Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Generation och On-Demand inledandet av akut Ictal aktivitet i gnagare och mänsklig vävnad

doi: 10.3791/57952 Published: January 19, 2019

Summary

Akut beslag modeller är viktiga för att studera mekanismerna bakom epileptiform händelser. Förmågan att generera epileptiform händelser på begäran ger dessutom en mycket effektiv metod för att studera det exakta händelseförloppet som ligger bakom deras inledande. Här beskriver vi de akuta 4-aminopyridin kortikala beslag modeller etablerat mus och mänsklig vävnad.

Abstract

Kontrollera kramper är fortfarande en utmanande problem för läkarkåren. För att göra framsteg, måste forskarna utförligt studera beslag dynamics och undersöka dess underliggande mekanismer. Akut beslag modeller är bekväma, erbjuder möjligheten att utföra elektrofysiologiska inspelningar och kan generera en stor mängd electrographic beslag-liknande (ictal) händelser. De lovande resultaten från akut beslag modeller kan sedan vara avancerade till kronisk epilepsi modeller och kliniska prövningar. Således, studera anfall i akut modeller som troget efterbilda electrographic och dynamiska underskrifter av kliniska anfall kommer vara avgörande för att göra kliniskt relevanta fynd. Studera ictal händelser i akut beslag modeller beredd från mänsklig vävnad är också viktigt för att göra fynd som är kliniskt relevant. Viktiga fokuserar i denna uppsats på den kortikala 4-AP-modellen på grund av dess mångsidighet generera ictal händelser i både i vivo och in vitro- studier samt i både mus och mänsklig vävnad. Metoderna i denna uppsats kommer att också beskriva en alternativ metod för beslag induktion med noll-Mg2 + modell och ger en detaljerad översikt över fördelar och begränsningar av den epileptiform-liknande verksamhet i de olika akut beslag-modeller. Dessutom genom att utnyttja kommersiellt tillgängliga optogenetic mus stammar, kan en ljuspuls i korthet (30 ms) användas för att utlösa en ictal händelse som är identiska med dem som uppstår spontant. Likaså, 30-100 ms puffar av neurotransmittorer (Gamma-Amino smörsyra eller glutamat) kan tillämpas på den mänskliga vävnaden att utlösa ictal händelser som är identiska med dem som uppstår spontant. Förmågan att utlösa ictal evenemang på begäran i akut beslag modeller erbjuder nyfunna förmåga att iaktta det exakta händelseförloppet som ligger bakom beslag inledande dynamics och effektivt utvärdera potentiella anfallsskydd terapier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Akut beslag modeller kan framgångsrikt återskapa electrographic signaturer som påminner om ictal händelser observerades i elektroencefalogram (EEG) individer upplever ett beslag. Forskare använder dessa ictal-liknande händelser (hädanefter kallas 'ictal evenemang') som surrogat för beslag händelse1. Kliniskt, tjäna ictal händelser som en pålitlig proxy för beslag händelser eftersom anfall är en neurologisk sjukdom som härstammar från hjärnan. I epilepsi övervakningsenheten åberopa neurologer upptäckt av ictal händelser att bekräfta hjärnans epileptogena region och isolera det för resektion2. I intensivvårdsavdelning övervaka läkare ictal aktivitet för att bedöma om eventuella krampaktivitet kvarstår i sederad patienter3. Kontrollera kramper återstår att en utmanande fråga för det medicinska samfundet, eftersom 30% av epilepsipatienter är resistenta till tillgängliga medicinering4,5och 10% av medicinska ärenden som rör läkemedelsinducerad kramper inte svarar på standardbehandling3. Detta utgör ett allvarligt problem för samhället, som 10% av den amerikanska befolkningen är prospekterat för att uppleva en beslag händelse under sin livstid och 3% förväntas utveckla epilepsi6.

Studera anfall i kronisk epilepsi modeller är dyra, mödosam och ofta ta månader att förbereda7. Det är också svårt att utföra elektrofysiologiska inspelningar i fritt rörliga djur. Kliniska prövningar möta liknande problem, samt ytterligare komplikationer relaterade till patientens samtycke, variabilitet i deltagarnas bakgrunder och de moraliska och etiska överväganden inblandade8. Akut beslag modeller, däremot, är gynnsamma eftersom de är relativt bekvämt att förbereda, kostnadseffektiva och kan generera stora volymer av ictal händelser för studien9. Vävnaden är dessutom fast i ett stabilt läge, så förutsättningarna är idealisk för att utföra nödvändigt att studera beslag dynamics och relaterade underliggande patofysiologin elektrofysiologiska inspelningarna. Akut beslag modeller förblir gynnsamt över i silico (dator) modeller eftersom de är baserade på biologiskt material består av hjärnans konstituerande neuronala nätverk med alla dess inneboende faktorer och synaptic anslutning, som inte kan fångas av även de mest detaljerade dator modeller10. Dessa funktioner gör akut beslag modeller redo för att vara effektiv screening för potentiella anfallsskydd terapier och göra preliminära resultat innan dem för vidare utredning i kronisk epilepsi modeller och kliniska prövningar.

Typiskt, akut beslag modeller härleds från normal hjärnvävnad som har utsatts för hyper-hetsiga förhållanden. För att inducera kliniskt relevanta ictal händelser i frisk hjärnvävnad, är det viktigt att förstå att hjärnan fungerar optimalt i ett kritiskt tillstånd11 där excitation (E) och hämning (I) är balanserat12. En störning av E-jag balans kan leda till hyper-retbara beslag staten där fällningen ictal händelser. Inom denna konceptuella ram, det finns därför två viktiga strategier för att generera ictal händelser i hjärnan skivor (in vitro-) eller hela-hjärnan (i vivo) preparat: antingen minskad hämning (”avhämning”) eller ökade magnetisering (”icke-avhämning”). Dock ictal händelser sorteras högt och synkroniserade händelser som kräver påverkan av GABAergic interneuroner att orkestrera den neurala nätverk aktivitet13,14. Av denna anledning är icke-avhämning modeller de mest effektiva för generera ictal händelser i isolerade neurala nätverk, såsom i en in vitro- hjärnan skiva15, in vitro- avhämning modeller ofta leda till tillsatta aktivitet påminner om interictal-liknande tillsatta. Dessutom inom den tankeramen, kan en momentan Synkronisera händelse också tillförlitligt utlösa en ictal händelse16. I själva verket kan en ictal händelse utlösas av någon mindre störning som tillämpas på de neurala system17 när det är i ett kritiskt tillstånd övergången (”bifurkation”) punkt18. Traditionellt har förmåddes dessa störningar genom elektrisk stimulering. Den senaste utvecklingen av optogenetik i neurovetenskap, men erbjuder nu en mer elegant strategi för att inducera kritiskt tillstånd övergångar16.

De metoder som beskrivs i detta dokument visar hur du generera ictal evenemang på begäran i akut beslag modeller för både in vitro- (steg 1 i protokollet) och in-vivo studier (steg 2 i protokollet). De innebär valet av hjärnregionen, beslag induktion metod, studie typ och arter. dock kommer att inriktas på det rekommendera valet av en akut 4-AP kortikala beslag modell på grund av dess mångsidighet i en mängd olika studie typer. 4-AP beslag akut in vitro- modellen är baserad på standardprotokollet att förbereda högkvalitativa hjärnan skivor för elektrofysiologiska inspelningar och imaging studier19. Dessa protokoll har redan använts för att göra i vitro koronalt hjärnan skivor från somatosensoriska-motoriska cortex möss16,20 och människor21. Ändringar generera ictal händelser i dessa typer av hjärnan skivor har påvisats tidigare16 och fullständiga uppgifter beskrivs i protokollet nedan. Den akuta i vivo 4-AP kortikala beslag modellen bygger på standardprotokollet att förbereda en kraniotomi för imaging studier22. Ändringen är att ingen (glasskiva) fönster installeras efter kraniotomi. Prokonvulsiva agenter (4-AP) tillämpas i stället lokalt exponerade cortex att inducera ictal händelser medan djuret är under narkos. Till vår kunskap var vår grupp först med att utveckla denna akut i vivo kortikala beslag modell i möss16,23. Den akut i vivo 4-AP kortikala beslag modell beredd från vuxna möss har utvecklats för att komplettera den in vitro- slice modellen från juvenil vävnad. Replikering av fynden i den vuxna i vivo beslag modellen hjälper till att generalisera resultaten från segment modeller genom att adressera den inneboende oro avseende icke-fysiologiskt 2D hjärnan bitens (kontra en 3-D hela-hjärnan struktur) och de fysiologiska skillnaderna mellan juvenil och adult vävnad.

Metoden på begäran ictal händelse insättande demonstreras med en picospritzer eller optogenetic strategier antingen puffar av neurotransmittorer. Till bäst av vår kunskap är vår grupp först att inleda ictal händelser i mänsklig vävnad med hjälp av signalsubstanser via en picospritzer16. För optogenetic strategier är C57BL/6 möss stammen konventionella stammen används för att uttrycka transgener. Uttrycket av channelrhodopsin-2 (ChR2) i antingen GABAergic interneuroner eller glutamatergic pyramidala celler kommer att ge valfri förmågan att generera ictal händelser on-demand med korta ljuspulser. Lämplig optogenetic möss stammar inkludera den kommersiellt tillgängliga C57BL/6 variant som uttrycker ChR2 i antingen interneuroner, med hjälp av musen vesikulär GABA transportör promotor (VGAT)24, eller pyramidala celler, använder musen bräss cell antigenet 1 promotor (Thy1)25. Dessa kommersiellt tillgängliga VGAT-ChR2 och Thy1-ChR2 möss ger möjlighet att aktivera GABAergic nervceller eller glutamatergic nervceller, respektive i hjärnbarken med blå (470 nm) ljus. Förmågan att generera ictal händelser på efterfrågan i akut beslag modeller kan erbjuda nya möjligheter att studera beslag inledande dynamics och effektivt utvärdera potentiella anfallsskydd terapier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

All forskning som involverar patienter utfördes under ett protokoll som godkänts av etikprövningsnämnd universitet hälsa nätverk forskning i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Förfaranden som involverar djur var i enlighet med riktlinjerna i kanadensiska rådet om djur vård och godkänts av Krembil Institute djur hand utskottet för forskning.

1. protokollet I: akut In vitro beslag modell

  1. Beredning av dissektion lösningar och konstgjorda cerebrospinalvätska
    1. Carbogenate ultrarent vatten (vilket är vattnet filtreras med en resistivitet på 18,2 MΩ·cm) med carbogen (95% O2/5% CO2) för 5 min med luft sten bubbla diffusorer (luftare för akvarier).
      Obs: Luft stenar kan anslutas till carbogen tankens regulator via standard silikon slangar. Om luft stenar inte är tillgängliga, tätning stänga i slutet av silikon slangar och peta små hål i försegla så att carbogen gas till bubbla ut och carbogenate lösningen.
    2. Bered en dissektion av upplösning av koncentrationsfördelningen från tabell 1 i ultrarent vatten. Lägg till CaCl2 till en lösning som har varit carbogenated för minst 5 min att hjälpa den lös.
      Obs: Alternativt, lägga till CaCl2 först, så att den kan lösa upp lätt i en omättad lösning. Lösningen, i flytande form, bör vara 300-320 mOsm/L och har ett pH-värde 7,4 efter mättas med carbogen.
      1. Chill dissektion lösningen till 0 - 4 ° C. Lämnar lösningen i kylskåp över natten eller placera lösningen i frysen för 1 h och kontinuerligt övervaka temperaturen.
        Obs: Dissektion lösningen kan förvaras i upp till 3 nätter; Kassera efteråt.
      2. Carbogenate dissektion lösningen för 5-10 min innan användning.
        Obs: Helst lösningen bör antingen visas som slush eller vara övergår till att essens före användning.
    3. Förbereda gnagare konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) genom upplösning av koncentrationsfördelningen från tabell 2 (eller tabell 3 för mänskliga ACSF) i ultrarent vatten. Carbogenate ACSF lösningen samtidigt som den är i ett vattenbad som värms upp till 35 ° C fram till användning. Lägg till CaCl2 till en lösning som har varit carbogenated för minst 5 min att hjälpa den lös.
      Obs: Alternativt kan du lägga till CaCl2 först så att den kan lösa upp lättare i en omättad lösning. Lösningen, i flytande form, bör vara 290-320 mOsm/L och har ett pH-värde 7,4 efter mättas med carbogen. Lösningar bör göras i 1, 2 eller 4 L volymer beroende av experimenten. Gör 4 L för en hel dag (8 h) experiment. ACSF bör göras färsk varje dag; Förvara den inte längre än 1 d.
  2. Mus dissektion att samla hjärnvävnad
    Obs: För mänsklig vävnad, gå vidare till nästa steg (steg 1.3) på att göra hjärnan skivor med vibratome. De kubformade block (1 cm3) av hjärnvävnad bör erhållas från hjärnkirurgen använda förfaranden tidigare beskrivna26,27.
    1. Samla alla verktyg och material som behövs för djur dissektioner. Ställa in arbetsytan att förbereda för djur dissektioner.
      1. Kontrollera carbogen tanken (95 %O2/5%CO-2) för att säkerställa att den inte är tom. Byt ut gasflaskan före experiment om det finns mindre än 500 psi tryck kvar.
      2. Kalibrera den vibratome (vibrerande blad vävnad slicer) enligt tillverkarens bruksanvisning. Justera den vibratome inställningen till har en skärande amplituden av 1 mm och en skärhastighet på 0.12 mm/s.
        Obs: De optimala inställningarna kan variera för varje enskild vibrerande vävnad blade cutter; dock i allmänhet amplituden bör vara hög och skärhastigheten bör vara låg.
      3. Fyll hjärnan slice inkubation kammaren (dvs, hjärnan slice djurhållaren) med ACSF och bubbla det med carbogen. Placera sedan inkubation kammaren i vattenbad vid 35 ° C.
        Obs: Använd gnagare ACSF för gnagare hjärnan skivor och mänskliga ACSF för mänskliga hjärnan skivor.
    2. Skaffa en juvenil mus oavsett kön, i åldern 13 d (p13) till 21 d (p21, där p0 är födelsedatum).
    3. Söva musen med en intraperitoneal injektion av natrium pentobarbital (55 mg/kg kroppsvikt). När musen är djupt sövda, indikerat av avsaknad av tå nypa reflexen, omgående använda ett veterinär-godkända giljotin instrument för att halshugga musen i en snabb rörelse.
      Obs: Förbereda natrium pentobarbital injektion enligt de förfaranden som rekommenderas av institutionella riktlinjer.
    4. Håll musens näsa att stabilisera det avhuggna huvudet och försiktigt göra en mittlinjen snitt start mellan musens ögon och längs hela längden av hårbotten för att exponera skallen. Se till att skallen inte är komprimerade med det trycket som tillämpas av rakhyveln. Använd hörnet av blåsväder för att öka cut precision.
    5. Särade viftar med av musens hårbotten med fingrar för att exponera skallen. Använd sedan färska hörnet av en rakkniv kant för att gör ett snitt längs mittlinjen av skallen; var uppmärksam att undvika kontakt med hjärnbarken.
    6. Infoga splinter pincett in musens ögonhålor att stabilisera det avhuggna huvudet och placera den i en petriskål fylld med kallt (0 - 4 ° C) dissektion lösning. Se till att huvudet är helt nedsänkt i dissektion lösningen.
    7. En andra uppsättning splinter pincett försiktigt skala bort musens hårbotten genom att ta bort näsa benet genom att dra det och ta på baksidan (kaudala sida) av skallen.
      Obs: Näsan ben av juvenil möss är mycket mjuk och lätt bryts.
    8. Använd en mikro spatel för att skära den synnerverna, trigeminusneuralgi nerver och ryggmärg. Använd sedan micro spateln för att försiktigt separera hjärnan från kraniet. Lämna hjärnan helt nedsänkt i petriskål fylld med dissektion lösning.
  3. Beredning av kortikala skivor från somatosensoriska-motoriska cortex
    1. Fyll i vibratome buffertbrickan med ~ 150 mL kallt (0 - 4° C) dissektion lösning.
      Obs: Håll alternativt buffertbrickan i frysen tills behövs för att hålla en låg temperatur under förfarandet för skivning.
    2. Limma hjärnvävnad från musen eller mänskliga på vibratome scenen (preparatet innehavaren/bricka) använder instant klister. För möss, skära av en liten kaudala delen av hjärnan (dvs, lillhjärnan) så att det enkelt kan limmas plant på preparathållaren (tillåta den rostralt sidan av hjärnan att möta taket).
      Obs: Alternativt horisontellt musen hjärnan skivor kan förberedas genom limning ryggsidan av hjärnan på preparathållaren (den ventrala sidan av hjärnan bör möta taket)28.
    3. Placera försiktigt preparathållaren (med hjärnvävnad) in buffertbrickan. Se till att den dorsala delen av hjärnan är inför den vibratome blad.
      Obs: Det är viktigt att minimera den tid som hjärnan utsätts för luft.
  4. Hjärnans vävnad snittning och insamling
    1. Skiva hjärnan i 450 μm tjocka skivor med hjälp av vibratome i den dorsala ventral riktning. Se till att hjärnan förblir helt förankrade i preparatet facket samtidigt skivas det.
      1. Gör det första snittet i mus hjärnan ta bort luktbulben. Se sedan efterföljande nedskärningar tills området somatosensoriska-motor observeras (ligger ungefär halvvägs mellan luktbulben och bregma).
        Obs: Skiva alternativt hjärnan i tunnare (200 μm) skivor tills corpus callosum visas i vyn koronalt i hjärnan, vilket indikerar att området somatosensoriska-motor är nära.
    2. Använd en wide-bore överföring pipetten för att samla koronalt skivor (450 μm) som innehåller området somatosensoriska-motor och dränka dem i en petriskål som innehåller kall (0 - 4 ° C) dissektion lösning.
    3. Använd ett nytt rakblad och skär bort någon överflödig vävnad från skivor. För koronalt skivor från möss, utföra en tvärgående skär strax under hjärnbarkens commissure (dvs, corpus callosum). Skär inte i en sågning rörelse; bara applicera tryck på bladet i vävnaden och Använd en detailing borste att försiktigt separera vävnaden. Se till att minimera rörelsen av koronalt segmentet.
    4. Använd en wide-bore överföring pipett att överföra den dorsala delen av koronalt skivor som innehåller hjärnbarken (layer 1-6) till en andra petriskål fylld med varmt (35 ° C) ACSF för ett ögonblick (~ 1 s). Sedan omgående överföra skivor till en inkubation kammare innehållande varmt (35 ° C) carbogenated ACSF.
      Obs: Syftet med överföringen till petriskål med ACSF är att minimera överföringen av dissektion lösning till inkubation kammaren medan överföringen hjärnan skivor med wide-bore pipetten. Utnyttja inkubation avdelningens flera brunnar att hålla olika hjärnan skivor organiserade.
    5. Kassera resten av hjärnan och djurkropp enligt anvisningar.
  5. Inkubation och underhåll
    1. Lämna hjärnan skivor något nedsänkt i inkubation kammaren vid 35 ° C i 30 min. Ta sedan bort inkubation kammaren från vattenbadet och låt det rumstemperatur (20-25 ° C). Vänta 1 h för hjärnan skivor att återhämta sig innan du utför elektrofysiologiska inspelningar.
      Anmärkning: Se till att det finns inga luftbubblor som samlar in under hjärnan skivor i inkubation kammaren. Luftbubblor är luft-gränssnitt som orsakar vävnadsskada. Mus hjärnan skivor kan bibehållas för 6-8 h, medan mänsklig hjärnvävnad kan förvaras i upp till 24 h i en väl-carbogenated inkubation kammare med den lämpliga ACSF.
  6. Elektrofysiologiska inspelningar av det ytliga kortikala lagret
    Obs: Ictal händelser kan observeras i de extracellulära lokala potentiella (LFP) fältinspelningar från hjärnan skivor. LFP av hjärnan slice kan observeras och registreras med antingen ett gränssnitt typ kammare29 eller en nedsänkt multi elektrod array (MEA) system16. Förfarandet har varit tidigare beskrivna16 och ytterligare detaljer beskrivs nedan.
    1. Använda en wide-bore överföring pipett eller detailing borste för att flytta ett hjärnan segment på något större färdigskurna lins papper som hålls på plats med en dental pincett. Överföra det objektiv papper (som hjärnan slice vila upon) till inspelning kammaren och fäst den i position med en harpa skärm.
    2. Kör varmt (35 ° C), carbogenated ACSF perfusatet genom inspelning kammaren över hjärnan segmentet med en hastighet av 3 mL/min (~ 1 dropp/s). Använda en digital termometer för inspelning kammaren är 33-36° C.
    3. Dra glaselektroderna med en impedans på 1-3 MΩ från borosilikatglas slangar (med en yttre diameter av 1,5 mm) med hjälp av avdragare. Återfyllning glaselektroderna med ACSF (~ 10 µL) med en spruta som Hamilton. Kassera omedelbart elektroden om spetsen är skadad.
      Obs: Bleker den silver tråden (5 min) och tillåter endast en minimal del (dvs, spetsen) av silver tråd att dränkas i ACSF back-fyllda glaselektroderna att minimera buller och drift under inspelningarna. Ta bort någon överflödig ACSF från den glass elektroden med en Hamilton spruta vid behov.
    4. Användning 20 X stereo Mikroskop till korrekt guide inspelning glas elektroden in i det ytliga kortikala skikt (2/3) använder manuell manipulatorer. Post/Visa den elektriska aktiviteten i hjärnan skiva på en dator med standardprogramvara.
      Obs: Livskraftiga (hög kvalitet) hjärnan skivor kommer att ställa ut en robust evoked potential i svar till tillämpad elektriska stimuli (100 µs, 30-300 μA) eller ljuspulser (30 ms, 10 mW/mm2) för optogenetic vävnad.
  7. Induktion av beslag-liknande verksamhet
    1. BEGJUTA ACSF innehållande 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) över hjärnan segmentet. Lös 80 mg 4-AP i 8,5 mL vatten för att göra en stamlösning av 100 mM 4-AP. Tillsätt 100 µL av 100 mM 4-AP stamlösning till 100 mL ACSF att uppnå en ACSF perfusatet med 100 µM 4-AP.
      Obs: Alternativt använda noll-Mg2 + ACSF (tabell 4), en modifierad ACSF lösning som innehåller inget tillsatt Mg2 +, för att BEGJUTA hjärnan segmentet. För mänsklig vävnad, använda en kombination av 100 µM 4-AP i noll-Mg2 + mänskliga ACSF (tabell 5) för att uppnå optimala resultat. Den genomsnittliga tiden för ictal händelser ska visas är 15 min; Det kan dock ta upp till 40 min för vissa hjärnan skivor.
  8. På begäran beslag generation: en optogenetic strategi för optogenetic möss
    1. Tillämpa en kort (30 ms) puls blå (470 nm) ljus (med en minsta 1 mW/mm2 utdataintensitet) för att inleda en ictal händelse. Använda en manuell manipulator för att placera en 1000 µm core diameter optisk fiber (0.39 NA) direkt ovanför regionen inspelning.
      Obs: Ange graden av foto-stimulering som matchar den önskade graden av den ictal händelsen (dvs.1 puls varje 50 s). Men kan inte priset överdrivas alltför från den inneboende kurs som ictal händelser inträffar.
  9. På begäran beslag generation: en icke-optogenetic strategi för mänsklig vävnad
    1. Placera hjärnan skiva så att de ytliga lagrarna är uppströms, och de djupa skikten är nedströms till flödet av perfusatet genom inspelning kammaren.
    2. Dra en glaselektrod (samma typ som används för LFP inspelningar) och tryck försiktigt på dess spets med en delikat uppgift torkare att skapa en liten öppning. Återfyllning elektroden med ~ 25 µL av 100 mM GABA (upplöst i vatten) och koppla den till picospritzer. Alternativt, återfyllning elektroden med 200 µM glutamat (upplöst i vatten).
      Obs: För att uppskatta volymen att vara svälld från picospritzer (~ 50 µL), gäller en test puff på en plastplatta (helst inrutade). Applicera sedan, en droppe av kända volymer (dvs, 10 µL, 20 µL, 50 µL eller 100 µL) med en pipett för en jämförelse med den test puff.
    3. Gälla den mänskliga vävnaden med en picospritzer (10-20 psi för 30-100 ms) puffar av signalsubstansen (GABA eller glutamat) för att initiera en ictal händelse. Tillämpa en enda puff av 100 mM GABA på den djupa lagret (5) av hjärnvävnaden generera ictal händelser i det ytliga lagret (2/3). Alternativt, tillämpa ett enda bloss av 200 µM glutamat direkt på det ytliga lagret generera ictal händelser i det ytliga lagret.
      Obs: Ange graden av picospritzer puff att matcha önskade graden av den ictal händelsen (dvs.1 puls varje 50 s). Men kan inte priset överdrivas alltför från den inneboende kurs som ictal händelser inträffar.

2. protokoll II: Akut In vivo beslag modell

  1. Kirurgisk beredning och kirurgi
    1. Få en vuxen mus (p35 - p60) oavsett kön.
    2. Djupt söva mus med ketamin (95 mg/kg) och xylazin (5 mg/kg). Utför det tå-nypa reflex testet för att se till att musen är drogad. Alternativt använda isofluran (4% för induktion, 1,5-2% för kirurgi) att söva musen.
      Obs: Valet av bedövningsmedel kan påverka de beslag verksamhet30,31.
    3. Montera musen till en stereotaxic ram genom att säkra huvudet med örat barer. Placera en uppvärmd pad under musen under hela operationen.
    4. Raka toppen av musens huvud med en gnagare trimmer för att utsätta hårbotten. Injicera 0,3 mL lidokain med en 25 G 5/8 i nålen i periostet att undvika kraftig blödning eller smärta. Gäller ögonsalva musens ögon att hindra dem från att torka ut under experimentet.
    5. Nyp och lyft mitten av musens hårbotten för att bedöma om dess reflexer är borta. Därefter utför en horisontell skär för att exponera bregma till lambda region i skallen. Försiktigt skrapa i hela det exponerade området av skallen med en bomullspinne för att skapa en torr yta.
    6. Utföra en kraniotomi 4 mm i diameter på koordinater 2,0 mm lateromedial och -2,0 mm rostrocaudal att avslöja den somatosensoriska cortexen. Markera platsen med en cirkel (4 mm i diameter) med en permanent markörpenna. Borra runt cirkeln med en pneumatisk dental borr tills den återstående lagret av kraniotomi benet ger enkelt sätt när trycks ner. Tillämpa saltlösning på lagret av ben innan du tar bort kraniotomi med splinter pincett. Därefter gäller varm saltlösning regionen utsatt.
  2. Inspelning metoder och kemiska induktion av kramper
    1. Dra glaselektroderna med en impedans på 1-3 MΩ från borosilikatglas slangar (med en yttre diameter av 1,5 mm) med hjälp av avdragare. Återfyllning glaselektroderna med ~ 10 µL ACSF eller koksaltlösning använder en Hamilton spruta. Kassera omedelbart elektroden om spetsen är skadad.
      Obs: Bleker den silver tråden (5 min) och tillåter endast en minimal del (dvs, spetsen) av silver tråd att dränkas i ACSF back-fyllda glaselektroderna att minimera buller och drift under inspelningarna. Ta bort någon överflödig ACSF från den glass elektroden med en Hamilton spruta vid behov.
    2. Använd en manuell manipulator för att vägleda den glass elektroden in i det ytliga kortikala skikt (2/3) i området somatosensoriska-motor. Post/Visa den elektriska aktiviteten i hjärnan skiva på en dator med standardprogramvara.
      Obs: Layer 2/3 är cirka 0,3 mm djup från ytan32.
    3. Lokalt applicera ~0.5 mL 1,5 mM 4-AP koksaltlösning på exponerade cortex av musen med en spruta tills den helt täcker kraniotomi. Lös 14 mg 4-AP i 100 mL isoton koksaltlösning att göra en stamlösning 1,5 mM 4-AP koksaltlösning.
      Obs: Förbereda den 4-AP saltlösning innan försöket påbörjas. Ictal händelser visas i genomsnitt 15-30 min efter topikal applicering.
  3. On demand generation av kramper i optogenetic möss
    1. Tillämpa en kort (30 ms) puls blå (470 nm) ljus (med en minsta 10 mW/mm2 utdataintensitet) för att inleda en ictal händelse. Använda en manuell manipulator för att placera en 1000 µm core diameter optisk fiber (0.39 NA) direkt ovanför regionen inspelning.
      Obs: Ange graden av foto-stimulering som matchar den önskade graden av den ictal händelsen (dvs.1 puls varje 300 s). Men kan inte priset överdrivas alltför från den inneboende kurs som ictal händelser inträffar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tillämpningen av 100 µM 4-AP till god kvalitet (oskadade) 450 µm-sized kortikala hjärnan skivor från en juvenil VGAT-ChR2 tillförlitligt inducerad återkommande ictal mushändelser (> 5 s) inom 15 min (figur 1Ai). Tillämpningen av 100 µM 4-AP skivor av dålig kvalitet resulterade i spricker händelser eller tillsatta aktivitet (figur 1Aii). I genomsnitt genererade 40% av skivor från varje dissekerade mus hjärna framgångsrikt ictal händelser. Dessutom resulterade 83% (25/30) av dissekerade möss i minst en hjärna slice som framgångsrikt genererade ictal händelser. I hjärnan skivor med spontant förekommande ictal händelser, tillämpningen av en kort 30 ms ljuspuls på hjärnan skiva tillförlitligt utlöste en ictal händelse som var identiska i morfologi (figur 1Aiii och 1Aiv). Samma fynden gjordes i hjärnan skivor från Thy1-ChR2 möss (figur 1B). Således, oavsett vilken neuronala-subpopulation aktiverades, alla kort Synkronisera händelse i den isolerade kortikala neurala nätverk ledde till uppkomsten av en ictal händelse. Dessa ictal händelser var består av en sentinel (preictal) spike (figur 2Aii och 2Bii), tonic-liknande bränning (figur 2Aiii och 2Biii), kloniska-liknande bränning (figur 2Aiv och 2Biv) och sprängtryck aktivitet mot slutet (figur 2Av och 2Bv); de liknade i naturen electrographic underskrifter är associerad med kliniska anfall33. Dessutom var dessa unga möss fysiologiskt vuxen-liknande som tillägg av 10 µM bumetanid (BUM), en NKCC1 blockerare, hade ingen effekt på de resulterande ictal händelserna (figur 2).

In vitro- 4-AP kortikala slice modellen genererade tillförlitligt konsekvent ictal händelser för ~ 1 h (figur 1Ai), medan den noll-Mg2 + modellen genereras vanligtvis ictal händelser för ~ 10 min innan omvandlar snabbt i burst-liknande aktivitet ( Figur 3A). Dock krävs en icke-4-AP metod för beslag induktion, kan noll-Mg2 + modellen ändras med tillägg av 5-10 µM baklofen (ett GABAB receptoragonist) att omvandla sprängning verksamheten tillbaka till ictal händelser (figur 3B) . I allmänhet reproduceras metoder av icke-avhämning att öka retbarhet (dvs, 4-AP eller noll-Mg2 + ACSF) på ett tillförlitligt sätt ictal händelser i kortikala hjärnan skivor. Däremot medförde metoder för avhämning [dvs, bicucullin (BMI), en GABAA -receptorantagonist] tillsatta aktivitet påminner om interictal verksamhet eller spricker verksamhet, snarare än ictal händelser (figur 4A). Likaså akut beslag modeller beredd från 100 µM 4-AP-behandlade Hippocampus segment genereras interictal-liknande tillsatta aktivitet eller status epilepticus-liknande förhållanden i CA3 (figur 4B). I vivo 4-AP kortikala modellen genereras motsvarande återkommande ictal händelser (> 5 s). Ictal händelser observerades i det ytliga lagret (2/3) inom ~ 30 min lokalt tillämpa 1,5 mM 4-AP på exponerade cortex av vuxna VGAT-ChR2 möss. Tillämpningen av en kort 30 ms ljuspuls på exponerade hjärnbarken utlöst tillförlitligt ictal händelser som liknade dem som spontant uppstår (figur 5) morfologiskt.

Tillämpningen av noll-Mg2 + mänskliga ACSF med 100 µM 4-AP 'icke-epilepsi' kortikala hjärnan skivor (450 µm) från tinningloben epilepsipatienter tillförlitligt genererade återkommande ictal händelser (> 5 s) inom ~ 30 min (figur 6Ai och 6Bi). Skivor av dålig kvalitet genereras antingen tillsatta eller ingen verksamhet (figur 1Aii). Lönsamheten för hjärnan skivor ansågs 'bra kvalitet' när en kort elektrisk stimulans (100 µs, 30-300 µA) inducerade en robust, evoked response i LFP i början av experimentet. När ictal händelser började utfällning, utlöste tillämpningen av en kort puff (75 ms på 20 psi) 100 mm GABA på hjärnan slice tillförlitligt ictal händelser som var identiska i morfologi med de som förekommer spontant (figur 6Aii och 6Aiii) . En lägre koncentration av GABA, 100-200 µM, kommer sannolikt effektiv samt för in vitro- experiment34; en högre koncentration av GABA, 100 mM, rekommenderas dock för in-vivo -experiment-35. Samma anmärkningar reproducerades när en kort puff av 200 µM glutamat kopplades till mänskliga hjärnan skivor (figur 6Bii och 6Biii). Således, oavsett vilken efter synaptiska receptorer aktiverades, utlöste en kort Synkronisera händelse i isolerade mänskliga kortikala neurala nätverk tillförlitligt en ictal händelse.

Figure 1
Figur 1: Akut in vitro- 4-AP kortikala beslag modell. De svarta linjerna representerar lokala fältet potentiella (LFP) inspelning; de blå linjerna representerar den ljus stimulansen. (A) dessa paneler är baserade på resultaten från en VGAT-ChR2 musmodell. De illustrerar ictal händelser observerades i LFP inspelningen från det ytliga lagret (2/3) hög kvalitet kortikala hjärnan bitens behandlas med 100 µM 4-AP. jag) i denna panel visas en översikt över LFP inspelningen. ii) är exempel på den LFP inspelning från dålig kvalitet hjärnan skivor. Den vertikala skala baren är 0,4 mV, horisontella skalstapeln är 20 s. iii) Detta är en inzoomad vy av en ljus-utlöst ictal händelse. iv) Detta är en inzoomad vy av en spontan ictal händelse. (B) dessa panel är baserade på resultaten från en Thy1-ChR2 musmodell. De illustrerar ictal händelser observerades i LFP inspelningen från det ytliga lagret (2/3) kortikala hjärnan bitens behandlas med 100 µM 4-AP. jag) i denna panel visas en översikt över LFP inspelningen. ii) Detta är en inzoomad vy av en ljus-utlöst ictal händelse. iii) Detta är en inzoomad vy av en spontan ictal händelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Ictal händelser genereras i en hjärna slice (layer 2/3) från en juvenil (p13) VGAT-ChR2 mus perfusion med 4-AP och bumetanid (BUM). De svarta linjerna representerar lokala fältet potentiella (LFP) inspelning; de blå linjerna representerar den ljus stimulansen. (A) dessa paneler visar en spontan ictal händelse. jag) i denna panel visas en översikt över hela ictal evenemanget. Följande paneler Visa ii) en sentinel spike, iii) tonic-liknande bränning, iv) kloniska-liknande bränning, och v) spricker aktivitet. (B) dessa paneler visar en ljus-utlöst ictal händelse. jag) i denna panel visas en översikt över hela ictal evenemanget. Följande paneler Visa ii) ett ljus-utlöst sentinel spike från samma skiva inspelning, iii) tonic-liknande bränning, iv) kloniska-liknande bränning, och v) spricker aktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Akut in vitro- noll-Mg2 + kortikala beslag modell. De svarta linjerna representerar lokala fältet potentiella (LFP) inspelning; de blå linjerna representerar den ljus stimulansen. (A) Dessa paneler är baserade på resultaten från en VGAT-ChR2 musmodell. jag) panelen illustrerar status epilepticus-liknande villkor iakttas i LFP inspelningen från det ytliga lagret (2/3) kortikala hjärnan bitens behandlas med noll-Mg2 + ACSF. ii) Detta är en inzoomad vy av en ljus-utlöst ictal händelse. iii) Detta är en inzoomad bild av aktiviteten status epilepticus-liknande sprängtryck. (B) dessa paneler visar samma segment inspelning med tillägg av baklofen. jag) tillämpningen av 5 µM Baklofen på den noll-Mg2 + ACSF förvandlar sprängning verksamheten tillbaka till distinkta, återkommande ictal händelser. ii) Detta är en inzoomad vy för aktiviteten sprängtryck. iii) Detta är en inzoomad vy av distinkta ictal händelsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Akut i vitro spricker/tillsatta modeller. De svarta linjerna representerar lokala fältet potentiella (LFP) inspelning; de blå linjerna representerar den ljus stimulansen. (A) dessa paneler Visa resultaten från en kortikal skiva från en VGAT-ChR2mouse, illustrerar sprängtryck aktivitet observerades i det ytliga lagret (2/3) efter tillsats av 10 µM BMI till 100 µM 4AP. jag) Detta är en översikt av LFP inspelningen. Den streckade röda linjen indikerar när BMI trädde i kraft. ii) Detta är en inzoomad vy av en ljus-utlöst ictal händelse. iii) Detta är en inzoomad vy av spontana sprängning verksamheten. (B) dessa paneler Visa resultaten från en Hippocampus skiva från en VGAT-ChR2 mus, illustrerar en status epilepticus-liknande händelse observerats i området CA3 efter applicering av 100 µM 4AP. jag) Detta är en översikt av LFP inspelningen. ii) Detta är en inzoomad vy av en ictal händelse. iii) Detta är en inzoomad vy av ljus-utlöst och spontan bristning händelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Akut i vivo 4-AP kortikala beslag modell. De svarta linjerna representerar lokala fältet potentiella (LFP) inspelning; de blå linjerna representerar den ljus stimulansen. (A) dessa paneler visar resultaten av en vuxen (p56) VGAT-ChR2 musmodell med 1.5 mM 4-AP lokalt applicerade till exponerade cortex. jag) panelen illustrerar en ljus-utlöst ictal händelse som observerats i det ytliga lagret (2/3) av området somatosensoriska-motor. ii) Detta är en inzoomad vy av ljus-utlöst ictal händelsen från panelen Ai. iii) Detta är en super inzoomad vy av uppkomsten av ljus-utlöst ictal händelsen (indikeras av den svarta pilen). Denna siffra är ofiltrerade version av en figur från Chang et al. 16. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Akut in vitro- mänskliga kortikala beslag modell. De svarta linjerna representerar lokala fältet potentiella (LFP) inspelning; de bruna linjerna representerar den picospritzer puff. (A) dessa paneler Visa resultaten av en kortikal hjärnan skiva från en patient som mediala temporalloben epilepsi (MTLE), som illustrerar ictal händelserna observerats i det ytliga lagret (2/3) efter en perfusion med 100 µM 4-AP och noll-Mg2 + mänskliga ACSF . jag) Detta är en översikt av LFP inspelningen. Följande paneler Visa ii) en inzoomad vy av en 100 mM GABA puff-utlöst ictal händelse och iii) en inzoomad vy av en spontan ictal händelse. (B) dessa paneler Visa resultaten av en kortikal hjärnan skiva från en annan MTLE patient, som illustrerar de ictal händelser som observerats i det ytliga lagret (2/3) efter en perfusion med 100 µM 4-AP och noll-Mg2 + mänskliga ACSF. jag) Detta är en översikt av LFP inspelningen. Följande paneler Visa ii) en inzoomad vy av en 200 µM glutamat puff-utlöst ictal händelse och iii) en inzoomad vy av en spontan ictal händelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: recept för dissektion lösning. Dessa är instruktionerna för att göra 1 L och 2 L volymer. MW = molekylvikten för lösningens.

# Reagens Konc [mM] MW (g/mol) 1L (g) 2L (g)
1 Sackaros 248 342,3 84.89 169.78
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 2.18 4.37
3 Glukos (D-glukos) 10 180.16 1.8 3.6
4 Kaliumklorid (KCl) 2 74.55 0,15 0,3
5 Magnesiumsulfat (MgSO4·7H2O) 3 246.47 0,74 1,48
6 Monobasiskt natriumfosfatmonohydrat (H2NaPO4· H2O) 1,25 137.99 0,17 0,34
7 Kalciumklorid (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,15 0,29

Tabell 2: recept för gnagare konstgjorda cerebral ryggmärgsvätskan (ACSF). Dessa är instruktionerna för att göra 2 L eller 4 L volymer. MW = molekylvikten för lösningens.

# Reagens Konc [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumklorid (NaCl) 123 58,4 14,37 28.73
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 4.37 8,74
3 Glukos (D-glukos) 10 180.16 3.6 7,21
4 Kaliumklorid (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnesiumsulfat (MgSO4· H2O) 1.3 246.47 0,64 1.28
6 Monobasiskt natriumfosfatmonohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Kalciumklorid (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0,44 0,88

Tabell 3: recept för mänskliga artificiella cerebral spinal vätskan (mänskliga ACSF). Dessa är instruktionerna för att göra 2 L eller 4 L volymer. MW = molekylvikten för lösningens.

# Reagens Konc [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumklorid (NaCl) 123 58,4 14.38 28,75
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 25,2 84.01 4.23 8,46
3 Glukos (D-glukos) 10 180.16 3.6 7,21
4 Kaliumklorid (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnesiumsulfat (MgSO4· H2O) 1 246.47 0,49 0,99
6 Monobasiskt natriumfosfatmonohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Kalciumklorid (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,29 0,59

Tabell 4: recept för noll-Mg 2 + gnagare konstgjorda cerebral ryggmärgsvätskan (noll-Mg2 + ACSF). Dessa är instruktionerna för att göra 2 L eller 4 L volymer. MW = molekylvikten för lösningens.

# Reagens Konc [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumklorid (NaCl) 123 58,4 14,37 28.73
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 26 84.01 4.37 8,74
3 Glukos (D-glukos) 10 180.16 3.6 7,21
4 Kaliumklorid (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnesiumsulfat (MgSO4· H2O) Nominellt gratis 246.47 0 0
6 Monobasiskt natriumfosfatmonohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Kalciumklorid (CaCl2·2H2O) 1.5 147.01 0,29 0,59

Tabell 5: recept för noll-Mg 2 + mänskliga artificiella cerebral ryggmärgsvätskan (noll-Mg2 + mänskliga ACSF). Dessa är instruktionerna för att göra 2 L eller 4 L volymer; MW = molekylvikten för lösningens.

# Reagens Konc [mM] MW (g/mol) 2L (g) 4L (g)
1 Natriumklorid (NaCl) 123 58,4 14.38 28,75
2 Natriumbikarbonat (NaHCO2) 25,2 84.01 4.23 8,46
3 Glukos (D-glukos) 10 180.16 3.6 7,21
4 Kaliumklorid (KCl) 4 74.55 0,6 1.19
5 Magnesiumsulfat (MgSO4· H2O) Nominellt gratis 246.47 0 0
6 Monobasiskt natriumfosfatmonohydrat (HNaPO4· H2O) 1.2 137.99 0,33 0,66
7 Kalciumklorid (CaCl2·2H2O) 1 147.01 0,29 0,59

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hjärnan skivor behandlas med ett prokonvulsiva läkemedel eller en förändrad ACSF perfusatet att öka det neurala nätverket retbarhet och främja en utfällning av ictal händelser (electrographic beslag-liknande händelser). För möss, bör Rekommenderad koronalt skivor av området somatosensoriska-motor innehålla cingulum cortex, område 2 (CG), men inte det retrosplenial området (RS); dessa anatomiska markörer identifiera spänna av koronalt skivor som är bäst för att inducera ictal händelser. En valfri ändring för möss vävnad är att halvera de två halvklot av hjärnan segmentet för matchade-par experimentella modeller, som de två hjärnhalvorna är praktiskt taget identisk (liknande experimentella enheter). När du förbereder hjärnan skivor generera ictal händelser, är det absolut nödvändigt att upprätthålla integriteten hos neurala nätverk och dess synapsförbindelser, eftersom ictal händelser är ett neuralt nätverk fenomen. Tre punkter i steg 1 i protokollen som är kritiska för slice kvalitet är 1) skivning förfarande, 2) inkubation, och 3) syresättning. För det första, skivning förfarandet kräver en balans mellan fart och teknik. Det är viktigt att minimera tiden mellan halshuggning (eller kirurgisk resektion) och inkubation, samtidigt vara noga med varje kontakt och rörelse av hjärnan slice för att undvika skador. För det andra, kvaliteten på vävnaden är mycket känslig för inkubation temperatur och varaktighet. Det är viktigt att använda en timer och termometer att säkerställa ruvning är vid 35 ° C i 30 min. för det tredje livskraft hjärnvävnaden är känslig för exponering för något annat än syresatt (konstgjord) cerebral ryggmärgsvätskan. Hjärnan slice upphör om det inte är perfusion med carbogenated ACSF under en längre tid (~ 1 min).

Hjärnan skivor från möss åldern p13 - p16 erbjuder den högsta sannolikheten för framgång genererar ictal händelser. Anledningen är att möss ≤ p16 inte kräver en transcardial perfusion före dissektioner. Detta effektivt minskar risken för fel och snabbar upp dissektion, vilket är en enorm fördel, eftersom tiden mellan halshuggning och inkubation är omvänt korrelerad med den hjärnan segmentets lönsamhet. Under tiden möss > p13 har reducerat belopp av NKCC1 som är jämförbara med en vuxen36. I allmänhet, juvenil (< p21) vävnad är mer livskraftig än adult vävnad på grund av en enastående förmåga att återhämta sig från skadliga skivning förfarandet. Denna veckas fönster mellan p13 och p21 erbjuder möjlighet att utnyttja mössens vuxen-liknande fysiologi och juvenil-liknande förmåga att enkelt generera ictal händelser37,38. Dock om experiment behöver studera ictal händelser i hjärnan skivor från vuxna möss, kommer en NMDG-baserade ACSF med HEPES och tiourea askorbat att främja lönsamheten för adult vävnad24,39,40, 41. för mänsklig vävnad, tillsats av antioxidanter, såsom α-tokoferol, till dissektion lösningen kan gynna vävnad livskraft, särskilt under långväga transporter (> 30 min) mellan operationssalen och laboratoriet för skivning8,26. För alla hjärnan skivor är gynnsamma förutsättningar för att generera ictal händelser att spela in från 450 µm tjocka skivor vid 36 ° C. Hjärnan skivor behöver vara minst 350 µm tjock ska innehålla tillräckligt många nervceller i neurala nätverk att generera händelsen strukturerad ictal. Skivor kan emellertid inte tjockare än 500 µm, eftersom det gör det svårt för syret att diffundera in i centrera av vävnaden. Skivor som är 450 µm representerar en optimal tjocklek, där en riklig mängd neuronala nätverksanslutning upprätthålls utan att hindra perfusionen av syre i hela vävnaden. Slutligen är utfällning av ictal händelser optimala vid 33-36 ° C; om inspelning kammaren inte minst 33 ° C, blir det svårt för ictal händelser inträffa.

En begränsning av akut beslag modell är att de inte genererar anfall. De genererar endast ictal händelser, som är electrographic undertecknandet av ett beslag. Ictal händelser har ingen associerad beteendemässiga komponenter, såsom förlust av medvetande eller motor kramper som definierar ett beslag. Följaktligen, akut beslag modeller kan inte användas för att bekräfta effekten av potentiella anfallsskydd läkemedelskandidater eller få insikter i epileptogenes; sådana frågor bör behandlas av kronisk epilepsi modeller och kliniska prövningar. Akut beslag modeller bör användas endast för avsett ändamål utföra grundläggande förstudier på beslag mekanismer. Endast de mest lovande resultaten från akut beslag modeller bör vara avancerade vidare till högre modeller som är dyrare, mödosam att förbereda, och kräver mycket mer komplexa etiska överväganden.

För att göra framsteg i epilepsi och beslag forskning, är det absolut nödvändigt att ha en tillförlitlig akut beslag modell som exakt kan replikera aktiviteten electrographic kramper observerats kliniskt i EEGEN beslag patienter. För att på ett tillförlitligt sätt reproducera ictal händelser i hjärnan skivor, krävs icke-avhämning metoder för att öka retbarhet, metoder för avhämning (dvs.den GABAA -receptorantagonist BMI) normalt medföra tillsatta aktivitet påminner om den interictal verksamhet, snarare än ictal händelser (figur 3A). Den föredragna metoden för icke-avhämning är att tillämpa prokonvulsiva agent 4-AP eftersom det på ett tillförlitligt sätt kan generera konsekvent ictal händelser för 1 h. Däremot genererar noll-Mg2 + kortikala modellen ictal händelser för endast ~ 10 min innan snabbt omvandla till burst-liknande aktivitet (figur 2A). Om med noll-Mg2 + modell tillägg av 5-10 µM baklofen, hjälper en GABAB -receptoragonist, till att omvandla sprängning verksamheten tillbaka till ictal händelser (figur 2B), som tidigare visas i hippocampus skivor42. 4-AP beslag in vitro- modellen är dessutom att föredra, eftersom resultaten från denna modell kan replikeras i dess in-vivo motsvarighet, i vivo 4-AP kortikala beslag modell (figur 4). Det är inte möjligt att ändra hela cerebral ryggmärgsvätskan hos en levande vuxen mus att återskapa akut i vivo noll-Mg2 + miljö.

Tillämpningen av 4-AP i kortikala hjärnan skivor kan exakt återge den krampaktivitet observerats kliniskt15,33. Däremot är 4-AP-behandlade Hippocampus skivor predisponerade för att generera interictal tillsatta aktivitet43 och status epilepticus-liknande förhållanden (figur 3B). Således, för att studera anfall, akut in vitro- 4-AP kortikala modellen är att föredra framför i vitro 4-AP Hippocampus modellen. Dessutom finns det praktiskt taget inga möjligheter att spela in från livskraftiga mänskliga Hippocampus skivor, som mest Hippocampus resektioner har CA1 och CA3 skadad21. I kontrast, är icke-patologiska mänsklig kortikal vävnad mer lättillgängliga som är sekundära resultatet av subkortikala neurokirurgiska ingrepp såsom tinningloben epilepsi kirurgi. Icke-epilepsi 'kontroll' hjärnbarkens vävnad kan också förvärvas från tumör resektion operationer. Av dessa skäl är cortex den önskade platsen för modellering krampaktivitet på grund av dess flyttbarhet mellan mus och mänsklig vävnad att bekräfta klinisk relevans. Slutligen, C57BL/6 stam av möss är att föredra eftersom de lätt express transgener och optogenetic varianter är kommersiellt tillgängliga. Optogenetic möss modeller tillåter på begäran inledandet av ictal händelser via en minimalinvasiv, kort ljus stimulering. Det gör att studiet av anfall otroligt effektivt eliminerar väntetider och möjliggör riktade aktivering av neuronala subpopulations. Dessutom möjliggör förmågan att utlösa anfall på begäran nya sätt att slutgiltigt avgränsa den exakta punkten om beslag inledande och potentiellt studera effektiviteten av anfallsskydd läkemedelskandidater. En användarvänlig MATLAB-baserade programmet utvecklades specifikt för att upptäcka och klassificera olika typer av epileptiform händelser som inträffar i in vitro- och in vivo 4-AP beslag modeller. Detta påvisande program är tillgänglig för nedladdning från Valiante Labbets GitHub-databasen (https://github.com/Valiantelab/ChangValiante2018).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av den kanadensiska institut för hälsa forskning (MOP 119603 Peter L. Carlen och Taufik A. Valiante), Ontario hjärnan Institutet (att Taufik A. Valiante) och den Mightex studenten forskningsanslag (till Michael Chang). Vi vill tacka Liam Long för hans hjälp i filma video manuskriptet. Vi skulle vilja erkänna Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran och Shadini Dematagoda för deras hjälp i sammanställningen i siffror och tabeller i detta manuskript. Siffror 1A, 3A, 4Aoch 6A är alla ursprungliga siffror från Publiceringsnivåerna i Chang et al. 16.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium pentobarbital N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe N/A N/A Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle N/A N/A Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue N/A N/A Purchased through UT Med Store
Lens paper N/A N/A Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x) N/A N/A Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula N/A N/A Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end N/A N/A Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0 N/A N/A Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer N/A N/A Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital) N/A N/A Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2 N/A N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome Leica N/A Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)  Scientific Systems Design Inc N/A
Sodium Chloride (NaCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate N/A N/A Purchased through UT Med Store
Dextrose N/A N/A Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) N/A N/A Purchased through UT Med Store
Sucrose N/A N/A Purchased through UT Med Store

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19, (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53, (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81, (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342, (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22, (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31, (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511, (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. Seizures and epilepsy. Oxford University Press. Oxford, UK. (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50, (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95, (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30, (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137, (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88, (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155, (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55, (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54, (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Academic Press. London, San Diego (CA), Cambridge (MA), Oxford. 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25, (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1, (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61, (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42, (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31, (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7, (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23, (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468, (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7, (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26, (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303, (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. Martina, M., Taverna, S. Humana Press. New York, NY. 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410, (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50, (1), 98-110 (2006).
Generation och On-Demand inledandet av akut Ictal aktivitet i gnagare och mänsklig vävnad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).More

Chang, M., Dufour, S., Carlen, P. L., Valiante, T. A. Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue. J. Vis. Exp. (143), e57952, doi:10.3791/57952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter