Summary
ここでは、連続的な温度勾配を利用したショウジョウバエ幼虫の最寄りの環境温度を決定するプロトコルを提案する.
Abstract
ミバエショウジョウバエを含む多くの動物は、肥えた最寄り熱風景を模索することができます環境温度のわずかな違いが可能です。幼虫の温度の設定を定義すると、定義された線形範囲にわたって、温度勾配を使用してアッセイを開発しました。単一方向のグラデーションを確立するには、2 つのアルミ ブロックは個々 のブロックの温度を制御する独立した水のお風呂に接続されます。2 つのブロックは、グラデーションの上下限値を設定します。温度勾配は、プレート間の距離にまたがる 2 水制御ブロックをアガロース コーティング アルミ プレートを配置することによって確立されます。水ブロックの上に設定されているアルミ板の両端の最小値と最大温度を定義および中間の地域 2 つのブロックを形成する線形温度勾配。グラデーションのアッセイの幼虫に適用できるし、TRP チャネルと温度差別に必要なオプシン遺伝子に影響を与える突然変異などの表現型を示す変異体を識別するために使用することができます。
Introduction
モバイル動物によって温度走性を採用して、最も有利な条件1,2,3環境を選択します。過度に熱いまたは冷たい気候になった場合、この動作は生存に不可欠です。さらに、多くの動物は快適な範囲の温度の非常に小さい相違に敏感であるし、理想的な温度環境を模索します。これは、環境と自分の体の温度を平衡ショウジョウバエなど poikilothermic 生物にとって特に重要なのです。幼虫の温度走性を監視するための試金は識別し、ショウジョウバエ一過性受容体電位 (TRP) チャネル4,5,6など分子センサーの役割を明確に尽力しています。ロドプシン7、8、およびイオン型受容体受容体 (IRs)9、異なった温度較差上の温度感度を持つこれらの動物のため。
双方向の選択のテストは、幼虫6,7熱の好みを勉強する 1 つの方法を提供します。アッセイは、2 つの異なる温度ゾーンを確立することを伴なうし、動物他の上の 1 つの側面を選択することができます。双方向選択テストの結果は、堅牢な 2 つのオプションの間の温度差が大きい場合に特にすることができます。さらに、各分析には集計のみ 2 つのグループが含まれているので、データはシンプルな設定インデックスとして表現できます。使いやすさと双方向選択の試金のシンプルさは、遺伝子スクリーニングに適しています。しかし、主要な制限は、多くの実験動物の野生型や突然変異体の最寄りの温度を確立する必要は。
グラデーションのアッセイでは、単一のアッセイ8最寄りの温度を確立する機会を提供しています。さらに、双方向の選択テストとは異なり温度の連続的な範囲に直面したとき、動物の集団の分布の評価が可能です。1 つのグラデーション アッセイ ペトリ皿と単一動物を使用し、個々 の動物10の詳細な動作評価に適しています。ただし、ペトリ皿はラウンドなので温度ゾーンのサイズによって異なります、中心からの距離に応じて徐々 に小さい。したがって、このセットアップは、動物の集団の温度の選択のモニタリングに最適ではありません。
幼虫のグループの温度の設定を評価するために適しています連続熱勾配装置は、長方形のアリーナを採用し、ここに記載されています。装置は簡単に構築し、組み立てます。また、グラデーションは線形で、42 ° C まで 10 ° C から広い温度範囲で温度走性を評価するために使用することができますは、柔軟です、試金は迅速かつ簡単に実行を再現性のあるデータが得られます。幼虫の支持された温度のレポート作成に加えて、それは単一の実験で線形範囲全体に対する動物の人口の好みを明らかにします。これらの利点のための温度走性に関与する遺伝子を特定するための優れた選択肢です。
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Protocol
1. 装置製作・ グラデーション アッセイ用組立装置
- 単一方向のグラデーションの試金のためのアルミニウム アッセイ プレートを作製します。
- トリムしバンド鋸を使用してアルミニウムの単一部分から各アルミ アッセイ プレート (図 1 a) を挽くし、シャープの次の次元を持つ垂直ミル: 外側のサイズは 140 × 100 × 9 mm、内側のサイズは 130 × 90 × 8 mm (図 1 b)。幼虫を視覚化し、錆を防止しやすく、黒の塗料で各アッセイ プレートの内側をアルマイトします。
メモ: 単一方向のグラデーションのアルミニウム アッセイ プレートの作製は、マシン ショップによって行われます。商用ベンダーによって、陽極酸化処理が実行されます。 - 13 分界、永久的なマーカーを使用して 10 mm で区切られた各アッセイ プレートの上部と下部のリムをマークします。アッセイ プレート (図 1 a, B) の最初と最後の分界内側の端から 5 mm を配置します。
- トリムしバンド鋸を使用してアルミニウムの単一部分から各アルミ アッセイ プレート (図 1 a) を挽くし、シャープの次の次元を持つ垂直ミル: 外側のサイズは 140 × 100 × 9 mm、内側のサイズは 130 × 90 × 8 mm (図 1 b)。幼虫を視覚化し、錆を防止しやすく、黒の塗料で各アッセイ プレートの内側をアルマイトします。
- 双方向のグラデーションのアルミニウム アッセイ プレート作製、板金鋏を使用して次の次元を持つアルミ板をカット: 250 x 220 x 2 mm. アルマイト黒の塗料でアッセイ プレート。
注: 双方向グラデーション アルミ アッセイ プレートの作製は、マシン ショップによって実行されます。陽極酸化処理は、商用ベンダーによって行われます。 - アルミ ブロックを作製します。
メモ: 2 つのブロックが単一方向のグラデーションを必要し、双方向のグラデーションには 3 つのブロックが必要があります。- バンドソー (50 × 255 × 14 mm の寸法) を用いるアルミニウムの単一部分のアルミ ブロック (図 1) をカット (図 1d)。
- ドリル垂直ミルとねじ溝形状による 1 つの側面 (図 1) オープン エンド ブロック (7 mm の直径) 内水路。ボルトとねじシールテープ U 字水チャネル (図 1d) を形成する溝穴を閉じます。
注: アルミニウム アッセイ ブロックの製作は、マシン ショップによって実行されます。 - ねじでアルミ ブロック (図 1) でコネクタを固定し、シール 1 つの端にテープをスレッド。シリコン チューブ (1/4"内径 3/8" 外径 1/16"の壁 x x) に複数の棘を持つもう一方の端をフィットします。
- 2 冷蔵加熱循環バスを取得します。
- グラデーションのアッセイ システムの温度制御ブロックを組み立てます。
- 単一方向のグラデーションには、独立した水を循環システム (図 2 a) によって各ブロックの温度を制御できるように別々 の湯のお風呂に 2 つのアルミ ブロックの各接続します。シリコーン チューブ (1/4"内径 3/8" 外径 1/16"の壁 x x) を使用すると、風呂の水の出口をアルミ ブロック (図 2 a) の内部側コネクタに接続します。また、水お風呂の入口にアルミ ブロックの外側にコネクタを接続するのにチューブを使用します。
- 双方向のグラデーション 2 左下 3 つのブロックとプレートの右側に配置し、チューブ (図 2 b) と同じ水のお風呂に接続します。2 番目の水浴とプレート (図 2 b) の中心部の下に配置する三のアルミ ブロックを接続します。
注: この装置およびアッセイは、幼虫は 1 つの端または他の単一方向のグラデーションのゾーンに蓄積される場合のみ必要です。もしそうなら、エッジ効果があるかどうかを評価することが重要です。この可能性をテストするのには、単一方向のグラデーション (例えば 18 ° C) を使用しての幼虫によって優先エッジ ゾーン温度は双方向のグラデーション (図 3E のプレートの真ん中に温度双方向グラデーションを確立します。 , F)。
2. 幼虫の同期
- ハエが産卵のために栄養を与えます。
- ミックス酵母顆粒と酵母を貼り付けるように杵の蒸留水。徹底的に挽くし、貼り付けの一貫性がピーナッツ バターのようになるまで混ぜます。新鮮なバイアルにハエを転送するときオフにフレーク可能性がありますまたはハエをトラップできるペーストを濡れている過度に乾燥の貼り付けは避けてください。
- 乳棒を使用して、標準的なショウジョウバエのバイアルは、食品の表面のすぐ上の内側の壁に近い酵母貼り付けを追加します。
- カウント 12-35 女性 CO2パッド (10 以上) が半分として多くの男性までし、各酵母のペーストを含んでいるガラスびんに雌と雄を追加。
- その場を保つために酵母ペースト、湿った食品は、ハエはフィード中、までを含む 20 のオープン瓶 100 バイアル蒸留水のみを保持しているトレイにこれらのバイアルを組み合わせます。透明なプラスチックの袋にトレイを置き、シールします。
- 女性栄養適切に産む卵の数が多いし、48 h の 25 ° C の定温器でトレイを孵化させなさい。
- 産卵用管瓶を設定します。
- タップすることで卵を収集するための新しい食品バイアルに栄養のハエを転送します。CO2、可能性があります次の短い時間帯にわたって少なく卵を産むハエを使用しないでください。
注: 標準ショウジョウバエ食品バイアルは、採卵のため酵母貼り付けることがなく使用されます。 - すべての卵は比較的狭い時間帯にわたって収集された、25 ° C で 3 時間卵を産むハエを許可します。
注: これは同じ発達段階で同期する幼虫になります。 - 水の瓶を含むトレイに卵を含むバイアルを置き、袋を締めます。12 h ライト: 12 25 ° C の孵化時間の明暗周期。
- 指定した時間後に産卵 (AEL) 幼虫の段階に応じて必要な数の幼虫を年齢します。
注:表 1は時間 AEL とフライの在庫によって異なりますが、幼生の段階との関係の推定食品使用、飼育温度などAEL と発達段階の正確な関係をする必要があります口フックと気門11の形態などの物理的な条件を使用して調査員によって検証されます。
- タップすることで卵を収集するための新しい食品バイアルに栄養のハエを転送します。CO2、可能性があります次の短い時間帯にわたって少なく卵を産むハエを使用しないでください。
3. 温度勾配設定
- 単一方向のグラデーションを準備します。
- 法中に湿気のある環境を作成するために湿紙タオル、10 cm (図 2 a) で区切られた 2 つの水浴に接続されている 2 つのアルミ ブロックを配置します。
- 2 つの水浴場 〜 2 h 平衡にアルミ ブロックの温度に十分な時間を許可するように測定を開始する前にオンにします。
注: 目的の線形温度勾配を達成するために必要なそれぞれの水浴の温度を決定する模擬実験を実行することをお勧めします。水浴場を設定するいくつかの典型的な温度のペアの表 2のとおりです。ただし、表面の温度は周囲温度によって影響を受けます。影響を管の長さが温度管の冷却中です。我々 のセットアップでチューブの長さは 1.5 m です。 - 100 mL で 500 mL の広口ボトル丸高出力の設定で 1% の agarose を電子レンジ、25 mL を注ぐ/レベルまたは卓上プレートします。同時に (図 2 a) アルミ ブロックに配置できる 2 つのアッセイ プレートを準備します。
- 標準的なキッチン スポンジやアガロース表面を少し粗にメラミン スポンジで各 agarose の表面をこすり、agarose のゲルに水を噴霧、滑らかな薄い水膜が作成されます、agarose が (10-20 分) 凝固させる為後、水滴が形成されます。
- アッセイ プレートの乾燥を得ることを防ぐために実行する準備が整うまで蒸留水が付いている容器でプレートを完全に水没します。
- (省略可能) 双方向グラデーションを準備します。
- 法の中に、湿気のある環境を作成するには、湿紙タオルの 3 つのアルミニウム ブロック 8 cm (図 2 b) を配置します。
- 2 つの水浴場 〜 2 h 平衡にアルミ ブロックの温度に十分な時間を許可するように測定を開始する前にオンにします。
注: 双方向グラデーション各槽の温度を決定する模擬実験を実行することをお勧めします。水お風呂を設定するいくつかの典型的な温度のペアの表 3のとおりです。ただし、表面の温度は周囲温度によって影響を受けます。影響を管の長さが温度管の冷却中です。我々 のセットアップでチューブの長さは 1.5 m です。 - Agarose が皿からこぼれるを防ぐために、10 mm 高壁 (図 2 b) を形成するテープにラベル付け、アルミ板のエッジをラップします。
- 高出力設定、電子レンジ 200 mL、500 mL の 1% の agarose を使用してラウンド広口ボトルとアッセイ プレートに 120 mL を注ぐ。
- 標準的なキッチン スポンジや agarose のゲルに水を噴霧、滑らかな薄い水膜が作成されますので、若干粗 agarose 表面にメラミン スポンジで各 agarose の表面とをこすり agarose (30 分程度) を固めたが後、水滴形。
- アッセイが完全に乾くことを防ぐために実行する準備ができているまで完全に蒸留水が付いている容器でアッセイ プレートが水没します。
- 単一方向のグラデーションを設定します。
- 試薬およびグラデーション アッセイ装置 (材料の表を参照) の横にあるベンチ上のアイテムを準備します。
- 効率的な温度の伝達を促進するため、ブロックとプレート間のインターフェイスで水を噴霧することによりアルミ ブロックとアッセイ プレート間のギャップを埋めます。
- 手袋を使用して、水容器からアッセイ プレートを取り外します。水は agarose のゲルとプレートの間に侵入して表面にフォームにバンプが発生する場合、は、P1000 マイクロ ピペットで水分を除去します。
- 正確にいずれかの端から 2 cm の分界はアルミ ブロック (図 2 aC) のエッジを一致するようにアルミ ブロックにアッセイ プレートを配置します。
- (アガロースの表面を覆っている薄い水膜で十分です) プレートの表面に水をスプレー agarose のゲルが乾くを防ぐために。水膜は継続的に水滴の無料ので幼虫は水滴で引っ掛けられて得ることを確認します。
- 水の蒸発を減らすために段ボール箱でグラデーション システムをカバーし、ゲルの表面の温度を安定させます。温度平衡するまで 5-10 分待ちます。
- プレート (図 2) を 12 ポイントで表面の温度を確認してください。ゾーン内で変動があるかどうかを確立する各ゾーン内の 2 つの測定を取る。両方のスポット温 ± 0.2 の ° C の所望の温度内であることを確認します。
注: ゾーン内の変動は、通常、アルミニウム ブロックの端に 2 つのスポットの正確な距離が同一でないために発生します。アルミ ブロックのエッジをいずれかの端から 2 cm は、正確な分界に合わせるようにアルミ ブロックにプレートの位置を調整します。 - 測定温度勾配目的のグラデーションから逸脱している場合、増減水お風呂温度設定し水 bath(s) の温度 stabilize(s) 後表面温度を再確認します。
- 測定を開始するまで段ボール箱とグラデーション システムをカバーしてください。
- 双方向のグラデーションを設定 (オプション)
- 試薬およびグラデーション アッセイ装置 (材料の表を参照) の横にあるベンチ上のアイテムを準備します。
- サーフェス間のギャップを埋めることでアッセイ プレートにアルミ ブロックから効率的な温度の伝達を促進する 3 つのアルミニウムのブロックの表面にスプレー水。
- 水容器から慎重にアッセイ プレートを取り外し、アルミ ブロックを置きます。Agarose のゲルと表面上のフォームにバンプを引き起こす可能性があります、プレートの間に水が侵入する場合は、P1000 マイクロ ピペットで水分を除去します。
- いずれかの端からの最初と最後のゾーンの中線 2 つの側面のアルミ ブロック (図 2 b, D) のエッジと一致のアッセイ プレートをアルミ ブロックに配置します。
- (アガロースの表面を覆っている薄い水膜で十分です) プレートの表面に水をスプレー agarose のゲルが乾くを防ぐために。水膜は継続的に無料水滴、幼虫は水滴で引っ掛けられて得るのでであることを確認します。
- 水の蒸発を減らすために段ボール箱でグラデーション システムをカバーし、ゲルの表面の温度を安定させます。温度平衡するまで 5-10 分を待ちます。
- 各 10 ゾーン (図 2 D) の正中線に沿って 2 つのポイントで温度を確認してください。ゾーン内で変動があるかどうかを確立する各ゾーン内の 2 つの測定を取る。両方のスポット温 ± 0.2 の ° C の所望の温度内であることを確認します。
注: ゾーン内の変動は、通常、アルミニウム ブロックの端に 2 つのスポットの正確な距離が同一でないために発生します。各エッジに最も近い最初と最後のゾーンの中線が 2 つの側面のアルミ ブロックのエッジを一致させるアルミ ブロックにプレートの位置を調整します。 - 測定温度勾配目的のグラデーションから逸脱している、水のお風呂の温度設定を調整、水 bath(s) の温度 stabilize(s) 後表面温度を再確認します。
- アッセイの開始まで段ボール箱を持つブロックをカバーしてください。
4. 幼虫コレクションと洗濯
- きれいな幼虫 (オプション 1) を分離します。
- 50 mL 試験管に 〜 40 mL 18% ショ糖液を追加します。18% のショ糖液を薬さじと転送食品バイアルからすべての幼虫をスクープします。
- 優しく、薬さじを使用して食品の破片から幼虫を分離するが、徹底的に混ぜます。チューブの最上位のレイヤーに幼虫フロートまで 30-60 秒待ちます。幼虫 (~ 10 mL) を含む最上位のレイヤーを別の 50 mL チューブに注ぐ新鮮な 18% ショ糖溶液にチューブを記入してください。再び最上位のレイヤーに幼虫フロートまでの 30-60 秒を待ちます。
注: 大規模な食品の粒子は、時々 幼虫と共に転送や、彼らが削除されない場合に幼虫の温度走性に影響を与える可能性があります。最上位のレイヤーに大きな食べかすが残っている場合手順 4.1.1-4.1.2 を繰り返したり、薬さじを使用してそれらを手動で削除します。 - 他の 2 つの 50 mL チューブに幼虫 (~ 10 mL) の最上位のレイヤーを転送し、幼虫は、すぐに水に沈むので、ショ糖濃度を低減する蒸留水で 2 つの管を埋めます。幼虫は底に沈むまで 30-60 秒を待ちます。幼虫が溺死するを防ぐためにできるだけ早く、この手順と次の手順を実行します。
- 軽くチューブを傾けることによって、多くの可能な限りの水として破棄します。残りの水と幼虫を注ぐことによって 1 つの管に幼虫を結合し、蒸留水でチューブを入力します。
- すべての幼虫は沈み、軽くチューブを傾けることによって可能ように同様に多くの水を削除するまでは、30-60 秒を待ちます。2-4 回に完全削除ショ糖とすべて表示食品洗浄を繰り返します。
- 多くの可能な限りの水として破棄し、デカントで幼虫を空の 35 mm のペトリ皿に転送します。チューブを水でスプレーし、幼虫転送を支援する小さなペイント ブラシを使用します。
- P1000 マイクロ ピペットを使用してシャーレから余分な水を削除します。~0.5 mL の幼虫の脱水を防ぐために水を残します。
- 幼虫が脱出することを防ぐために皿の上ふたを配置します。蓋と皿の間の小さな隙間を通って脱出する幼虫の能力を減らすために上下逆さま蓋をオンにします。10 ~ 20 分回復する幼虫を許可します。
- きれいな幼虫 (オプション 2) を分離します。
注: 幼虫を洗浄するためこの方法は洗浄手順の中に幼虫を窒息の可能性を軽減します。この方法を使用するには、上記の手順 4.1.1-4.1.2 を実行した後次の手順に進みます。- セル ストレーナーを配置 (300 μ m、72 h AEL の幼虫を保持またはより古い) 50 mL のチューブの上に。
- 確認がない大人の体や食べ物のかすのショ糖液の表面に浮かんで後、メッシュ画面上すべての幼虫をトラップするこし器を通して、幼虫を含む最上位のレイヤーを注ぐ。50 mL のチューブが塗りつぶされるまで蒸留水で十分に幼虫を洗います。
- チューブから幼虫に使用される水の処分とセル ストレーナーを取り外します。空のチューブの上に幼虫を含むストレーナーを置き、50 mL のチューブが塗りつぶされるまで蒸留水で再び幼虫を洗浄します。
- 空 35 mm シャーレ、こし器を逆さま裏返し、ペトリ皿に幼虫を転送するセル ストレーナーの上から水をスプレーします。小さなペイント ブラシを使用して残りの幼虫を転送します。
- 手順 5 に進む前に上記 4.1.7 を手順に進みます。
5. 測定と計算
- 段ボール箱を外し、すぐに幼虫をプレートに転送する前にゲルの表面温度をチェックします。段ボール箱、温度平衡を中断することを防ぐために開いている時間を最小限に抑えます。表面が乾燥している場合は、表面に少量の水をスプレーします。
- 単一方向のグラデーション (リリース ゾーン (ゾーン 3 および 4 6 ゾーンから出る) の間各プレートの中心に近い 150 ± 50 幼虫を配布します。図 2)。
注: 双方向グラデーションの各半分の中間地帯に沿って 200 400 幼虫を配布 (図 2 D)。 - 各アッセイ プレートをクロールから幼虫を防ぐためにマイクロ プレート蓋を置きます。Agarose のゲルの幼虫の選択肢に影響を与える可能性があります光の露出を防ぐために段ボール箱を使用してセットアップをカバーします。
注: 双方向のグラデーションがない必要になるプレートが大きいので幼虫の最寄りの温度は中間地帯で、蓋付きプレートをカバーします。その結果、いくつか幼虫は端を蓄積し、クロールする機会を持っています。、 - 単一方向のグラデーション、15-35 分 (表 4) 幼虫の年齢に応じて、双方向グラデーションの 10-30 分のため続行するアッセイを許可します。
- 段ボール箱とマイクロ プレート蓋を取り外します。デジタル カメラを使用して上からプレートを撮影します。調査官より良いコントラストと明るさ解析のための 1 つを選択できるように、各アッセイ プレートの 2 枚の写真を取る。
- 幼虫のすべてを削除吸引によりアッセイ プレートから、どこでもプレート外。
- アッセイ プレート、チューブ、および蒸留水で十分にセル ストレーナーを掃除します。Agarose の表面が破損している場合を除き、その日に準備アッセイ プレートを再利用します。
- 各ゾーンにおける幼虫の割合を計算します。
- マーキングをイメージに追加することができます任意のソフトウェアを使用してアッセイ結果の写真のイメージを開きます。アッセイのゾーンを示すときに、アッセイ プレート上の分界に基づいてすべての 2 cm の垂直線を描画します。
- 各ゾーンで幼虫の数をカウントし、番号を記録します。壁のいずれかから 0.5 cm の地域で幼虫はカウントされません。ゲルは壁に近い厚いと表面温度は、これらの地域ではリニアではありません。
- 単一方向のグラデーションでは、次のように各ゾーンの割合を計算します。
(特定の 2 cm ゾーンで幼虫の数)/(6 ゾーンにおける幼虫の合計数) x 100。 - 双方向のグラデーションでは、次のように各ゾーンの割合を計算します。
(特定の 2 cm ゾーンで幼虫の数)/(グラデーションの各側面の 5 つのゾーンで幼虫の合計数) x 100。
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Representative Results
18 ° C から 28 ° C の単一方向を確立するには、グラデーション、2 つの水のお風呂の温度を 16.8 ° C と設定 31 ° C我々 はすべての 6 ゾーン、ゾーン間の境界線の上部と下部の部分内の 26 の位置に agarose のゲルの表面 (図 2, 2 e) の極端な両端の温度を測定することによって 13 点の温度を取得します。グラデーションの温度分布はほぼ線形 (Y = 0.9672 * X + 16.19、R2 = 0.9961) (図 2 e)。
我々 は様々 な年齢での制御 (w1118) の幼虫の温度の設定を試金。1st (24 ± 1.5 h AEL)、2nd (48 ± 1.5 h AEL) と初期 3rd幼虫 (72 ± 1.5 h) 24 ° C ゾーン (図 3 a, B) でピークを示した。3rdの中に変更の温度の設定は、幼虫の発育を令します。半ば 3rd齢 (96 ± 1.5 h AEL) の最大の割合は、18 ° C ゾーン (図 3 a, B) に蓄積し、このバイアスは、年齢と共に増加し。18 ° C ゾーンでクラスター化 〜 50% 後半 3rd齢幼虫 (事前登山; 120 ± 1.5 h AEL) の中で、この温度の選択だった ~ 20 ° C 隣接ゾーンよりも 4 倍高い (18 ° C ゾーン、50.2%; 20 ° C ゾーン、15.1%;図 3AB)W1118で 18 ° C ゾーンに蓄積する性癖なかったエッジ効果による後期 3rd令幼虫 18 ° C ゾーンにまだ蓄積された双方向の温度勾配 (図 3E、F を使用して).
また、快適な範囲で差別の温度の相違のために必要な遺伝子の遺伝子変異を有する後半 3rd幼虫 (120 ± 1.5 h AEL) をテストしました。18-24 ° C 範囲5,7,8常温選択に必要なtrpA1が含まれます。幼虫trpA1 (trpA11) の null 変異を有する分散均等に全体の 18 ° C-28 ° C グラデーション (図 3)。だけ、A と B のアイソ フォーム (trpA1 ABG4) または C と D アイソ フォーム (trpA1 CDG4) をまた行方不明幼虫を示す重度障害 (図 3)。ハエがホスホリパーゼ Cβ (PLC21C、NORPA) の 2 つのアイソ フォームをエンコードおよびないplc21c (plc21c号 P319) が、 norpA (norpAP24) にも影響を与える突然変異は 18 ° C の範囲 (の蓄積を破壊3 D を図)。
図 1。単一方向の温度勾配試験を実行するための装置。(A)アルミニウムが幼虫の温度走性動作を試金するために使われる版をテストします。上部と下部に 13 の黒い線は画定 12 ゾーン (10 mm) です。プレートの底の黒の塗料で陽極酸化、幼虫を視覚化するために簡単です。(B)寸法 (mm で示されます) アルミ板の。アルミ板の外側のサイズは 140 × 100 × 9 mm です。アルミ板の内側のサイズは 130 × 90 × 8 mm です。分界は、10 mm で区切られます。最初と最後の分界はプレートの内部領域の端から 5 mm です。(C)トップし、アルミ ブロックの 1 つの側面ビューを使用するグラデーションの温度を制御します。ブロックには 2 つのコネクタが水浴に接続、シリコン チューブに取り付けるために使用します。(D)アルミニウム ブロックの寸法。アルミ ブロックの外側のサイズは 255 × 50 × 14 mm です。内部水経路の径は 7 mm です。左側の 2 つの 30 の mm コネクタと風呂の水に伸びるシリコン チューブを接続します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。シングルと双方向のグラデーション アッセイ設定。(A) 2 アルミニウム アッセイ プレート 2 つのアルミ ブロックが単一方向グラデーションの設定。アルミ ブロックの温度は、2 つの水のお風呂からの水の循環によって制御されます。(B) 3 つのアルミ ブロック、水浴、アルミ プレート (250 x 220 mm) の双方向のグラデーションのアレンジメント。左右のブロックは、同じ水のお風呂に接続しているし、中央のブロックは、他の風呂の水に接続されています。アルミ アッセイ プレートは、1% の agarose を格納する 10 mm の壁を形成するため、テープでラップされます。(C)位置 (ドットで示されます) の温度をチェックし、プレートに幼虫を解放します。実験を開始する前に目的の線形温度勾配が確立されていることを確認する各ゾーン内の 2 つのポイントで温度を確認します。幼虫は、正中線の近く示された領域内で解放されます。幼虫は、各 2 cm ゾーン内で数えられます。(D)温度 (ドットで示されます) と双方向勾配の幼虫のリリース ゾーンを確認する位置。幼虫の等しい数は、双方向のグラデーションの各半分の正中線に沿ってリリースされます。幼虫の数は、ゾーン 10 (2 cm) のそれぞれにカウントされます。アガロース表面温度 (18 ° C ~ 26 ° C) の 1 つの標準的なセットが表示されます。(E)温度は、境界線、およびサンプルの単一方向グラデーション内の各ゾーンの中線に沿って測定されます。データを表す平均気温 ± SD. n = 8 の試金 (150 ± 50 幼虫/アッセイ)。曽我部らからこの図のパーツで再現します。8のわずかな変更です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。単一方向と双方向のグラデーションの試金を使用して代表結果。(A, B)単一方向のグラデーションの 6 ゾーンに幼虫の割合を意味します。データは、産卵 (AEL) 後示された時間で 3rd幼虫を含めます。n = 6-7。誤差範囲を表す ±SEM。 (C) 熱の分布に事前登山後半 3rd令コントロール (w1118) と単一方向のグラデーションのtrpA1を突然変異体の幼虫です。n = 3-4。誤差範囲 ±SEM。 (D) 制御 (w1118) と単一方向のグラデーションに PLCβ 変異体の後半 3rd幼虫の熱分布を表しています。n = 4-6。誤差範囲は、±SEM。 (E) 事前登山、後半 3rd幼虫 (w1118) 双方向勾配の代表的な分布を表します。左と右のアッセイ ゾーンは点線で示されるおよびセンター (灰色の領域) のない数ゾーンで区切られました。前後半 3rdを登山の (F) の割合は、温度勾配に沿って各ゾーンで幼虫 (w1118) を令します。左の幼虫および右側ゾーンのリリースです。アッセイ ゾーン中央に 3 cm no カウント ゾーンで区切られているし、ディストリビューションが個別に計算されます。誤差範囲は、Sem を表しています。n = 3 の試金 (200-400 幼虫/試金)。曽我部らからこの図のパーツで再現します。8のわずかな変更です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 時間 AEL | 幼虫の段階 | |
| 24 | 1st齢 | |
| 48 | 2nd齢 | |
| 72 | 初期 3rd齢 | |
| 96 | 半ば 3rd齢 | |
| 120 | ステージを登る直前の後半 3rd齢 | |
表 1。産卵 (AEL) 後時間と幼虫の段階の関係。
| アガロース ・ プレート (斜面) の温度勾配 | 水浴の温度 | アルミ ブロックの温度 |
| 10.0-25.0 ° C (1.5 ° C/cm) | ~6.5-7°C/~28.5°C | ~8.5°C/~26.8°C |
| 18.0-28.0 ° C (1 ° C/cm) | ~16.8°C/~31.0°C | ~17.8°C/~29.7°C |
| 14.0-34.0 ° C (2 ° C/cm) | ~10.0°C/~40.0°C | ~11.8°C/~36.8°C |
| 12.5-42.0 ° C (2.95 ° C/cm) | ~7.0°C/~55.0°C | ~9.4°C/~49.4°C |
表 2。典型的な温度勾配と水浴と単一方向グラデーションのアルミ ブロックの対応する温度。
| アガロース ・ プレートの温度勾配 | 水浴の温度 | アルミ ブロックの温度 |
| 22/10/22 ° C (1.5 ° C/cm) | ~5.0°C/~25.0°C | ~7.5°C/~24.0°C |
| 26-18-26 ° C (1 ° C/cm) | ~15.8°C/~30.6°C | ~16.9°C/~28.4°C |
| 30-14-30 ° C (2 ° C/cm) | ~8.5°C/~36.4°C | ~10.9°C/~32.8°C |
| 36-12.5-36 ° C (2.95 ° C/cm) | ~5.0°C/~47.2°C | ~7.9°C/~40.9°C |
表 3。典型的な温度勾配と水浴や双方向のグラデーションのアルミ ブロックの対応する温度。
| 令 (AEL) | 測定時間 (単方向) | 測定時間 (双方向) |
| 24 h | 30 分 | 35 分 |
| 48 h | 22 分 | 27 分 |
| 72 h | 16 分 | 21 分 |
| 96 h | 13 分 | 18 分 |
| 120 h | 10 分 | 15 分 |
表 4。幼虫の年齢別 (AEL) と対応する回の試金します。
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Discussion
このプロトコルの成功を確保するため、幼虫の実験を行うための十分な番号を取得する手順を取ることが重要です。あらかじめ産卵を改善するために 2-3 d 酵母貼り付け含むバイアル中のハエを餌が含まれます。バイアルは水の瓶を含むトレイに置かれ、食品の水分を保持し、通常の光サイクルへの露出を確保しながらの幼虫によって効果的な摂食を促進する透明なプラスチック袋に封入する必要があります。ただし、ハエが引っかかるので、ソフトに酵母ペーストしないでください。バイアルあたりの女性の数は遺伝子型に依存します。W1118、場合通常 12 〜 女性と 〜 6 男性 3 h の卵を産むために十分なです。通常 2 バイアルは単一方向の試金のため十分な幼虫 (幼虫 100-200) 皿の上に配置するを提供します。フライのストックが野生型よりも少なく卵を産むか、孵化幼虫の割合が減少 (30-35/バイアル) まで追加女性と男性を追加します。
これらのアッセイを実行するとき、予期せぬ変動の多くの原因があります。発達段階、幼虫の温度選好に影響を与えます。したがって、定義された段階の幼虫は慎重に使用することが不可欠です。これを行うには、(3 h) などの狭い時間枠で幼虫を収集します。時間後に対等を分析する産卵幼虫を高齢者に、飼育条件 (温度、湿度、明暗サイクルと餌の種類) ので、開発の速度に影響を与えるいくつかの変異が厳密に依存しないでください。また、異なった遺伝子型の幼虫が同じ発達段階でかどうか口フックと気門7のサイズなどの物理的な特性を調べることが重要です。時刻の 1st、2ndと 3rdの幼虫 (表 1) を開発する、12 h ライト: 12 下 25 ° C でトウモロコシ ベースの食品と潜伏を使用してに基づきます h 暗いサイクル。幼虫は糖蜜ベースの食品に遅い成長します。適切な水分補給や食品鮮度も幼虫の生育に影響します。食品中の水の量は、バイアルから戻って皮をむき乾燥しすぎても、過剰な水のために緩すぎる食べ物を残してください。理想的には、食品表面に最も近い ~ 5 ミリの層成長の幼虫によって調節される、バイアルを傾斜またはをタップしたときに簡単に移動します。この条件は、50-100 幼虫と新鮮な食品を使用して実現できます。
分析を開始する前に安定した温度勾配を確立することが不可欠です。したがって、オン 1-2 h 風呂の水水風呂熱源し、順番、グラデーションに影響を与える可能性のある周囲の室内温度を変更可能性があります、アッセイを開始する前に。1-2 時間後最も客室の温度はあります。ただし、これは、各環境で決定する必要があります。また、広い温度範囲でのグラデーションを生成するとき (> 3.0 ° C/cm)、それは安定的なグラデーションを得ることが困難にすることができます。アッセイ プレートの小さな動きは、範囲が大きい場合より大幅温度勾配を変更 (例えば> 3.0 ° C/cm)。1-2 ° C/cm 勾配が最も安定したグラデーションを生成することがわかった。
温度走性の試金の変動を制限するように制御する必要があるいくつかの追加の考慮事項があります。幼虫を洗浄、食品の粒子の存在と、重要または幼虫に及ぼすショ糖は分析に影響を与えます。洗浄のステップを徹底的に行う必要がありますすぐに、酸素供給を制限するため過度に中で水浸しになる水影響することが自分の健康。したがって、セル ストレーナー (オプション 2) を使用して、幼虫をきれいにすることをお勧めします。300 μ m うまく初期 3rdで幼虫齢期 (72 h AEL) のための気孔のサイズとストレーナーまたはより古い。さらに、同調因子から ZT8 に (ZT) ZT4 の時間など一日の同じ時間で実験を実行することが重要だ (ZT = 0 は、ライトが点灯)、温度の選択の概日リズムの影響を受け変動を制限します。アガロース ・ プレートの湿気のレベルでは、結果に変動することもあります。板の表面は、しっとりする必要があります、水滴が幼虫は、トラップ、したがって回避する必要があります。
法における変動を制限すると、大量の独立実験の実行することがなく信頼性の高い結果を得ることが可能になるそれがあります。通常、3-8 独立した実験は、信頼性の高い結果を得るのに十分です。結果の適切な集計も温度走性アッセイの成功にとって重要です。温度は、これらの地域ではリニアではありませんのでアルミ壁から 0.5 cm 内の領域の分散の幼虫はカウントされません。いくつかの幼虫、アッセイを締結時に、2 つのゾーン間の境界に配置されます。ボディーの長さの 50% 以上が 1 つのゾーンに存在する場合は、そのゾーンに対して集計に幼虫を含めます。幼虫が 2 つのゾーンのそれぞれに正確に 50% の場合は、各ゾーンで 0.5 幼虫として動物を数えます。
グラデーションのアッセイ可能温度の相違の範囲を区別する幼虫ですが、効果的にテストできる上限と下限温度に制限があります。温度をテストするのには現実的ではありません < 幼虫の移動以来の 10 の ° C の低温で大幅短縮が。ほとんどないコントロール幼虫滞在任意のゾーンで 42 ° C に達する上部の温度勾配を確立できるが > 28 ° C様々 なゾーン間温度設定を判別する連続グラデーション アッセイを使用ことはできませんそのため、> 28 ° Cしかし、これらの高温でグラデーションの試金される可能性があります可能性があります彼らは強く暖かい温度の設定をシフトしている場合に突然変異体を特徴付けます。
変異体に運動障害がある場合は、見かけの温度設定が運動障害のため不正確ではないことを確認する追加実験を行うこと必要があります。この潜在的な問題を解決するには、目的のゾーンに移動する動物の追加の時間を許可するように測定時間が長くを確立する必要がある場合があります。双方向のグラデーション アッセイは、動物プレート上の最初に配置がどこかにかかわらず、同じ優先ゾーンを選択するかどうかをテストする使用できます。
結論としては、ここで説明したグラデーションの試金その他温度走性アッセイに利点があります。双方向選択の試金、彼らは堅牢な結果をもたらすことができる 2 つのゾーン間の温度差が大きい場合に特に役に立ちます、明らかに単一の実験の幼虫によって優先の理想的な温度で有効ではありません。これを行うに最も好ましい温度5,6,7を決定する多くの双方向選択の組み合わせを実行する必要があります。対照的に、グラデーションの試金は動物景色の単一の連続的な温度環境で、好まれる温度ゾーンを選択する機会を提供します。したがって、最寄りの温熱環境を決定するための双方向の選択肢の組み合わせを工夫する必要はありません。温度走性ラウンド ペトリ皿を使用しての勉強は、幼虫10の移動のダイナミクスに対する温度の効果を評価するために採用されています。ただし、各ゾーンはサイズが異なるので、異なる温度の設定の判別にはあまり役に立ちませんが。最後に、アッセイとその単一のアッセイの識別の小さい温度の設定の簡単のために用いることができる可能性があります幼虫の温度設定に関与している可能性のある候補者の遺伝子の画面を数十人にそうでなければ他の試金を使用して見落とさ
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
C. m. は NIDCD (DC007864、DC016278) (EY008117、EY010852)、ネイから資金援助によってサポートされて、NIAID (1DP1AI124453)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
