Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generasjon og behovsbetinget initiering av akutt Ictal aktivitet i gnagere og menneskelig vev

doi: 10.3791/57952 Published: January 19, 2019

Summary

Akutt anfall modeller er viktig for å studere mekanismer underliggende epileptiform hendelser. I tillegg gir muligheten til å generere epileptiform hendelser på forespørsel en svært effektiv metode for å studere den nøyaktige sekvensen av hendelser underliggende deres innvielse. Her beskriver vi akutt 4-aminopyridine kortikale anfall modeller etablert i musen og menneskelig vev.

Abstract

Kontrollere beslag er et utfordrende problem for det medisinske fellesskapet. For å gjøre fremgang, trenger forskere en måte å mye studere anfall dynamics og undersøke de underliggende mekanismene. Akutt anfall modeller er praktisk, tilbyr muligheten til å utføre elektrofysiologiske innspillinger og kan generere store mengder electrographic beslag som (ictal) hendelser. Lovende funn fra akutt anfall modeller kan deretter være avansert kronisk epilepsi modeller og kliniske studier. Dermed vil studere beslag i akutt modeller som trofast gjenskape electrographic og dynamiske signaturene i en klinisk anfall være avgjørende for å gjøre klinisk korrelasjon. Studere ictal hendelser i akutt anfall modeller utarbeidet av menneskelig vev er også viktig for å gjøre funnene som klinisk relevante. Sentralt i dette papiret er på kortikale 4-AP modellen på grunn av sin allsidighet generere ictal hendelser i både i vivo og vitro studier og både mus og menneskelig vev. Metodene i denne artikkelen vil også beskriver en alternativ metode for anfall induksjon med null-Mg2 + modellen og gi en detaljert oversikt over fordelene og begrensningene epileptiform-lignende aktivitet generert de forskjellige akutt anfall modeller. Videre ved å utnytte kommersielt tilgjengelig optogenetic musen stammer, kan en kort (30 ms) lys pulsen brukes til å utløse en ictal hendelse-identiske med de som oppstår spontant. Tilsvarende kan 30-100 ms puffs av nevrotransmittere (Gamma-Amino Butyric Acid eller glutamat) brukes til menneskelig vev å utløse ictal hendelser som er identiske med de som oppstår spontant. Muligheten til å utløse ictal hendelser på etterspørselen i akutt anfall modeller tilbyr nyvunne å observere den nøyaktige sekvensen av hendelser som ligger anfall innvielsen dynamics og effektivt vurdere potensielle anti-beslag terapier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akutt anfall modeller kan kunne reprodusere electrographic signaturer minner ictal Hendelsesforløpet observert i EEG (EEG) av enkeltpersoner opplever et anfall. Forskere bruke disse ictal-lignende hendelser (heretter referert til som "ictal eventer") som surrogater for anfall hendelse1. Klinisk tjene ictal hendelser som en pålitelig proxy for anfall hendelser siden beslag er en nevrologisk lidelse som stammer fra hjernen. I epilepsi overvåking enhet stole nevrologer på deteksjon av ictal hendelser å bekrefte hjernens epileptogenic regionen og isolere den resection2. I intensivavdelingen overvåker leger ictal aktivitet å vurdere om alle beslag aktivitet vedvarer i bedøvet pasienter3. Kontrollere beslag gjenstår for å bli et utfordrende problem for det medisinske fellesskapet, 30% av epilepsi pasienter er resistente til tilgjengelig medisiner4,5og 10% av medisinske saker som involverer narkotikainduserte beslag er ikke svarer til standard behandling3. Dette utgjør en alvorlig bekymring for samfunnet, som 10% av den amerikanske befolkningen er skjerpet for å oppleve en anfall hendelse i livet og 3% forventes å utvikle epilepsi6.

Studere beslag i kronisk epilepsi modeller er dyrt, arbeidskrevende, og ofte tar måneder å forberede7. Det er også vanskelig å utføre elektrofysiologiske opptak i fritt flytte dyr. Kliniske studier står overfor lignende problemer, i tillegg til ytterligere komplikasjoner relatert til pasienten samtykke, variasjon i deltakernes bakgrunner og moralske og etiske betraktninger involvert8. Akutt anfall modeller, derimot, er gunstig fordi de er relativt lett å forberede, kostnadseffektiv og generere store mengder ictal hendelser for studier9. I tillegg er vevet fast i en stabil posisjon, slik forholdene er ideelle for å utføre elektrofysiologiske opptakene nødvendig å studere anfall dynamics og beslektede underliggende patofysiologi. Akutt anfall modeller være gunstige forhold i sili (datamaskin) modeller fordi de er basert på biologisk materiale består av hjernens konstituerende nevrale nettverk med alle dens iboende faktorer og synaptic tilkobling, som ikke kan fanges selv de mest detaljerte datamaskinen modeller10. Disse funksjonene gjør akutt anfall modeller klar for å være effektiv til screening potensielle anti-beslag terapi og gjøre foreløpige funn før fremme dem for videre etterforskning i kronisk epilepsi modeller og kliniske studier.

Vanligvis utarbeides akutt anfall modeller fra normal hjernevev som har vært utsatt for hyper-nervøs forhold. For å indusere klinisk relevante ictal hendelser i sunn hjernevev, er det viktig å forstå at hjernen fungerer optimalt i en kritisk tilstand11 hvor eksitasjon (E) og hemming (I) er balansert12. Avbrudd av E-jeg balanse kan føre til hyper-nervøs anfall staten der ictal hendelser føre. Følgelig, i dette konseptuelle rammeverket, det er to viktige strategier for å generere ictal hendelser i hjernen skiver (i vitro) eller hele-hjerne (i vivo) forberedelser: redusert hemming ("disinhibition") eller økt eksitasjon ("ikke-disinhibition"). Men ictal hendelser er svært organisert og synkronisert hendelser som krever påvirkning av GABAergic interneurons å organisere nettverk aktivitet13,14. Derfor er ikke-disinhibition modellene de mest effektive for genererer ictal hendelser i isolerte nevrale nettverk, som i en i vitro hjernen skjær15, mens i vitro disinhibition modeller ofte føre til skyter aktivitet minner om interictal som skyter. Videre i dette konseptuelle rammeverket, kan en kortvarig synkronisering hendelse også pålitelig utløse en ictal hendelse16. Faktisk kan en ictal hendelse utløses av noen mindre forstyrrelsene på neural systemet17 når det er i en kritisk tilstand overgang ("bifurkasjonen") punkt18. Tradisjonelt har ble disse forstyrrelser indusert av elektrisk stimulering. Den siste utviklingen av optogenetics i nevrovitenskap, men tilbyr nå en mer elegant strategi for å indusere kritisk tilstand overganger16.

Metodene som er beskrevet i denne artikkelen viser hvordan du genererer ictal hendelser på forespørsel i akutt anfall modeller for både i vitro (trinn 1 av protokollen) og i vivo studier (trinn 2 av protokollen). De involverer valg av hjernen regionen, beslag induksjon metoden, studie type og arter; men vil fokus være på anbefalt valg av en akutt 4-AP kortikale anfall modell på grunn av sin allsidighet i en rekke typer studie. Akutt i vitro 4-AP anfall modellen er basert på standard protokoll forberede høykvalitets hjernen skiver elektrofysiologiske opptak og imaging studier19. Disse protokollene har allerede blitt brukt til å gjøre i vitro koronale hjernen sektorer fra somatosensory-motorisk cortex mus16,20 og mennesker21. Endringer til å generere ictal hendelser i disse typer hjernen skiver har vist tidligere16 og detaljer er beskrevet i protokollen nedenfor. Akutt i vivo 4-AP kortikale anfall modellen er basert på standard protokoll å forberede en craniotomy imaging studier22. Endringen er at ingen (objektglass) vindu er installert etter craniotomy. I stedet brukes topically proconvulsant agenter (4-AP) til utsatte cortex å indusere ictal hendelser mens dyret er under narkose. Vi vet var vår gruppe først til å utvikle denne akutt i vivo kortikale anfall modellen i mus16,23. Akutt i vivo 4-AP kortikale anfall modellen forberedt fra voksen mus ble utviklet for å utfylle skive i vitro modellen fra juvenile vev. Replikering av funnene i voksen i vivo anfall modellen bidrar til å generalisere resultatene fra skive modeller av adressering iboende bekymringene om ikke-fysiologiske vilkårene for en 2D hjernen SKIVE (versus 3D hele-hjerne struktur) og fysiologiske forskjellene mellom juvenil og voksen vev.

Metoden av behovsbetingede ictal hendelsen er demonstrert med enten puffs av nevrotransmittere med en picospritzer eller optogenetic strategier. Til best av vår kunnskap er vår gruppe først til å starte ictal hendelser i menneskelig vev bruker nevrotransmittere via en picospritzer16. For optogenetic strategier er C57BL/6 mus belastningen konvensjonelle påkjenningen brukes for å uttrykke effekter av transgener. Uttrykk for channelrhodopsin-2 (ChR2) i GABAergic interneurons eller glutamatergic pyramideformet celler vil gi valgfrie muligheten til å generere ictal hendelser på forespørsel med kort lyspulser. Egnet optogenetic mus stammer inkluderer kommersielt tilgjengelig C57BL/6 varianten som uttrykker ChR2 i begge interneurons, bruker musen vesicula GABA transporter promotor (VGAT)24eller pyramideformet celler, bruke musen thymus celle antigen 1 Utbyggeren (Thy1)25. Disse kommersielt tilgjengelige VGAT-ChR2 og Thy1-ChR2 mus tilbyr muligheten til å aktivere GABAergic nerveceller eller glutamatergic neurons, henholdsvis i neocortex med blå (470 nm) lys. Muligheten til å generere ictal hendelser på etterspørselen i akutt anfall modeller kan tilby romanen muligheter til å studere anfall innvielsen dynamics og effektivt vurdere potensielle anti-beslag terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle forskning innvolvere pasienter ble utført under en protokoll godkjent av universitetet helse nettverk forskning etikk styret i henhold til erklæringen i Helsinki. Prosedyrer som involverer dyr ble retningslinjer av Canadian Council on Animal Care og godkjent av Krembil Research Institute dyr omsorg komiteen.

1. protokollen I: akutt In vitro anfall modell

  1. Utarbeidelse av disseksjon løsninger og kunstig Cerebrospinalvæske
    1. Carbogenate ultrapure vann (som er vannet filtrert med en resistivitet av 18.2 MΩ·cm) med carbogen (95% O2/5% CO2) i 5 minutter bruke air stein boble diffusorer (bakgrunnsbilder for akvarier).
      Merk: Air steiner kan kobles til carbogen tankens regulator via standard silikon rør. Hvis luften steiner ikke er tilgjengelig, seal stengt slutten av silikon slangen og rote små hull i seglet for å tillate carbogen gass å boble ut og carbogenate løsningen.
    2. Forberede en disseksjon løsning ved å løse opp solutes fra tabell 1 i ultrapure vann. Legge til CaCl2 en løsning som har vært carbogenated i minst 5 minutter å hjelpe oppløse.
      Merk: Alternativt legge CaCl2 først, slik at det kan oppløse lett i en umettet. Løsningen, i flytende form, bør være 300-320 mOsm/L og har en pH på 7,4 etter blir mettet med carbogen.
      1. Chill disseksjon løsningen 0 - 4 ° C. La løsningen i kjøleskapet over natten eller plasser løsningen i fryseren 1t og kontinuerlig overvåke temperatur.
        Merk: Disseksjon løsningen kan lagres i opptil 3 netter. Kast etterpå.
      2. Carbogenate disseksjon løsningen for 5-10 min før bruk.
        Merk: Ideelt løsningen skal enten vises som slaps eller være overgang til slaps før bruk.
    3. Klargjør gnager kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) ved oppløsning solutes fra tabell 2 (eller tabell 3 for menneskelig ACSF) i ultrapure vann. Carbogenate den ACSF løsningen mens den er i et vannbad oppvarmet til 35 ° C før bruk. Legge til CaCl2 en løsning som har vært carbogenated i minst 5 minutter å hjelpe oppløse.
      Merk: Alternativt legge CaCl2 først slik at det kan oppløse lettere i en umettet. Løsningen, i flytende form, bør være 290-320 mOsm/L og har en pH på 7,4 etter blir mettet med carbogen. Løsninger bør gjøres i 1, 2 eller 4 L bind avhengig av varigheten av eksperimenter. Gjør 4 L for en hel dag (8 h) eksperimenter. ACSF bør være laget av dagen. Ikke oppbevar det i mer enn 1 d.
  2. Musen disseksjon samle hjernevev
    Merk: For menneskelig vev, Fortsett til neste trinn (trinn 1.3) å gjøre hjernen skiver med vibratome. Kube-formet blokker (1 cm3) av hjernevevet kan skaffes fra det nevrokirurg bruke prosedyrer beskrevet tidligere26,27.
    1. Samle alle verktøy og nødvendige materialer for dyr dissections. Opprettet arbeidsområdet for å forberede dyr dissections.
      1. Sjekk carbogen tanken (95 %O2/5%CO2) for å sikre ikke er tom. Erstatte gassflasken før eksperimenter hvis det er mindre enn 500 psi press igjen.
      2. Kalibrere vibratome (vibrerende blad vev slicer) i henhold til produsentens instruksjonshåndbok. Juster vibratome til en kutte amplituden til 1 mm og en hastighet på 0,12 mm/s.
        Merk: De optimale innstillingene kan variere for hver individuelle vibrerende vev blad kutter; men generelt amplituden bør være høyt og hastighet bør være lav.
      3. Fylle hjernen stykke inkubasjon kammeret (dvs., hjernen stykke keeper) med ACSF og boble det med carbogen. Plass inkubasjon kammeret i et vannbad satt på 35 ° C.
        Merk: Bruk gnager ACSF for gnager hjernen skiver og menneskelig ACSF for menneskelige hjerne skiver.
    2. Få en juvenil mus av begge kjønn, mellom alderen 13 d (p13) 21 d (p21, der p0 er fødselsdato).
    3. Bedøve musen med en intraperitoneal injeksjon av natrium pentobarbital (55 mg/kg kroppsvekt). Når musen er dypt anesthetized, som indikert av fravær av tå knipe refleks, raskt bruke en veterinær-godkjent giljotinen instrument for å halshugge musen i en rask bevegelse.
      Merk: Forberede natrium pentobarbital injeksjon i henhold til prosedyrene anbefalt av institusjonelle retningslinjer.
    4. Hold musen er nese å stabilisere decapitated hodet og forsiktig gjør en midtlinjen snitt mellom musen er øyne og langs hele lengden av hodebunnen å utsette skallen. Sikre skallen ikke er komprimert trykket av høvelen. Bruk hjørnet av razor's edge for å øke kuttet presisjon.
    5. Spredt fra hverandre flaps av musen er hodebunnen bruker fingrene til å utsette skallen. Deretter Bruk ferske hjørnet av en barberhøvel kanten for å gjøre et snitt langs midtlinjen av skallen; Pass på å unngå kontakt med hjernebarken.
    6. Sett inn splinter tang til musen er øyehulene å stabilisere decapitated hodet og legg den i en Petriskål fylt med kaldt (0 - 4 ° C) disseksjon løsning. Kontroller at hodet er fullstendig neddykket i disseksjon løsningen.
    7. Bruke andre splinter tang forsiktig løsner musen er hodebunnen, fjerne nese benet ved peeling det, og fjerne baksiden (caudal side) av skallen.
      Merk: Nese benet juvenile mus er veldig myk og lett ødelagt.
    8. Bruke en mikro slikkepott til å kutte den optiske nervene, trigeminal nerve og ryggmargen. Deretter Bruk micro spatula forsiktig skille hjernen fra kraniet. La hjernen fullstendig neddykket i Petriskål fylt med disseksjon løsning.
  3. Utarbeidelse av kortikale skiver fra somatosensory-motorisk cortex
    1. Fyll den vibratome bufferbrettet med ~ 150 mL kaldt (0 - 4° C) disseksjon løsning.
      Merk: Du kan også holde bufferbrettet i fryseren til nødvendig å opprettholde en lav temperatur under kutting prosedyren.
    2. Fest hjernevevet fra musen eller human på vibratome scenen (prøven holderen/brett) ved hjelp av øyeblikkelig selvklebende lim. For mus, kuttet av en liten caudal del av hjernen (dvs., lillehjernen) slik at det lett kan festes flatt på prøveholderen (slik at den rostral siden av hjernen mot taket).
      Merk: Alternativt vannrett musen hjernen skiver tilberedes av lime dorsal side av hjernen på prøveholderen (ventrale siden av hjernen skal vende taket)28.
    3. Forsiktig plassere prøveholderen (med hjernevev) i bufferbrettet. Kontroller at den dorsal delen av hjernen vender den vibratome blad.
      Merk: Det er viktig å minimere tiden hjernen er eksponert for luft.
  4. Hjernen vev snitting og samling
    1. Skjær hjernen i 450 μm tykke skiver ved hjelp av vibratome i det dorsal ventrale retning. Kontroller at hjernen blir helt forankret til prøven skuffen mens slicing det.
      1. Gjør det første kuttet i musen hjernen fjerne olfactory pære. Deretter gjøre senere kutt til området somatosensory-motor er observert (ligger omtrent halvveis mellom Luktelappen og bregma).
        Merk: Skjær eventuelt hjernen i tynnere (200 μm) skiver til corpus callosum vises i koronale del av hjernen, som angir at området somatosensory-motor er nær.
    2. Bruk en bred-fødte overføring pipette samle koronale skiver (450 μm) som inneholder området somatosensory-motor og senk dem i en Petriskål inneholder kalde (0 - 4 ° C) disseksjon løsning.
    3. Bruk en ny barberblad og kuttet alle overflødig vev fra skiver. For koronale skiver fra mus, kan du utføre en tverrgående kuttet rett under den neocortical commissure (dvs., corpus callosum). Ikke kutt i BT2508RC bevegelse; bare legge press på bladet inn i vevet og bruk en detaljering børste forsiktig skille i vevet. Sørg for å minimere bevegelse av koronale sektoren.
    4. Bruk en bred-fødte overføring pipette overføre delen dorsal koronale sektorene som inneholder neocortex (lag 1-6) til en andre Petriskål fylt med varm (35 ° C) ACSF et øyeblikk (~ 1 s). Deretter raskt overføre skiver til en inkubasjon kammeret som inneholder varm (35 ° C) carbogenated ACSF.
      Merk: Hensikten med overføring i Petriskål med ACSF er å minimere overføring av disseksjon løsning til inkubasjon kammeret ved overføring hjernen skiver med bred-fødte pipette. Bruke inkubasjon kammeret flere brønner å holde ulike hjernen skiver organisert.
    5. Kast resten av hjernen og dyr carcass i henhold til institusjonelle retningslinjer.
  5. Inkubasjon og vedlikehold
    1. La hjernen skiver litt neddykket i inkubasjon kammeret ved 35 ° C i 30 min. Deretter fjerne inkubasjon kammeret fra vannbad og tillate det å gå tilbake til romtemperatur (20-25 ° C). Vent 1 h for hjernen sektorene å gjenopprette før du utfører elektrofysiologiske innspillinger.
      Merk: Kontroller at det er ingen luftbobler som samler under hjernen sektorene i inkubasjon kammeret. Luftbobler er luft grensesnitt som skade vev. Musen hjernen skiver kan vedlikeholdes for 6-8 h, mens hjernevev kan lagres i opptil 24 timer i et godt-carbogenated inkubasjon kammer med den riktige ACSF.
  6. Elektrofysiologiske opptak av overfladiske kortikale laget
    Merk: Ictal hendelser er observert i ekstracellulære lokale feltet potensielle (LFP) opptak fra hjernen sektorene. LFP på hjernen sektoren kan observert og spilt inn med et grensesnitt type kammer29 eller en neddykket multi elektrode matrise (MEA) systemet16. Prosedyren er beskrevet tidligere16 og flere detaljer er beskrevet nedenfor.
    1. Bruk en bred-fødte overføring pipette eller detaljering pensel til å flytte et hjernen stykke på litt større pre-cut linsen papir som holdes på plass med en tannlege tweezer. Overføre linsen papiret (som hjernen stykket er hviler på) til opptak chamber og sikre det i posisjon med en harpe skjerm.
    2. Kjøre varm (35 ° C), carbogenated ACSF perfusate gjennom opptak kammeret over hjernen skive med en hastighet på 3 mL/min (~ 1 drypp/s). Bruk et digitalt termometer for å sikre opptak kammeret 33-36° C.
    3. Trekke glass elektroder med en impedans på 1-3 MΩ fra Borosilikatglass rør (med en ytre diameter på 1,5 mm) med en hevet. Etterfylle glass elektrodene med ACSF (~ 10 µL) bruker en Hamilton sprøyte. Umiddelbart forkaste elektroden hvis spissen er skadet.
      Merk: Bleach sølv wire (5 min) og bare tillate en minimal del (dvs., spissen) av sølv wire dyppes i ACSF rygg-fylte glasset elektrodene for å minimere støy og drift under opptakene. Fjerne alle overflødig ACSF fra glass elektroden med Hamilton montering om nødvendig.
    4. Bruk 20 X stereo mikroskop nøyaktig guide opptak glass elektroden i overfladiske kortikale lag (2/3) bruke manuell manipulators. Post/vise den elektriske aktiviteten i hjernen sektoren på en datamaskin med programvare.
      Merk: Levedyktig (høy kvalitet) hjernen skiver har en robust evoked potensial anvendt elektrisk stimuli (100 µs, 30-300 μA) eller lyspulser (30 ms, 10 mW/mm2) for optogenetic vev.
  7. Induksjon av anfall-lignende aktiviteter
    1. Perfuse ACSF som inneholder 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) over hjernen sektoren. Oppløse 80 mg 4-AP i 8,5 mL vann for å lage en lagerløsning 100 mM 4-AP. legge 100 µL av 100 mM 4-AP lagerløsning til 100 mL ACSF å oppnå en ACSF perfusate med 100 µM 4-AP.
      Merk: Alternativt bruke null-Mg2 + ACSF (Tabell 4), en modifisert ACSF løsning som inneholder ingen ekstra Mg2 +, for å perfuse hjernen sektoren. For menneskelig vev, bruk en kombinasjon av 100 µM 4-AP i null-Mg2 + menneskelig ACSF (tabell 5) for å oppnå optimale resultater. Gjennomsnittlig tid for ictal hendelser skal vises er 15 min; Det kan imidlertid ta opptil 40 min for noen hjernen skiver.
  8. Behovsbetinget anfall generasjon: en optogenetic strategi for optogenetic mus
    1. Bruke en kort (30 ms) puls blå (470 nm) lys (med en minimum 1 mW/mm2 produksjon intensitet) til å starte en ictal hendelse. Bruk en manuell manipulator for å plassere en 1000 µm kjernen diameter optisk fiber (0.39 NA) direkte over regionen opptak.
      Merk: Angi frekvensen av foto-stimulering tilsvarer det ønskede rate av ictal hendelsen (dvs.1 puls hver 50 s). Men kan ikke prisen være altfor overdrevet fra den indre rate som ictal hendelser inntreffer.
  9. Behovsbetinget anfall generasjon: en ikke-optogenetic strategi for menneskelig vev
    1. Plasser hjernen sektoren slik at overfladisk lagene er oppstrøms, og de dype lag nedstrøms til flyt av perfusate gjennom opptak kammeret.
    2. Trekke en glass elektrode (av samme type som brukes til LFP opptakene) og trykk forsiktig spissen sin med en delikat oppgave vindusvisker opprette en liten åpning. Etterfylle elektroden med ~ 25 µL av 100 mM GABA (oppløst i vann) og knytte den til picospritzer. Alternativt etterfylle elektroden med 200 µM glutamat (oppløst i vann).
      Merk: For å beregne volumet blir andpusten fra picospritzer (~ 50 µL), gjelde en test puff på en plast-plate (fortrinnsvis gridded). Bruk deretter en dråpe kjent volumer (dvs, 10 µL, 20 µL, 50 µL eller 100 µL) med en pipette for en sammenligning test puff.
    3. Bruke puffs av nevrotransmitter (GABA eller glutamat) til menneskelig vev med en picospritzer (10-20 psi i 30-100 ms) for å starte en ictal hendelse. Bruke en enkelt puff 100 mm GABA på det dype hudlaget (5) hjernevev å generere ictal hendelser i den overfladisk layer (2/3). Alternativt bruke en enkelt puff av 200 µM glutamat direkte på overfladiske laget til å generere ictal hendelser i den overfladisk layer.
      Merk: Angi frekvensen av picospritzer puff tilsvarer det ønskede rate av ictal hendelsen (dvs.1 puls hver 50 s). Men kan ikke prisen være altfor overdrevet fra den indre rate som ictal hendelser inntreffer.

2. protocol II: Akutt i vivo anfall modell

  1. Kirurgisk forberedelse og kirurgi
    1. Få en voksen mus (p35 - p60) av begge kjønn.
    2. Dypt bedøve musen med ketamin (95 mg/kg) og Xylazine (5 mg/kg). Utføre tå-klype refleks testen for å sikre at musen er bedøvet. Alternativt, bruk isoflurane (4% for induksjon, 1,5-2% for kirurgi) å bedøve musen.
      Merk: Valg av bedøvelse kan påvirke beslag aktivitet30,31.
    3. Monter musen i en stereotaxic ved å sikre hodet med øret barer. Plass en oppvarmet pad under musen for varigheten av operasjonen.
    4. Barbere toppen av musen er hodet med en gnager trimmer for å avsløre hodebunnen. Injisere 0,3 mL lidocaine med 25 G 5/8 i p i periosteum å unngå overdreven blødning eller smerte. Bruke øye ointment musen er øynene for å hindre uttørking under eksperimentet.
    5. Knip og løft midten av musen er hodebunnen å vurdere om sin reflekser er borte. Deretter utføre en vannrett kuttet for å avsløre bregma lambda regionen av skallen. Forsiktig skrape hele eksponert område av skallen med en bomull swab å skape en tørr overflate.
    6. Utføre en craniotomy på 4 mm i diameter på koordinatene 2.0 mm lateromedial og-2.0 mm rostrocaudal å avsløre somatosensory cortex. Merk plasseringen med en sirkel (4 mm i diameter) med et permanent markør. Drill rundt sirkelen med en pneumatisk tannlege bore inntil den gjenværende lag av craniotomy benet gir lett måte når presset. Bruke saltvann på laget av bein før du fjerner craniotomy med splinter tang. Deretter bruke varmt saltvann regionen eksponert.
  2. Opptak metoder og kjemiske induksjon beslag
    1. Trekke glass elektroder med en impedans på 1-3 MΩ fra Borosilikatglass rør (med en ytre diameter på 1,5 mm) med en hevet. Etterfylle glass elektrodene med ~ 10 µL ACSF eller saltvann bruker en Hamilton sprøyte. Umiddelbart forkaste elektroden hvis spissen er skadet.
      Merk: Bleach sølv wire (5 min) og bare tillate en minimal del (dvs., spissen) av sølv wire dyppes i ACSF rygg-fylte glasset elektrodene for å minimere støy og drift under opptakene. Fjerne alle overflødig ACSF fra glass elektroden med Hamilton montering om nødvendig.
    2. Bruk en manuell manipulator å glass elektroden i overfladiske kortikale lag (2/3) i somatosensory-motor området. Post/vise den elektriske aktiviteten i hjernen sektoren på en datamaskin med programvare.
      Merk: Lag 2/3 er ca 0,3 mm dyp fra overflaten32.
    3. Lokalt gjelde ~0.5 mL 1,5 mM 4-AP saltvann på utsatte cortex av musen med en sprøyte til det helt dekker craniotomy. Oppløse 14 mg av 4-AP i 100 mL isotonic saltoppløsning å gjøre en lagerløsning 1,5 mM 4-AP saltoppløsning.
      Merk: Forberede 4-AP saltkildene før eksperimentet begynner. Ictal hendelser vises i gjennomsnitt 15-30 min etter lokal applikasjon.
  3. Behovsbetinget generasjon beslag i optogenetic mus
    1. Bruke en kort (30 ms) puls blå (470 nm) lys (med en minimum 10 mW/mm2 produksjon intensitet) til å starte en ictal hendelse. Bruk en manuell manipulator for å plassere en 1000 µm kjernen diameter optisk fiber (0.39 NA) direkte over regionen opptak.
      Merk: Angi frekvensen av foto-stimulering tilsvarer det ønskede rate av ictal hendelsen (dvs.1 puls hver 300 s). Men kan ikke prisen være altfor overdrevet fra den indre rate som ictal hendelser inntreffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Anvendelsen av 100 µM 4-AP til god kvalitet (uskadet) 450 µm størrelse kortikale hjernen skiver fra en juvenil VGAT-ChR2 mus pålitelig indusert tilbakevendende ictal hendelser (> 5 s) innen 15 min (figur 1Ai). Anvendelsen av 100 µM 4-AP til skiver av dårlig kvalitet ført sprengning hendelser eller skyter aktivitet (figur 1Aii). Gjennomsnittlig generert 40% av skivene hver dissekert musen hjernen ble ictal hendelser. Videre resulterte 83% (25/30) av dissekert mus i minst en hjerne sektoren som ble generert ictal hendelser. I hjernen skiver med spontant forekommende ictal hendelser, anvendelse av et kort 30 ms lys pulsen på hjernen skive pålitelig utløste en ictal hendelse som var identiske i morfologi (figur 1Aiii og 1Aiv). De samme funnene ble gjort i hjernen skiver fra Thy1-ChR2 mus (figur 1B). Dermed uansett hvilken neuronal-subpopulasjon ble aktivert, noen kort synkronisering hendelse i den isolerte kortikale nettverk førte til utbruddet av en ictal hendelse. Disse ictal hendelsene ble omfattet av sentinel (preictal) spike (figur 2Aii og 2Bii), tonic som avfyring (figur 2Aiii og 2Biii), kloniske som avfyring (figur 2Aiv og 2Biv), og sprengning aktivitet mot slutten (figur 2Av og 2Bv); de var lik electrographic signaturene knyttet klinisk beslag33i naturen. Videre var disse juvenile mus fysiologisk voksen-lignende som tillegg av 10 µM bumetanide (BOMS), en NKCC1 blokkering, hadde ingen effekt på de resulterende ictal hendelsene (figur 2).

I vitro 4-AP kortikale skive modellen generert pålitelig konsekvent ictal hendelser for ~ 1 h (figur 1Ai), mens null-Mg2 + modellen vanligvis genereres ictal hendelser for ~ 10 min før raskt forvandle seg til burst-lignende aktivitet ( Figur 3A). Men hvis en ikke-4-AP metode for anfall induksjon, kan null-Mg2 + modellen endres med tillegg av 5-10 µM baclofen (en GABAB reseptorer Agonistiske) å transformere sprengning aktiviteten tilbake til ictal hendelser (figur 3B) . Generelt, gjengitt metoder for ikke-disinhibition øke excitability (dvs., 4-AP eller null-Mg2 + ACSF) pålitelig ictal hendelser i kortikale hjernen skiver. I kontrast resulterte metoder for disinhibition [dvs., bicuculline (BMI), en GABAA reseptor antagonist] i skyter aktivitet minner om interictal aktivitet eller sprengning aktivitet, i stedet for ictal hendelser (figur 4A). Tilsvarende akutt anfall modeller forberedt fra 100 µM 4-AP-behandlet hippocampus skiver generert interictal som skyter aktiviteten eller statusen epilepticus-lignende forhold i CA3 (figur 4B). I vivo 4-AP kortikale modellen generert tilsvarende tilbakevendende ictal hendelser (> 5 s). Ictal hendelser ble observert i den overfladisk layer (2/3) innen ~ 30 min lokalt bruke 1.5 mM 4-AP på utsatte cortex voksen VGAT-ChR2 mus. Anvendelsen av et kort 30 ms lys pulsen på utsatte cortex utløst pålitelig ictal hendelser som var morphologically lik de som oppstår spontant (figur 5).

Programmet av null-Mg2 + menneskelige ACSF med 100 µM 4-AP til ikke-epileptiske kortikale hjernen skiver (450 µm) fra tinninglappen epilepsi pasienter pålitelig generert tilbakevendende ictal hendelser (> 5 s) innen ~ 30 min (figur 6Ai og 6Bi). Skiver av dårlig kvalitet generert skyter aktivitet eller ingen aktivitet (figur 1Aii). Levedyktigheten til hjernen stykker ble ansett som "god kvalitet" når en kort elektrisk stimulans (100 µs, 30-300 µA) forårsaket en robust, evoked respons i LFP i begynnelsen av eksperimentet. Når ictal hendelser begynte å utløse, utløste anvendelse av en kort puff (75 ms på 20 psi) 100 mm GABA på hjernen stykket pålitelig ictal hendelser som var identiske i morfologi til de oppstår spontant (figur 6Aii og 6Aiii) . En lavere konsentrasjon av GABA, 100-200 µM, vil trolig være effektiv også for i vitro eksperimenter34; imidlertid anbefales en høyere konsentrasjon av GABA, 100 mM, for i vivo eksperimenter35. De samme observasjonene ble reprodusert da en kort puff av 200 µM glutamat ble utlignet mot menneskelige hjerne skiver (figur 6Bii og 6Biii). Dermed uansett hvilken post synaptiske reseptorer var aktivert, utløste en kort synkronisering hendelse i isolerte menneskelige kortikale nettverk pålitelig en ictal hendelse.

Figure 1
Figur 1: Akutt i vitro 4-AP kortikale anfall modell. Den svarte linjen representerer lokale feltet potensielle (LFP) opptak; de blå linjene representerer lys stimulans. (A) disse panelene er basert på resultatene fra en VGAT-ChR2 musemodell. De illustrerer ictal hendelser i LFP innspillingen fra overfladisk laget (2/3) av en høy kvalitet kortikale hjernen skive behandlet med 100 µM 4-AP. jeg) dette panelet viser en oversikt over LFP innspillingen. ii) Dette er eksempler på LFP innspilling fra dårlig kvalitet hjernen skiver. Baren loddrette skalaen er 0,4 mV, vannrette skala baren er 20 s. iii) Dette er en zoomet inn visningen av en lys-utløst ictal hendelse. iv) Dette er en zoomet inn visningen av en spontan ictal hendelse. (B) disse panelet er basert på resultatene fra en Thy1-ChR2 musemodell. De illustrerer ictal hendelser i LFP innspillingen fra overfladisk laget (2/3) av en kortikale hjernen skive behandlet med 100 µM 4-AP. jeg) dette panelet viser en oversikt over LFP innspillingen. ii) Dette er en zoomet inn visningen av en lys-utløst ictal hendelse. iii) Dette er en zoomet inn visningen av en spontan ictal hendelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Ictal hendelser generert i en hjernen stykke (layer 2/3) fra en juvenil (p13) VGAT-ChR2 mus parfyme med 4-AP og bumetanide (BOMS). Den svarte linjen representerer lokale feltet potensielle (LFP) opptak; de blå linjene representerer lys stimulans. (A) disse panelene viser spontane ictal hendelse. jeg) dette panelet viser en oversikt over hele ictal hendelsen. Følgende paneler Vis ii) en sentinel pigg, iii) tonic som avfyring, iv) kloniske som skyting og v) sprengning aktivitet. (B) disse panelene viser en lys-utløst ictal hendelse. jeg) dette panelet viser en oversikt over hele ictal hendelsen. Følgende paneler Vis ii) en lys-utløst sentinel spike fra samme stykke opptak, iii) tonic som avfyring, iv) kloniske som skyting og v) sprengning aktivitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Akutt i vitro null-Mg2 + kortikale anfall modell. Den svarte linjen representerer lokale feltet potensielle (LFP) opptak; de blå linjene representerer lys stimulans. (A) Disse sidene er basert på resultatene fra en VGAT-ChR2 musemodell. jeg) dette panelet viser statusen epilepticus-lignende forhold i LFP innspillingen fra overfladisk laget (2/3) av en kortikale hjernen skive behandlet med null-Mg2 + ACSF. ii) Dette er en zoomet inn visningen av en lys-utløst ictal hendelse. iii) Dette er en zoomet inn visningen status epilepticus-lignende sprengning aktivitet. (B) disse panelene viser samme stykke med tillegg av baclofen. jeg) bruk av 5 µM baclofen til den null-Mg2 + ACSF forvandler sprengning aktiviteten tilbake til forskjellige, tilbakevendende ictal hendelser. ii) Dette er en zoomet inn visning av sprengning aktivitet. iii) Dette er en zoomet inn visning av forskjellige ictal hendelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Akutt i vitro sprengning/skyter modeller. Den svarte linjen representerer lokale feltet potensielle (LFP) opptak; de blå linjene representerer lys stimulans. (A) disse panelene viser resultatene fra en kortikale skive fra en VGAT-ChR2mouse, illustrerer sprengning aktiviteten i overfladiske lag (2/3) etter tillegg av 10 µM BMI 100 µM 4AP. jeg) Dette er en oversikt over LFP innspillingen. Stiplede røde linjen angir når BMI trådte i kraft. ii) Dette er en zoomet inn visningen av en lys-utløst ictal hendelse. iii) Dette er en zoomet inn visning av spontane sprengning aktivitet. (B) disse panelene viser resultatene fra en hippocampus skive fra VGAT-ChR2 mus, illustrerer en status epilepticus-lignende hendelse observert i CA3 området etter anvendelsen av 100 µM 4AP. i) Dette er en oversikt over LFP innspillingen. ii) Dette er en zoomet inn visningen av en ictal hendelse. iii) Dette er en zoomet inn visning av lys-utløst og spontan sprengning hendelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Akutt i vivo 4-AP kortikale anfall modell. Den svarte linjen representerer lokale feltet potensielle (LFP) opptak; de blå linjene representerer lys stimulans. (A) disse panelene vise resultatene av en voksen (p56) VGAT-ChR2 musemodell med 1.5 mM 4-AP brukes topically eksponert cortex. jeg) dette panelet illustrerer en lys-utløst ictal hendelse i den overfladisk layer (2/3) av området somatosensory-motor. ii) Dette er en zoomet inn visning av lys-utløst ictal hendelsen fra panelet Ai. iii) Dette er en super zoomet inn visning av utbruddet av lys-utløst ictal hendelsen (angitt med den svarte pilen). Dette tallet er ufiltrert versjon av en figur fra Chang et al. 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Akutt i vitro menneskelige kortikale anfall modell. Den svarte linjen representerer lokale feltet potensielle (LFP) opptak; brun linjene representerer picospritzer puff. (A) disse panelene viser resultatene av en kortikale hjernen skive fra en mediale tinninglappen epilepsi (MTLE) pasient, illustrerer ictal hendelsene observert i overfladiske lag (2/3) etter en perfusjonsmåling med 100 µM 4-AP og null-Mg2 + menneskelig ACSF . jeg) Dette er en oversikt over LFP innspillingen. Følgende paneler Vis ii) zoomet inn utsikt over en 100 mM GABA puff-utløst ictal hendelse og iii) et zoomet inn visningen av en spontan ictal hendelse. (B) disse panelene viser resultatene av en kortikale hjernen skive fra en annen MTLE pasient, illustrerer ictal hendelsene observert i overfladiske lag (2/3) etter en perfusjonsmåling med 100 µM 4-AP og null-Mg2 + menneskelige ACSF. jeg) Dette er en oversikt over LFP innspillingen. Følgende paneler Vis ii) zoomet inn utsikt over en 200 µM glutamat puff-utløst ictal hendelse og iii) et zoomet inn visningen av en spontan ictal hendelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tabell 1: oppskrift disseksjon løsning. Dette er å gjøre 1 L eller 2 L volumer. MW = molekylvekt av stoff.

# Reagens CONC. [mM] MW (g/mol) 1L (g) 2L (g)
1 Sukrose 248 342.3 84.89 169.78
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 2,18 4,37
3 Druesukker (D-glukose) 10 180.16 1.8 3.6
4 Kalium klorid (KCl) 2 74.55 0,15 0,3
5 Magnesium sulfat (MgSO4·7H2O) 3 246.47 0.74 1.48
6 Natrium fosfat monobasic monohydrat (H2NaPO4· H2O) 1.25 137.99 0,17 0,34
7 Veisalt (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,15 0.29

Tabell 2: oppskrift på gnager kunstig hjerne spinalvæske (ACSF). Dette er å gjøre 2 L eller 4 L volumer. MW = molekylvekt av stoff.

# Reagens CONC. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumklorid (NaCl) 123 58,4 14.37 28.73
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 4,37 8.74
3 Druesukker (D-glukose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Kalium klorid (KCl) 4 74.55 0,6 1,19
5 Magnesium sulfat (MgSO4· H2O) 1.3 246.47 0.64 1,28
6 Natrium fosfat monobasic monohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Veisalt (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0.44 0,88

Tabell 3: oppskrift på menneskelig kunstig hjerne spinal væske (human ACSF). Dette er å gjøre 2 L eller 4 L volumer. MW = molekylvekt av stoff.

# Reagens CONC. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumklorid (NaCl) 123 58,4 14.38 28.75
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 25.2 84.01 4.23 8.46
3 Druesukker (D-glukose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Kalium klorid (KCl) 4 74.55 0,6 1,19
5 Magnesium sulfat (MgSO4· H2O) 1 246.47 0.49 0.99
6 Natrium fosfat monobasic monohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Veisalt (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0.29 0,59

Tabell 4: oppskrift på null-Mg 2 + gnager kunstig hjerne spinalvæske (null-Mg2 + ACSF). Dette er å gjøre 2 L eller 4 L volumer. MW = molekylvekt av stoff.

# Reagens CONC. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumklorid (NaCl) 123 58,4 14.37 28.73
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 4,37 8.74
3 Druesukker (D-glukose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Kalium klorid (KCl) 4 74.55 0,6 1,19
5 Magnesium sulfat (MgSO4· H2O) Nominelt gratis 246.47 0 0
6 Natrium fosfat monobasic monohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Veisalt (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0.29 0,59

Tabell 5: oppskrift på null-Mg 2 + menneskelig kunstig hjerne spinalvæske (null-Mg2 + human ACSF). Dette er å gjøre 2 L eller 4 L volumer; MW = molekylvekt av stoff.

# Reagens CONC. [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumklorid (NaCl) 123 58,4 14.38 28.75
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 25.2 84.01 4.23 8.46
3 Druesukker (D-glukose) 10 180.16 3.6 7.21
4 Kalium klorid (KCl) 4 74.55 0,6 1,19
5 Magnesium sulfat (MgSO4· H2O) Nominelt gratis 246.47 0 0
6 Natrium fosfat monobasic monohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Veisalt (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0.29 0,59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjernen skiver behandles med et proconvulsant stoff eller en forandret ACSF perfusate å øke nettverks excitability og fremme nedbør ictal hendelser (electrographic anfall-lignende hendelser). Mus, bør foretrukne koronale skiver av somatosensory-motor området inneholde cingulate cortex, område 2 (CG), men ikke retrosplenial området (RS); disse anatomiske markørene å identifisere hvilket koronale skiver som er best for å indusere ictal hendelser. En valgfri modifikasjon for mus vev er å halvert de to halvkulene av hjernen sektoren for matchet par eksperimentell design, som de to halvkulene er nesten identisk (lignende eksperimentelle enheter). Når forberede hjernen skiver til å generere ictal hendelser, er det viktig å opprettholde integriteten til nettverk og synaptic tilkoblingene, fordi ictal hendelser er et nettverk fenomen. Tre poeng i trinn 1 av protokollen som er avgjørende for skive kvalitet er 1) den kutting prosedyren, 2) inkubasjon og 3) oksygenering. Først krever kutting prosedyren en balanse imellom fart og teknikk. Det er viktig å minimere tiden mellom halshogging (eller kirurgisk resection) og inkubasjon, samtidig være forsiktig med hver kontakt og bevegelse på hjernen sektoren å unngå skader. Dernest er kvaliteten av vev svært følsomme for inkubasjon temperatur og varighet. Det er viktig å bruke en tidtaker og termometer for å sikre inkubering er på 35 ° C for 30 min. det tredje levedyktigheten til hjernevev er følsom for eksponering til noe annet enn oksygenrikt (kunstig) hjerne spinalvæske. Hjernen stykket utløper hvis det ikke er parfyme med carbogenated ACSF lengre (~ 1 min).

Hjernen skiver fra mus alderen p13 - p16 tilbyr den høyeste sannsynligheten for å kunne generere ictal hendelser. Grunnen er at mus ≤ p16 ikke krever en transcardial perfusjon før disseksjoner. Dette effektivt reduserer sjansen for feil og raskere disseksjon, som er en stor fordel, fordi tiden mellom halshogging og inkubasjon omvendt korrelert med hjernen stykket levedyktighet. I mellomtiden mus > p13 har redusert mengder NKCC1 som sammenlignes med en voksen36. Generelt, juvenile (< p21) vev er mer levedyktige enn voksen vev på grunn av en eksepsjonell evne til å gjenopprette fra skade kutting prosedyren. Denne ukelange vinduet mellom p13 og p21 tilbyr muligheten til å utnytte mus voksen-lignende fysiologi og ungdoms-lignende evne til å generere ictal hendelser37,38. Men hvis eksperimenter krever studere ictal hendelser i hjernen skiver fra voksne mus, vil en NMDG-basert ACSF med HEPES, thiourea og ascorbate hjelpe fremme levedyktigheten til voksen vev24,39,40, 41. for menneskelig vev, tillegg av antioksidanter, som α-tokoferol, disseksjon løsningen kan nytte vev levedyktighet, spesielt under langdistanse transport (> 30 min) mellom operasjonsstuen og laboratorium for kutting8,26. For alle hjernen skiver er gunstige forholdene generere ictal hendelser å ta opp fra 450 µm tykke skiver på 36 ° C. Hjernen skiver må være minst 350 µm tykk inneholder nok nerveceller i nettverk for å generere strukturerte ictal hendelsen. Men sektorer kan ikke være tykkere enn 500 µm, slik som det vil gjøre det vanskelig for oksygen å spre inn i sentrum av vev. Skiver som er 450 µm representerer en optimal tykkelse, der en rikelig mengde nevrale nettverk connectivity opprettholdes uten hindrer perfusjon av oksygen i vevet. Til slutt, nedbør av ictal hendelser er optimal på 33-36 ° C; Hvis opptaket kammeret ikke er minst 33 ° C, vil det være vanskelig for ictal hendelsene.

En begrensning av akutt anfall modellen er at de ikke generere beslag. De bare generere ictal events som electrographic signaturen av et anfall. Ictal hendelser har ingen tilknyttede atferdsmessige komponenter, for eksempel tap av bevissthet eller motor kramper som definerer et anfall. Følgelig kan ikke akutt anfall modeller brukes til å bekrefte effektiviteten av potensielle anti-beslag narkotika kandidater eller få innsikt i epileptogenesis; slike problemstillinger skal rettes ved kronisk epilepsi modeller og kliniske studier. Akutt anfall modeller bør brukes bare for sitt tilsiktede formål å utføre grunnleggende forstudier på anfall mekanismer. Bare de mest lovende funnene fra akutt anfall modeller skal bli avansert på høyere modeller som er dyrere, arbeidskrevende å forberede, og krever mye mer kompleks etiske hensyn.

For å gjøre fremskritt i epilepsi og beslag, er det viktig å ha en pålitelig akutt anfall modell som replikeres nøyaktig electrographic beslag aktivitet observert klinisk i EEG av beslag pasienter. Pålitelig reprodusere ictal hendelser i hjernen skiver, er ikke-disinhibition metoder for økt excitability nødvendig, mens metoder for disinhibition (dvs., GABAA reseptor antagonist BMI) vanligvis føre skyter aktivitet minner om interictal aktivitet, i stedet for ictal hendelser (figur 3A). Den foretrukne metoden for ikke-disinhibition er å bruke proconvulsant agent 4-AP fordi det sikkert kan generere konsistent ictal hendelser 1t. I kontrast, genererer null-Mg2 + kortikale modellen ictal hendelser i bare ~ 10 min før raskt forvandle seg til burst-lignende aktivitet (figur 2A). Hvis bruker null-Mg2 + modellen, tillegg av 5-10 µM baclofen, vil en GABAB reseptor Agonistiske, bidra til å transformere sprengning aktiviteten tilbake til ictal hendelser (figur 2B), som tidligere vist i hippocampus skiver42. Videre er i vitro 4-AP anfall modellen foretrukket, fordi resultatene fra denne modellen kan replikeres i sin i vivo motpart, i vivo 4-AP kortikale anfall modellen (Figur 4). Det er ikke mulig å endre det hele hjerne spinalvæske av live voksen mus å gjenskape akutt i vivo null-Mg2 + miljøet.

Bruk av 4-AP i kortikale hjernen skiver kan gjengi beslag aktivitet observert klinisk15,33. Derimot er 4-AP-behandlet hippocampus skiver disponert for å generere interictal som skyter aktivitet43 og status epilepticus-lignende forhold (figur 3B). Derfor, for å studere beslag, akutt i vitro 4-AP kortikale modellen er foretrukket over i vitro 4-AP hippocampus modellen. Det er nesten ingen muligheter til å ta opp fra levedyktig menneskelige hippocampus skiver, som mest hippocampus resections har CA1 og CA3 skadet21. Derimot er ikke-patologisk menneskelig kortikale vev lettere tilgjengelig som det er sekundære utfallet av subkortikal neurosurgical prosedyrer som tinninglappen epilepsi kirurgi. Ikke-epileptiske 'administrere' neocortical vev kan også skaffes fra svulst resection kirurgi. For disse grunner er cortex foretrukket sted for modellering beslag aktivitet på grunn av sin mobilitet mellom mus og menneskelig vev å bekrefte kliniske relevans. Til slutt, C57BL/6 belastningen av mus er foretrukket fordi de lett uttrykke effekter av transgener, og optogenetic varianter er kommersielt tilgjengelig. Optogenetic mus modeller tillate behovsbetinget initiering av ictal arrangementer via en minimal invasiv, kort lys stimulering. Dette gjør studiet av beslag utrolig effektiv ved å eliminere ventetider og tillate målrettet aktivering av neuronal subpopulasjoner. Videre gir kan utløse beslag på forespørsel nye måter å definitivt avgrense nøyaktig hvor anfall initiering og potensielt studere effektiviteten av anti-beslag narkotika kandidater. Et brukervennlig MATLAB-basert program er spesielt utviklet for å oppdage og klassifisere ulike typer epileptiform hendelser som oppstår i vitro og in vivo 4-AP anfall modeller. Denne oppdagelsen programmet er tilgjengelig for nedlasting fra Valiante Lab GitHub oppbevaringssted (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske institutter for helseforskning (MOPP 119603 Peter L. Carlen og Taufik A. Valiante), Ontario hjernen Institute (til Taufik A. Valiante) og Mightex Student Research Grant (til Michael Chang). Vi vil gjerne takke Liam Long for hans hjelp filming video manuskriptet. Vi ønsker å erkjenne Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran og Shadini Dematagoda for deres hjelp i kompilering figurer og tabeller i dette manuskriptet. Tallene 1A, 3A, 4Aog 6A er alle opprinnelige tallene fra data publisert i Chang et al. 16.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium pentobarbital N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe N/A N/A Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle N/A N/A Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue N/A N/A Purchased through UT Med Store
Lens paper N/A N/A Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula N/A N/A Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end N/A N/A Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0 N/A N/A Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer N/A N/A Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital) N/A N/A Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2 N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome Leica N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)  Scientific Systems Design Inc N/A
Sodium Chloride (NaCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dextrose N/A N/A Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sucrose N/A N/A Purchased through UT Med Store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19, (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53, (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81, (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342, (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22, (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31, (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511, (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50, (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95, (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30, (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137, (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88, (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55, (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25, (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1, (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61, (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42, (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31, (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7, (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23, (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468, (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7, (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26, (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303, (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410, (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50, (1), 98-110 (2006).
Generasjon og behovsbetinget initiering av akutt Ictal aktivitet i gnagere og menneskelig vev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).More

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter