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Neuroscience

Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de drosophile

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57963
Automatic Translation
*1, *2,3, 1
1Neuroscience Research Institute and Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Division of Cell Signaling, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Thermal Biology Group, Exploratory Research Center on Life and Living Systems, National Institutes of Natural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un protocole pour déterminer la température environnementale préférée des larves de drosophile à l’aide d’un gradient thermique continu.

Abstract

Beaucoup d’animaux, y compris la drosophile, Drosophila melanogaster, est capables de discriminant les plus infimes différences dans la température ambiante, ce qui leur permet de tenter de découvrir leur paysage thermique préféré. Pour définir les préférences de température des larves sur une plage linéaire définie, nous avons développé une méthode utilisant un gradient de température. Pour établir un gradient directionnel unique, deux blocs d’aluminium sont connectés à des bains d’eau indépendants, dont chacun contrôle la température des blocs individuels. Les deux blocs défini les limites inférieures et supérieures du dégradé. Le gradient de température est établi en plaçant une plaque en aluminium enduit de gel d’agarose sur les deux blocs d’eau contrôlé afin que la plaque couvre la distance entre eux. Les extrémités de la plaque d’aluminium qui est définie sur le dessus des blocs d’eau définit les températures minimales et maximales, et les régions entre les deux blocs forment un dégradé linéaire de la température. Le test de gradient peut être appliqué à des larves de différents âges et peut être utilisé pour identifier des mutants qui présentent des phénotypes, comme ceux présentant des mutations affectant les gènes codant pour des canaux TRP et opsines, qui sont nécessaires pour la discrimination de température.

Introduction

Thermotactisme est employé par des animaux mobiles pour sélectionner un environnement le plus favorable des conditions1,2,3. Si le climat est trop chaud ou froid, ce comportement est vital pour la survie. En outre, beaucoup d’animaux est sensibles aux très petites différences de température dans la gamme confortable et cherche un cadre avec une température idéale. Ceci est particulièrement important pour les organismes poïkilothermes tels que les mouches des fruits, qui équilibrer la température de leur corps avec l’environnement. Dosages pour surveiller les larve thermotactisme ont contribué à identifier et à clarifier les rôles de capteurs moléculaires comme Drosophila transitoire récepteurs potentiels (TRP) canaux4,5,6, rhodopsines7,8et ionotropiques récepteurs récepteurs (IRs)9, qui empreignent ces animaux avec des sensibilités de température sur différentes plages de températures.

Un test bilatéral choix fournit une approche pour étudier les préférences thermiques en larves6,7. Le test implique l’établissement de deux zones de températures distinctes et permet les animaux sélectionner un côté sur l’autre. Les résultats de tests à choix bidirectionnelle peuvent être robustes, surtout si les différences de température entre les deux options sont grandes. En outre, puisque chaque essai implique tabulating seulement deux groupes, les données peuvent être exprimées comme un indice simple de préférence. La facilité et la simplicité des tests de choix bidirectionnelle se prêtent également aux écrans de génétiques. Toutefois, une limitation majeure est que beaucoup d’expériences est tenus d’établir la température préférée des animaux sauvage ou mutants.

Un test de gradient offre la possibilité d’établir la température préférée en un seul essai8. De plus, contrairement à l’épreuve de choix bidirectionnelle, il permet l’évaluation de la distribution d’un groupe d’animaux, lorsqu’ils sont confrontés avec une gamme continue de températures. Un dosage dégradé utilise une boîte de Pétri et animaux et est bien adapté pour caractériser le comportement détaillé de chaque animal10. Toutefois, étant donné que les boîtes de Pétri sont ronds, les tailles des zones thermiques varient et sont progressivement plus petites selon la distance du centre. Par conséquent, cette configuration n’est pas idéale pour surveiller les sélections de température des populations d’animaux.

Un appareil de gradient thermique continu bien adaptée pour évaluer les préférences de température des groupes de larves emploie une arène rectangulaire et est décrite ici. L’appareil est simple à construire et à assembler. En outre, le gradient est linéaire et est flexible, car il peut être utilisé pour évaluer la thermotactisme plus grande température varie de 10 ° C à 42 ° C. Le test est rapide et simple à réaliser et donne des données reproductibles. En plus de signaler la température favorable des larves, il révèle les préférences de la population d’animaux sur un ensemble linéaire dans une expérience simple. En raison de ces avantages, c’est un excellent choix pour l’identification des gènes nécessaires à thermotactisme.

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Protocol

1. le matériel Fabrication et assemblage appareils pour essais de Gradient

  1. Fabriquer les plaques aluminium de dosage pour le dosage de gradient directionnel unique.
    1. Couper et broyer chaque plaque de dosage de l’aluminium (Figure 1 a) sur une seule pièce d’aluminium à l’aide d’une scie à ruban et sharp moulin vertical avec les dimensions suivantes : la taille extérieure est 140 x 100 x 9 mm et la taille intérieure est 130 x 90 x 8 mm (Figure 1 b). Anodisé à l’intérieur de chaque plaque de test avec une peinture noire pour le rendre plus facile à visualiser les larves et prévenir la rouille.
      NOTE : La Fabrication des plaques aluminium Dosage pour le gradient directionnel unique est faite par un atelier d’usinage. L’anodisation est effectuée par un fournisseur commercial.
    2. Marquer les jantes supérieures et inférieures de chaque plaque de test avec 13 démarcations, séparées de 10 mm à l’aide d’un marqueur permanent. Placez les premiers et le derniers démarcations 5 mm du bord intérieur des plaques assay (Figure 1 a, B).
  2. Pour fabriquer la plaque en aluminium de dosage pour le gradient bidirectionnel, découper une plaque en aluminium avec les dimensions suivantes à l’aide de cisailles à tôle : 250 x 220 x 2 mm. Anodize les plaques de dosage avec une peinture noire.
    NOTE : Fabrication des plaques d’aluminium Dosage pour les gradients bidirectionnelle est réalisée par un atelier d’usinage. L’anodisation est effectuée par un fournisseur commercial.
  3. Fabriquer les blocs d’aluminium.
    Remarque : Deux blocs sont nécessaires pour le gradient directionnel unique et trois blocs sont nécessaires pour le gradient bidirectionnel.
    1. Couper les blocs en aluminium (Figure 1) d’une seule pièce d’aluminium à l’aide d’une scie à ruban (dimensions de 50 x 255 x 14 mm) (Figure 1, D).
    2. Percer le canal d’eau à l’intérieur du bloc (7 mm de diamètre) à l’aide d’un broyeur vertical et rainures de fil dans les extrémités ouvertes sur un côté (Figure 1). Fermer les trous rainurés avec boulons et joint un ruban pour former un canal d’eau en forme de U (Figure 1, D).
      NOTE : La fabrication des blocs en aluminium de dosage est effectuée par un atelier d’usinage.
    3. Fixez le connecteur du bloc d’aluminium (Figure 1) avec filetages et thread seal tape à une extrémité. Insérer l’autre extrémité avec ardillons multiples (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" mur) de tuyau silicone.
  4. Obtenir deux bains circulants réfrigérés/chauffants.
  5. Assembler les blocs sous température contrôlée pour le système de dosage dégradé.
    1. Le gradient directionnel unique, chacun des deux blocs aluminium connectez à un bain d’eau distinctes afin que la température de chaque bloc est contrôlée par une circulation système (Figure 2 a) d’eau indépendant. Tube en silicone (ID 1/4" x 3/8" OD x 1/16" mur) permet de raccorder la sortie de l’eau du bain le connecteur sur le côté intérieur du bloc en aluminium (Figure 2 a). En outre, utiliser de tubes à raccorder le connecteur côté extérieur sur le bloc en aluminium à l’entrée de l’eau du bain.
    2. Le gradient bidirectionnel, placer deux des trois blocs sous la gauche et la droite de la plaque et liez-les à la baignoire d’eau même avec le tube (Figure 2 b). Connecter le troisième bloc en aluminium à un second bain d’eau et place sous le centre de la plaque (Figure 2 b).
      Remarque : Cet appareil et le dosage sont nécessaire uniquement si les larves s’accumulent dans la zone à un bord ou l’autre du gradient directionnel unique. Dans l’affirmative, il est important d’évaluer si oui ou non il y a un effet de bord. Pour vérifier cette possibilité, établir un gradient bidirectionnelle dans laquelle la température de la zone de bord préférée par les larves à l’aide du gradient directionnel unique (par exemple 18 ° C) est la température au milieu de la plaque du gradient bidirectionnel (Figure 3E , F).

2. larve synchronisation

  1. Nourrir les mouches à utiliser pour la ponte.
    1. Les granules de levure Mix et eau distillée avec un pilon pour faire levure pâte. Soigneusement broyé et remuer jusqu'à ce que la consistance de la pâte est similaire au beurre d’arachide. Éviter la pâte trop sèche, qui peut s’écailler lorsque vous transférez des mouches à flacons fraîches, ou mouiller la pâte, qui peut piéger les mouches.
    2. À l’aide d’un pilon, ajouter la pâte de levure près des murs intérieurs de flacons de Drosophila standards, juste au-dessus de la surface de l’aliment.
    3. Les femelles comte 12-35 et jusqu'à la moitié des mâles autant (mais pas plus de 10) sur un bloc de2 CO et ajouter les femelles et les mâles dans chaque flacon de pâte contenant des levures.
    4. Pour garder la mouche alimentaire avec de la levure-pâte humide, tandis que les mouches se nourrissent, combiner ces flacons dans un plateau qui contient jusqu'à 100 flacons avec 20 flacons ouverts contenant distillée seulement. Placez le plateau dans un sac en plastique transparent et sceller.
    5. Incuber le plateau dans une étuve à 25 ° C pendant 48 h afin que les femelles sont nourrissent convenablement, permettant ainsi à poser un grand nombre de œufs.
  2. Mettre en place les flacons pour la ponte.
    1. Transférer les mouches nourries dans nouveaux flacons de nourriture pour la collecte des œufs en tapant dessus au-dessus. Ne pas utiliser de CO2, qui peuvent causer les mouches à pondent moins d’oeufs sur la fenêtre suivante de peu de temps.
      Remarque : Flacons alimentaires Standard Drosophila sont utilisés sans pâte de levure pour la collecte des œufs.
    2. Laissez les mouches à pondre des œufs pendant 3 h à 25 ° C pour que tous les oeufs sont prélevés sur une fenêtre de temps relativement étroite.
      Remarque : Ceci permettra les larves à synchroniser au même stade du développement.
    3. Placer les flacons contenant les oeufs dans le bac contenant les flacons de l’eau et serrer le sac. Incuber à 25 ° C sous 12 h lumière : 12 h cycles sombres.
    4. Laissez reposer les larves pendant un nombre donné d’heures après que la ponte (AEL) selon le stade larvaire désirée.
      Remarque : Le tableau 1 donne une estimation de la relation entre les heures AEL et le stade larvaire, qui variera selon le stock de mouche, aliments utilisés, etc. la relation exacte entre AEL et stade de développement doit être la température d’élevage vérifié par chaque chercheur à l’aide de critères physiques, tels que la morphologie de la bouche de crochets et stigmates11.

3. installation de Gradient de température

  1. Préparer le gradient directionnel unique
    1. Pour créer un environnement ambiant humide pendant les essais, placez les deux blocs d’aluminium reliés à deux bains d’eau sur des essuie-tout humide, séparés par 10 cm (Figure 2 a).
    2. Allumez les deux bains d’eau ~ 2 h avant de commencer le test afin de permettre suffisamment de temps pour que la température des blocs d’aluminium s’équilibrer.
      Remarque : Il est recommandé de réaliser une expérience de simulation pour déterminer la température de chaque bain d’eau qui est nécessaire pour obtenir le gradient de température linéaire souhaité. Quelques paires de température typique pour définir les bains-marie sont répertoriés dans le tableau 2. Toutefois, Notez que les températures de surface sont affectées par la température ambiante. La longueur de tube aussi affecte les températures étant donné qu’il est le refroidissement dans les tubes. La longueur de la tubulure dans notre programme d’installation est de 1,5 m.
    3. 100 mL d’agarose à 1 % lors du réglage de forte puissance dans un rond large-bouche bouteille de 500 mL de micro-ondes et verser 25 mL/plaque sur une table de travail niveau de dosage. Préparer deux plaques d’essai, qui peuvent être placés sur des blocs d’aluminium en même temps (Figure 2 a).
    4. Après que l’agarose a solidifié (10-20 min), frottez doucement chaque surface d’agarose avec une éponge de cuisine standard ou une éponge de mélamine pour rendre la surface d’agarose légèrement grossier, afin qu’en pulvérisant l’eau sur le gel d’agarose, créera une membrane mince lisse de l’eau, et aucun des gouttelettes d’eau ne seront forme.
    5. Complètement immerger les plaques dans un récipient avec de l’eau distillée jusqu'à ce que le test est prêt à être exécuté pour empêcher que les plaques se desséchée.
  2. Préparer un dégradé bidirectionnel (facultatif)
    1. Pour créer un environnement ambiant humide pendant les essais, placer des blocs d’aluminium trois espacées de 8 cm (Figure 2 b) sur un essuie-tout humide.
    2. Allumez les deux bains d’eau ~ 2 h avant de commencer le test afin de permettre suffisamment de temps pour que la température des blocs d’aluminium s’équilibrer.
      Remarque : Il est recommandé de réaliser une expérience de simulation pour déterminer la température de chaque bain d’eau pour le gradient bidirectionnel. Quelques paires de température typique pour définir les bains-marie sont répertoriés dans le tableau 3. Toutefois, Notez que les températures de surface sont affectées par la température ambiante. La longueur de tube aussi affecte les températures étant donné qu’il est le refroidissement dans les tubes. La longueur de la tubulure dans notre programme d’installation est de 1,5 m.
    3. Pour éviter que l’agarose répandre hors de la plaque, envelopper les bords de la plaque en aluminium avec étiquetage des bandes pour former un mur 10 de mm de hauteur (Figure 2 b).
    4. En utilisant le réglage haute puissance, micro-ondes 200 mL d’agarose à 1 % dans un 500 mL bouteille de large-bouche ronde et verser 120 mL sur une plaque de test.
    5. Après que l’agarose a solidifié (~ 30 min), frottez doucement chaque surface d’agarose avec une éponge de cuisine standard ou une eponge de mélamine pour former la surface d’agarose légèrement grossier, afin qu’en pulvérisant l’eau sur le gel d’agarose, une membrane mince lisse de l’eau est créée et aucun forme de gouttelettes d’eau.
    6. Complètement immerger les plaques d’essai dans un récipient avec de l’eau distillée jusqu'à ce que le test est prêt à effectuer pour les empêcher de se dessécher.
  3. Mettre en place le gradient directionnel unique
    1. Préparer des réactifs et des éléments sur un banc à côté de l’appareil de dosage dégradé (voir la Table des matières).
    2. Pour promouvoir le transfert de température efficace, combler les lacunes entre les blocs d’aluminium et les plaques de dosage par pulvérisation d’eau à l’interface entre les blocs et la plaque.
    3. L’utilisation de gants, enlever les plaques de dosage de la cuve d’eau. Si l’eau envahit entre le gel d’agarose et la plaque et provoque des bosses pour former à la surface, enlever l’eau avec une micropipette P1000.
    4. Placer les plaques de dosage sur les blocs d’aluminium afin que les démarcations qui mesurent 2 cm de chaque bord exactement correspondant les bords des blocs d’aluminium (Figure 2 a, C).
    5. Pulvériser de l’eau sur la surface de la plaque (une membrane mince de l’eau recouvrant la surface du gel d’agarose est suffisante) pour empêcher le gel d’agarose de se dessécher. S’assurer que la membrane de l’eau est continu et gratuit de gouttelettes d’eau car les larves peuvent se retrouvent piégés dans les gouttelettes d’eau.
    6. Couvrir le système de gradient avec une boîte en carton pour réduire l’évaporation de l’eau et contribuer à stabiliser la température de la surface du gel. Attendre 5-10 min permettre à la température de s’équilibrer.
    7. Vérifier la température de surface à 12 points sur la plaque (Figure 2). Prendre deux mesures au sein de chaque zone pour établir si oui ou non il y a la variabilité au sein d’une zone. Assurez-vous que la température à deux endroits est de ± 0,2 ° C de la température désirée.
      Remarque : La variabilité au sein d’une zone se produit généralement parce que les distances exactes des deux taches au bord des blocs d’aluminium ne sont pas identiques. Ajustez la position de la plaque sur les blocs d’aluminium pour s’assurer que les démarcations qui mesurent 2 cm de chaque bord exactement correspondant les bords des blocs en aluminium.
    8. Si le gradient de température mesuré s’écarte de la pente désirée, augmenter ou diminuer les paramètres de température de bain l’eau et vérifier à nouveau la température à la surface après que la température de l’eau salles de bain stabilize(s).
    9. Couvrir le système de gradient avec une boîte en carton avant de commencer l’essai.
  4. Mis en place le gradient bidirectionnel (facultatif)
    1. Préparer des réactifs et des éléments sur un banc à côté de l’appareil de dosage dégradé (voir la Table des matières).
    2. Projections d’eau sur les surfaces des trois blocs aluminium pour promouvoir le transfert de température efficace des blocs d’aluminium sur la plaque d’essai de combler les lacunes entre les surfaces.
    3. Enlever les plaques de dosage soigneusement depuis le réservoir d’eau et placer sur les blocs d’aluminium. Si l’eau envahit entre le gel d’agarose et la plaque, ce qui pourrait causer des bosses pour former sur la surface, enlever l’eau avec une micropipette P1000.
    4. Placer la plaque de test sur les blocs d’aluminium afin que les médianes des zones premiers et le derniers de chaque bord correspondent exactement les bords des blocs aluminium bilatéral (Figure 2 b, D).
    5. Pulvériser de l’eau sur la surface de la plaque (une membrane mince de l’eau recouvrant la surface du gel d’agarose est suffisante) pour empêcher le gel d’agarose de se dessécher. S’assurer que la membrane de l’eau est continu et gratuit de gouttelettes d’eau, car les larves peuvent se retrouvent piégés dans les gouttelettes d’eau.
    6. Couvrir le système de gradient avec une boîte en carton pour réduire l’évaporation de l’eau et contribuer à stabiliser la température de la surface du gel. Attendre 5-10 min pour permettre à la température de s’équilibrer.
    7. Vérifier la température de surface à deux points le long de la ligne médiane de chacune des 10 zones (Figure 2D). Prendre deux mesures au sein de chaque zone pour établir si oui ou non il y a la variabilité au sein d’une zone. Assurez-vous que la température à deux endroits est de ± 0,2 ° C de la température désirée.
      Remarque : La variabilité au sein d’une zone se produit généralement parce que les distances exactes des deux taches au bord des blocs d’aluminium ne sont pas identiques. Ajustez la position de la plaque sur les blocs d’aluminium pour s’assurer que les médianes des zones Prénom le plus proche de chaque bord coïncider exactement avec les bords des blocs aluminium deux côté.
    8. Si le gradient de température mesuré s’écarte de la pente désirée, ajustez les paramètres de température de bain l’eau et vérifier à nouveau la température à la surface après que la température de l’eau salles de bain stabilize(s).
    9. Couvrir les blocs avec une boîte en carton jusqu’au début de l’essai.

4. lavage et Collection larvaire

  1. Isoler les larves propres (option 1)
    1. Ajouter environ 40 mL de solution de saccharose 18 % à un tube 50 mL. Ramasser toutes les larves de la vial(s) de nourriture avec une scoopula et le transfert à la solution de saccharose de 18 %.
    2. Mélanger soigneusement mais délicatement à l’aide d’un scoopula pour séparer les débris de nourriture des larves. Attendez 30-60 s jusqu'à ce que le flotteur de larves à la couche supérieure du tube. Verser la couche supérieure contenant les larves (~ 10 mL) à un autre tube de 50 mL et remplir le tube avec la nouvelle solution de saccharose de 18 %. Attendez 30-60 s jusqu'à ce que le flotteur de larves à la couche supérieure à nouveau.
      NOTE : Grosses particules alimentaires parfois transfert ainsi que les larves et peuvent affecter la thermotactisme larvaire si ils ne sont pas supprimés. Si les grosses particules alimentaires restent dans la couche supérieure, répétez les étapes 4.1.1-4.1.2, ou les supprimer manuellement à l’aide d’un scoopula.
    3. Transférer la couche supérieure de larves (~ 10 mL) dans deux autres tubes de 50 mL et remplir les deux tubes avec de l’eau distillée pour réduire la concentration de saccharose, afin que les larves sombrer rapidement dans l’eau. Attendez 30-60 s jusqu'à ce que les larves se déposent au fond. Effectuer ceci et les étapes suivantes dès que possible afin d’empêcher les larves de la noyade.
    4. Jeter autant d’eau que possible en inclinant doucement les tubes. Combiner les larves dans un tube en déversant les larves avec l’eau restante et remplir le tube de l’eau distillée.
    5. Attendez 30-60 s jusqu'à ce que toutes les larves s’enfoncer et retirer autant d’eau que possible en inclinant doucement les tubes. Répétez cette étape de lavage 2 à 4 fois à entièrement supprimer saccharose et toute nourriture visible.
    6. Jeter autant d’eau que possible et transférer les larves dans un vide 35 mm boîte de Pétri par décantation. Pulvériser le tube avec de l’eau et utiliser un petit pinceau pour aider le transfert les larves.
    7. Retirer l’eau en excès de la boîte de Pétri à l’aide d’une micropipette P1000. Laissez ~0.5 mL d’eau pour prévenir la déshydratation des larves.
    8. Placez le couvercle sur le plat pour éviter les larves de s’échapper. Faites pivoter le couvercle à l’envers afin de réduire la capacité des larves de s’échapper par le petit espace entre le couvercle et le plat. Laisser les larves de récupérer pendant 10-20 min.
  2. Isoler les larves propres (option 2)
    Remarque : Cette méthode alternative pour le nettoyage des larves atténue la possibilité d’étouffer les larves au cours de la procédure de nettoyage. Pour utiliser cette méthode, procédez comme suit après avoir effectué les 4.1.1-4.1.2 étapes ci-dessus.
    1. Placez une passoire de cellule (300 µm, conserve les larves 72 h AEL ou plus) au sommet d’un tube de 50 mL.
    2. Après avoir confirmé qu’il n’y a aucun corps adultes ou les débris de nourriture flottant à la surface de la solution de saccharose, verser la couche supérieure contenant les larves à travers le tamis pour piéger tous les larves sur le grillage. Laver les larves avec de l’eau distillée jusqu'à ce que le tube de 50 mL est rempli.
    3. Retirer la crépine de la cellule avec des larves et dispose de l’eau usée du tube. Placer le filtre contenant les larves sur le dessus du tube vide et laver les larves à nouveau avec de l’eau distillée jusqu'à ce que le tube de 50 mL est rempli.
    4. Retournez la crépine à l’envers un vide 35 mm boîte de Pétri et vaporiser de l’eau du dessus de la crépine de la cellule de transférer les larves à la boîte de Pétri. Transférer les larves restantes à l’aide d’un petit pinceau.
    5. Passez à l’étape 4.1.7 ci-dessus avant de passer à l’étape 5.

5. analyse et calcul

  1. Retirez la boîte en carton et vérifiez la température de surface de gel immédiatement avant de transférer les larves à la plaque. Réduire au minimum le temps que le carton est ouvert afin d’éviter de perturber l’équilibre de la température. Si la surface est sèche, vaporisez un peu d’eau sur la surface.
  2. Distribuer 150 ± 50 larves près du centre de chaque assiette (entre les zones 3 et 4 sur les 6 zones) pour le gradient directionnel unique (zone de dégagement ; La figure 2).
    Remarque : Pour le gradient bidirectionnel, distribuer 200-400 larves le long de la zone médiane de chaque moitié (Figure 2D).
  3. Placez un couvercle de microplaque sur chaque plaque de test pour éviter les larves rampant sur. Couvrir l’installation avec une boîte en carton pour éviter l’exposition à la lumière, susceptible d’influer sur les choix larve sur le gel d’agarose.
    Remarque : Pour le gradient bidirectionnel, devrait serait-il pas nécessaire couvrir la plaque avec un couvercle, car la plaque est plus grande, et la température préférée des larves est dans la zone médiane. Par conséquent, peu de larves s’accumulent sur les bords et ont la possibilité de ramper.
  4. Permettre le dosage de procéder pendant 10-30 min pour le gradient directionnel unique et pour les 15-35 min pour le gradient bidirectionnelle, selon l’âge des larves (tableau 4).
  5. Enlever le carton et le couvercle de la microplaque. Photographier les plaques par dessus à l’aide d’un appareil photo numérique. Prendre deux photos de chaque plaque de test afin que l’enquêteur puisse choisir celui avec meilleur contraste et luminosité pour analyse.
  6. Supprimer tous les larves sur les plaques d’essai et n’importe où à l’extérieur les plaques par aspiration.
  7. Nettoyer les plaques d’essai, les tubes et la crépine de la cellule avec de l’eau distillée. Réutiliser les plaques de dosage établis ce jour-là, à moins que la surface de l’agarose est endommagée.
  8. Calculer la répartition en pourcentage des larves dans chaque zone.
    1. Ouvrez l’image photographique des résultats de titrage à l’aide d’un logiciel qui permet d’ajouter des repères à l’image. Pour indiquer les zones de test, tracer des lignes verticales tous les 2 cm basée sur le tracé sur la plaque de test.
    2. Compter le nombre de larves dans chaque zone et enregistrer les numéros. Ne comptez pas les larves dans les régions de 0,5 cm d’un mur. Le gel est plus épais près des murs, et les températures de surface ne sont pas linéaires dans ces régions.
    3. Le gradient directionnel unique, calculer la répartition en pourcentage dans chaque zone comme suit :
      (le nombre de larves dans une zone déterminée de 2 cm) / (nombre total de larves dans 6 zones) x 100.
    4. Le gradient bidirectionnel, calculer la répartition en pourcentage dans chaque zone comme suit :
      (le nombre de larves dans une zone déterminée de 2 cm) / (nombre total de larves en 5 zones de chaque côté du gradient) x 100.

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Representative Results

Afin d’établir une unique bidirectionnel de 18 ° C à 28 ° C dégradé, nous avons mis les températures des deux bains d’eau de 16,8 ° C et 31 ° C. On obtient les températures à 13 points en mesurant la température à 26 postes dans les parties supérieures et inférieures de 6 toutes les zones, les lignes de frontière entre les zones et les extrémités de la surface du gel d’agarose (Figure 2, 2E). La distribution de la température le long du gradient est presque linéaire (Y = X + 0.9672 * 16,19, R2 = 0.9961) (Figure 2E).

Nous avons analysé les préférences de température des larves de contrôle (w1118) à divers âges. 1st (24 ± 1,5 h AEL), 2nd (48 ± 1,5 h AEL) et les larves au début-3rd (72 ± 1,5 h) montré des pics dans la zone de 24 ° C (Figure 3 a, B). Les préférences de température a changé au cours de la 3rd instar larvaire. Pourcentage le plus élevé du milieu-3rd instar (96 ± 1,5 h AEL) accumulés dans la zone de 18 ° C (Figure 3 a, B), et ce biais augmente avec l’âge. Chez les larves de stade tardif-3rd (pré escalade ; 120 ± 1,5 h AEL), environ 50 % concentrées dans la zone de 18 ° C, et la sélection de cette température était ~ 4 fois supérieur à la zone adjacente de 20 ° C (18 ° C zone, 50,2 % ; zone de 20 ° C, 15,1 % ; Figure 3 a B). La propension à s’accumuler dans la zone de 18 ° C en w1118 n’était pas due à un effet de bord depuis la fin-3rd stade larvaire encore accumulés dans la zone de 18 ° C, les larves à l’aide d’un gradient de température bidirectionnel (Figure 3E, F ).

Nous avons aussi testé fin-3rd stade larvaire (120 ± 1,5 h AEL) présentant des mutations dans les gènes nécessaires pour discriminant écarts de température dans la gamme confortable. Il s’agit d' trpA1, qui est requis pour la sélection de la température normale dans le 18 ° C à 24 ° C plage5,7,8. Larves avec une mutation nulle en trpA1 (trpA11) répartissent également sur l’ensemble de 18 ° C, 28 ° C gradient (Figure 3). Manque juste les A et B isoformes (trpA1-ABG4), ou les isoformes de C et D (trpA1-CDG4) également les larves montrent une déficience sévère (Figure 3). Mouches codent deux isoformes de la phospholipase Cβ (PLC21C et NORPA) et mutations affectant norpA (norpAP24) mais pas plc21c (plc21cP319) également perturbent l’accumulation dans l’intervalle de 18 ° C ( Figure 3D).

Figure 1
Figure 1. Appareil permettant d’effectuer le test de gradient de température unique bidirectionnel. (A) d’aluminium plaque utilisé pour analyser le comportement des larves thermotactisme d’essai. Les 13 lignes noires en haut et en bas délimitent 12 zones (10 mm). La partie inférieure de la plaque est anodisée avec une peinture noire pour qu’il soit plus facile de visualiser les larves. (B) Dimensions de la plaque d’aluminium (indiqué en mm). La taille extérieure de la plaque d’aluminium est 140 x 100 x 9 mm. La taille intérieure de la plaque d’aluminium est 130 x 90 x 8 mm. Les délimitations sont séparées par 10 mm. La délimitation de la première et la dernière est de 5 mm sur les bords de la partie intérieure de la plaque. (C) haut et vue de côté de l’un des blocs d’aluminium utilisé pour contrôler la température du dégradé. Le bloc dispose de deux connecteurs utilisés pour attacher aux tubes de silicium, qui se connectent à un bain d’eau. (D) Dimensions d’un bloc d’aluminium. La taille extérieure du bloc en aluminium est 255 x 50 x 14 mm. Le diamètre de la voie d’eau intérieure est de 7 mm. Deux connecteurs de 30 mm sur la gauche se connecter avec la tuyauterie de silicone qui s’étend à l’eau du bain. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Configurations de test dégradé simple et bidirectionnel. (A) installation gradient directionnel unique avec deux plaques d’aluminium Dosage sur deux blocs d’aluminium. Les températures des blocs d’aluminium sont contrôlés par circulation d’eau de deux bains d’eau. (B) l’arrangement des trois blocs d’aluminium, des bains d’eau et une plaque en aluminium (250 x 220 mm) pour un gradient bidirectionnel. Les blocs de gauche et de droite sont reliés à l’eau du bain même et le bloc central est relié aux autre l’eau du bain. La plaque de test en aluminium est enveloppée avec du ruban adhésif pour former un mur de 10 mm pour contenir l’agarose à 1 %. (C) Positions pour vérifier la température (indiqués par des points) et libérer des larves sur la plaque. Avant de commencer une expérience, vérifiez la température à deux points dans chaque zone pour confirmer que le gradient de température linéaire désiré est établi. Les larves sont libérées dans le secteur indiqué près de la ligne médiane. Les larves sont comptés au sein de chacune des zones de 2 cm. (D) des postes pour vérifier les températures (indiquées par des points) et les zones de dégagement pour les larves sur un gradient bidirectionnel. Un nombre égal de larves est libéré le long de la ligne médiane de chaque moitié du gradient bidirectionnel. Le nombre de larves est compté dans chacune des 10 (2 cm) zones. Un ensemble typique de températures (18 ° C à 26 ° C) sur la surface du gel d’agarose est indiqué. (E) les températures mesurées le long des lignes de bordure et médianes de chaque zone dans un gradient de single-directional échantillon. Les données représentent les températures moyennes ± SD. n = 8 essais (150 ± 50 larves/test). Certaines parties de ce chiffre sont tirés de Sokabe et al. 8 avec de légères modifications. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Les résultats représentatifs à l’aide de dosages gradients single unidirectionnel et bidirectionnel. (A, B) Pourcentages moyens de larves dans 6 zones sur le gradient directionnel unique. Données comprennent 3rd stade larvaire aux heures indiquées après la ponte (AEL). n = 6-7. Les barres d’erreur dans un représentent ±ét. (C) thermique distributions de l’escalade avant fin-3rd instar des larves de trpA1 mutants du gradient directionnel unique et de contrôle (w1118). n = 3-4. Les barres d’erreur représentent ±ét. (D) distributions thermique de la fin-3rd stade larvaire de la PLCβ mutants du gradient directionnel unique et de contrôle (w1118). n = 4-6. Les barres d’erreur représentent ±ét. (E) répartition représentative de pré escalade, fin-3rd stade larvaire (w1118) sur le gradient bidirectionnel. Les zones de test gauche et droite sont indiquées par des lignes pointillées et séparées par la zone non-comte dans le Centre (région ombrée). (F) pourcentage d’escalade avant fin-3rd instar des larves (w1118) dans chaque zone le long du gradient thermique. Les larves ont été placés à la gauche et le droit de sortie des zones. Les zones de test sont séparées par une zone de non-comte de 3 cm dans le centre et les distributions sont calculées indépendamment. Les barres d’erreur représentent SEMs. n = 3 épreuves (200-400 larves/test). Certaines parties de ce chiffre sont tirés de Sokabe et al. 8 avec de légères modifications. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Heures AEL Stade larvaire
24 1 stade dest
48 2ème stade larvaire
72 Stade précoce-3rd
96 Stade de milieu-3rd
120 Fin-3rd stade, juste avant le stade d’escalade

Le tableau 1. La relation entre les heures qui suivent la ponte (AEL) et les stades larvaires.

Gradient de température sur la plaque de gel d’agarose (pente) Températures des bains d’eau Températures de blocs en aluminium
10.0-25,0 ° C (1,5 ° C/cm) ~6.5-7°C/~28.5°C ~8.5°C/~26.8°C
18.0-28.0° C (1° C/cm) ~16.8°C/~31.0°C ~17.8°C/~29.7°C
14,0-34.0° C (2° C/cm) ~10.0°C/~40.0°C ~11.8°C/~36.8°C
12.5-42,0 ° C (2,95 ° C/cm) ~7.0°C/~55.0°C ~9.4°C/~49.4°C

Le tableau 2. Typique des gradients de température et les températures correspondantes des bains-marie et blocs d’aluminium pour les gradients directionnels unique.

Gradient de température sur la plaque de gel d’agarose Températures des bains d’eau Températures de blocs en aluminium
22/10/22 ° C (1,5 ° C/cm) ~5.0°C /~25.0°C ~7.5°C/~24.0°C
26-18-26 ° C (1° C/cm) ~15.8°C /~30.6°C ~16.9°C/~28.4°C
30-14-30 ° C (2° C/cm) ~8.5°C /~36.4°C ~10.9°C/~32.8°C
36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm) ~5.0°C /~47.2°C ~7.9°C/~40.9°C

Tableau 3. Typique des gradients de température et les températures correspondantes des bains-marie et blocs d’aluminium de gradients bidirectionnel.

Âge larvaire (AEL) Temps de test (sens unique) Temps de test (bidirectionnel)
24h 30 min 35 min
48 h 22 min 27 min
72 h 16 min 21 min
96 h 13 min 18 min
120 h 10 min 15 min

Tableau 4. Différents âges larvaires (AEL) et les temps de dosage correspondante.

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Discussion

Pour assurer le succès de ce protocole, il est important de prendre des mesures pour obtenir un nombre suffisant de larves à réaliser les expériences. Il s’agit d’alimentation avant les mouches en flacons pâte contenant de la levure pendant 2-3 jours afin d’améliorer la ponte. Les flacons doivent être placés dans un bac contenant des flacons d’eau et enfermé dans un sac en plastique transparent, qui maintient l’humidité de l’aliment et favorise les efficaces les larves tout en permettant une exposition à des cycles normaux de clair-obscur. Cependant, la pâte de levure ne devrait pas être si douce que les mouches sont coincer. Le nombre de femelles par flacon dépend du génotype. Dans le cas de w1118, il est habituellement suffisant lui permettant de ~ 12 femelles et mâles ~ 6 à pondre des œufs pendant 3 h. Deux flacons fournissent généralement assez larves (100-200 larves) placés sur un plateau pour le dosage de single-directionnelle. Si le stock mouche Pond moins d’oeufs que sauvage ou la proportion de larves qui éclosent est réduite, ajouter des mâles et des femelles supplémentaires (jusqu'à 30-35/flacon).

Il y a beaucoup de causes de variabilité inattenduse lors de l’exécution de ces tests. Le stade de développement affecte la préférence de température des larves. Par conséquent, il est impératif d’utiliser avec précaution les larves d’une étape définie. Pour ce faire, recueillir des larves sur un laps de temps restreint (par exemple 3 h). Étant donné que l’élevage des conditions (température, humidité, cycle lumière-obscurité et type d’aliment) et certaines mutations affectent le taux de développement, ne comptez pas strictement l’heure après que la ponte pour analyser comparable âgés de larves. Il est également important d’examiner les traits physiques, tels que la taille de la bouche crochets et stigmates7 pour déterminer si des larves de différents génotypes sont au même stade du développement. Les temps pour 1st, 2ème et 3rd stade larvaire à développer (tableau 1) reposent sur l’utilisation des aliments à base de farine de maïs et incubation à 25 ° C sous 12 h lumière : 12 h cycles sombres. Les larves croissent plus lentement sur les aliments à base de mélasse. Bonne fraîcheur hydratation et nourriture affecte également la croissance des larves. La quantité d’eau dans l’aliment devrait laisser la nourriture trop sèche à éplucher de la fiole, ni trop lâche en raison de l’excès d’eau. Idéalement, la couche de ~ 5 mm le plus proche de la surface des aliments est conditionnée par les larves de plus en plus et se déplace facilement lorsque le flacon est incliné ou taraudé. Cette condition peut être réalisée à l’aide des aliments fraîchement préparés avec des larves de 50-100.

Il est essentiel d’établir un gradient de température stable avant de mettre. Par conséquent, allumez le bain d’eau 1-2 h avant d’entamer l’analyse, que les bains d’eau produisant de la chaleur et peuvent changer la température ambiante, qui ont à leur tour susceptibles de toucher le gradient. Après 1-2 h, la température ambiante de plus climatisées s’équilibre. Toutefois, cela doit être déterminé dans chaque environnement. En outre, lors de la génération d’un dégradé avec une plage de température importante (> 3,0 ° C/cm), il peut être difficile d’obtenir un gradient de stable. Un petit mouvement de la plaque de test plus sensiblement modifie le gradient de température lorsque la plage est grande (par exemple > 3,0 ° C/cm). Nous avons constaté qu’une pente de 1 à 2 ° C/cm produit des gradients plus stables.

Il y a plusieurs considérations supplémentaires qui doivent être contrôlés afin de limiter la variabilité dans les essais thermotactisme. Les larves de lavage est essentiel, car la présence de particules d’aliments ou saccharose sur les larves peut influer sur le test. Les étapes de lavage doivent être effectuées soigneusement mais rapidement, parce que restreindre leur alimentation en oxygène trop alors qu’ils sont immergés dans l’eau peut-être affecter leur santé. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser le filtre de la cellule (option 2) pour nettoyer les larves. Une passoire avec une taille de pore de 300 µm fonctionne bien pour les larves à la petite-3rd stade stade (72 h AEL) ou plus. En outre, il est important d’effectuer des expériences à la fois de la journée, comme Zeitgeber fois (ZT) ZT4 à ZT8 (ZT = 0 est lorsque les lumières sont allumées), à limiter la variabilité due à l’impact des rythmes circadiens sur sélection de la température. Le niveau d’humidité sur la plaque de gel d’agarose peut également causer la variabilité dans les résultats. Alors que la surface des plaques doit être humide, les gouttelettes d’eau pourraient piéger les larves et doivent donc être évitées.

Limiter la variabilité dans les essais permettra d’obtenir des résultats robustes sans effectuer un grand nombre d’expériences indépendantes. 3-8 expériences indépendantes sont habituellement suffisants pour obtenir un résultat fiable. Bonne mise en tableaux des résultats est également critique pour le succès des essais thermotactisme. Ne comptez pas les larves distribuées dans les régions au sein de 0,5 cm des parois en aluminium, étant donné que les températures ne sont pas linéaires dans ces régions. Certaines larves seront positionnés à la frontière entre les deux zones, au moment de que la conclusion de l’essai. Si plus de 50 % de la longueur du corps se trouve dans une zone, incorporez ensuite la larve de la tabulation pour cette zone. Si une larve est précisément de 50 % dans chacune des deux zones, puis compter l’animal sous forme de larves 0,5 dans chaque zone.

Alors que le test de gradient permet les larves de discriminer un éventail de différences de température, il y a des limites aux températures inférieures et supérieures qui peuvent être testés de manière efficace. Il n’est pas possible de tester les températures < 10 ° C depuis la mobilité des larves diminue grandement aux basses températures. Bien que des gradients avec la température supérieure à 42 ° C peuvent être établies, presque aucune larve de contrôle ne rester dans n’importe quelle zone > 28 ° C. Par conséquent, dosages gradients continus ne peuvent servir à distinguer les préférences de température entre les différentes zones > 28 ° C. Cependant, les dosages dégradés à ces températures élevées susceptibles de servir pour caractériser des mutants, si elles ont changé très préférences de température chaude.

Si un mutant a un défaut locomotrice, il peut être nécessaire d’effectuer des expériences supplémentaires pour s’assurer que la préférence de température apparente n’est pas inexacte en raison d’un trouble de la circulation. Pour remédier à ce problème potentiel, il peut être nécessaire d’établir des délais plus longs de dosage pour permettre le temps supplémentaire d’animaux vers les zones souhaitées. Le dosage de gradient bidirectionnelle peut aussi servir pour vérifier si les animaux sélectionnez un fuseau privilégié même, peu importe où ils sont placés au départ sur la plaque.

En conclusion, les dosages gradients décrits ici ont avantages par rapport aux autres épreuves thermotactisme. Tandis que choix bidirectionnelle dosages sont utiles, car ils peuvent donner des résultats robustes, surtout lorsque les différences de température entre les deux zones sont grands, ils ne sont pas efficaces en révélant la température idéale, préférée par les larves dans une seule expérience. Pour ce faire nécessite effectuant de nombreuses combinaisons de choix bidirectionnelles pour déterminer le plus préféré température5,6,7. En revanche, l’analyse de gradient permet l’animal pour choisir leur zone de température préférée dans un environnement avec un paysage unique continue de la température. Ainsi, il est inutile de concevoir une grande combinaison de choix bidirectionnelles pour déterminer l’environnement thermique préféré. Étudier à l’aide d’un plat rond de Petri de thermotactisme a été employé pour évaluer les effets de la température sur la dynamique de mouvement d’une larve10. Toutefois, il est moins utile pour distinguer les préférences entre les différentes températures, chaque zone étant une taille différente. Enfin, en raison de la simplicité de son utilité dans les préférences de température petit discriminant en un seul essai et le dosage, il peut être utilisé à l’écran des dizaines de gènes candidats qui sont potentiellement impliqués dans les préférences de larves de température qui pourraient dans le cas contraire être négligé à l’aide d’autres dosages

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

C.M. est financé par l’IEN (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) et le NIAID (1DP1AI124453).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

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References

  1. Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
  2. Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
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  6. Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
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Neurosciences numéro 136 drosophile larves thermotactisme gradient de température comportement somatosensation
Un dosage de Gradient de température pour déterminer les préférences thermiques de larves de <em>drosophile</em>
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Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A… More

Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

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