Summary
Hier presenteren we een protocol om te bepalen van de gewenste omgevingstemperatuur van Drosophila larven met behulp van een continu thermisch verloop.
Abstract
Veel dieren, met inbegrip van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, zijn geschikt voor discriminerende minieme verschillen in omgevingstemperatuur, die hen toelaat om te zoeken naar hun voorkeur thermische landschap. Om de voorkeuren van de temperatuur van larven via een gedefinieerd bereik van de lineaire gedefinieerd, ontwikkelden we een bepaling met behulp van een temperatuurgradiënt. Om vast te stellen een single-directionele verloop, zijn twee aluminium blokken verbonden met onafhankelijke waterbaden, elk waarvan de temperatuur van de afzonderlijke blokken regelt. De twee blokken Stel de boven- en ondergrenzen van het verloop. De temperatuurgradiënt is opgericht door het plaatsen van een agarose-coated aluminiumplaat over de twee water-gecontroleerde blokken, zodat de plaat de afstand tussen hen overspant. De uiteinden van de aluminiumplaat die is ingesteld op de bovenkant van de water-blokken definieert de minimale en maximale temperaturen en de regio's tussen de twee blokken vormen een lineair verloop van de temperatuur. De kleurovergang bepaling kan worden toegepast op de larven van verschillende leeftijden en kan worden gebruikt voor het identificeren van mutanten die vertonen fenotypen, zoals die met mutaties die genen coderend voor TRP channels en opsins, die nodig voor de discriminatie van de temperatuur zijn.
Introduction
Thermotaxis is werkzaam bij mobiele dieren te selecteren van een omgeving met de meest gunstige voorwaarden1,2,3. Als het klimaat is extreem warm of koud, dit probleem is van vitaal belang voor het voortbestaan. Daarnaast veel dieren zijn gevoelig voor zeer kleine verschillen in temperatuur in het comfortabele bereik en omgeving met een ideale temperatuur uitzoeken. Dit is van bijzonder belang voor poikilothermic organismen zoals fruitvliegjes, die equilibreer hun lichaamstemperatuur met het milieu. Testen om te controleren van larvale thermotaxis hebben bijgedragen in de identificatie en verduidelijking van de rol van moleculaire sensoren zoals Drosophila voorbijgaande Receptor potentiële (TRP) kanalen4,5,6, rhodopsins7,8, en ionotropic receptor receptoren (IRs)9, die deze dieren met temperatuur gevoeligheden begiftigen over verschillende temperatuurbereiken.
Een tweeweg multiple-choice test biedt een aanpak om te bestuderen van thermische voorkeuren in larven6,7. De bepaling brengt met zich mee tot de oprichting van twee verschillende temperatuurzones en laat de dieren om te selecteren van de ene kant boven de andere. De resultaten van twee richtingen keuze tests kunnen robuust, vooral als de temperatuurverschillen tussen de twee opties groot zijn. Bovendien, aangezien elke bepaling classificatie van slechts twee groepen impliceert, kan de gegevens worden uitgedrukt als een eenvoudige voorkeur-index. Het gemak en de eenvoud van twee richtingen keuze tests zijn ook vatbaar voor genetische schermen. Een belangrijk minpunt is echter dat veel experimenten nodig om de gewenste temperatuur van de wild-type of mutant dieren zijn.
Een kleurovergang assay biedt de mogelijkheid om de gewenste temperatuur in een enkele assay-8. Bovendien, in tegenstelling tot de twee richtingen multiple-choice test, het maakt het mogelijk de evaluatie van de verdeling van een groep dieren, wanneer geconfronteerd met een doorlopend bereik van temperaturen. Een kleurovergang assay gebruikt een petrischaal en enkele dieren en is geschikt voor het karakteriseren van de gedetailleerde gedrag van individuele dieren10. Echter, aangezien petrischaaltjes ronde zijn, de grootte van de temperatuurzones variëren en geleidelijk kleiner zijn afhankelijk van de afstand van het centrum. Dus, deze setup is niet ideaal voor het toezicht op de selecties van de temperatuur van de populaties van dieren.
Een continu thermisch kleurovergang apparaat dat is geschikt voor het beoordelen van de voorkeuren van de temperatuur van groepen van larven maakt gebruik van een rechthoekige arena en hier wordt beschreven. Het apparaat is eenvoudig te construeren en te assembleren. Bovendien, het verloop is lineair, en is flexibel, aangezien het kan worden gebruikt om te beoordelen van thermotaxis over grote temperatuur variëren van 10 ° C tot 42 ° C. De bepaling is snel en eenvoudig uit te voeren en reproduceerbare gegevens levert. Naast de rapportage van de favoriete temperatuur van larven, blijkt het de voorkeuren van de bevolking van dieren over een gehele lineaire bereik in een enkele experiment. Als gevolg van deze voordelen is het een uitstekende keuze voor de identificatie van genen die nodig zijn voor thermotaxis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. apparatuur fabricage en montage apparaat voor kleurovergang Assays
- De aluminium assay platen voor de single-directionele kleurovergang assay fabriceren.
- Trim en slijpen van elke aluminiumplaat assay (figuur 1A) uit één stuk aluminium met behulp van een lintzaag en scherpe verticale molen met de volgende dimensies: de buitenste grootte is 140 x 100 x 9 mm en de binnenste grootte is 130 x 90 x 8 mm (figuur 1B). Anodize van de binnenkant van elke assay plaat met zwarte verf gemakkelijker voorkomen dat roest te visualiseren van de larven.
Opmerking: Vervaardiging van de platen aluminium assay voor het single-directionele verloop wordt gedaan door een machine winkel. De anodisatie wordt uitgevoerd door een commerciële leverancier. - Mark van de bovenste en onderste randen van elke plaat assay met 13 begrenzingen, gescheiden door 10 mm met behulp van een permanent marker. Plaats de eerste en laatste begrenzingen 5 mm van de binnenste rand van de platen assay (figuur 1A, B).
- Trim en slijpen van elke aluminiumplaat assay (figuur 1A) uit één stuk aluminium met behulp van een lintzaag en scherpe verticale molen met de volgende dimensies: de buitenste grootte is 140 x 100 x 9 mm en de binnenste grootte is 130 x 90 x 8 mm (figuur 1B). Anodize van de binnenkant van elke assay plaat met zwarte verf gemakkelijker voorkomen dat roest te visualiseren van de larven.
- Om de aluminiumplaat van de bepaling van de bidirectionele gradatie, een aluminiumplaat met uitgesneden de volgende afmetingen gebruikt plaatwerk schaar: 250 x 220 x 2 mm. Anodize de assay platen met zwarte verf.
Opmerking: Fabricage van de aluminium assay platen voor de bidirectionele verlopen wordt uitgevoerd door een machine winkel. De anodisatie wordt gedaan door een commerciële leverancier. - De aluminium blokken te fabriceren.
Opmerking: Twee blokken nodig zijn voor het verloop van de single-directionele en drie blokken nodig zijn voor het verloop van de bidirectionele.- Snijd de aluminium blokken (Figuur 1 c) uit één stuk aluminium met behulp van een lintzaag (afmeting van 50 x 255 x 14 mm) (Figuur 1 c, D).
- Boor het water kanaal binnen het blok (7 mm in doorsnede) met behulp van een verticale molen en draad groeven in de open uiteinden aan de ene kant (Figuur 1 d). Sluit de gegroefde gaten met bouten en draad tape van de zegel te vormen van een U-vormige water kanaal (Figuur 1 c, D).
Opmerking: De fabricage van de aluminium assay blokken wordt uitgevoerd door een machine winkel. - Herstellen van de connector in het aluminium blok (Figuur 1 d) met schroefdraad en draad afdichting band aan het ene uiteinde. Het andere uiteinde met meerdere weerhaken past silicone slangen (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" muur).
- Krijgen twee gekoeld/verwarmd circulerende Baden.
- Assembleren temperatuurgevoelig blokken voor de kleurovergang assay-systeem.
- Voor het verloop van de single-directionele, verbinden met elk van de twee aluminium blokken een aparte waterbad zodat de temperatuur van elk blok wordt gecontroleerd door een onafhankelijke water circuleren systeem (figuur 2A). Silicone slangen (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" muur) gebruiken de uitlaat van het waterbad verbinden met de connector op de binnenzijde van het aluminium blok (figuur 2A). Gebruik ook buizen de inlaat van het waterbad verbinden met de connector van de buitenzijde van het aluminium blok.
- Voor het verloop van de bidirectionele, plaatst u twee van de drie blokken onder de links en rechts van de plaat en hen verbinden met de dezelfde waterbad met de buis (figuur 2B). Het derde blok aluminium verbinden met een tweede bad met water en plaats onder het midden van de plaat (figuur 2B).
Opmerking: Dit apparaat en de bepaling zijn alleen nodig als de larven zich in de zone op een van de randen of de andere van het single-directionele verloop ophopen. Zo ja, is het belangrijk om te beoordelen of er is een randeffect. Om te testen deze mogelijkheid, stellen een bidirectionele verloop waarin de rand zone temperatuur de voorkeur van de larven met behulp van het single-directionele verloop (bijvoorbeeld 18 ° C) de temperatuur in het midden van de plaat van het bidirectionele verloop (figuur 3E is , F).
2. de larvale synchronisatie
- Voeden vliegen moet worden gebruikt voor het leggen van eieren.
- Mix gist korrels en gedestilleerd water met een stamper om gist plakken. Grondig vermalen en roer totdat het de consistentie van de pasta is vergelijkbaar met pindakaas. Vermijd overdreven droge pasta, die kan bij het overbrengen van vliegen naar verse flesjes afschilferen, of natte pasta, die de vliegen overlappen kan.
- Voeg de gist plakken dicht bij de binnenmuren van standaard Drosophila flesjes, net boven het oppervlak van het voedsel met behulp van een stamper.
- Graaf 12-35 vrouwtjes tot half zoveel mannetjes (maar niet meer dan 10) op een pad van CO2 en de vrouwtjes en mannetjes toevoegen aan elke gist plakken-bevattende flacon.
- Om te houden van de vlieg voedsel met de gist-pasta vochtig, terwijl de vliegen voeden, combineren deze flesjes in een lade die in het bezit tot 100 flacons met 20 open flesjes met gedestilleerd water alleen. Plaats de lade in een doorzichtige plastic zak en verzegelen.
- Incubeer de lade in een incubator 25 ° C gedurende 48 uur zodat de vrouwtjes worden gevoed adequaat, waardoor ze te grote aantallen eieren leggen.
- Instellen van flesjes voor het leggen van eieren.
- Breng de gevoed vliegen in nieuwe voedsel flesjes voor het verzamelen van ei door te tikken op hen. Gebruik geen CO2, waardoor de vliegen minder om eieren te leggen over de volgende korte tijd venster.
Opmerking: Standaard Drosophila voedsel flesjes worden gebruikt zonder gist plakken voor de eicelpunctie. - Laat het vliegen om eieren te leggen gedurende 3 uur bij 25 ° C zodat alle eitjes zijn verzameld over een relatief smalle tijd venster.
Opmerking: Dit zal toelaten de larven moeten worden gesynchroniseerd op de dezelfde ontwikkelingsstadium. - Plaats de flesjes met de eieren in de lade met de flesjes water en draai de zak. Incubeer bij 25 ° C onder 12 h licht: 12 h donkere cycli.
- De larven van de leeftijd voor een gegeven aantal uren nadat ei leggen (AEL) afhankelijk van het larvale stadium gewenst.
Opmerking: Tabel 1 is een schatting van de relatie tussen de uren AEL en het larvale stadium, die afhankelijk van de vlieg materieel variëren zal, voedsel gebruikt, temperatuur, etc. de precieze relatie tussen de AEL en ontwikkelingsstadium moet fokken gecontroleerd door elke onderzoeker die met behulp van fysieke criteria, zoals de morfologie van de mond haken en spiracles11.
- Breng de gevoed vliegen in nieuwe voedsel flesjes voor het verzamelen van ei door te tikken op hen. Gebruik geen CO2, waardoor de vliegen minder om eieren te leggen over de volgende korte tijd venster.
3. temperatuurverloop tijdens Setup
- Bereiden van single-directionele verloop
- Om te maken een vochtige ambient omgeving tijdens het testen, plaatst u de twee aluminium blokken verbonden met twee waterbaden op natte papieren handdoeken, gescheiden door 10 cm (figuur 2A).
- De twee waterbaden ~ 2 h alvorens aan te vangen de bepaling zodat u genoeg tijd voor de temperatuur van de aluminium blokken te equilibreer inschakelen.
Opmerking: Het wordt aanbevolen voor het uitvoeren van een mock experiment om te bepalen van de temperatuur van elk waterbad die nodig is om de gewenste lineair verloop van de temperatuur. Sommige paren van de typische temperatuur in te stellen van de waterbaden zijn vermeld in tabel 2. Nochtans, merken op dat de oppervlakte temperaturen worden beïnvloed door de omgevingstemperatuur. De lengte van de buizen ook beïnvloedt de temperaturen er is koelen in de buizen. De lengte van de buis in onze opstelling is 1,5 m. - Magnetron 100 mL van de 1% agarose op de high-power instelling in een 500 mL ronde wide-mouth fles en giet 25 mL/assay plaat op een niveau benchtop. Twee assay platen, die kunnen worden geplaatst op de aluminium blokken op hetzelfde moment (figuur 2A) voor te bereiden.
- Nadat de agarose heeft verhard (10-20 min), wrijf zachtjes elk agarose oppervlak met een standaard keuken spons of een melamine spons te maken de oppervlakte agarose enigszins grof, zodat wanneer het sproeien van water op de agarose gel, een soepele dunne water membraan worden gemaakt, en geen waterdruppels zal vormen.
- Volledig dompelen de platen in een container met gedestilleerd water totdat de bepaling klaar om te worden uitgevoerd is om te voorkomen dat de platen krijgen verdroogde.
- Bereiden een bidirectionele verloop (optioneel)
- Als u wilt maken een vochtige ambient omgeving tijdens het testen, drie aluminium blokken 8 cm uit elkaar (figuur 2B) op natte papieren handdoeken te plaatsen.
- De twee waterbaden ~ 2 h alvorens aan te vangen de bepaling zodat u genoeg tijd voor de temperatuur van de aluminium blokken te equilibreer inschakelen.
Opmerking: Het wordt aanbevolen voor het uitvoeren van een mock experiment om te bepalen van de temperatuur van elke waterbad voor het bidirectionele verloop. Sommige paren van de typische temperatuur in te stellen van de waterbaden zijn vermeld in tabel 3. Nochtans, merken op dat de oppervlakte temperaturen worden beïnvloed door de omgevingstemperatuur. De lengte van de buizen ook beïnvloedt de temperaturen er is koelen in de buizen. De lengte van de buis in onze opstelling is 1,5 m. - Wikkelen om te verhinderen dat de agarose morsen uit de plaat, de randen van de aluminiumplaat met het labelen van tape om te vormen van een 10 mm hoge muur (figuur 2B).
- Met behulp van de high-power instelling, magnetron 200 mL van de 1% agarose in een 500 mL ronde wide-mouth fles en giet 120 mL op een plaat assay.
- Nadat de agarose heeft verhard (~ 30 min), zachtjes wrijf elk agarose oppervlak met een standaard keuken spons of een melamine spons te maken van het agarose oppervlak enigszins grof, zodat wanneer het sproeien van water op de agarose gel, een soepele dunne water membraan ontstaat en neen waterdruppels vorm.
- Volledig dompelen de assay platen in een container met gedestilleerd water totdat de bepaling klaar om te worden uitgevoerd is om te voorkomen dat ze uitdrogen.
- Single-directionele kleurovergang instellen
- Bereiden van reagentia en items op een bankje naast het apparaat van de kleurovergang assay (Zie de Tabel van de materialen).
- Ter bevordering van efficiënte temperatuur overdracht, vult u eventuele leemten tussen de aluminium blokken en de assay platen door het sproeien van water op het raakvlak tussen de blokken en de plaat.
- Met behulp van handschoenen, verwijder de assay platen uit de watercontainer. Als water tussen de agarose gel en de plaat valt en zorgt ervoor dat oneffenheden te vormen op het oppervlak, verwijdert u het water met een micropipet P1000.
- De assay-platen op de aluminium blokken plaatsen, zodat de begrenzingen die 2 cm vanaf beide rand precies overeenkomen met de randen van de aluminium blokken (figuur 2A, C).
- Spuit water op het oppervlak van de plaat (een dunne water membraan die betrekking hebben op het oppervlak van het agarose is voldoende) om te voorkomen dat de agarose gel uitdrogen. Zorg ervoor dat het membraan van het water continue en vrij van waterdruppels omdat larven krijgen in waterdruppels gevangen kunnen.
- Betrekking hebben op het verloop systeem met een kartonnen doos te water verdamping verminderen en helpen stabiliseren van de temperatuur van het oppervlak van de gel. 5-10 min om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur aan equilibreer wacht.
- Controleer de oppervlaktetemperatuur op 12 punten op de plaat (figuur 2C). Neem twee metingen binnen elke zone vast te stellen of er variabiliteit binnen een zone is. Zorg ervoor dat de temperatuur op beide plekken binnen ± 0,2 ° C van de gewenste temperatuur.
Opmerking: Variabiliteit binnen een zone meestal treedt op omdat de exacte afstanden van de twee plekken aan de rand van de aluminium blokken niet identiek zijn. Pas de positie van de plaat op de aluminium blokken om ervoor te zorgen dat de begrenzingen die 2 cm vanaf beide rand precies overeenkomt met de randen van de aluminium blokken. - Indien de gemeten temperatuur gradiënt van het gewenste verloop afwijkt, verhogen of verlagen van het water bad temperatuur instelling(en) en gecontroleerd of de oppervlaktetemperatuur nadat de temperatuur van het water bad stabilize(s).
- Gelden de kleurovergang systeem met een kartonnen doos tot het starten van de test.
- Bidirectionele kleurovergang instellen (optioneel)
- Bereiden van reagentia en items op een bankje naast het apparaat van de kleurovergang assay (Zie de Tabel van de materialen).
- Spray water op de oppervlakken van de drie blokken van het aluminium te bevorderen van efficiënte temperatuur overdracht van de aluminium blokken aan de assay platen door het invullen van een kloof tussen de oppervlakken.
- Verwijder de assay platen zorgvuldig uit de watercontainer en plaats op de aluminium blokken. Als water tussen de agarose gel en de plaat, die zou kunnen veroorzaken hobbels te vormen op het oppervlak binnenvalt, verwijdert u het water met een micropipet P1000.
- De assay-plaat op de aluminium blokken plaatsen, zodat de midlines van de eerste en laatste zones van beide rand exact overeenkomen met de randen van de twee zijden aluminium blokken (figuur 2B, D).
- Spuit water op het oppervlak van de plaat (een dunne water membraan die betrekking hebben op het oppervlak van het agarose is voldoende) om te voorkomen dat de agarose gel uitdrogen. Zorg ervoor dat het membraan water continue en vrij van waterdruppels, want larven krijgen in waterdruppels gevangen kunnen.
- Betrekking hebben op het verloop systeem met een kartonnen doos te water verdamping verminderen en helpen stabiliseren van de temperatuur van het oppervlak van de gel. 5-10 min om ervoor te zorgen dat de lichaamstemperatuur aan equilibreer wachten.
- Controleer de oppervlaktetemperatuur op twee punten langs de middellijn van elk van de 10 zones (figuur 2D). Neem twee metingen binnen elke zone vast te stellen of er variabiliteit binnen een zone is. Zorg ervoor dat de temperatuur op beide plekken binnen ± 0,2 ° C van de gewenste temperatuur.
Opmerking: Variabiliteit binnen een zone meestal treedt op omdat de exacte afstanden van de twee plekken aan de rand van de aluminium blokken niet identiek zijn. Pas de positie van de plaat op de aluminium blokken om ervoor te zorgen dat de midlines van de eerste en laatste zones dichtstbijzijnde elke rand exact overeenkomen met de randen van de twee zijden aluminium blokken. - Indien de gemeten temperatuur gradiënt van het gewenste verloop afwijkt, aanpassen van de water bad temperatuur instelling(en) en controleer de oppervlaktetemperatuur nadat de temperatuur van het water bad stabilize(s).
- De blokken met een kartonnen doos gelden tot het begin van de test.
4. larvale collectie en wassen
- Isoleren van schone larven (optie 1)
- ~ 40 mL 18% sacharoseoplossing toevoegen aan een test tube van 50 mL. Schep de larven van de voedsel-vial(s) met een scoopula en de overdracht naar de 18% sacharoseoplossing.
- Meng grondig maar voorzichtig met behulp van een scoopula te scheiden van de larven van het voedsel puin. Wachten voor 30-60-s tot de larven float aan de bovenste laag van de buis. De bovenste laag met de larven (~ 10 mL) pour naar een andere tube van 50 mL en vul de buis met vers 18% sacharoseoplossing. Wachten voor 30-60-s tot de larven float aan de bovenste laag weer.
Opmerking: Grote voedseldeeltjes soms dragen samen met larven en larvale thermotaxis kunnen beïnvloeden als ze niet worden verwijderd. Als grote voedseldeeltjes in de bovenste laag blijven, herhaal stappen 4.1.1-4.1.2 of deze handmatig verwijderen met een scoopula. - De bovenste laag van de larven (~ 10 mL) overbrengen naar twee andere buizen van 50 mL en vul de twee buizen met gedestilleerd water tot het verminderen van de sucrose concentratie, zodat de larven wordt snel in water dalen. Wachten voor 30-60-s tot de larven naar de bodem zinken. Dit en volgt zo spoedig mogelijk om te voorkomen dat de larven van de verdrinkingsdood uitvoeren.
- Gooi zoveel mogelijk van het water mogelijk door het voorzichtig het kantelen van de buizen. Larven combineren in één buis door gieten uit de larven met het resterende water en vul de buis met gedestilleerd water.
- Wachten voor 30-60-s alle larven zinken en water zo veel mogelijk door het kantelen van de buizen voorzichtig verwijderen. Herhaal deze stap wassen 2 - 4 keer tot volledig verwijderen sacharose en alle zichtbare voedsel.
- Verwijder zo veel van het water mogelijk en de larven overbrengen in een lege 35 mm petrischaal door decanteren. Spray de buis met water en een kleine kwast gebruiken om te helpen de overdracht de larven.
- Verwijder overtollig water uit de petrischaal met behulp van een micropipet P1000. Laat ~0.5 mL water om uitdroging van de larven te voorkomen.
- Plaats het deksel op de schotel om te voorkomen dat de larven ontsnappen. Zet de deksel ondersteboven ter vermindering van het vermogen van larven te ontsnappen door het kleine gat tussen de deksel en de schotel. Toestaan dat de larven te herstellen voor 10-20 min.
- Isoleren van schone larven (optie 2)
Opmerking: Deze alternatieve methode voor het schoonmaken van de larven vermindert de mogelijkheid van verstikkende de larven tijdens de procedure wassen. Voor het gebruik van deze methode, gaat u verder met de volgende stappen na het uitvoeren van de bovenstaande stappen 4.1.1-4.1.2.- Plaats een cel zeef (300 µm, behoudt larven 72 h AEL of ouder) op de top van een tube van 50 mL.
- Nadat u hebt bevestigd dat er is geen volwassen organen of voedsel puin drijvend op het oppervlak van de sacharoseoplossing, giet de bovenste laag met de larven door de zeef val alle de larven op het gaas-scherm. Wassen de larven grondig met gedestilleerd water tot de 50 mL-buis is gevuld.
- Verwijder de zeef van de cel met de larven en de afzet van het gebruikte water uit de buis. Plaats de zeef met de larven op de top van de lege buis en wassen van de larven opnieuw met gedestilleerd water tot de 50 mL-buis is gevuld.
- Draai de zeef ondersteboven om een lege 35 mm petrischaal, en spuiten van water vanaf de bovenkant van de cel zeef overdracht van de larven naar de petrischaal. Overdracht van de resterende larven met een kleine kwast.
- Blijven stap 4.1.7 boven voordat u verdergaat met stap 5.
5. assay en berekening
- Verwijder kartonnen doos en controleer de oppervlaktetemperatuur van de gel direct vóór de overbrenging van de larven aan de plaat. Minimaliseer de tijd die de kartonnen doos geopend is om te voorkomen dat de temperatuur evenwichtsinstelling verstoren. Als het oppervlak droog, spuit een kleine hoeveelheid water op het oppervlak.
- Distribueren van 150 ± 50 larven in de buurt van het centrum van elke plaat (tussen de zones 3 en 4 uit de 6 zones) voor de single-directionele gradatie (release zone; Figuur 2C).
Opmerking: Voor het verloop van de bidirectionele, distribueren 200-400 larven langs de middelste zone van elke helft (figuur 2D). - Plaats een microplate deksel boven elke assay plaat om te voorkomen dat de larven kruipen uit. Betrekking hebben op de installatie met een kartonnen doos om te voorkomen dat blootstelling aan licht, die mogelijk van invloed zijn op de larvale keuze op de agarose gel.
Opmerking: Voor het bidirectionele verloop, het moet niet noodzakelijk zijn ter dekking van de plaat met een deksel, omdat de plaat groter is, en de gewenste temperatuur van de larven in de middelste zone is. Daarom enkele larven zich ophopen op de randen en hebben een kans om te kruipen uit. - Het toestaan van de bepaling te gaan voor 10-30 min voor het verloop van de single-directionele en voor 15-35 min. voor het verloop van de bidirectionele, afhankelijk van de leeftijd van de larven (tabel 4).
- De kartonnen doos en het deksel microplate verwijderen. De platen uit bovenstaande met behulp van een digitale camera te fotograferen. Twee foto's nemen van elke plaat assay zodat de onderzoeker met een beter contrast en helderheid voor analyse kiezen kunt.
- Verwijder alle van de larven van de assay platen en overal buiten de platen door aspiratie.
- Reinig de platen assay, de buizen en de cel zeef grondig met gedestilleerd water. Hergebruik de assay platen die dag bereid, tenzij de oppervlakte van het agarose is beschadigd.
- Berekenen de percentage-verdeling van de larven in elke zone.
- Open het fotografische beeld van de resultaten van de test met software waarmee markeringen toe te voegen aan de afbeelding. Om aan te geven de assay zones, tekent u verticale lijnen elke 2 cm op basis van de begrenzingen op de plaat assay.
- Het aantal larven in elke zone en de nummers opnemen. Tellen niet larven in regio's 0.5 cm vanaf een van de muren. De gel is dikker in de buurt van de muren en de oppervlaktetemperaturen niet lineaire in deze regio's.
- Voor het verloop van de single-directionele, het percentage distributie in elke zone als volgt te berekenen:
(aantal larven in een bepaalde zone 2-cm) / (totale aantal larven in 6 zones) x 100. - Voor het verloop van de bidirectionele, het percentage distributie in elke zone als volgt te berekenen:
(aantal larven in een bepaalde zone 2-cm) / (totale aantal larven in 5 zones op elke zijde van het verloop) x 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om vast te stellen een 18 ° C - 28 ° C single-directionele kleurovergangen, we stellen de temperaturen van twee waterbaden op 16,8 ° C en 31 ° C. Door het meten van de temperatuur op 26 posities binnen de bovenste en onderste gedeelten van alle 6 zones, de randen tussen de zones, en aan de extreme uiteinden van het agarose gel oppervlak (figuur 2C, 2E) verkrijgen we de temperaturen op 13 punten. De verdeling van de temperatuur langs het verloop was bijna lineair (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (figuur 2E).
Wij vehiculumcontrolegroep de voorkeuren van de temperatuur van de controle (w1118) larven op verschillende leeftijden. 1st (24 ± 1,5 h AEL), 2nd (48 ± 1,5 h AEL) en vroege-3rd larven (72 ± 1,5 h) toonde pieken in de 24 ° C-zone (figuur 3A, B). De temperatuur-voorkeuren gewijzigd tijdens 3rd instar larvale ontwikkeling. Het grootste percentage van medio-3rd instar (96 ± 1,5 h AEL) verzameld in de 18 ° C-zone (figuur 3A, B), en dit vooroordeel verhoogd met de leeftijd. Onder late-3rd instar-larven (vooraf klimmen; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50% geclusterd in de 18 ° C-zone, en de selectie van deze temperatuur was ~ 4-fold hoger dan de aangrenzende 20 ° C-zone (50,2%; zone 18 ° C 20 ° C-zone, 15,1%; Figuur 3A B). De neiging om te accumuleren in de zone van de 18 ° C in w1118 niet te wijten was een randeffect aangezien de laat-3rd instar larven nog opgebouwd in de zone van 18 ° C, met behulp van een bidirectionele temperatuurverloop tijdens (figuur 3E, F ).
We getest ook laat-3rd instar-larven (120 ± 1,5 h AEL) met mutaties in de genen nodig voor discriminerende temperatuurverschillen in het comfortabele bereik. Deze omvatten trpA1, die nodig is voor normale temperatuur selectie in de 18 ° C - 24 ° C bereik5,7,8. Larven met een null mutatie in trpA1 (trpA11) distribueren gelijkelijk over de gehele 18 ° C-28 ° C verloop (Figuur 3 c). Larven ontbreken gewoon de A en B isoforms (trpA1-ABG4), of de C en D isoforms (trpA1-CDG4) ook Toon ernstige waardeverminderingen (Figuur 3 c). Vliegen coderen twee isoforms van fosfolipase Cβ (PLC21C en NORPA) en mutaties op het gebied van norpA (norpAP24) maar niet plc21c (plc21cP319) ook verstoren accumulatie in het bereik van 18 ° C ( Figuur 3D).
Figuur 1. Toestellen voor het uitvoeren van de bepaling van de single-directionele temperatuurgradiënt. (A) een aluminium plaat gebruikt voor het analyseren van larvale thermotaxis gedrag testen. De 13 zwarte lijnen op de boven- en onderkant afbakening van 12 zones (elke 10 mm). De onderkant van de plaat is geanodiseerd met zwarte verf, zodat het is makkelijker om te visualiseren van de larven. (B) afmetingen van de aluminiumplaat (aangegeven in mm). De uiterlijke grootte van de aluminiumplaat is 140 x 100 x 9 mm. De binnenste omvang van de aluminiumplaat is 130 x 90 x 8 mm. De begrenzingen worden gescheiden door 10 mm. De eerste en laatste afbakening is 5 mm van de randen van het binnenste gedeelte van de plaat. (C) Top en zijaanzicht van één van de aluminium blokken gebruikt om de temperatuur van het verloop. Het blok heeft twee aansluitingen gebruikt om hechten aan silicium buizen, die op een waterbad aansluit. (D) afmetingen van een aluminium blok. De uiterlijke grootte van het aluminium blok is 255 x 50 x 14 mm. De diameter van het innerlijke water pad is 7 mm. Twee 30 mm-aansluitingen aan de linkerkant verbinden met silicium leidingen die zich tot het waterbad uitstrekt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Single en bidirectionele kleurovergang assay opstellingen. (A) Single-directionele kleurovergang opstelling met twee aluminium assay platen op twee aluminium blokken. De temperaturen van de aluminium blokken worden gecontroleerd door het circulerende water uit twee waterbaden. (B) de opstelling van de drie aluminium blokken, waterbaden en een aluminiumplaat (250 x 220 mm) voor een bidirectionele verloop. De linker en rechter blokken zijn verbonden met het zelfde waterbad en het middelste blok is verbonden met de andere waterbad. De aluminiumplaat van de bepaling is verpakt met tape aan de muur van een 10 mm te bevatten van de 1% agarose vormen. (C) posities om te controleren van de temperatuur (aangeduid met stippen) en larven op de plaat. Controleer voor het initiëren van een experiment, de temperatuur op twee punten binnen elke zone om te bevestigen dat de gewenste lineair verloop van de temperatuur is gevestigd. Larven zijn vrijgegeven binnen het aangegeven gebied in de buurt van de middellijn. De larven worden geteld binnen elk van de zones 2 cm. (D) posities om temperaturen (aangegeven door de puntjes) en de zones vrijlating voor de larven in een bidirectionele verloop te controleren. Een gelijk aantal larven worden vrijgegeven langs de middellijn van elke helft van het bidirectionele verloop. Het aantal larven worden meegeteld in elk van de 10 (2 cm) zones. Een standaardset van temperaturen (18 ° C - 26 ° C) op het oppervlak van het agarose wordt aangegeven. (E) temperaturen gemeten langs de randen en de midlines van elke zone in een monster single-directionele verloop. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde temperatuur ± SD. n = 8 assays (150 ± 50 larven/assay). Delen van dit cijfer worden gereproduceerd van Sokabe et al. 8 met lichte wijzigingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Representatieve resultaten met behulp van single-directionele en bidirectionele kleurovergang testen. (A, B) Gemiddelde percentages van de larven in 6 zones op het single-directionele verloop. Gegevens omvatten 3rd instar-larven op de aangegeven uren na ei leggen (AEL). n = 6-7. De foutbalken in een vertegenwoordigen ±SEM. (C) thermische distributies van het vooraf klimmen laat-3rd instar larven van controle (w1118) en trpA1 mutanten op het single-directionele verloop. n = 3-4. De foutbalken vertegenwoordigen ±SEM. (D) thermische distributies van de laat-3rd instar-larven van controle (w1118) en PLCβ mutanten op het single-directionele verloop. n = 4-6. De foutbalken vertegenwoordigen ±SEM. (E) vertegenwoordiger verdeling van vooraf klimmen, laat-3rd instar larven (w1118) op het bidirectionele verloop. De zones links en rechts assay zijn aangegeven door stippellijnen en gescheiden door de neen-graaf-zone in het midden (schaduwrijke regio). (F) Percentage van vooraf klimmen laat-3rd instar larven (w1118) in elke zone langs de thermische verloop. Larven werden geplaatst in links en rechts laat zones. De assay zones worden gescheiden door een 3 cm neen-graaf zone in het midden en de distributies zijn onafhankelijk berekend. De foutbalken vertegenwoordigen SEMs. n = 3 testen (200-400 larven/assay). Delen van dit cijfer worden gereproduceerd van Sokabe et al. 8 met lichte wijzigingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Uren AEL | Larvale stadium | |
| 24 | 1st instar | |
| 48 | 2nd instar | |
| 72 | Vroege-3rd instar | |
| 96 | Mid-3rd instar | |
| 120 | Laat-3rd instar, vlak voor het podium klimmen | |
Tabel 1. De relatie tussen de uren na ei leggen (AEL) en larvale stadia.
| Temperatuurverloop tijdens op agarose plaat (helling) | Temperaturen van waterbaden | Temperaturen van aluminium blokken |
| 10,0-25.0° C (1,5 ° C/cm) | ~6.5-7°C/~28.5°C | ~8.5°C/~26.8°C |
| 18,0-28.0° C (1° C/cm) | ~16.8°C/~31.0°C | ~17.8°C/~29.7°C |
| 14.0-34.0° C (2° C/cm) | ~10.0°C/~40.0°C | ~11.8°C/~36.8°C |
| 12,5-42.0° C (2,95 ° C/cm) | ~7.0°C/~55.0°C | ~9.4°C/~49.4°C |
Tabel 2. Typische temperatuurgradiënten en de bijbehorende temperatuur van het waterbaden en aluminium blokken voor één directionele verlopen.
| Temperatuurverloop tijdens op agarose plaat | Temperaturen van waterbaden | Temperaturen van aluminium blokken |
| 22-10-22 ° C (1,5 ° C/cm) | ~5.0°C /~25.0°C | ~7.5°C/~24.0°C |
| 26-18-26 ° C (1° C/cm) | ~15.8°C /~30.6°C | ~16.9°C/~28.4°C |
| 30-14-30 ° C (2° C/cm) | ~8.5°C /~36.4°C | ~10.9°C/~32.8°C |
| 36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm) | ~5.0°C /~47.2°C | ~7.9°C/~40.9°C |
Tabel 3. Typische temperatuurgradiënten en de bijbehorende temperatuur van het waterbaden en aluminium blokken voor bidirectionele verlopen.
| Larvale leeftijd (AEL) | Assay tijd (één richting) | Assay tijd (bidirectionele) |
| 24 h | 30 min | 35 min |
| 48 h | 22 min | 27 min |
| 72 h | 16 min | 21 min |
| 96 h | 13 min | 18 min |
| 120 h | 10 min | 15 min |
Tabel 4. Verschillende larvale leeftijden (AEL) en de bijbehorende assay-tijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om het welslagen van dit protocol, is het belangrijk maatregelen te nemen voor het verkrijgen van voldoende aantal larven uit te voeren van de experimenten. Deze omvatten vooraf voeden de vliegen in gist plakken-bevattende flesjes voor 2-3 d te verbeteren met het leggen van eieren. De flesjes moeten worden geplaatst in een lade met flesjes water en ingesloten in een doorzichtige plastic zak, die houdt het vocht van het levensmiddel en bevordert effectief voeden door de larven terwijl blootstelling aan normale licht-donker cycli toelaat. De gist plakken moet niet echter zo zacht dat het vliegen worden gevangen. Het aantal koeien per flacon is afhankelijk van het genotype. In het geval van w1118is het meestal voldoende ~ 12 vrouwtjes en mannetjes ~ 6 te leggen eieren voor 3u. Twee flesjes geven doorgaans genoeg larven (100-200 larven) te plaatsen op een plaat voor de single-directionele assay. Ingeval de vliegen voorraad minder dan wild-type eieren of het aantal larven die uitkomen is verminderd, voeg extra vrouwtjes (maximaal 30-35/injectieflacon) en mannetjes.
Er zijn veel oorzaken van onbedoelde variabiliteit bij het uitvoeren van deze tests. Het ontwikkelingsstadium is van invloed op de voorkeur van de temperatuur van de larven. Daarom is het noodzakelijk om zorgvuldig gebruik larven van een bepaald stadium. Om dit te doen, door larven te verzamelen over een smalle tijdsbestek (zoals 3 h). Aangezien het fokken omstandigheden (temperatuur, luchtvochtigheid, licht-donker cyclus en type van voedsel) en sommige mutaties van invloed zijn op het tempo van de ontwikkeling, vertrouw niet strikt op de keer nadat ei leggen om te analyseren relatief ouder larven. Het is ook belangrijk te onderzoeken van fysieke eigenschappen, zoals de grootte van de mond haken en spiracles7 om te bepalen of de larven van verschillende genotypen het dezelfde developmental stadium zijn. De tijden voor 1st, 2nd en 3rd instar-larven te ontwikkelen (tabel 1) zijn gebaseerd op het gebruik van maïsmeel gebaseerde voedsel en incubatie bij 25 ° C onder 12 h licht: 12 h donkere cycli. Larven groeien langzamer op melasse gebaseerde voedsel. Goede hydratatie en voeding versheid is ook van invloed op de groei van de larven. De hoeveelheid water in het voedsel moet het voedsel laten te droog te schillen terug uit de flacon noch te los als gevolg van buitensporige water. In het ideale geval de ~ 5 mm laag dichtstbijzijnde het oppervlak van het voedsel wordt geconditioneerd door de groeiende larven en beweegt gemakkelijk als de ampul schuin of getikt. Deze voorwaarde kan worden bereikt met behulp van vers bereide levensmiddelen met 50-100 larven.
Het is essentieel om een stabiel temperatuur verloop voor het begin van de test. Daarom zet het waterbad 1-2 h voorafgaand aan het opzetten van de bepaling, als de water baden warmte produceren en de omgevingstemperatuur van de kamer veranderen kunnen, die op hun beurt hebben de potentie om invloed op het verloop. Na 1-2 h equilibrates de omgevingstemperatuur van meest airconditioned kamers. Dit moet echter worden bepaald in elke omgeving. Bovendien, bij het genereren van een gradiënt met een groot temperatuurbereik (> 3,0 ° C/cm), het kan moeilijk zijn om een stabiel verloop te verkrijgen. Een kleine beweging van de assay plaat meer aanzienlijk verandert het temperatuurverloop tijdens wanneer het bereik groot is (b.v. > 3,0 ° C/cm). We vonden dat een 1-2 ° C/cm verloop de meest stabiele verlopen produceert.
Er zijn verschillende extra overwegingen die moeten worden gecontroleerd om te beperken van de variabiliteit in de thermotaxis testen. Wassen van de larven is van cruciaal belang, als de aanwezigheid van voedseldeeltjes of sacharose op de larven kan invloed hebben op de bepaling. De stappen wassen grondig moeten worden uitgevoerd, maar snel, omdat de beperking van hun zuurstoftoevoer overdreven terwijl ze worden ondergedompeld in water invloed kan zijn op hun gezondheid. Daarom raden we de cel zeef (optie 2) om de larven schoon te maken. Een zeef met een poriegrootte van 300 µm werkt goed voor de larven aan de vroege-3rd instar fase (72 h AEL) of ouder. Daarnaast is het belangrijk om uit te voeren van de experimenten op hetzelfde moment van de dag, zoals uit de Zeitgeber tijd (ZT) ZT4 tot ZT8 (ZT = 0 is wanneer de lichten zijn ingeschakeld), variabiliteit als gevolg van effecten van circadiane ritmen op temperatuur selectie beperken. Ook kan de hoeveelheid vocht op de plaat agarose variabiliteit veroorzaken in de resultaten. Terwijl het oppervlak van de platen vochtig moet, kon waterdruppels overlappen de larven, en daarom moeten worden vermeden.
Beperking van de variabiliteit in de testen zal het mogelijk maken te robuuste resultaten behalen zonder grote aantallen van onafhankelijke experimenten uit te voeren. 3-8 onafhankelijke experimenten zijn meestal voldoende voor een betrouwbaar resultaat. Juiste tabulation van de resultaten is ook cruciaal voor het succes van de thermotaxis tests. Tellen niet larven verdeeld in de regio's binnen 0,5 cm van de muren van aluminium, want de temperaturen niet lineaire in deze regio's zijn. Sommige larven zal worden geplaatst op de grens tussen de twee zones, op het moment dat de bepaling wordt gesloten. Als meer dan 50% van de lichaamslengte bevindt zich in een tijdzone bevindt, moet u dan de larve opgenomen in de tab voor die zone. Als een larve precies 50% in elk van twee zones is, dan tellen het dier als 0.5 larven in elke zone.
Terwijl de kleurovergang bepaling de larven toestaat te discrimineren allerlei temperatuurverschillen, zijn er beperkingen aan de laagste en de hoogste temperaturen die effectief kunnen worden getest. Het is niet haalbaar om te testen temperaturen < 10 ° C sinds de mobiliteit van de larven vermindert sterk bij lagere temperaturen. Hoewel verlopen met de bovenste temperatuur bereiken van 42 ° C kunnen worden vastgesteld, bijna geen controle larven blijven in elke zone > 28 ° C. Daarom continu verlopende testen kunnen niet worden gebruikt om te discrimineren temperatuur voorkeuren tussen verschillende zones > 28 ° C. Kleurovergang testen bij deze hogere temperaturen kunnen echter mogelijk worden gebruikt om mutanten karakteriseren als ze zeer warme temperatuur voorkeuren hebben verschoven.
Als een mutant een motorische defect is, het mogelijk moet uitvoering van aanvullende experimenten om ervoor te zorgen dat de voorkeur van de schijnbare temperatuur niet onjuist te wijten aan de waardevermindering van een beweging is. Om dit potentiële probleem te verhelpen, kan het nodig om langere assay tijden dat de dieren extra tijd om naar hun gewenste zones zijn. De bidirectionele kleurovergang bepaling kan ook worden gebruikt om te testen of de dieren Selecteer dezelfde gewenste zone, ongeacht waar zij aanvankelijk op de plaat worden gebracht.
Tot slot hebben de kleurovergang testen hier beschreven voordelen ten opzichte van andere thermotaxis testen. Terwijl twee richtingen keuze testen nuttig, zijn als ze kunnen robuuste resultaten opleveren, vooral wanneer de temperatuurverschillen tussen de twee zones groot zijn, zijn ze niet effectief in het onthullen van de ideale temperatuur de voorkeur van de larven in een enkele experiment. Vereist vele bilaterale keuze combinaties om te bepalen van de meest aangewezen temperatuur5,6,7uitvoeren om dit te doen. Daarentegen biedt de kleurovergang assay het dier een kans hun gewenste temperatuur om zone te selecteren in een omgeving met een enkele ononderbroken temperatuur landschap. Het is dus overbodig om te ontwikkelen een grote combinatie van twee richtingen keuzes bepalen de gewenste thermische omgeving. Bestuderen van de thermotaxis met behulp van een ronde petrischaal heeft gewerkt om te beoordelen van de effecten van temperatuur op de bewegende dynamiek van een larve10. Het is echter minder nuttig in het onderscheid tussen voorkeuren tussen verschillende temperaturen, aangezien elke zone een ander formaat is. Ten slotte te wijten aan de eenvoud van de bepaling, en het nut ervan in discriminerende kleine temperatuur voorkeuren in een enkele assay, kan het worden gebruikt om het scherm tientallen kandidaat-genen die mogelijk betrokken zijn bij de larvale temperatuur voorkeur die misschien anders worden over het hoofd gezien met behulp van andere testen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
C.M. wordt ondersteund door de financiering van de NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) en de NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
References
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
