Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد درجة الحرارة البيئية المفضل لليرقات المورفولوجية استخدام تدرج حراري مستمر.
Abstract
العديد من الحيوانات، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، قادرون على تمييز الفروق الدقيقة في درجة الحرارة البيئية، التي تمكنهم من البحث عن المناظر الطبيعية الحراري المفضل. تحديد تفضيلات اليرقات درجات الحرارة أكثر من مجموعة خطية محددة، قمنا بتطوير فحص استخدام تدرج درجات الحرارة. إنشاء تدرج لوني واحد ثنائي الاتجاه، ترتبط اثنين من كتل الألومنيوم لحمامات مياه مستقلة، كل منها ضوابط درجة حرارة كتل الفردية. الكتلتين تعيين الحدود الدنيا والعليا للتدرج. هو إنشاء التدرج درجة الحرارة بوضع صفيحة ألومنيوم [اغروس] المغلفة اثنين من كتل التحكم في المياه حيث أن اللوحة تمتد المسافة بينهما. ينتهي لوحة الألومنيوم التي تم تعيينها على رأس كتل المياه يحدد درجات الحرارة الدنيا والقصوى، ومناطق الفترات الفاصلة بين الكتلتين تشكل درجة الحرارة تدرج خطي. تحليل الانحدار يمكن تطبيقها على اليرقات من مختلف الإعمار، ويمكن استخدامها لتحديد طفرات أن المعرض تعمل، مثل تلك التي مع الطفرات التي تؤثر على الجينات ترميز قنوات الحزب وأوبسينس، ومطلوبة من أجل تمييز درجة الحرارة.
Introduction
وتستخدم الحيوانات المتنقلة لتحديد بيئة مواتية أكثر الشروط1،2،3ثيرموتاكسيس. إذا كان المناخ مفرطة الساخنة أو الباردة، أمر حيوي للبقاء هذا السلوك. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الحيوانات حساسية للاختلافات الصغيرة جداً في درجة الحرارة في مجموعة مريحة والبحث عن المناطق المحيطة بها مع درجة حرارة مثالية. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للكائنات بويكيلوثيرميك مثل ذباب الفاكهة، وحجته بدرجة حرارة الجسم مع البيئة. فحوصات لمراقبة اليرقات ثيرموتاكسيس قد ساعدت في تحديد وتوضيح دور كل من أجهزة الاستشعار الجزيئية مثل المورفولوجية مستقبلات عابر المحتملة (الحزب) قنوات4،،من56، رهودوبسينس7،8وإيونوتروبيك مستقبلات مستقبلات (IRs)9، التي تضفي هذه الحيوانات مع الحساسيات درجة الحرارة على نطاقات مختلفة في درجة الحرارة.
اختبار اختيار اتجاهين يوفر نهج واحد لدراسة تفضيلات الحرارية في اليرقات6،7. المقايسة يستتبع إنشاء منطقتين حرارة متميزة ويسمح للحيوانات لتحديد جانب واحد على الآخر. يمكن أن تكون نتائج اختبارات الاختيار ثنائية قوية، لا سيما إذا كانت الاختلافات في درجة الحرارة بين الخيارين كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، أن كل مقايسة تتضمن جدولة المجموعات اثنين فقط، يمكن التعبير عن البيانات كمؤشر لتفضيل بسيطة. السهولة والبساطة في اختيار اتجاهين فحوصات قابلة أيضا لشاشات الجينية. ومع ذلك، قيداً رئيسيا أن هناك حاجة تحديد درجة الحرارة المفضلة للحيوانات البرية من نوع أو متحولة إلى العديد من التجارب.
مقايسة تدرج يتيح الفرصة لإنشاء درجة الحرارة المفضلة في مقايسة واحدة8. وعلاوة على ذلك، خلافا لاختبار الخيار ذات اتجاهين، ويسمح تقييم توزيع مجموعة من الحيوانات، عندما تواجه مع نطاق متواصل من درجات الحرارة. تحليل الانحدار واحد يستخدم طبق بيتري والحيوانات وحيدة ومناسبة تماما لوصف سلوك الحيوانات الفردية10مفصل. ومع ذلك، منذ جولة أطباق بيتري، أحجام المناطق درجة الحرارة تختلف وهي تدريجيا أقل اعتماداً على المسافة من المركز. ولذلك، هذا الإعداد ليست مثالية لرصد التحديدات درجة الحرارة من سكان حيوانات.
جهاز تدرج حراري مستمر التي مناسبة تماما لتقييم تفضيلات درجة الحرارة لمجموعات من اليرقات توظف ساحة مستطيلة الشكل، ويرد هنا. الجهاز بسيط لبناء وتجميع. وباﻹضافة إلى ذلك، الانحدار الخطي، وهو مرن، كما يمكن استخدامه لتقييم ثيرموتاكسيس على درجة حرارة كبيرة تتراوح بين 10 درجات مئوية إلى 42 درجة مئوية. المقايسة سريعة ومباشرة لأداء وتعطي البيانات استنساخه. بالإضافة إلى الإبلاغ عن درجة الحرارة المفضلة لليرقات، فإنه يكشف عن أفضليات سكان الحيوانات على مجموعة خطية كاملة في تجربة واحدة. ونظرا لهذه المزايا، خيار ممتاز لتحديد الجينات المطلوبة ثيرموتاكسيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-معدات تصنيع وتجميع أجهزة لفحوصات التدرج
- اختﻻق لوحات الألومنيوم المقايسة لتحليل الانحدار أحادية الاتجاه.
- تقليم وطحن كل لوحة المقايسة الألومنيوم (الشكل 1A) الخروج من قطعة واحدة من الألمنيوم باستخدام منشار باند وحادة مطحنة عمودية مع الأبعاد التالية: حجم الخارجي هو 140 × 100 × 9 مم وهو الحجم الداخلي 130 × 90 × 8 مم (الشكل 1B). انودت داخل كل لوحة المقايسة مع الطلاء الأسود لجعله أسهل لتصور اليرقات ومنع الصدأ.
ملاحظة: يتم تصنيع لوحات الألومنيوم المقايسة للتدرج أحادية الاتجاه بمتجر لالة. أنوديزيشن يؤديها بائع تجارية. - وضع علامة على دواليب العلوي والسفلي لكل لوحة المقايسة مع ترسيم 13، مفصولة بواسطة 10 ملم باستخدام علامة دائمة. وضع ترسيم أول وآخر 5 مم من الحافة الداخلية من ألواح المقايسة (الشكل 1 أ، ب).
- تقليم وطحن كل لوحة المقايسة الألومنيوم (الشكل 1A) الخروج من قطعة واحدة من الألمنيوم باستخدام منشار باند وحادة مطحنة عمودية مع الأبعاد التالية: حجم الخارجي هو 140 × 100 × 9 مم وهو الحجم الداخلي 130 × 90 × 8 مم (الشكل 1B). انودت داخل كل لوحة المقايسة مع الطلاء الأسود لجعله أسهل لتصور اليرقات ومنع الصدأ.
- لاختلاق لوحة الألومنيوم المقايسة للتدرج ثنائي الاتجاه، قطع صفيحة ألومنيوم مع الأبعاد التالية باستخدام مقص صفائح معدنية: 250 × 220 × 2 مم. انودت لوحات المقايسة مع الطلاء الأسود.
ملاحظة: يؤديها متجر آلة تصنيع لوحات الألومنيوم المقايسة للتدرجات ثنائي الاتجاه. أنوديزيشن يتم عن طريق بائع تجارية. - افتعال كتل الألومنيوم.
ملاحظة: هناك حاجة إلى مبنيين للتدرج أحادية الاتجاه، وهناك حاجة إلى ثلاث كتل للتدرج ثنائي الاتجاه.- قص كتل الألومنيوم (الشكل 1) الخروج من قطعة واحدة من الألمنيوم باستخدام منشار باند (أبعاد 50 × 255 × 14 مم) (الشكل 1، د).
- حفر قناة مائية داخل الكتلة (7 ملم في القطر) باستخدام طاحونة عمودية والاخاديد مؤشر ترابط في نهايات مفتوحة على جانب واحد (الشكل 1). قم بإغلاق الثقوب مخدد مع البراغي وترابط ختم الشريط لتشكيل قناة مياه على شكل U (الشكل 1، د).
ملاحظة: يؤديها متجر آلة تصنيع الكتل المقايسة الألومنيوم. - إصلاح الرابط في كتلة الألومنيوم (الشكل 1) مع المواضيع المسمار وترابط ختم الشريط في نهاية واحدة. تناسب الطرف الآخر مع عدة انتقادات لاذعة في سيليكون أنابيب (معرف 1/4 "x 3/8" OD x 1/16 "الجدار).
- الحصول على اثنين حمامات يتناقل المبردة ساخنة.
- تجميع كتل التحكم في درجة الحرارة لنظام تحليل الانحدار.
- للتدرج أحادية الاتجاه، الاتصال كل من الكتلتين الألومنيوم بحمام مائي منفصلة حيث أن درجة الحرارة لكل كتلة يسيطر مياه مستقلة تعميم نظام (الشكل 2A). استخدام أنابيب سيليكون (معرف 1/4 "x 3/8" OD x 1/16 "الجدار) لتوصيل مخرج حوض ماء بالموصل الموجود على الجانب الداخلي من كتلة الألومنيوم (الشكل 2A). أيضا، استخدام أنابيب لتوصيل موصل الجانب الخارجي على كتلة الألومنيوم إلى المدخل لحمام الماء.
- للتدرج ثنائي الاتجاه، مكان اثنين من ثلاث كتل تحت اليسار والجانبين الأيمن من اللوحة وتوصيلها إلى حمام الماء نفسه مع الأنبوب (الشكل 2). قم بتوصيل كتلة الألومنيوم الثالثة إلى حوض ماء ومكان أدناه مركز اللوحة (الشكل 2) الثانية.
ملاحظة: هذا الجهاز والمقايسة ضرورية فقط إذا اليرقات تتكدس في المنطقة عند حافة واحدة أو أخرى من التدرج أحادية الاتجاه. إذا كان الأمر كذلك فمن المهم لتقييم ما إذا كان أو لم يكن هناك تأثير الحافة. لاختبار هذه الإمكانية، إنشاء تدرج ثنائي الاتجاه فيها درجة الحرارة في منطقة الحافة المفضلة من قبل اليرقات باستخدام التدرج أحادية الاتجاه (مثلاً 18 درجة مئوية) هو درجة الحرارة في منتصف لوحة التدرج ثنائي الاتجاه (3E الشكل وو).
2-اليرقات المزامنة
- تغذية الذباب لاستخدامها لوضع البيض.
- مزيج الخميرة الحبيبات والماء المقطر مع مدقة جعل الخميرة لصق. دقة طحن ويقلب حتى اتساق اللصق مماثل لزبدة الفول السوداني. تجنب لصق الجافة مفرطة، قد تقشر عند نقل الذباب على قارورة جديدة، أو الرطب اللصق، التي يمكن أن تعوض الذباب.
- استخدام مدقة، إضافة عجينة الخميرة قريبة من الجدران الداخلية للقنينات المورفولوجية القياسية، فقط فوق السطح من المواد الغذائية.
- 12-35 عدد الإناث وتصل إلى نصف الذكور العديد من (ولكن لا يزيد عن 10) على لوح2 أول أكسيد الكربون، وإضافة على الإناث والذكور لكل قنينة المحتوية على لصق الخميرة.
- للحفاظ على الطاير الغذاء مع لصق الخميرة الرطبة، بينما تغذية الذباب، بضم هذه القنينات في درج يحمل يصل إلى 100 قارورة مع 20 قارورة مفتوحة تحتوي على الماء فقط المقطر. ضع العلبة في كيس من بلاستيك الشفاف وختم.
- احتضان الدرج في حاضنة 25 درجة مئوية أجل ح 48 حيث أن الإناث يحصلون على تغذية كافية، مما يفسح المجال أمامهم تضع أعدادا كبيرة من البيض.
- إعداد قنينات لوضع البيض.
- نقل الذباب يتغذى في قنينات الغذائية الجديدة لجمع البيض بالاستفادة منها أكثر. لا تستخدم CO2، الذي قد يسبب الذباب لوضع البيض أقل خلال وقت قصير النافذة التالية.
ملاحظة: يتم استخدام قارورة الغذاء القياسية المورفولوجية دون لصق الخميرة لجمع البيض. - تسمح الذباب لوضع البيض ح 3 عند 25 درجة مئوية حيث أن يتم جمع كل البيض على مدى إطار زمني ضيق نسبيا.
ملاحظة: هذا سيمكن اليرقات التي سيتم مزامنتها في نفس المرحلة الإنمائية. - ضع قارورة تحتوي على البيض في علبة تحتوي على قنينة المياه وتشديد الحقيبة. احتضان عند 25 درجة مئوية تحت الضوء ح 12:12 ح دورات الظلام.
- عمر اليرقات لعدد معين من ساعات بعد وضع البيض (AEL) تبعاً لمرحلة اليرقات المرجوة.
ملاحظة: الجدول 1 هو تقدير العلاقة بين ساعات AEL ومرحلة اليرقات، التي سوف تختلف باختلاف الأسهم يطير، المواد الغذائية المستخدمة، تربية إلخ العلاقة الدقيقة بين AEL ومرحلة النمو يجب أن يكون درجة الحرارة التحقق من كل محقق باستخدام المعايير المادية، مثل مورفولوجية خطاطيف و spiracles الفم11.
- نقل الذباب يتغذى في قنينات الغذائية الجديدة لجمع البيض بالاستفادة منها أكثر. لا تستخدم CO2، الذي قد يسبب الذباب لوضع البيض أقل خلال وقت قصير النافذة التالية.
3-تدرج درجة الحرارة الإعداد
- إعداد التدرج أحادية الاتجاه
- لتهيئة بيئة المحيطة رطبة خلال الاختبارات، مكان اثنين من كتل الألومنيوم متصل بحمامات المياه اثنين على مناشف ورقية رطبة، مفصولة بواسطة 10 سم (الشكل 2A).
- قم بتشغيل أحواض المياه هما ح ~ 2 قبل الشروع في فحص للسماح بوقت كاف لدرجة حرارة كتل الألومنيوم لحجته.
ملاحظة: من المستحسن القيام بتجربة وهمية لتحديد درجة حرارة حمام المياه كل ما هو مطلوب لتحقيق التدرج الخطي درجة الحرارة المرجوة. يتم سرد بعض أزواج درجة الحرارة النموذجية لتعيين أحواض المياه في الجدول 2. ومع ذلك، نلاحظ أن درجات الحرارة السطحية تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة. طول الأنابيب كما يؤثر هو التبريد درجات الحرارة كما أن هناك في الأنابيب. طول الأنابيب في الإعداد لدينا 1.5 متر. - الموجات الدقيقة 100 مل من 1% [اغروس] في الإعداد عالية الطاقة في 500 مل جولة الزجاجة واسعة الفم وصب 25 مل/الاعتداء لوحة على benchtop مستوى. إعداد لوحات المقايسة اثنين، والتي يمكن وضعها على كتل الألومنيوم في نفس الوقت (الشكل 2A).
- بعد وقد توطد [اغروس] (10-20 دقيقة)، فرك بلطف كل سطح [اغروس] مع اسفنجة مطبخ قياسية أو ميلامين الأسفنج جعل [اغروس] سطح خشن قليلاً، حيث أنه عند رش الماء على [اغروس] هلام، سيتم إنشاء غشاء الماء رقيقة ناعمة، وسوف تشكل لا قطرات الماء.
- تماما تغرق اللوحات في حاوية مع الماء المقطر حتى المقايسة على استعداد لإجراء لمنع اللوحات من الحصول على السيلاني.
- إعداد تدرج ثنائي الاتجاه (اختياري)
- لتهيئة بيئة المحيطة رطبة خلال الاختبارات، وضع ثلاث كتل الألومنيوم 8 سم عن بعضها البعض (الشكل 2B) على مناشف ورقية رطبة.
- قم بتشغيل أحواض المياه هما ح ~ 2 قبل الشروع في فحص للسماح بوقت كاف لدرجة حرارة كتل الألومنيوم لحجته.
ملاحظة: من المستحسن القيام بتجربة وهمية لتحديد درجة حرارة كل حمام الماء للتدرج ثنائي الاتجاه. يتم سرد بعض أزواج درجة الحرارة النموذجية لتعيين أحواض المياه في الجدول 3. ومع ذلك، نلاحظ أن درجات الحرارة السطحية تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة. طول الأنابيب كما يؤثر هو التبريد درجات الحرارة كما أن هناك في الأنابيب. طول الأنابيب في الإعداد لدينا 1.5 متر. - للحيلولة دون تسرب خارج اللوحة [اغروس]، التفاف حواف لوحة الألومنيوم بوسم الشريط لتشكيل جدار 10 ملم-عالية (الشكل 2).
- استخدام الإعداد عالية الطاقة، الميكروويف 200 مل من 1% [اغروس] في 500 مل جولة الزجاجة واسعة الفم وصب 120 مل على صفيحة مقايسة.
- بعد وقد توطد [اغروس] (~ 30 دقيقة)، فرك بلطف كل سطح [اغروس] مع اسفنجة مطبخ قياسية أو ميلامين الأسفنج جعل السطح [اغروس] قليلاً الخشنة، حيث أنه عند رش الماء على [اغروس] هلام، يتم إنشاء غشاء الماء رقيقة ناعمة ولا شكل قطرات الماء.
- تماما تغرق لوحات الفحص في حاوية مع الماء المقطر حتى المقايسة على استعداد لإجراء لمنعها من الجفاف.
- إنشاء تدرج لوني واحد ثنائي الاتجاه
- إعداد الكواشف والعناصر على مقعد بجوار جهاز تحليل الانحدار (انظر الجدول للمواد).
- تشجيع نقل الحرارة فعالة، سد أي ثغرات بين كتل الألومنيوم وألواح المقايسة برش المياه في مجال التفاعل بين الكتل ولوحة.
- استخدام قفازات، إزالة لوحات الفحص من وعاء الماء. إذا يغزو بين [اغروس] هلام وصفيحة الماء وتسبب المطبات بشكل على السطح، إزالة الماء مع ميكروبيبيتي P1000.
- وضع لوحات الفحص على كتل الألومنيوم حيث أن ترسيم التي 2 سم من الحافة أما بالضبط مطابقة حواف كتل الألومنيوم (الشكل 2 أ، ج).
- رش الماء على سطح اللوحة (غشاء رقيق الماء يغطي السطح [اغروس] غير كافية) لمنع [اغروس] هلام من الجفاف. تأكد من أن الغشاء المياه مستمرة وخالية من قطرات الماء حيث يمكن الحصول على المحاصرين اليرقات في قطرات الماء.
- يشمل نظام التدرج مع صندوق من الورق المقوى للحد من تبخر المياه وتساعد على استقرار درجة حرارة سطح هلام. انتظر لمدة 5-10 دقيقة للسماح لدرجة الحرارة إلى حجته.
- فحص درجة الحرارة السطحية في 12 نقطة على اللوحة (الشكل 2). أخذ قياسات اثنين داخل كل منطقة تحديد ما إذا كان أو لم يكن هناك تباين داخل منطقة. تأكد من درجة الحرارة في كل المواقع داخل ± 0.2 درجة مئوية من درجة الحرارة المطلوبة.
ملاحظة: يحدث التغير داخل منطقة عادة بسبب المسافات الدقيقة للمكانين إلى الحافة من كتل الألومنيوم ليست متطابقة. ضبط موضع لوحة على كتل الألومنيوم للتأكد من تطابق ترسيم التي 2 سم من الحافة أما بالضبط على حواف كتل الألومنيوم. - إذا كان التدرج درجة الحرارة المقاسة ينحرف عن التدرج المطلوب، زيادة أو نقصان تصبح درجة حرارة حمام المياه وإعادة فحص درجة الحرارة السطحية بعد درجة حرارة bath(s) المياه stabilize(s).
- تغطية نظام التدرج مع صندوق من الورق المقوى حتى البدء الفحص.
- إعداد ثنائي الاتجاه التدرج (اختياري)
- إعداد الكواشف والعناصر على مقعد بجوار جهاز تحليل الانحدار (انظر الجدول للمواد).
- رش المياه على أسطح ثلاث كتل الألومنيوم لتشجيع نقل الحرارة فعالة من كتل الألومنيوم إلى لوحات الفحص بسد أي ثغرات بين السطوح.
- إزالة لوحات الفحص بعناية من وعاء الماء ووضع على كتل الألومنيوم. إذا يغزو المياه بين [اغروس] هلام اللوحة، التي قد تسبب المطبات إلى النموذج على السطح، وإزالة الماء مع ميكروبيبيتي P1000.
- ضع لوحة الفحص على كتل الألومنيوم حتى تتوافق ميدلينيس المناطق الأولى والأخيرة من أي حافة من حواف كتل الألومنيوم الجانب الثاني (الشكل 2، د) بالضبط.
- رش الماء على سطح اللوحة (غشاء رقيق الماء يغطي السطح [اغروس] غير كافية) لمنع [اغروس] هلام من الجفاف. تأكد من أن الغشاء المياه مستمرة وخالية من قطرات الماء، حيث يمكن الحصول على المحاصرين اليرقات في قطرات الماء.
- يشمل نظام التدرج مع صندوق من الورق المقوى للحد من تبخر المياه وتساعد على استقرار درجة حرارة سطح هلام. انتظر 5-10 دقيقة للسماح لدرجة الحرارة إلى حجته.
- فحص درجة الحرارة السطحية في نقطتين على طول خط الوسط من كل مناطق 10 (الشكل 2D). أخذ قياسات اثنين داخل كل منطقة تحديد ما إذا كان أو لم يكن هناك تباين داخل منطقة. تأكد من درجة الحرارة في كل المواقع داخل ± 0.2 درجة مئوية من درجة الحرارة المطلوبة.
ملاحظة: يحدث التغير داخل منطقة عادة بسبب المسافات الدقيقة للمكانين إلى الحافة من كتل الألومنيوم ليست متطابقة. ضبط موضع لوحة على كتل الألومنيوم لتأكد من تطابق ميدلينيس المناطق الأولى والأخيرة أقرب كل حافة من حواف كتل الألومنيوم اثنين من الجانب بالضبط. - إذا كان التدرج درجة الحرارة المقاسة ينحرف عن التدرج المطلوب، ضبط تصبح درجة حرارة حمام المياه وإعادة فحص درجة الحرارة السطحية بعد درجة حرارة bath(s) المياه stabilize(s).
- تغطية لبنات مع صندوق من الورق المقوى حتى بداية المقايسة.
4-اليرقات جمع والغسيل
- عزل اليرقات نظيفة (الخيار 1)
- إضافة 18% ~ 40 مل من محلول السكروز إلى أنبوب اختبار 50 مل. حلج القطن جميع اليرقات من vial(s) الغذاء مع سكوبولا ونقل إلى 18% من محلول السكروز.
- مزيج دقيق لكن برفق باستخدام سكوبولا لفصل اليرقات من بقايا الطعام. انتظر 30-60 ثانية حتى تطفو اليرقات إلى الطبقة العليا من الأنبوب. صب الطبقة العليا التي تحتوي على اليرقات (~ 10 مل) إلى آخر أنبوب 50 مل وملء الأنبوب مع محلول السكروز 18% الطازجة. انتظر 30-60 ثانية حتى تطفو اليرقات إلى الطبقة العليا مرة أخرى.
ملاحظة: نقل جنبا إلى جنب مع اليرقات جزيئات الغذاء الكبيرة في بعض الأحيان وقد تؤثر على اليرقات ثيرموتاكسيس إذا لم تتم إزالة. إذا تبقى جزيئات الغذاء الكبيرة في الطبقة العليا، كرر الخطوات 4.1.1-4.1.2، أو إزالتها يدوياً باستخدام سكوبولا. - نقل الطبقة العليا من اليرقات (~ 10 مل) إلى اثنين آخرين من أنابيب 50 مل وملء أنابيب اثنين بالماء المقطر لخفض تركيز السكروز، حيث أن اليرقات غرقت بسرعة في الماء. انتظر 30-60 ثانية حتى اليرقات تنزل إلى القاع. نفذ هذا والخطوات التالية، في أسرع وقت ممكن لمنع اليرقات من الغرق.
- تجاهل قدر من الماء قدر الإمكان عن إمالة الأنابيب برفق. ضم اليرقات في أنبوب واحد بصب اليرقات مع الماء المتبقي وملء الأنبوب بماء مقطر.
- انتظر 30-60 ثانية حتى اليرقات كل بالوعة وإزالة المياه قدر ممكن عن إمالة الأنابيب برفق. كرر هذه الخطوة الغسيل 2-4 مرات تماما إزالة السكروز وجميع المواد الغذائية مرئية.
- تجاهل الكثير من الماء قدر الإمكان ونقل اليرقات إلى 35 ملم فارغ طبق بيتري بالصب. رش الأنبوب بالماء واستخدام فرشاة طلاء صغيرة للمساعدة في نقل اليرقات.
- إزالة الماء الزائد من طبق بيتري استخدام ميكروبيبيتي P1000. ترك ~0.5 مل من الماء منع جفاف اليرقات.
- ضع الغطاء على الطبق للحيلولة دون الإفلات من اليرقات. تشغيل الغطاء رأسا إلى الحد من قدرة يرقات للهروب من خلال الفجوة الصغيرة بين الغطاء وطبق. تسمح اليرقات استرداد ل 10-20 دقيقة.
- عزل اليرقات نظيفة (الخيار 2)
ملاحظة: هذا الأسلوب البديل لتنظيف اليرقات يخفف إمكانية خنق اليرقات أثناء إجراء الغسيل. لاستخدام هذا الأسلوب، المضي قدما في الخطوات التالية بعد تنفيذ 4.1.1-4.1.2 الخطوات المذكورة أعلاه.- ضع مصفاة خلية (300 ميكرون، تحتفظ اليرقات 72 ح AEL أو كبار السن) على رأس أنبوب 50 مل.
- بعد التأكد من أن ليس هناك هيئات الكبار أو بقايا الطعام التي تطفو على سطح محلول السكروز، صب الطبقة العليا تحتوي على اليرقات من خلال مصفاة إلى اعتراض جميع اليرقات على شاشة شبكة. أغسل اليرقات جيدا بالماء المقطر حتى يتم تعبئة أنبوب 50 مل.
- إزالة مصفاة الخلية مع اليرقات والتخلص من المياه المستعملة من الأنبوب. ضع المصفاة المحتوية على اليرقات على رأس الأنبوبة الفارغة وتغسل اليرقات مرة أخرى مع الماء المقطر حتى يتم تعبئة أنبوب 50 مل.
- اقلب في المصفاة رأسا فارغة 35 ملم طبق بيتري، ورش المياه من الأعلى من مصفاة الخلية لنقل اليرقات إلى طبق بيتري. نقل اليرقات المتبقية باستخدام فرشاة طلاء صغيرة.
- ما زالت خطوة 4.1.7 أعلاه قبل الانتقال إلى الخطوة 5.
5-التحليل والحساب
- إزالة في صندوق من الورق المقوى وفحص درجة الحرارة السطحية جل مباشرة قبل نقل اليرقات إلى اللوحة. تقليل الوقت الذي مفتوح صندوق من الورق المقوى لمنع الإخلال بالموازنة درجة الحرارة. إذا كان السطح الجاف، رش كمية صغيرة من المياه على السطح.
- توزيع 150 ± 50 اليرقات قرب مركز كل لوحة (بين مناطق 3 و 4 من أصل 6 مناطق) للتدرج أحادية الاتجاه (الإصدار المنطقة؛ الشكل 2).
ملاحظة: للتدرج ثنائي الاتجاه، توزيع اليرقات 200-400 على طول المنطقة الوسطى لكل نصف (الشكل 2D). - ضع غطاء ميكروسكوبية على كل لوحة الفحص للحيلولة دون الزحف على اليرقات. تغطي الإعداد مع صندوق من الورق المقوى لمنع التعرض للضوء، مما قد يؤثر على اختيار اليرقات على [اغروس] هلام.
ملاحظة: للتدرج ثنائي الاتجاه، فإنه لا ضرورة لتغطية اللوحة مع غطاء، لأن اللوحة أكبر، ودرجة الحرارة المفضلة لليرقات في المنطقة الوسطى. ونتيجة لذلك، اليرقات قليلة تتراكم في الحواف وتتاح له فرصة للزحف. - السماح المقايسة المضي قدما لمدة 10-30 دقيقة للتدرج أحادية الاتجاه، ول 15-35 دقيقة للتدرج ثنائي الاتجاه، تبعاً لعمر اليرقات (الجدول 4).
- قم بإزالة في صندوق من الورق المقوى وغطاء الميكروسكوبية. تصوير اللوحات من فوق باستخدام كاميرا رقمية. أخذ صورتين فوتوغرافيتين لكل لوحة الفحص حيث أن المحقق يمكن أن تختار واحدة مع التباين والسطوع لتحليل أفضل.
- إزالة كل من اليرقات من لوحات المقايسة، وفي أي مكان خارج اللوحات بالطموح.
- تنظيف لوحات المقايسة والأنابيب ومصفاة الخلية جيدا بالماء المقطر. إعادة استخدام لوحات الفحص أعد ذلك اليوم إلا إذا تلف سطح [اغروس].
- حساب النسبة المئوية لتوزيع اليرقات في كل منطقة.
- قم بفتح الصورة الفوتوغرافية نتائج التحليل باستخدام أي برنامج يتيح إضافة علامات للصورة. للإشارة إلى مناطق الفحص، رسم خطوط عمودية كل سم 2 استناداً إلى ترسيم على لوحة المقايسة.
- حساب عدد اليرقات في كل منطقة وتسجيل الأرقام. لا تعول اليرقات في مناطق 0.5 سم من أي من الجدران. الهلام سمكا قرب الجدران، ودرجات الحرارة السطحية ليست خطية في هذه المناطق.
- للتدرج أحادية الاتجاه، حساب النسبة المئوية للتوزيع في كل منطقة على النحو التالي:
(عدد اليرقات في منطقة معينة 2-سم)/(إجمالي عدد اليرقات في 6 مناطق) x 100. - للتدرج ثنائي الاتجاه، حساب النسبة المئوية للتوزيع في كل منطقة على النحو التالي:
(عدد اليرقات في منطقة معينة 2-سم)/(إجمالي عدد اليرقات في 5 مناطق على كل جانب من التدرج) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لإنشاء 18 درجة مئوية--28 درجة مئوية واحدة-الاتجاه التدرج، نحن تعيين درجات الحرارة من اثنين من أحواض المياه إلى 16.8 درجة مئوية و 31 درجة مئوية. ونحن الحصول على درجات الحرارة على 13 نقطة عن طريق قياس درجة الحرارة في 26 موقعا في الجزأين العلوي والسفلي من جميع مناطق 6، خطوط الحدود بين المناطق، وفي أقصى الغايات من السطح [اغروس] هلام (الشكل 2، 2E). وكان توزيع درجة الحرارة على طول التدرج الخطي نحو (Y = 0.9672 * X + 16.19، ص2 = 0.9961) (الشكل 2E).
نحن جزيئي تفضيلات درجة الحرارة من اليرقات التحكم (w1118) في مختلف الإعمار. 1st (24 ± 1.5 ح AEL)، 2nd (48 ± 1.5 ح AEL) وأوائل 3rd اليرقات (± 1.5 ح 72) أظهرت قمم في منطقة 24 درجة مئوية (الشكل 3 أ، ب). تفضيلات درجة الحرارة تتغير خلال 3rd instar التنمية اليرقات. أكبر نسبة من منتصف 3rd الطور (± 96 ح 1.5 AEL) المتراكمة في منطقة 18 درجة مئوية (الشكل 3 ألف، باء)، وزاد هذا التحيز مع التقدم في السن. بين أواخر 3rd يرقات الطور (قبل تسلق الجبال؛ 120 ± 1.5 ح AEL)، تجمع ~ 50% في منطقة 18 درجة مئوية، وتم اختيار هذه الحرارة ~ 4-fold أعلى من منطقة مجاورة 20 درجة مئوية (المنطقة 18 درجة مئوية، ونسبة 50.2 في المائة؛ المنطقة 20 درجة مئوية، ونسبة 15.1 في المائة؛ الشكل 3 ألف ب.) نزعة تتراكم في منطقة 18 درجة مئوية في ث1118 لم يكن بسبب تأثير الحافة منذ أواخر 3rd instar اليرقات لا تزال تتراكم في منطقة 18 درجة مئوية، واستخدام تدرج درجة حرارة ثنائي الاتجاه (الشكل 3 أي، و ).
نحن أيضا اختبار يرقات الطور أواخر 3rd (120 ± 1.5 ح AEL) مع الطفرات في الجينات اللازمة لتمييز الاختلافات في درجة الحرارة في مجموعة مريحة. وتشمل هذه trpA1، ومطلوب لتحديد درجة الحرارة العادية في نطاق 18 درجة مئوية-24 درجة مئوية5،،من78. توزيع اليرقات مع طفرة فارغة في trpA1 (trpA11) على قدم المساواة على مدى كامل 18 درجة مئوية – 28 درجة مئوية متدرجة (الشكل 3). وتظهر اليرقات مفقود فقط في A و B isoforms (trpA1 ABG4)، أو إيسوفورمس C و D (trpA1-CDG4) أيضا العاهات الشديدة (الشكل 3). ترميز الذباب isoforms اثنين من phospholipase Cβ (PLC21C ونوربا)، والطفرات التي تؤثر على نوربا (نورباP24) لكن لا plc21c (plc21cP319) أيضا عرقلة تراكم في حدود 18 درجة مئوية ( الشكل 3D).
رقم 1. جهاز لإجراء تحليل الانحدار درجة حرارة وحيدة الاتجاه. (أ) ألومنيوم اختبار اللوحة المستخدمة لفحص سلوك اليرقات ثيرموتاكسيس. 13 خطوط سوداء في أعلى وأسفل ترسيم المناطق 12 (10 ملم في كل). الجزء السفلي من اللوحة هو أكسيد مع الطلاء الأسود حتى يكون من السهل تصور اليرقات. (ب) الأبعاد للوحة الألومنيوم (المشار إليها في مم). حجم اللوحة الألومنيوم الخارجي هو 140 × 100 × 9 مم. حجم اللوحة الألومنيوم الداخلية هو 130 × 90 × 8 مم. تكون مفصولة ترسيم 10 ملم. ترسيم الأول والأخير 5 ملم من الحواف للمنطقة الداخلية اللوحة. (ج) أعلى ووجهات نظر الجانب أحد كتل الألومنيوم المستخدمة للتحكم في درجة حرارة التدرج. وقد الكتلة موصلان يستخدم لإرفاق أنابيب السيليكون، والتي تتصل بحمام مائي. (د) أبعاد كتلة الألومنيوم. حجم كتلة الألومنيوم الخارجي هو 255 × 50 × 14 مم. قطر طريق المياه الداخلية من 7 ملم. موصلان 30 ملم على اليسار الاتصال مع أنابيب السيليكون الذي يمتد إلى حمام الماء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. الأجهزة المقايسة التدرج أحادية وثنائية الاتجاه. (أ) أحادية الاتجاه إعداد التدرج مع اثنين من لوحات المقايسة الألومنيوم على اثنين من كتل الألومنيوم. يتم التحكم في درجات حرارة كتل الألومنيوم بتعميم المياه من اثنين من أحواض المياه. (ب) ترتيب ثلاث كتل الألومنيوم، وأحواض المياه وصفيحة ألمنيوم (250 × 220 مم) لتدرج ثنائي الاتجاه. وترتبط كتل اليسار واليمين إلى حمام الماء نفسه وكتلة الأوسط متصلاً بحمام المياه الأخرى. يتم تغليف لوحة الألومنيوم المقايسة مع الشريط لتشكيل جدار 10 ملم تحتوي 1% [اغروس]. (ج) مواقع لفحص درجات الحرارة (المشار إليها بواسطة النقاط) والإفراج اليرقات على اللوحة. قبل البدء تجربة، التحقق من درجة الحرارة في نقطتين داخل كل منطقة للتأكد من أنه يتم إنشاء التدرج الخطي درجة الحرارة المرجوة. يتم الإفراج اليرقات داخل المنطقة المشار إليها بالقرب من خط الوسط. يتم عد اليرقات داخل كل منطقة من المناطق 2-سم. (د) مواقع لفحص درجات الحرارة (المشار إليها بواسطة النقاط) ومناطق الإصدار لليرقات في تدرج ثنائي الاتجاه. يتم الإفراج على عدد متساو من اليرقات على طول خط الوسط لكل نصف التدرج ثنائي الاتجاه. يتم حساب عدد اليرقات في كل من 10 (2 سم) مناطق. تتم الإشارة إلى مجموعة نموذجية واحدة من درجات الحرارة (18 درجة مئوية-26 درجة مئوية) على السطح [اغروس]. (ﻫ) قياس درجات الحرارة على طول خطوط الحدود وميدلينيس من كل منطقة في تدرج أحادية الاتجاه عينة. البيانات تمثل متوسط درجات الحرارة ± التنمية المستدامة. n = 8 فحوصات (150 ± 50 يرقة/التحليل). أجزاء من هذا الرقم مستنسخة من سكاب et al. 8 مع تعديلات طفيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. نتائج تمثيلية باستخدام فحوصات التدرج أحادية الاتجاه وثنائي الاتجاه. (أ وب) يعني النسب المئوية لليرقات في 6 مناطق في التدرج أحادية الاتجاه. وتشمل البيانات 3rd الطور اليرقات في الساعات المشار إليها بعد بيضة زرع (AEL). n = 6-7. مجالات الخطأ في تمثل ±SEM-(ج) حرارية توزيعات من أواخر 3 قبل التسلقrd instar اليرقات التحكم (w1118) وطفرات trpA1 على التدرج أحادية الاتجاه. n = 3-4. أشرطة الخطأ تمثل ±SEM-(د) التوزيعات الحرارية ليرقات الطور أواخر 3rd التحكم (w1118) وطفرات PLCβ على التدرج أحادية الاتجاه. n = 4-6. أشرطة الخطأ تمثل ±SEM-(ه) التوزيع الممثل من قبل التسلق، الراحل 3rd الطور اليرقات (w1118) على التدرج ثنائي الاتجاه. مناطق الفحص اليسار واليمين هو مبين بالخطوط المنقطة ومفصولة بمنطقة العد لا في المركز (المنطقة المظللة). (و) النسبة المئوية لتسلق قبل أواخر 3rd instar اليرقات (w1118) في كل منطقة على طول التدرج الحراري. ووضعت اليرقات في اليسار والحق في الإفراج عن المناطق. تفصل منطقة العد لا 3-سم في الوسط مناطق الفحص ويتم حساب التوزيعات بشكل مستقل. أشرطة الخطأ تمثل SEMs. n = 3 فحوصات (200-400 يرقات/التحليل). أجزاء من هذا الرقم مستنسخة من سكاب et al. 8 مع تعديلات طفيفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| ساعات AEL | مرحلة اليرقات | |
| 24 | 1st الطور | |
| 48 | الطور 2nd | |
| 72 | الطور المبكر 3rd | |
| 96 | الطور منتصف 3rd | |
| 120 | الطور متأخرة 3rd ، قبل مرحلة التسلق | |
الجدول 1. العلاقة بين الساعات بعد بيضة زرع (AEL) ومراحل اليرقات.
| التدرج درجة حرارة على [اغروس] لوحة (المنحدر) | درجات حرارة أحواض المياه | درجات حرارة كتل الألومنيوم |
| 10.0-25.0 درجة مئوية (1.5 درجة مئوية/سم) | ~6.5-7°C/~28.5°C | ~8.5°C/~26.8°C |
| 18.0-28.0 درجة مئوية (1 درجة مئوية/سم) | ~16.8°C/~31.0°C | ~17.8°C/~29.7°C |
| 14.0-34.0 درجة مئوية (2 درجة مئوية/سم) | ~10.0°C/~40.0°C | ~11.8°C/~36.8°C |
| 12.5-42.0 درجة مئوية (2.95° C/سم) | ~7.0°C/~55.0°C | ~9.4°C/~49.4°C |
الجدول 2. عادة درجة الحرارة التدرجات ودرجات الحرارة المقابلة لأحواض المياه وكتل الألومنيوم للتدرجات اتجاهي واحد.
| التدرج درجة الحرارة على لوحة [اغروس] | درجات حرارة أحواض المياه | درجات حرارة كتل الألومنيوم |
| 22/10/22 درجة مئوية (1.5 درجة مئوية/سم) | ~5.0°C/~25.0°C | ~7.5°C/~24.0°C |
| 26-18-26 درجة مئوية (1 درجة مئوية/سم) | ~15.8°C/~30.6°C | ~16.9°C/~28.4°C |
| 30-14-30 درجة مئوية (2 درجة مئوية/سم) | ~8.5°C/~36.4°C | ~10.9°C/~32.8°C |
| 36-12.5-36 درجة مئوية (2.95° C/سم) | ~5.0°C/~47.2°C | ~7.9°C/~40.9°C |
الجدول 3. عادة درجة الحرارة التدرجات ودرجات الحرارة المقابلة لأحواض المياه وكتل الألومنيوم للتدرجات ثنائي الاتجاه.
| عمر اليرقات (AEL) | وقت الفحص (وحيد الاتجاه) | وقت الفحص (ثنائي الاتجاه) |
| ح 24 | 30 دقيقة | 35 دقيقة |
| ح 48 | 22 دقيقة | 27 دقيقة |
| ح 72 | 16 دقيقة | 21 دقيقة |
| ح 96 | 13 دقيقة | 18 دقيقة |
| ح 120 | 10 دقيقة | مدة 15 دقيقة |
الجدول 4. مختلف الإعمار اليرقات (AEL) وأوقات فحص المقابلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لضمان النجاح لهذا البروتوكول، من المهم اتخاذ خطوات للحصول على العدد الكافي من اليرقات لإجراء التجارب. وتشمل هذه التغذية قبل الذباب في قارورة تحتوي على لصق الخميرة لمد 2-3 لتحسين وضع البيض. قارورة تحتاج إلى وضعها في علبة تحتوي على قارورة الماء ومحاطة بكيس من بلاستيك واضحة، مما يحافظ على الرطوبة من المواد الغذائية ويعزز تغذية فعالة من اليرقات في حين تسمح بالتعرض للضوء الظلام الدورات العادية. ومع ذلك، لا ينبغي لينة حتى أنه أصبح محاصراً الذباب لصق الخميرة. ويعتمد عدد الإناث كل قنينة على النمط الوراثي. في حالة ث1118، أنها عادة ما تكون كافية للسماح ~ 12 الإناث والذكور ~ 6 لوضع البيض ح 3. عادة ما توفر قنينات اثنين يكفي اليرقات (100-200 اليرقات) مكان على لوحة للمقايسة أحادية الاتجاه. إذا كان المخزون يطير يضع البيض أقل من البرية من نوع أو هو خفض نسبة اليرقات التي تفقس، أضف الذكور والإناث إضافية (يصل إلى 30-35/فيال).
هناك العديد من الأسباب لتقلب غير مقصودة عند إجراء هذه الاختبارات. مرحلة النمو يؤثر على تفضيل درجة الحرارة من اليرقات. ولذلك، من الضروري استخدام يرقات مرحلة محددة بعناية. للقيام بذلك، جمع اليرقات على مدى فترة زمنية ضيقة (مثل ح 3). منذ تربية الشروط (الحرارة والرطوبة، ودورة الضوء الظلام ونوع من الطعام) وبعض الطفرات تؤثر على معدل التنمية، لا تعتمد تماما على الوقت بعد بيضة زرع لتحليل نسبيا تتراوح أعمارهم بين اليرقات. كما أن من المهم دراسة السمات الجسدية، مثل حجم الفم خطاطيف و spiracles7 تحديد ما إذا كانت اليرقات من الأنماط الجينية المختلفة في نفس المرحلة الإنمائية. أوقات 1st, 2nd ويرقات الطورrd 3 لتطوير (الجدول 1) تستند إلى استخدام الغذاء القائم على وجبة الذرة والحضانة عند 25 درجة مئوية تحت الضوء ح 12:12 ح دورات الظلام. يرقات تنمو أبطأ في الغذاء على أساس دبس السكر. نضارة ترطيب والغذاء السليم يؤثر أيضا على نمو اليرقات. كمية المياه في الغذاء يجب أن تترك الطعام الجاف للغاية قشر العودة من القنينة ولا فضفاضة جداً بسبب المفرط للمياه. ومن الناحية المثالية، الطبقة ~ 5 ملم أقرب سطح الغذاء مرهون بيرقات المتزايد وينتقل بسهولة عندما يتم إمالتها القنينة أو استغلالها. يمكن تحقيق هذا الشرط استخدام الأغذية الطازجة الصنع مع اليرقات 50-100.
من الضروري إنشاء تدرج درجة الحرارة مستقرة قبل الشروع في الفحص. ولذلك، تشغيل في حوض ماء ح 1-2 قبل الشروع المقايسة، كأحواض المياه إنتاج الحرارة، وقد تتغير درجة الحرارة المحيطة للغرفة، التي بدورها يمكن أن تؤثر على التدرج. بعد 1-2 ساعة، درجة الحرارة المحيطة الغرف المكيفة الهواء الأكثر اكويليبراتيس. ومع ذلك، وهذا يجب أن تحدد في كل بيئة. وبالإضافة إلى ذلك، عند إنشاء تدرج مع طائفة كبيرة في درجة حرارة (> 3.0 درجة مئوية/سم)، قد يكون من الصعب الحصول على تدرج مستقرة. حركة صغيرة لصفيحة المقايسة والأهم تغيير التدرج درجة الحرارة عندما يكون النطاق كبير (مثلاً > 3.0 درجة مئوية/سم). ووجدنا أن تدرج 1-2 درجة مئوية/سم تنتج التدرجات الأكثر استقرارا.
وهناك عدة اعتبارات إضافية التي تحتاج إلى مراقبة للحد من التقلبات في فحوصات ثيرموتاكسيس. الغسيل اليرقات الحاسمة، كوجود جزيئات الطعام أو السكروز عن اليرقات يمكن أن تؤثر التحليل. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات الغسيل جيدا ولكن بسرعة، لأنه يحد من إمداداتها من الأوكسجين مفرطة بينما كانت مغمورة في المياه قد يؤثر على صحتهم. ولذلك، نوصي باستخدام مصفاة الخلية (الخيار 2) لتنظيف اليرقات. مصفاة بحجم مسام من 300 ميكرون يعمل بشكل جيد لليرقات في وقت مبكر 3rd instar المرحلة (72 ح AEL) أو كبار السن. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم القيام بتجارب في نفس الوقت من اليوم، مثل من زيتجيبير الوقت ZT4 (ZT) إلى ZT8 (ZT = 0 عندما يتم تشغيل أضواء)، والحد من التقلبات بسبب الآثار المترتبة على إيقاعات circadian على اختيار درجة الحرارة. مستوى الرطوبة في اللوحة [اغروس] يمكن أيضا أن يسبب التغير في النتائج. في حين تكون رطبة على سطح اللوحات، قطرات الماء يمكن فخ اليرقات، ولذلك تحتاج إلى تجنبها.
الحد من تقلب في فحوصات سيجعل من الممكن الحصول على نتائج قوية دون إجراء عدد كبير من التجارب المستقلة. 3-8 تجارب مستقلة عادة كافية للحصول نتائج يمكن الاعتماد عليها. جدولة النتائج المناسبة أيضا حاسمة بالنسبة لنجاح فحوصات ثيرموتاكسيس. لا تعول اليرقات الموزعة في مناطق داخل 0.5 سم من الجدران الألومنيوم، ونظرا لأن درجات الحرارة ليست خطية في هذه المناطق. سوف توضع بعض اليرقات على الحدود بين المنطقتين، في الوقت الذي يبرم المقايسة. إذا كان أكثر من 50% طول الجسم موجودة في منطقة واحدة، ثم تدرج اليرقة في جدولة لتلك المنطقة. إذا كان يرقة دقة 50% في كل من المنطقتين، ثم عد الحيوان يرقات 0.5 في كل منطقة.
بينما يسمح تحليل الانحدار اليرقات تميز طائفة من الاختلافات في درجة الحرارة، إلا أن هناك حدوداً لدرجات الحرارة الدنيا والعليا التي يمكن اختبارها فعلياً. ليس من الممكن لاختبار درجات الحرارة < 10 درجة مئوية منذ انتقال اليرقات يقلل إلى حد كبير في درجات الحرارة المنخفضة. على الرغم من أن يمكن إنشاء التدرجات مع درجة الحرارة العليا تصل إلى 42 درجة مئوية، تقريبا لا مراقبة اليرقات البقاء في أي منطقة > 28 درجة مئوية. ولذلك، لا يمكن استخدام فحوصات الانحدار المستمر لتميز تفضيلات درجة الحرارة بين مختلف المناطق > 28 درجة مئوية. ومع ذلك، فحوصات التدرج في درجات الحرارة المرتفعة هذه يمكن استخدامها لتوصيف طفرات إذا كانت شديدة قد حولت تفضيلات درجة حرارة دافئة.
إذا كان متحولة عيب الحركي، قد يكون ضروريا لإجراء تجارب إضافية للتأكد من أن تفضيل واضح درجة الحرارة ليست دقيقة نظراً ضعف حركة. لتصحيح هذه المشكلة المحتملة، قد يكون من الضروري إيجاد وقت أطول للمقايسة للسماح للحيوانات الوقت الإضافي للانتقال إلى المناطق المطلوب لها. يمكن أيضا أن تستخدم تحليل الانحدار ثنائي الاتجاه لاختبار ما إذا كانت الحيوانات حدد نفس المنطقة المفضلة، بغض النظر فيما يتعلق بحيث يتم وضعها في البداية على اللوحة.
وفي الختام، فحوصات التدرج الموضحة هنا بمزايا أكثر من غيرها من فحوصات ثيرموتاكسيس. حين فحوصات اختيار اتجاهين مفيدة، كما أنها يمكن أن تسفر عن نتائج قوية، خاصة عندما تكون الاختلافات في درجة الحرارة بين منطقتي كبيرة، إلا أنها ليست فعالة في الكشف عن درجة الحرارة المثالية المفضلة من قبل اليرقات في تجربة واحدة. للقيام بذلك يتطلب القيام بالعديد من مجموعات الاختيار ذات اتجاهين لتحديد الأكثر تفضيلاً درجة الحرارة5،،من67. وفي المقابل، يوفر تحليل الانحدار الحيوان فرصة لتحديد منطقة درجة الحرارة المفضلة الخاصة بهم في بيئة مع المناظر الطبيعية واحدة درجة حرارة مستمرة. وبالتالي، ليس من الضروري وضع مجموعة كبيرة من الخيارات ذات اتجاهين لتحديد البيئة الحرارية المفضل. استخدمت الدراسة ثيرموتاكسيس باستخدام طبق بيتري جولة لتقييم آثار درجة الحرارة على ديناميات تتحرك اليرقة10. ومع ذلك، أنها أقل فائدة في التمييز بين اﻷفضليات بين درجات الحرارة المختلفة، ونظرا لكل منطقة بحجم مختلف. وأخيراً، بسبب البساطة المقايسة، وفائدتها في تفضيلات درجة الحرارة الصغيرة تمييزاً في مقايسة واحدة، يمكن أن تستخدم الشاشة عشرات الجينات المرشحة التي يحتمل أن تشارك في تفضيل اليرقات درجات الحرارة التي قد إلا أن التغاضي عن استخدام فحوصات أخرى
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
C.M. هي مدعومة بتمويل من نيي (EY008117، EY010852)، نيدكد (DC007864، DC016278) ونييد (1DP1AI124453).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
