पूर्व एक transcardial छिड़काव की आवश्यकता नहीं है. यह प्रभावी ढंग से त्रुटियों के लिए मौका कम कर देता है और विच्छेदन प्रक्रिया है, जो एक बड़ा लाभ है गति, क्योंकि decapitation और मशीन के बीच समय की मात्रा व्युत्क्रम मस्तिष्क है स्लाइस व्यवहार्यता के साथ संबद्ध है । इस बीच, चूहों > p13 NKCC1 कि एक वयस्क३६के लिए तुलनीय है की मात्रा कम है । सामांय में, जुवेनाइल (< p21) ऊतक एक असाधारण हानिकारक टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया से उबरने की क्षमता के कारण वयस्क ऊतक से अधिक व्यवहार्य है । इस सप्ताह p13 और p21 के बीच लंबी खिड़की के लिए चूहों के वयस्क की तरह शरीर क्रिया विज्ञान और बाल शोषण करने का अवसर प्रदान करता है आसानी से ictal घटनाओं३७,३८उत्पंन करने की क्षमता । हालांकि, अगर प्रयोगों वयस्क चूहों से मस्तिष्क स्लाइस में ictal घटनाओं का अध्ययन की आवश्यकता होती है, HEPES के साथ एक NMDG आधारित ACSF, thiourea, और ascorbate वयस्क ऊतक की व्यवहार्यता को बढ़ावा देने में मदद करेगा24,३९,४०, ४१. मानव ऊतक के लिए, antioxidants के अलावा, α-tocopherol के रूप में, विच्छेदन समाधान के लिए ऊतक व्यवहार्यता लाभ, विशेष रूप से लंबी दूरी की ढुलाई के दौरान (> 30 मिनट) के बीच ऑपरेटिंग कमरे और प्रयोगशाला के लिए कर सकते है टुकड़ा करने की क्रिया8,26। सभी मस्तिष्क स्लाइसें, अनुकूल परिस्थितियों ictal घटनाओं उत्पन्न करने के लिए ३६ डिग्री सेल्सियस पर ४५० µm मोटी स्लाइस से रिकॉर्ड करने के लिए कर रहे हैं । मस्तिष्क स्लाइस करने के लिए कम ३५० µm मोटी होने की जरूरत है करने के लिए पर्याप्त न्यूरॉन्स शामिल करने के लिए तंत्रिका नेटवर्क संरचित ictal घटना उत्पन्न. हालांकि, स्लाइस से ५०० µm मोटा नहीं हो सकता, के रूप में है कि यह मुश्किल ऑक्सीजन ऊतक के केंद्र में फैलाना करने के लिए कर देगा । स्लाइस कि ४५० µm एक इष्टतम मोटाई का प्रतिनिधित्व करते हैं, जहां एक पर्याप्त मात्रा में न्यूरॉन नेटवर्क कनेक्टिविटी के ऊतकों में ऑक्सीजन की छिड़काव में बाधा के बिना बनाए रखा है. अंत में, ictal घटनाओं का वर्षण ३३-३६ ° c में इष्टतम है; यदि रिकॉर्डिंग चैंबर कम से ३३ डिग्री सेल्सियस नहीं है, यह ictal घटनाओं होने के लिए मुश्किल हो जाएगा ।

तीव्र जब्ती मॉडल की एक सीमा है कि वे बरामदगी उत्पंन नहीं है । वे केवल ictal घटनाओं, जो एक जब्ती के electrographic हस्ताक्षर कर रहे है उत्पंन करते हैं । Ictal घटनाओं कोई संबद्ध व्यवहार घटकों, ऐसी चेतना या मोटर आक्षेप के नुकसान के रूप में है कि एक जब्ती को परिभाषित है । नतीजतन, तीव्र जब्ती मॉडल के लिए संभावित विरोधी जब्ती दवा उंमीदवारों की प्रभावशीलता की पुष्टि या epileptogenesis में लाभ अंतर्दृष्टि नहीं किया जा सकता; ऐसे अनुसंधान प्रश्न क्रोनिक मिर्गी मॉडल और नैदानिक परीक्षणों द्वारा संबोधित किया जाना चाहिए । तीव्र जब्ती मॉडल केवल जब्ती तंत्र पर मौलिक प्रारंभिक अध्ययन प्रदर्शन के अपने उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । केवल तीव्र जब्ती मॉडल से सबसे होनहार निष्कर्षों उच्च मॉडल है कि अधिक महंगे हैं, श्रमसाध्य तैयार करने के लिए पर उंनत किया जाना चाहिए, और अधिक जटिल नैतिक विचारों की आवश्यकता होती है ।

मिर्गी और बरामदगी अनुसंधान में प्रगति करने के लिए, यह एक विश्वसनीय तीव्र जब्ती मॉडल है कि सही electrographic जब्ती गतिविधि की नकल कर सकते है जब्ती रोगियों की ईईजी में चिकित्सकीय मनाया है अनिवार्य है । मज़बूती से मस्तिष्क स्लाइस में ictal की घटनाओं को पुन: पेश करने के लिए, गैर-संकोच बढ़ाने के तरीकों की आवश्यकता है, जबकि निषेध के तरीकों (यानी, गाबाएक रिसेप्टर विरोधी बीएमआई) आम तौर पर spiking गतिविधि में परिणाम interictal गतिविधि की याद ताजा, बजाय ictal घटनाओं (3ए) । गैर-निषेध के पसंदीदा विधि proconvulsant एजेंट 4-एपी लागू है क्योंकि यह मज़बूती से 1 एच के लिए सुसंगत ictal घटनाओं उत्पंन कर सकते है । इसके विपरीत, शूंय मिलीग्राम2 + cortical मॉडल केवल ~ 10 मिनट के लिए तेजी से पटाखे की तरह गतिविधि (चित्रा 2a) में बदलने से पहले ictal घटनाओं उत्पंन करता है । अगर शूंय का उपयोग-2 मिलीग्राम + मॉडल, 5-10 µ एम baclofen, एक गाबाबी रिसेप्टर एगोनिस्ट के अलावा, ictal घटनाओं में वापस फटा गतिविधि को बदलने में मदद मिलेगी (आंकड़ा2 ए), के रूप में पहले हिप्पोकैम्पस स्लाइस४२में दिखाया गया है । इसके अलावा, इन विट्रो 4-एपी जब्ती मॉडल में पसंद किया जाता है, क्योंकि उस मॉडल से निष्कर्षों में अपनी वीवो समकक्ष में दोहराया जा सकता है, vivo 4-ap cortical जब्ती मॉडल (चित्रा 4) में । यह संभव के लिए एक जीवित वयस्क माउस के पूरे मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी को संशोधित करने के लिए vivo शूंय में तीव्र विश्राम नहीं है-2 मिलीग्राम + पर्यावरण ।

4 के आवेदन-cortical मस्तिष्क स्लाइस में एपी सही जब्ती गतिविधि को पुन: पेश कर सकते है चिकित्सकीय15,३३मनाया । इसके विपरीत, 4-एपी-इलाज हिप्पोकैम्पस स्लाइसें interictal की तरह spiking गतिविधि४३ और स्थिति एपिलेप्टिकस की तरह पैदा करने के लिए संवेदनशील हैं-शर्तों (3बी चित्र) । इस प्रकार, बरामदगी का अध्ययन करने के प्रयोजनों के लिए, में तीव्र इन विट्रो 4-एपी cortical मॉडल पर इन इन विट्रो में पसंद है-एपी हिप्पोकैम्पस मॉडल । इसके अलावा, वहां वस्तुतः कोई अवसर व्यवहार्य मानव हिप्पोकैम्पस स्लाइस से रिकॉर्ड कर रहे हैं, के रूप में सबसे हिप्पोकैम्पस लकीरें CA1 और CA321क्षतिग्रस्त है । इसके विपरीत, गैर रोग मानव cortical ऊतक और अधिक आसानी से सुलभ है कि जैसे लौकिक पालि मिर्गी सर्जरी के रूप में subcortical तंत्रिकाशल्यक प्रक्रियाओं के माध्यमिक परिणाम है । गैर मिरगी ' नियंत्रण ' neocortical ऊतक भी ट्यूमर लकीर सर्जरी से प्राप्त किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, प्रांतस्था माउस और मानव ऊतक के बीच अपने परिवहन की वजह से चिकित्सकीय प्रासंगिकता की पुष्टि करने के लिए जब्ती गतिविधि मॉडलिंग के लिए पसंदीदा स्थल है । अंत में, चूहों के C57BL/6 तनाव पसंद है क्योंकि वे आसानी से व्यक्त transgenes, और optogenetic वेरिएंट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । Optogenetic चूहों मॉडल एक न्यूनतम इनवेसिव, संक्षिप्त प्रकाश उत्तेजना के माध्यम से ictal घटनाओं की मांग पर दीक्षा के लिए अनुमति देते हैं. इस दौरे के अध्ययन अविश्वसनीय रूप से प्रतीक्षा समय को नष्ट करने और ंयूरॉंस की उपआबादी के लक्षित सक्रियण के लिए अनुमति देकर कुशल बनाता है । इसके अलावा, पर बरामदगी को ट्रिगर करने की क्षमता मांग नए तरीके से निश्चित रूप से जब्ती दीक्षा के सटीक बिंदु demarcate और संभावित विरोधी जब्ती दवा उंमीदवारों की प्रभावशीलता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है । एक उपयोगकर्ता के अनुकूल MATLAB-आधारित प्रोग्राम विशेष रूप से का पता लगाने और epileptiform घटनाओं में होते है कि विभिंन प्रकार के वर्गीकृत करने के लिए विकसित किया गया था और vivo 4-एपी जब्ती मॉडल में । यह पता लगाने कार्यक्रम बहादुरी लैब GitHub भंडार (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018) से डाउनलोड के लिए उपलब्ध है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (पीटर एल Carlen और तौफीक एक. बहादुरी को ११९६०३), ओंटारियो ब्रेन इंस्टीट्यूट (एक. वीर तौफीक), और Mightex छात्र अनुसंधान अनुदान (माइकल चांग को) । हम वीडियो पांडुलिपि फिल्माने में उसकी सहायता के लिए लियाम लंबे समय शुक्रिया अदा करना चाहूंगा. हम इस पांडुलिपि में आंकड़ों और तालिकाओं के संकलन में उनकी सहायता के लिए पारिया Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran, और Shadini Dematagoda को स्वीकार करना चाहेंगे । आंकड़े 1a, 3ए, 4a, और 6A सभी मूल चांग एट अल में प्रकाशित आंकड़ों से बने आंकड़े हैं । 16.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium pentobarbital N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe N/A N/A Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle N/A N/A Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue N/A N/A Purchased through UT Med Store
Lens paper N/A N/A Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula N/A N/A Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end N/A N/A Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0 N/A N/A Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer N/A N/A Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital) N/A N/A Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)  N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome Leica N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)  Scientific Systems Design Inc N/A
Sodium Chloride (NaCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dextrose N/A N/A Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sucrose N/A N/A Purchased through UT Med Store

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तंत्रिका विज्ञान अंक १४३ Epileptiform जब्ती ictal interictal 4-एपी optogenetic ChR2 गाबा पर मांग प्रांतस्था हिप्पोकैम्पस
उत्पादन और मांग पर मूषक और मानव ऊतक में तीव्र Ictal गतिविधि की दीक्षा
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Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).

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