Summary
여기, 우리는 연속 열 그라디언트를 사용 하 여 초파리 애벌레의 기본 환경 온도 결정 하는 프로토콜 제시.
Abstract
많은 동물, 과일 파리, 초파리 melanogaster를 포함 하 여 차별 분 차이 환경 온도를 선호 그들의 열 조를 찾아 그들을 가능 하 게 할 수 있다. 애벌레의 온도 환경 정의 된 선형 범위를 정의 하려면 우리는 온도 기울기를 사용 하 여 분석 결과 개발 했다. 단일 지향성 그라디언트를 설정 하려면 두 개의 알루미늄 블록 독립 물 탕, 각각의 개별 블록의 온도 제어에 연결 됩니다. 해당 하위 및 상위 제한을 설정 하는 두 개의 블록. 온도 기울기는 접시에 걸쳐 그들 사이의 거리는 두 물 제어 블록 위에 agarose 코팅 알루미늄 플레이트를 삽입 하 여 설정 됩니다. 끝 물 블록 위에 설정 된 알루미늄 플레이트의 최소 및 최대 온도 정의 하 고 지역 사이 선형 온도 기울기를 형성 하는 두 개의 블록. 그라데이션 분석 결과 다른 연령대의 애벌레에 적용할 수 있는 고 고기, 인코딩 TRP 채널 및 opsins, 온도 차별에 필요한 유전자에 영향을 미치는 돌연변이 등을 전시 하는 돌연변이 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다.
Introduction
Thermotaxis는 모바일 동물 선택 가장 유리한 조건1,2,3환경 하에 고용 됩니다. 지나치게 뜨겁거나 차가운 기후 인 경우이 문제는 생존을 위해 생명 이다. 또한, 많은 동물 편안한 범위에서 온도에 아주 작은 차이에 민감한 고 이상적인 온도 환경. 이 같은 환경과 그들의 체온을 equilibrate 과일 파리 poikilothermic 유기 체에 대 한 특정 중요성 이다. 애벌레 thermotaxis 모니터링 분석 수단이 식별, Drosophila 일시적인 수용 체 잠재력 (TRP) 채널4,,56, 같은 분자 센서의 역할을 명확히 rhodopsins7,8와 ionotropic 수용 체 수용 체 (국세청)9, 다른 온도 범위와 온도 감도이 동물을 부여.
양방향 선택 테스트 애벌레6,7열 기본을 공부 하는 한 가지 방법은 제공 합니다. 분석 결과 수반 두 가지 온도 영역을 설정 하 고 다른 한쪽을 선택 하는 동물을 수 있습니다. 양방향 선택 테스트에서 결과 강력 하 고, 두 가지 옵션 사이의 온도 차이가 큰 경우 특히 수 있습니다. 또한, 각 분석 결과 두 그룹을 tabulating 포함, 데이터는 간단한 기본 색인으로 표현할 수 있습니다. 편리 하 고 양방향 선택 분석 실험의 단순 유전 스크린 의무가 있습니다. 그러나, 주요 한계는 많은 실험은 야생-타입 또는 돌연변이 동물의 원하는 온도 설정 하는 데 필요한입니다.
그라데이션 분석 결과 단일 분석 결과8원하는 온도 설정할 기회를 제공 합니다. 연속 범위의 온도 직면할 때 또한, 양방향 선택 테스트와는 달리 그것은 동물의 그룹의 분포의 평가 허용. 한 그라데이션 분석 결과 페 트리 접시를 사용 하 여 단일 동물 이며 개별 동물10의 상세한 동작을 특성화 하는 데 적합 합니다. 그러나, 접시 라운드 이기 때문에, 온도 영역의 크기 변화 하 고 중심 으로부터 거리에 따라 점차적으로 작은. 따라서,이 설정 온도 선택의 동물의 인구를 모니터링에 이상적입니다.
애벌레의 그룹의 온도 선호를 평가 하기 위해 적합 한 연속 열 그라데이션 기구 직사각형 경기장을 고용 하 고 여기 설명. 기구는 생성 하 고 조립 하기 쉽습니다. 또한, 그라데이션, 선형 이며 유연 하 고, 42 ° c에 10 ° C에서 큰 온도 범위 동안 thermotaxis를 평가 하는 데 사용할 수 있습니다. 분석 결과 신속 하 고 간단 하 게 수행 하 고 재현 가능한 데이터를 생성 합니다. 애벌레의 선호 온도 보고, 뿐만 아니라 그것은 하나의 실험에서 전체 선형 범위 동물의 인구의 환경 설정을 보여준다. 이러한 장점으로 인해 thermotaxis에 필요한 유전자를 식별 하는 데 탁월한 선택 이다.
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Protocol
1. 장비 제조 및 조립 장치 그라데이션 분석 실험
- 단일 방향 그라데이션 분석 결과 대 한 알루미늄 분석 결과 번호판 조작.
- 트림 및 밴드 톱을 사용 하 여 알루미늄의 한 조각에서 각 알루미늄 분석 결과 플레이트 (그림 1A)를 갈기 고 다음 크기와 수직 밀 날카로운: 외부 크기 140 x 100 x 9 mm 이며 내부 크기는 130 x 90 x 8 mm (그림 1B). 애벌레를 시각화 하 고 녹 방지를 쉽게 검은 페인트와 각 분석 결과 판의 내부 anodize
참고: 단일 방향 그라데이션에 대 한 알루미늄 분석 결과 접시의 제조 기계 공장에 의해 이루어집니다. 양극 상업적인 공급 업체에 의해 수행 됩니다. - 13 경계 설정, 10 mm 영구 마커를 사용 하 여 구분 된 각 분석 결과 접시의 위쪽과 아래쪽 테두리를 표시 합니다. 첫 번째 및 마지막 경계 설정 내부 가장자리에서 5mm 분석 결과 플레이트 (그림 1A, B)의 장소.
- 트림 및 밴드 톱을 사용 하 여 알루미늄의 한 조각에서 각 알루미늄 분석 결과 플레이트 (그림 1A)를 갈기 고 다음 크기와 수직 밀 날카로운: 외부 크기 140 x 100 x 9 mm 이며 내부 크기는 130 x 90 x 8 mm (그림 1B). 애벌레를 시각화 하 고 녹 방지를 쉽게 검은 페인트와 각 분석 결과 판의 내부 anodize
- 판금이 위를 사용 하 여 다음 치수와 알루미늄 플레이트 잘라 알루미늄 분석 결과 플레이트 양방향 그라데이션에 대 한 조작, 하: 250 x 220 x 2 mm. Anodize 검은 페인트와 분석 결과 접시.
참고: 양방향 그라디언트에 대 한 알루미늄 분석 결과 접시의 제조 기계 공장에 의해 수행 됩니다. 양극 상업적인 공급 업체에 의해 이루어집니다. - 알루미늄 블록을 조작.
참고: 두 개의 블록은 단일 방향 그라데이션에 대 한 고 3 블록 양방향 그라데이션에 필요한.- 알루미늄 블록 (그림 1C) 밴드 톱 (50 x 255 x 14mm의 크기)를 사용 하 여 알루미늄의 한 조각 잘라 (그림 1 c, D).
- 드릴 한쪽 (그림 1D)에 열린 끝에 수직 밀 및 스레드 홈을 사용 하 여 블록 (7 mm에 직경) 내부 물 채널. 볼트와 U 자 모양 물 채널 (그림 1 c, D)를 실 물개 테이프와 홈된 구멍을 닫습니다.
참고: 알루미늄 분석 결과 블록의 제조 기계 공장에 의해 수행 됩니다. - 스크류 스레드 알루미늄 블록 (그림 1D)에 커넥터를 해결 하 고 실 물개 테이프 한쪽 끝에. 실리콘 튜브 (1/4"ID 벽 1/16" x 3/8"OD x)에 여러 가시와 다른 쪽 끝을 맞습니다.
- 2 개의 냉장/온수 순환 목욕을 가져옵니다.
- 그라데이션 분석 결과 시스템에 대 한 온도 제어 블록을 조립.
- 단일 방향 그라데이션에 대 한 연결 두 알루미늄 블록의 각 별도 물 욕조에는 각 블록의 온도 독립적인 물 순환 시스템 (그림 2A)에 의해 제어 됩니다. 실리콘 튜브 (ID 1/4"x 3/8" x 벽 1/16"OD)를 사용 하 여 커넥터 알루미늄 블록 (그림 2A)의 안쪽에 물 목욕의 콘센트를 연결 하. 또한, 물 목욕의 입구를 알루미늄 블록에 외부 커넥터 연결 튜브를 사용 합니다.
- 양방향 그라데이션에 대 한 왼쪽 아래 세 블록의 2 개 및 오른쪽 접시의 놓고 튜브 (그림 2B)와 같은 물 목욕에 그들을 연결 합니다. 3 알루미늄 블록을 두 번째 물 목욕 플레이트 (그림 2B)의 중앙 아래에 연결 합니다.
참고:이 장치 및 분석 결과 애벌레 한 가장자리 또는 단일 방향 그라데이션의 다른 영역에서 축적 하는 경우만 필요 됩니다. 그렇다면, 그것은 가장자리 효과 여부를 평가 하는 것이 중요입니다. 이 가능성을 테스트 하기 위해 양방향 그라데이션이 있는 단일 지향성 그라데이션 (예: 18 ° C)를 사용 하 여 애벌레 선호 가장자리 영역 온도 양방향 그라데이션 (그림 3E 접시 중간 온도 설정 , F).
2. 애벌레 동기화
- 파리를 달걀 누워 하는 데 사용할 키 우다.
- 혼합 효 모 립 고 붙여 누 룩을 만들기 위해 유 봉과 증류수. 철저 하 게 갈기 고 붙여넣기의 일관성은 땅콩 버터를 유사한 때까지 저 어. 지나치게 건조 한 풀을, 신선한 튜브에 파리를 전송할 때 떠나 또는 젖은 파리 트랩 수 붙여넣기 하지 마십시오.
- 사용 하는 유 봉, 음식의 표면 바로 위에 표준 초파리 튜브의 내부 벽에 가까운 누 룩 붙여넣기를 추가 합니다.
- 수 12-35 여성 및 CO2 패드 (하지만 더 이상 10) 절반 만큼 남성에 게 고 각 효 모 포함 하는 붙여넣기 유리병에 암컷과 수 컷을 추가.
- 비행을 유지 효 모-붙여 촉촉한, 음식 파리 피드 동안 결합이 튜브 100 튜브 포함 20 오픈 튜브와 증류수만 보유 하 고 있는 트레이. 투명 한 플라스틱 가방에 트레이 놓고 밀봉 합니다.
- 있도록 암컷 적절 하 게, 많은 계란을 낳 기 위해 그들을 함으로써 영양은 48 h에 대 한 25 ° C 배양 기에서 트레이 품 어.
- 달걀 누워에 대 한 튜브를 설정 합니다.
- 이상 그들을 활용 하 여 달걀을 수집에 대 한 새로운 음식 튜브로 영양된 파리를 전송. CO2, 다음 짧은 시간 창에 적은 계란을 낳 기 위해 파리를 발생할 수 있습니다를 사용 하지 마십시오.
참고: 표준 초파리 음식 튜브 계란 컬렉션에 대 한 효 모 반죽 없이 사용 됩니다. - 파리 모든 계란은 상대적으로 좁은 시간 창을 동안 수집 되도록 25 ℃에서 3 h에 대 한 알 수 있습니다.
참고:이 애벌레 같은 발달 단계에서 동기화 할 수 있게 된다. - 물 튜브를 포함 하는 쟁반에서 계란을 포함 하는 튜브를 배치 하 고 가방을 조입니다. 12 h 빛: 12에서 25 ° C에서 품 어 h 어두운 주기.
- 지정된 된 수 시간 후 원하는 계란 애벌레 단계에 따라서 (AEL) 누워의 애벌레를 나이.
주: 표 1 은 AEL 시간과 비행 재고에 따라 달라 집니다, 애벌레 단계 사이 관계의 추정 식품, 사용 온도 등 AEL과 발달 단계 사이 정확한 관계 해야 양육 실제 기준 입 후크 및 spiracles11의 형태를 사용 하 여 각 조사에 의해 확인.
- 이상 그들을 활용 하 여 달걀을 수집에 대 한 새로운 음식 튜브로 영양된 파리를 전송. CO2, 다음 짧은 시간 창에 적은 계란을 낳 기 위해 파리를 발생할 수 있습니다를 사용 하지 마십시오.
3. 온도 기울기 설정
- 단일 방향 그라데이션 준비
- 분석 실험 동안 습 한 주위 환경을 만들려면, 젖은 종이 타 올, 10 cm (그림 2A)으로 구분 된 2 개의 물 목욕에 연결 된 두 개의 알루미늄 블록을 배치 합니다.
- 2 개의 물 목욕 equilibrate 알루미늄 블록의 온도 대 한 충분 한 시간을 허용 하도록 시험 시작 전에 ~ 2 h를 켭니다.
참고: 원하는 선형 온도 기울기를 달성 하는 데 필요한 각 물 목욕의 온도 결정 하는 모의 실험을 수행 하기 위해 추천 된다. 물 목욕을 설정 하려면 몇 가지 일반적인 온도 쌍 표 2에 나열 됩니다. 그러나, 표면 온도 주위 온도 의해 영향을 받는 note. 또한 영향을 튜브의 길이 만큼 온도 튜브에 냉각 하 고. 우리의 설치에서 튜브의 길이 1.5 m입니다. - 전자 렌지 100 mL 500 mL 넓은 입 병 라운드에서 고 출력 설정 1 %agarose 25 mL를 붓고/레벨 벤치탑에 접시를 시험. (그림 2A) 동시에 알루미늄 블록에 배치할 수 있는 두 분석 결과 접시를 준비 합니다.
- agarose (10-20 분) 경화는, 후 부드럽게 각 agarose로 표면을 문질러 표준 부엌 스폰지 또는 약간 거친 agarose 표면 수 있도록 멜 라 민 스폰지는 agarose 젤에 물 분사 때 부드러운 얇은 물 막 생성 됩니다, 그리고 아무 물방울 형성 될 것 이다.
- 분석 결과 포장해 점점에서 번호판을 방지 하기 위해 수행 될 준비가 될 때까지 완전히 증류수와 컨테이너에 접시를 잠수함.
- (옵션) 양방향 그라데이션 준비
- 분석 하는 동안 습 한 주위 환경을 만들려면, 젖은 종이 수건에 3 알루미늄 블록 8 cm 떨어져 (그림 2B)을 배치 합니다.
- 2 개의 물 목욕 equilibrate 알루미늄 블록의 온도 대 한 충분 한 시간을 허용 하도록 시험 시작 전에 ~ 2 h를 켭니다.
참고: 양방향 그라데이션에 대 한 각 물 목욕의 온도 결정 하는 모의 실험을 수행 하기 위해 추천 된다. 물 목욕을 설정 하려면 몇 가지 일반적인 온도 쌍 표 3에 나열 됩니다. 그러나, 표면 온도 주위 온도 의해 영향을 받는 note. 또한 영향을 튜브의 길이 만큼 온도 튜브에 냉각 하 고. 우리의 설치에서 튜브의 길이 1.5 m입니다. - agarose는 접시 밖으로 흘리 고 하지 않도록 하려면 라벨 테이프 10 m m 높이 벽 (그림 2B)를 형성 하는 알루미늄 플레이트의 가장자리를 래핑하십시오.
- 고 전력 설정, 전자 레인지 200 mL 500 mL에 1 %agarose 사용 하 여 라운드 넓은 입 병 하 고 120 mL는 시험 접시에 부 어.
- agarose (~ 30 분) 경화는, 후 각 agarose 표면 표준 부엌 스폰지 또는 만들 agarose 표면 약간 굵고 부드러운 얇은 물 막 만들어집니다 때 agarose 젤에 물 분사, 멜 라 민 스폰지 없고 부드럽게 문질러 물 방울 형태입니다.
- 분석 결과 밖으로 건조에서 그들을 방지 하기 위해 수행 될 준비가 될 때까지 완전히 분석 결과 접시 증류수와 컨테이너에 잠수함.
- 단일 방향 그라데이션 설정
- 시 약 및 그라데이션 시험 장치 ( 재료의 표참조) 옆 벤치에 항목을 준비 합니다.
- 효율적인 온도 전송, 홍보 분석 결과 석판 및 알루미늄 블록 사이 어떤 간격 든 지 블록 및 플레이트 사이의 인터페이스에서 물을 분사 하 여 작성.
- 장갑을 사용 하 여, 물 컨테이너에서 분석 결과 플레이트를 제거 합니다. 물 agarose 젤과 접시 사이 침공과 표면에 범프 양식에 발생, P1000 micropipette와 물을 제거 합니다.
- 알루미늄 블록 (그림 2A, C)의 가장자리를 일치 하는 정확 하 게 2 cm 가장자리에서 경계 설정 되도록 알루미늄 블록 분석 결과 접시를 놓습니다.
- (Agarose 표면을 덮고 얇은 물 막이 충분 한) 격판덮개의 표면에 물을 스프레이 agarose 젤 밖으로 건조 하지 않도록. 물 막 이며 지 연속 물방울의 무료 애벌레 물방울에 갇혀 얻을 수 있기 때문에 다는 것을 확인 하십시오.
- 물이 증발을 줄이기 위해 골 판지 상자와 그라데이션 시스템을 커버 하 고 젤 표면의 온도 안정화 하는 데 도움이. Equilibrate 온도가 5-10 분을 기다립니다.
- (그림 2C) 접시에 12 포인트에서 표면 온도 확인 하십시오. 영역 내에서 변화 여부 설정에 각 영역 내에서 두 개의 측정을 가져가 라. 두 관광 명소에 온도 ± 0.2 ° C 원하는 온도 내에서 다는 것을 확인 하십시오.
참고: 영역 내의 변화는 일반적으로 알루미늄 블록의 가장자리에 두 개의 관광 명소의 정확한 거리는 동일 하기 때문에 발생 합니다. 알루미늄 블록 가장자리에서 2cm를 정확 하 게는 경계 설정 알루미늄 블록의 가장자리를 일치 하는지 확인을 접시의 위치를 조정 합니다. - 측정된 온도 기울기 원하는 그라데이션에서 일탈, 증가 또는 감소 물 목욕 온도 설정 고 물 bath(s)의 온도 stabilize(s) 후 표면 온도 다시.
- 골 판지 상자와 그라데이션 시스템 분석 결과 시작까지 커버.
- (옵션) 양방향 그라데이션 설정
- 시 약 및 그라데이션 시험 장치 ( 재료의 표참조) 옆 벤치에 항목을 준비 합니다.
- 스프레이 물 표면 사이 간격을 작성 하 여 분석 결과 번호판 알루미늄 블록에서 효율적인 온도 전송 홍보 3 알루미늄 블록의 표면에.
- 물 컨테이너에서 신중 하 게 분석 결과 플레이트를 제거 하 고 알루미늄 블록에 놓습니다. Agarose 젤과 표면에 범프 양식에 발생할 수 있습니다, 격판덮개 사이 물 침공 P1000 micropipette와 물을 제거 합니다.
- 가장자리에서 첫 번째 및 마지막 영역의 중간 정확 하 게 일치 하는 두 측면 알루미늄 블록 (그림 2B, D)의 가장자리는 알루미늄 블록에 분석 결과 접시를 놓습니다.
- (Agarose 표면을 덮고 얇은 물 막이 충분 한) 격판덮개의 표면에 물을 스프레이 agarose 젤 밖으로 건조 하지 않도록. 물 막 이며 지 연속 물방울, 무료 애벌레 물방울에 갇혀 얻을 수 있기 때문에 다는 것을 확인 하십시오.
- 물이 증발을 줄이기 위해 골 판지 상자와 그라데이션 시스템을 커버 하 고 젤 표면의 온도 안정화 하는 데 도움이. Equilibrate 온도가 5-10 분을 기다립니다.
- 각 10 영역 (그림 2D)의 중간 선 따라 두 지점에서 표면 온도 확인 하십시오. 영역 내에서 변화 여부 설정에 각 영역 내에서 두 개의 측정을 가져가 라. 두 관광 명소에 온도 ± 0.2 ° C 원하는 온도 내에서 다는 것을 확인 하십시오.
참고: 영역 내의 변화는 일반적으로 알루미늄 블록의 가장자리에 두 개의 관광 명소의 정확한 거리는 동일 하기 때문에 발생 합니다. 알루미늄 블록 각 가장자리에 가장 가까운 첫 번째 및 마지막 영역의 중간 두 측면 알루미늄 블록의 가장자리를 정확 하 게 일치 하는지 확인을 접시의 위치를 조정 합니다. - 측정된 온도 기울기 원하는 그라데이션에서 성적이 상자, 물 목욕 온도 설정 조정 하 고 물 bath(s)의 온도 stabilize(s) 후 표면 온도 다시.
- 분석 결과의 시작까지 판지 상자 블록을 커버 합니다.
4. 애벌레 수집 및 세척
- 격리 깨끗 한 애벌레 (옵션 1)
- 50 mL 테스트 튜브에 40 mL 18% 자당 해결책을 추가 합니다. 18% 자당 해결책에 scoopula와 전송 음식 vial(s)에서 모든 애벌레 특 종.
- 식품에서 애벌레를 분리 하는 scoopula를 사용 하 여 부드럽게 하지만 철저 하 게 혼합. 튜브의 꼭대기 층에 애벌레 부동까지 30-60 s를 기다립니다. 또 다른 50 mL 튜브에 애벌레 (~ 10 mL)를 포함 하는 상위 계층을 부 어 하 고 신선한 18% 자당 해결책으로 튜브를 입력. 30-60 s에 대 한 때까지 기다릴 상위 계층에 애벌레 float 다시.
참고: 큰 음식 입자 때로는 애벌레 함께 전송 및 제거 되지 않습니다 경우 애벌레 thermotaxis에 영향을 미칠 수 있습니다. 큰 음식 입자는 상위 계층에 남아 있으면 반복 단계 4.1.1-4.1.2, 또는 수동으로 scoopula를 사용 하 여 그들을 제거. - 다른 두 50 mL 튜브에 애벌레 (~ 10 mL)의 상위 계층을 전송 하 고 애벌레는 신속 하 게 물에 싱크 있도록 자당 농도 줄이기 위해 증류수와 두 개의 튜브를 입력 합니다. 애벌레 맨 아래에 침 몰 될 때까지 30-60 s를 기다립니다. 애벌레가 익사 하지 않도록 가능한 한 빨리이 고 다음 단계를 수행 합니다.
- 부드럽게 튜브를 기울이기로 가능한 물 만큼 삭제 합니다. 나머지 물으로 애벌레를 털어 여 한 튜브에 애벌레를 결합 하 고 증류수와 튜브를 작성.
- 모든 애벌레 가라앉 고 부드럽게 튜브를 기울이기로 가능한 많은 물을 제거 될 때까지 30-60 s를 기다립니다. 2-4 시간을 완전히 제거 자당 모든 보이는 음식이 세척 단계를 반복 합니다.
- 가능한 물을 많이 삭제 하 고 decanting 여 빈 35 mm 페 트리 접시에 애벌레를 전송. 튜브 물 스프레이를 사용 하는 작은 페인트 브러시 하 게 전송 애벌레.
- P1000 micropipette를 사용 하 여 배양 접시에서 초과 물을 제거 합니다. 애벌레의 탈수를 방지 하기 위해 물 ~0.5 mL를 남겨 주세요.
- 애벌레가 탈출 하지 않도록 접시에 뚜껑을 놓습니다. 뚜껑을 거꾸로 뚜껑 접시 사이의 작은 차이 통해 탈출 하는 애벌레의 기능을 줄이기 위해 설정 합니다. 10-20 분에 대 한 복구할 수 애벌레 수 있습니다.
- 깨끗 한 애벌레 (옵션 2) 분리
참고: 애벌레를 청소에 대 한 대체 방법이 세척 절차 동안 애벌레를 질 식의 가능성을 줄입니다. 이 방법을 사용 하려면 위의 단계 4.1.1-4.1.2를 수행한 후 다음 단계를 진행 합니다.- 셀 스 트레이너를 배치 (300 µ m, 애벌레 72 h AEL 유지 이상) 50 mL 튜브 위에.
- 확인 후 성인 시체 또는 자당 솔루션의 표면에 떠 있는 음식 파편, 메쉬 스크린에 모든 애벌레를 함정에 스 트레이너를 통해 애벌레를 포함 하는 상위 계층을 붓는 다. 50 mL 튜브 채워질 때까지 증류수로 깨끗이 애벌레를 씻어.
- 튜브에서 애벌레와 사용 물의 dispose 셀 여과기를 제거 합니다. 빈 튜브 위에 애벌레를 포함 하는 여과기를 놓고 50 mL 튜브 채워질 때까지 다시 증류수와 애벌레를 세척 합니다.
- 스 트 레는 빈 35 mm 페 트리 접시, 거꾸로 뒤집어 하 고 페 트리 접시에 애벌레를 전송할 셀 스 트레이너의 위에서 물 스프레이. 나머지 애벌레는 작은 페인트 브러시를 사용 하 여 전송 합니다.
- 5 단계로 진행 하기 전에 위의 4.1.7 단계를 계속 합니다.
5. 분석 결과 및 계산
- 골 판지 상자를 제거 하 고 접시에 애벌레를 전송 하기 전에 즉시 젤 표면 온도 확인. 골 판지 상자는 온도 평형 방해를 방지 하기 위해 시간을 최소화 합니다. 표면이 건조 한 경우에, 표면에 소량의 물 스프레이.
- 단일 방향 그라데이션 (릴리스 영역;에 대 한 (영역 3와 4는 6 영역에서) 사이 각 격판덮개의 센터 근처 150 ± 50 애벌레를 배포 그림 2C)입니다.
참고: 양방향 그라데이션에 대 한 배포 각 절반의 중간 영역에 따라 200-400 애벌레 (그림 2D). - 애벌레가 밖으로 크롤 링 하지 않도록 하려면 각 분석 결과 접시 위에 microplate 뚜껑을 놓습니다. Agarose 젤에 애벌레 선택에 영향을 줄 수 있는 가벼운 노출을 방지 하기 위해 골 판지 상자를 가진 설치를 커버.
참고: 양방향 그라데이션에 대 한 그것은 해서는 안됩니다 접시는 더 큰, 그리고 애벌레의 기본 온도 중간 영역에 있기 때문에, 뚜껑 접시를 커버 하는 데 필요한. 따라서, 몇몇 애벌레 가장자리에 축적 하 고 밖으로 크롤 링 수 있는 기회가. - 10-30 분 단일 방향 그라데이션 및 (표 4) 애벌레의 나이 따라 양방향 그라데이션에 대 한 15-35 분 동안 진행 하는 분석 결과 허용 합니다.
- 골 판지 상자와 미 판 뚜껑을 제거 합니다. 디지털 카메라를 사용 하 여 위에서 접시 사진. 조사 더 나은 콘트라스트와 밝기 분석에 대 한 하나를 선택할 수 있도록 각 분석 결과 접시의 두 사진을 가져가 라.
- 열망 하 여 애벌레의 모든 분석 결과 접시에서와 어디 판 외부를 제거 합니다.
- 분석 결과 판, 관, 및 증류수로 깨끗이 셀 스 트레이너를 청소. 분석 결과 접시는 agarose의 표면 손상 하지 않는 한 그 날을 준비를 다시 사용 합니다.
- 각 영역에서 애벌레의 비율 분포를 계산 합니다.
- 이미지에 표시를 추가 수 있는 모든 소프트웨어를 사용 하 여 분석 결과의 사진 이미지를 엽니다. 분석 결과 영역을 모든 2 cm 시험 접시에 경계 설정에 따라 수직 라인을 그립니다.
- 각 영역에서 애벌레의 수를 세 고 숫자를 기록 합니다. 지역 벽에서 0.5 c m 애벌레를 포함 하지 않습니다. 젤 두꺼운 벽, 근처 이며 표면 온도 다음이 지역에 선형.
- 단일 방향 그라데이션에 대 한 각 영역에서 백분율 분포를 다음과 같이 계산.
(주어진된 2 cm 영역에서 애벌레의 수) / (6 영역에서 애벌레의 총 수) x 100. - 양방향 그라데이션에 대 한 각 영역에서 백분율 분포를 다음과 같이 계산.
(주어진된 2 cm 영역에서 애벌레의 수) / (해당 각 측에 5 영역에 애벌레의 총 수) x 100.
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Representative Results
18 °-28 ° C 단일 방향 설정 그라데이션, 우리 두 물 탕의 온도를 설정 16.8 ° C와 31 ° C 우리는 agarose 젤 표면 (그림 2C, 2E)의 극단적인 끝에 모든 6 영역, 영역 사이의 테두리 라인의 상단과 하단에서 26 위치에서 온도 측정 하 여 13 지점에서 온도 얻을. 그라데이션에 따라 온도 분포는 거의 선형 (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (그림 2E).
우리는 다양 한 연령대에서 제어 (w1118) 애벌레의 온도 선호를 분석. 1세인트 (24 ± 1.5 h AEL), 2nd (48 ± 1.5 h AEL) 및 초기 3rd 애벌레 (72 ± 1.5 h) 24 ° C 영역 (그림 3A, B)에서 봉우리를 보여주었다. 온도 환경 설정 3rd 동안 변경 애벌레의 개발을 탈피 하 고 중반-3rd 탈피 (96 ± 1.5 h AEL)의 큰 비율에 18 ° C 영역 (그림 3A, B), 축적 하 고이 바이어스 나이로 증가. 늦은 3rd 탈피 애벌레 (중 등반; 120 ± 1.5 h AEL), 중 50%는 18 ° C 영역에 클러스터 그리고이 온도 선택 ~ 4-fold 인접 한 20 ° C 영역 보다 높은 (18 ° C 영역, 50.2%; 20 ° C 영역, 15.1%; 그림 3A B)입니다. W1118 에 18 ° C 영역에 누적 proclivity가 아니었다 가장자리 효과 탈피 하는 후반 3rd 이후 양방향 온도 기울기 (그림 3E, F를 사용 하 여 여전히 18 ° C 영역에서 축적 된 애벌레 ).
또한 편안한 범위에서 차별 온도 차이에 필요한 유전자에 있는 돌연변이와 늦은 3rd 탈피 애벌레 (120 ± 1.5 h AEL) 테스트. 이 정상적인 온도 18 ° C-24 ° C 범위5,,78선택에 필요한 trpA1을 포함 됩니다. TrpA1 (trpA11)에 null 돌연변이와 애벌레 전체 18 ° C에 동등 하 게 분배-28 ° C 그라데이션 (그림 3C). 누락 된 단지는 A와 B isoforms (trpA1 ABG4), 또는 C와 D isoforms (trpA1 CDG4) 또한 애벌레 보여 심각한 장애 (그림 3C). 파리 phospholipase (PLC21C 및 NORPA), Cβ의 2 개의 isoforms 인코딩하고 돌연변이 영향을 미치는 norpA (norpAP24) 하지 plc21c (plc21cP319) 하지만 또한 방해 18 ° C의 범위 ( 에 축적 3D 그림).
그림 1입니다. 단일 방향 온도 기울기 분석을 수행 하기 위한 기구. (A) 알루미늄 플레이트 애벌레 thermotaxis 동작 시 금 사용 테스트. 위쪽 및 아래쪽에 있는 13 블랙 라인 구분 12 영역 (각 10 mm). 애벌레를 시각화 하기가 그렇게 접시의 바닥은 검은 페인트로 양극 처리 했다. (B) 치수 (mm에서 표시) 알루미늄 격판덮개의. 알루미늄 플레이트의 외부 크기는 140 x 100 x 9 mm입니다. 알루미늄 플레이트의 내부 크기는 130 x 90 x 8 m m입니다. 경계 설정 10 m m으로 구분 됩니다. 첫 번째 및 마지막 경계 접시의 내부 영역의 가장자리에서 5 m m 이다. (C) 상위 고 알루미늄 블록 중의 사이드 뷰 그라데이션의 온도 제어 하는 데 사용. 블록 연결 물 목욕 하는 실리콘 튜브를 연결 하는 데 사용 하는 커넥터 2 개 있다. (D)는 알루미늄 블록의 치수. 알루미늄 블록의 외부 크기는 255 x 50 x 14 mm입니다. 내부 물 경로의 직경 7 m m 이다. 왼쪽에 2 명의 30 m m 커넥터 물 목욕에 확장 실리콘 튜브와 연결 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 단일 및 양방향 그라데이션 분석 결과 설정 (A) 두 개의 알루미늄 블록에 두 개의 알루미늄 분석 결과 격판덮개를 가진 단일 방향 그라데이션 설정. 알루미늄 블록의 온도 두 물 탕에서 물 순환에 의해 제어 됩니다. (B)는 배열 3 알루미늄 블록, 물 욕조와 알루미늄 플레이트 (250 x 220 mm)의 양방향 그라디언트에 대 한. 왼쪽 및 오른쪽 블록 같은 물 목욕에 연결 하 고 중간 블록이 다른 물 목욕에 연결 되어. 알루미늄 분석 결과 접시 1 %agarose 포함 하는 10 m m 벽을 형성 하는 테이프를 가진 래핑됩니다. (C) 위치 온도 (점으로 표시)를 확인 하 고 접시에 애벌레를 출시. 실험을 시작 하기 전에 원하는 선형 온도 기울기 설정 확인 각 영역 내에서 두 지점에서 온도 확인 합니다. 애벌레는 정중 선 근처 지정 된 영역 내에서 해제 됩니다. 애벌레는 2 cm의 각 내에서 계산 됩니다. 온도 (점으로 표시)와 양방향 그라데이션에 애벌레에 대 한 릴리스 영역 (D) 위치. 애벌레의 동등한 수는 양방향 기온 변화도의 각 절반의 중간 선 따라 해제 됩니다. 애벌레의 수 영역 (2 cm) 10의 각각에서 계산 됩니다. Agarose 표면에 온도 (18 ℃-26 ° C)의 일반적인 집합이 표시 됩니다. (E) 테두리 선을 따라 샘플 단일 방향 그라데이션에 각 영역의 중간 온도 측정. 데이터 대표 평균 온도 ± sd. n = 8 분석 (150 ± 50 애벌레/분석 결과). 이 그림의 부분 Sokabe 그 외 여러분 에서 재생 된다 약간의 수정 8 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 단일 방향 및 양방향 그라데이션 분석 실험을 사용 하 여 대표 결과. (A, B) 단일 방향 그라데이션 6 영역에 애벌레의 백분율을 의미 합니다. 데이터 (AEL) 누워 계란 후 지정 된 시간에 3rd 탈피 애벌레를 포함 합니다. n = 6-7. 오차 막대는 대표 ±SEM. (C) 열 배포판에 미리 등반 늦은 3rd 의 제어 (w1118) 및 단일 방향 그라데이션에 trpA1 돌연변이의 애벌레 탈피 하 고 n = 3-4. 오차 막대 ±SEM. (D) 제어 (w1118) 및 단일 방향 그라데이션에 PLCβ 돌연변이의 후반 3rd 탈피 애벌레의 열 분포를 나타냅니다. n = 4-6. 오차 막대는 미리 등반, 후반 3rd 탈피 애벌레 (w1118) 양방향 그라데이션에의 ±SEM 」 (E) 대표 배포를 나타냅니다. 왼쪽 및 오른쪽 분석 결과 영역이 점선으로 표시 되며 센터 (음영된 지역)에 노 수 영역으로 구분. (F) 비율 중 후반 3rd 등반의 열 그라데이션에 따라 각 영역에서 탈피 하는 애벌레 (w1118). 애벌레는 왼쪽에 배치 하 고는 바로 자료 영역. 분석 결과 영역 중앙에 3 cm 아니 수 영역으로 구분 되 고 배포판 독립적으로 계산 됩니다. 오차 막대 SEMs를 나타냅니다. n = 3 분석 (200-400 애벌레/분석 결과). 이 그림의 부분 Sokabe 그 외 여러분 에서 재생 된다 약간의 수정 8 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| AEL 시간 | 애벌레 단계 | |
| 24 | 1세인트 탈피 | |
| 48 | 2차 탈피 | |
| 72 | 초기 3rd 탈피 | |
| 96 | 중반-3rd 탈피 | |
| 120 | 단계를 등반 직전 늦은 3rd 탈피 | |
표 1입니다. (AEL) 누워 계란 후 시간 및 애벌레 단계 사이의 관계.
| Agarose 플레이트 (경사)에 온도 기울기 | 물 목욕의 온도 | 알루미늄 블록의 온도 |
| 10.0 50-25.0 ° C (1.5 ° C/cm) | ~6.5-7°C/~28.5°C | ~8.5°C/~26.8°C |
| 18.0 50-28.0 ° C (1 ° C/cm) | ~16.8°C/~31.0°C | ~17.8°C/~29.7°C |
| 14.0 50-34.0 ° C (2 ° C/cm) | ~10.0°C/~40.0°C | ~11.8°C/~36.8°C |
| 12.5 50-42.0 ° C (2.95 ° C/cm) | ~7.0°C/~55.0°C | ~9.4°C/~49.4°C |
표 2입니다. 일반적인 온도 기울기 그리고 물 욕조와 단일 방향 그라디언트에 대 한 알루미늄 블록의 해당 온도.
| Agarose 접시에 온도 기울기 | 물 목욕의 온도 | 알루미늄 블록의 온도 |
| 22-10-22 ° C (1.5 ° C/cm) | ~5.0°C /~25.0°C | ~7.5°C/~24.0°C |
| 26-18-26 ° C (1 ° C/cm) | ~15.8°C /~30.6°C | ~16.9°C/~28.4°C |
| 30-14-30 ° C (2 ° C/cm) | ~8.5°C /~36.4°C | ~10.9°C/~32.8°C |
| 36-12.5-36 ° C (2.95 ° C/cm) | ~5.0°C /~47.2°C | ~7.9°C/~40.9°C |
표 3입니다. 일반적인 온도 기울기 그리고 물 욕조와 양방향 그라디언트에 대 한 알루미늄 블록의 해당 온도.
| 애벌레 나 (AEL)이 | 시험 시간 (단일 방향) | 시험 시간 (양방향) |
| 24 h | 30 분 | 35 분 |
| 48 h | 22 분 | 27 분 |
| 72 h | 16 분 | 21 분 |
| 96 h | 13 분 | 18 분 |
| 120 h | 10 분 | 15 분 |
표 4입니다. 다른 애벌레 연령대 (AEL) 고 해당 분석 결과 번.
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Discussion
이 프로토콜의 성공을 위해 실험을 수행 하는 애벌레의 적절 한 숫자를 얻기 위해 조치를 취할 중요 하다. 전 달걀 누워 개선 하기 위해 2-3 d에 대 한 효 모 붙여넣기 포함 된 튜브에 파리를 먹이 포함 됩니다. 튜브 물 튜브를 포함 하는 쟁반에 배치 하는 식품의 수 분을 유지 하 고 촉진 효과 먹이 애벌레에 의해 정상적인 빛 어두운 주기에 노출을 허용 하는 동안 투명 한 플라스틱 가방에 포함 해야 합니다. 그러나, 누 룩 붙여 부드러운 파리 갇혀 될 수 없습니다. 유리병 당 여성의 수는 유전자 형에 따라 달라 집니다. W1118, 경우 일반적으로 12 ~ 여성 및 ~ 6 남성 3 h에 대 한 알 수 있도록 충분 한입니다. 두 개의 튜브는 일반적으로 단일 지향성 분석 결과 대 한 접시에 충분 한 애벌레 (유 충 100-200)를 제공 합니다. 비행 주식 야생-타입 보다 적은 알을 낳는 또는 부 화 애벌레의 비율 감소, 추가 (30-35/유리병)까지 추가 여성 및 남성.
이러한 분석을 수행할 때 의도 하지 않은 다양성의 많은 원인이 있다. 개발 단계는 애벌레의 온도 환경을 영향을 줍니다. 그러므로, 신중 하 게 정의 된 단계의 애벌레를 사용 하는 것이 필수적 이다. 이렇게 하려면 (예: 3 h) 좁은 시간 프레임 동안 애벌레를 수집 합니다. 양육 조건 (온도, 습도, 빛 어두운 주기와 음식의 종류) 일부 돌연변이 개발의 속도 영향을 때문에, 의존 하지 마십시오 엄격 하 게 분석 comparably 누워 계란 애벌레를 세 후 시간에. 그것은 또한 입 갈고리와 spiracles7 다른 genotypes의 애벌레 같은 발달 단계에서 인지 확인 하기 위해의 크기와 같은 물리적 특성을 검사 하는 것이 중요. 1st, 시간 2nd 와 3rd 탈피 애벌레 (표 1)을 개발 하는 기반 12 h 빛: 12에서 25 ° C에서 옥수수 식사 기반 음식과 외피를 사용 하 여 h 어두운 주기. 애벌레는 당 밀 기반 음식에 느리게 성장. 적절 일 분 및 음식 신선도 애벌레의 성장을도 영향을 줍니다. 음식에 물 양을 유리병에서 다시 껍질을 너무 건조 하지도 않고 너무 과도 한 물 때문에 느슨한 음식을 떠나야 한다. 이상적으로, 식품 표면에 가장 가까운 ~ 5 m m 층 성장 애벌레에 의해 조절 된다 고 유리병 기울이면 또는 도청 때 쉽게 이동 합니다. 이 조건은 50-100 애벌레와 갓 만든된 음식을 사용 하 여 얻을 수 있습니다.
분석 결과 시작 하기 전에 안정적인 온도 기울기를 설정 필수적 이다. 따라서, 설정 물 목욕 1-2 h 물 탕 열을 생산 하 고 방 온도 있는 그라데이션에 영향을 미칠 가능성이 변경 될 수 있습니다, 분석 결과 시작 하기 전에. 1-2 시간 후 가장 객실의 온도 equilibrates. 그러나,이 각 환경에서 결정 되어야 합니다. 또한, 넓은 온도 범위와 그라디언트를 생성할 때 (> 3.0 ° C/cm), 안정 그라디언트를 얻으려면 어려울 수 있습니다. 분석 결과 접시의 작은 운동 범위가 큰 경우 더 크게 온도 기울기를 변경 (예: > 3.0 ° C/cm). 우리는 1-2 ° C/cm 그라디언트는 가장 안정적인 그라디언트 생산을 발견.
제한 thermotaxis 분석 실험에 있는 가변성을 제어 하는 데 필요한 몇 가지 추가 고려 사항이 있습니다. 애벌레를 세척 하는 것이 중요 하 고, 음식 입자의 존재로 또는 애벌레에 자당 분석 결과 영향을 줄 수 있습니다. 세척 단계를 철저 하 게 수행 해야 하지만 신속 하 게, 그들의 산소 공급을 제한 하기 때문에 과도 동안에 잠긴 물 영향을 미칠 수 그들의 건강. 따라서, 청소 애벌레 셀 스 트레이너 (옵션 2)를 사용 하는 것이 좋습니다. 300 µ m 작품 초기 3rd 에서 애벌레 단계 (72 h AEL) 탈피 위해 잘의 기 공 크기와 여과기 이상. 또한, 그것은 Zeitgeber에서 ZT8 (ZT) ZT4 시간 등 하루 중 같은 시간에 실험을 수행 하는 것이 중요 (ZT = 0은 조명이 켜져 있는 경우), 온도 선택에 circadian 리듬에 미치는 영향으로 인해 다양성을 제한. Agarose 플레이트에 습기의 수준 결과에 변화를 일으킬 수 있습니다. 플레이트의 표면 축축한 해야, 하는 동안 물방울 수 애벌레, 함정 그리고 그러므로 피해 야.
분석 실험에 있는 가변성을 제한 하 게 됩니다 많은 수의 독립적인 실험을 수행 하지 않고 강력한 결과 얻을 수 있습니다. 일반적으로, 3-8 독립적인 실험은 신뢰할 수 있는 결과 얻을 수 충분 하다. 적절 한 집계 결과의 또한 thermotaxis 분석 실험의 성공을 위해 긴요 하다. 때문에 온도 다음이 지역에 선형 알루미늄 벽에서 0.5 c m 이내 지역에 분산 하는 애벌레를 포함 하지 않습니다. 일부 애벌레 분석 결과 결론은 당시 2 개의 지역 사이 국경에 배치 됩니다. 몸 길이의 50% 이상이 한 영역에 있는 경우 해당 영역에 대 한 집계에서 유 충이 포함 됩니다. 유 충의 두 영역 각각에 정확 하 게 50% 이면 다음 각 영역에서 0.5 애벌레로 동물을 계산 합니다.
그라데이션 분석 결과 다양 한 온도 차이 구별할 수 애벌레 수, 효과적으로 테스트할 수 있는 하위 및 상위 온도에 한계가 있다. 그것은 온도 테스트 가능한 < 애벌레의 이동성 이후 10 ° C 낮은 온도에서 크게 감소. 42 ° C에 도달 위 온도 그래디언트를 설정할 수 있습니다, 있지만 아무 제어 애벌레 거의 모든 영역에 있어 > 28 ° c. 따라서, 연속 그라데이션 분석 차별 다양 한 영역 간의 환경 설정 온도를 사용할 수 없습니다 > 28 ° c. 그러나, 이러한 높은 온도에서 그라데이션 분석 실험 그들은 매우 따뜻한 온도 환경 설정을 이동 하는 경우 돌연변이 하 잠재적으로 사용 될 수 있습니다.
돌연변이 운전 결함, 경우 있는지 확인 하는 명백한 온도 선호 하지 운동 장애 때문에 부정확 한 추가 실험을 실시 필요할 수 있습니다. 이 잠재적인 문제를 해결 하려면 동물 추가 시간을 그들의 원하는 지역으로 이동 하 긴 시험 시간을 설정 하려면 필요할 수 있습니다. 양방향 그라데이션 분석 결과 또한 동물 같은 선호 영역, 어디 그들은 접시에 처음 배치는으로 관계 없이 선택 여부 테스트를 사용할 수 있습니다.
끝으로, 여기에 설명 된 그라데이션 분석은 다른 thermotaxis 분석 실험 이점이 있다. 양방향 선택 분석 실험 유용한 한편, 두 영역 사이의 온도 차이 큰 하는 경우에 특히 그들은 강력한 결과 얻을 수로, 그들은 하나의 실험에 애벌레에 의해 선호 하는 이상적인 온도 드러내는에 효과적입니다. 이렇게 하려면 많은 양방향 선택 조합을 가장 선호 온도5,,67결정을 수행 해야 합니다. 반면, 그라데이션 분석 결과 동물 단일 연속 온도 프리는 환경에서 그들의 기본 온도 영역을 선택 하는 기회를 제공 합니다. 따라서, 기본 열 환경 결정을 양방향 선택의 큰 조합 고안 필요는 없습니다. Thermotaxis 라운드 페 트리 접시를 사용 하 여 공부 유 충10의 이동 역학에 온도 효과 평가 하기 위해 고용 했다. 그러나, 그것은 덜 다른 온도, 각 영역 이기 때문에 다른 크기 사이의 기본 설정 사이의 감 별에 유용 합니다. 마지막으로, 분석 결과, 및 단일 분석 결과에 차별 작은 온도 환경 설정에서 해당 유틸리티의 단순, 그것은 채택 될 수 있다 잠재적으로 수 애벌레 온도 설정에서 관련 후보 유전자의 화면에 다른 분석 실험을 사용 하 여 간과 될 수
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
입방 미터 여 NIDCD (DC007864, DC016278) (EY008117, EY010852) NEI에서 자금 지원 및 NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
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- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
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- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
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