Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57963
Automatic Translation
*1, *2,3, 1
1Neuroscience Research Institute and Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Division of Cell Signaling, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Thermal Biology Group, Exploratory Research Center on Life and Living Systems, National Institutes of Natural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.

Abstract

בעלי חיים רבים, כולל זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, מסוגלים מפלה דקה ההבדלים בטמפרטורה הסביבה, המאפשרת להם לחפש את נוף תרמי המועדפת שלהם. כדי להגדיר את העדפות טמפרטורה של הזחלים מעל טווח מוגדר ליניארי, פיתחנו וזמינותו של שימוש הדרגתי בטמפרטורה. כדי ליצור מעבר הדרגתי חד כיווני, שני רחובות אלומיניום מחובר אמבטיות מים עצמאית, שכל אחד מהם שולט הטמפרטורה של בלוקים בודדים. שני רחובות להגדיר את הגבולות העליון והתחתון של מעבר הצבע. מעבר הצבע החום היא הוקמה על ידי הצבת צלחת אלומיניום מצופה agarose מעל שני רחובות שבשליטת מים כך הצלחת משתרע על המרחק ביניהם. הקצוות של צלחת אלומיניום המוגדר על אבני מים מגדיר את טמפרטורת מינימום ומקסימום, ויוצרים האזורים שביניהם שני רחובות הדרגתי טמפרטורה לינארי. הדרגתיות וזמינותו שניתן להחיל על רימות בגילאים שונים, ניתן להשתמש כדי לזהות מוטנטים כי התערוכה הפנוטיפים, כגון אלה בעלי מוטציות המשפיעות על גנים קידוד TRP ערוצים ו opsins, אשר נדרשים עבור טמפרטורה אפליה.

Introduction

Thermotaxis הוא מועסק על ידי חיות ניידים לבחירת סביבה עם מצוינות והומלץ תנאים1,2,3. אם האקלים בצורה מוגזמת חם או קר, התנהגות זו חיונית להישרדותו. בנוסף, בעלי חיים רבים רגישים מאוד קטן הבדלי טמפרטורה בטווח נוח ונחפש את הסביבה עם טמפרטורה אידיאלית. זה חשיבות מיוחדת עבור אורגניזמים poikilothermic כמו זבובי פירות, אשר equilibrate טמפרטורת גופם עם הסביבה. מבחני לעקוב אחר thermotaxis הזחל סייעו בזיהוי, ולהבהיר את התפקידים של חיישנים מולקולריים כגון דרוזופילה ארעי קולטן פוטנציאליים (TRP) ערוצים4,5,6, rhodopsins7,8, ionotropic קולטן קולטנים (IRs)9, ואשר היצוקים החיות האלה עם רגישויות הטמפרטורה מעל טמפרטורה שונות טווחים.

בדיקת הבחירה דו כיוונית מספקת גישה אחת ללמוד העדפות תרמי ב הזחלים6,7. וזמינותו כרוך בהקמת שני אזורי טמפרטורה שונות ומאפשרת החיות לבחור צד אחד על השני. התוצאות של מבחנים דו כיוונית הבחירה יכול להיות חזקים, במיוחד אם ההבדלים בטמפרטורה בין שתי האפשרויות הן גדולות. בנוסף, מאז כל assay כרוך ליווח רק לשתי קבוצות, הנתונים ניתן לבטא מאינדקס העדפה פשוטה. הקלות והפשטות של מבחני בחירה דו-כיווני נתונות גם למסכים גנטי. אולם, מגבלה עיקרית היא כי ניסויים רבים נדרשים לקבוע את הטמפרטורה המועדף של חיות פראי-סוג או מוטציה.

Assay הדרגתיות מציעה הזדמנות להקים את הטמפרטורה המועדף assay יחידה8. יתר על כן, בניגוד הבדיקה הבחירה דו-כיווני, הוא מאפשר את ההערכה של ההתפלגות של קבוצה של בעלי חיים, כאשר התעמת עם טווח רציף של טמפרטורות. Assay מעבר צבע אחד משתמש צלחת פטרי וחיות יחיד והוא מתאים היטב אפיון ההתנהגות מפורט של חיות בודדות10. אולם, מאז פטרי עגול, הגודל של אזורי טמפרטורה משתנים, קטנים בהדרגה בהתאם למרחק מן המרכז. לכן, תוכנית התקנה זו אינה אידיאלית לניטור הבחירות טמפרטורה של אוכלוסיות בעלי חיים.

מנגנון הדרגתיות תרמי רציפה, כי הוא מתאים היטב כדי להעריך את העדפות טמפרטורה של קבוצות של הזחלים מעסיקה של ארנה מלבני, מתואר כאן. המנגנון הוא פשוט לבנות ולהרכיב. בנוסף, מעבר הצבע הוא ליניארי, הוא גמיש, כמו זה יכול לשמש כדי להעריך את thermotaxis מעל טמפרטורה גדול נע בין 10 ° C ל 42 º C. וזמינותו היא מהירה וישירה לביצוע ותשואות לשחזור נתונים. בנוסף דיווח הטמפרטורה המועדף של הזחלים, היא מגלה את ההעדפות של אוכלוסיית חיות מעל וההתדיינות ליניארי בניסוי יחיד. בשל יתרונות אלו, זה הוא בחירה מצוינת עבור זיהוי גנים הדרושים עבור thermotaxis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ציוד ייצור, וההספק מכשירי מבחני הדרגה

  1. לפברק את הצלחות assay אלומיניום עבור וזמינותו מעבר חד כיווני.
    1. לקצץ, לטחון כל צלחת assay אלומיניום (איור 1 א'). חתיכה אחת של אלומיניום באמצעות חבל מאד, מסור, חדים אנכי מיל בעל הממדים הבאים: הגודל החיצוני הוא 140 x 100 x 9 מ מ, הגודל הפנימי הוא 130 x 90 x 8 מ מ (איור 1B). אילגון (אנודייז) הפנימי של כל צלחת assay בצבע שחור כדי שיהיה קל יותר לדמיין את הזחלים, מונע חלודה.
      הערה: ייצור של הלוחות assay אלומיניום למעבר הצבע חד כיווני נעשית על ידי חנות מכונות. Anodization מתבצע על ידי ספק מסחרי.
    2. סמן חישוקים העליון והתחתון של כל צלחת assay עם מטוס 13, מופרדים על-ידי 10 מ מ בעזרת סמן קבוע. מקם את הראשונה והאחרונה מטוס 5 מ מ מהקצה הפנימי של הלוחות assay (איור 1 א', ב').
  2. כדי לפברק את הצלחת assay אלומיניום למעבר הצבע דו-כיווני, לגזור צלחת אלומיניום עם הממדים הבאים באמצעות המזמרה מתכת: 250 x 220 x 2 מ"מ. אילגון (אנודייז) צלחות assay עם צבע שחור.
    הערה: ייצור של הלוחות assay אלומיניום עבור מעברי הצבע דו-כיווני מתבצע על ידי חנות מכונות. Anodization נעשית על ידי ספק מסחרי.
  3. לפברק את קוביות אלומיניום.
    הערה: שני רחובות יש צורך במעבר חד כיווני, שלושה גושי בניינים יש צורך במעבר הצבע דו-כיווניים.
    1. לגזור את קוביות אלומיניום (איור 1C) חתיכה אחת של אלומיניום באמצעות מסור הלהקה (מידות של 50 x 255 x 14 מ מ) (איור 1C, יח).
    2. התרגיל תעלת המים בתוך הבלוק (7 מ מ מ) באמצעות מפעל אנכי, חריצים חוט הקצוות פתוחים בצד אחד (איור 1D). לסגור את החורים מחורץ עם בריחים, קלטת חותם להקים תעלת מים בצורת U (איור 1C, יח).
      הערה: הזיוף של אבני assay אלומיניום מתבצע על ידי חנות מכונות.
    3. לתקן את המחבר בבלוק האלומיניום (איור 1D) עם תבריג, חוט חותם קלטת בקצה אחד. להכניס את הקצה השני עם ווים מרובים סיליקון אבובים (1/4 פלייר מזהה x 3/8 פלייר OD x "1/16" קיר).
  4. להשיג שתי אמבטיות במחזור קירור/חימום.
  5. להרכיב מבוקרי טמפרטורה רחובות עבור מערכת assay הדרגתיות.
    1. למעבר הצבע חד כיווני, להתחבר לכל אחד שני רחובות אלומיניום באמבט מים נפרד כך הטמפרטורה של כל בלוק נשלטת על ידי מים עצמאית מחזורי מערכת (איור 2 א). השתמש סיליקון אבובים (1/4 פלייר מזהה x 3/8 פלייר OD x "1/16" קיר) כדי להתחבר לשקע של האמבטיה מים המחבר בצד הפנימי של בלוק אלומיניום (איור 2 א). בנוסף, להשתמש אבובים להתחבר המחבר הצד החיצוני בבלוק האלומיניום לים ביסוד אמבט מים.
    2. למעבר הצבע דו-כיווני, במקום שניים שלושה רחובות תחת בצד שמאל ובצד הימני של הצלחת ולחבר אותם לאמבטיה מים אותו עם הצנרת (איור 2B). להתחבר הרחוב אלומיניום השלישי תנורים והמקום השני מתחת למרכז של הצלחת (איור 2B).
      הערה: זה המנגנון ואת וזמינותו הם הצורך רק אם הזחלים להצטבר באזור קצה אחד או אחר של המילוי ההדרגתי חד כיווני. אם כך, חשוב להעריך אם יש אפקט קצה או לא. כדי לבדוק אפשרות זו, ליצור מעבר הדרגתי דו-כיווני שבו הטמפרטורה באזור קצה המועדף על הזחלים שימוש במעבר חד כיווני (למשל 18 ° C) היא הטמפרטורה במרכז הצלחת של המילוי ההדרגתי דו-כיווני (איור 3E , F).

2. זחל סינכרון

  1. לטפח זבובים כדי לשמש להטלת ביצים.
    1. לערבב גרגרי שמרים, מים מזוקקים עם כבעלי כדי להפוך שמרים להדביק. ביסודיות לטחון ומערבבים עד מרקם של הדבק דומה חמאת בוטנים. למנוע הדבקה יבש בצורה מוגזמת, אשר אגיע בעת העברת הזבובים בקבוקונים טריים, או רטובה הדבק, אשר יכול ללכוד את הזבובים.
    2. בעזרת כבעלי, להוסיף את העיסה שמרים קרוב הקירות הפנימיים של בקבוקונים דרוזופילה רגילה, מעל פני השטח של המזון.
    3. ספירת 12-35 נקבות ו עד חצי זכרים רבים (אך לא יותר מ 10) על משטח2 CO, ולהוסיף את נקבות וזכרים בקבוקון המכיל הדבק כל שמרים.
    4. כדי לשמור את הזבוב מזון עם השמרים-הדבק לח, בזמן ניזונים הזבובים, משלבים את שתי המבחנות מגש המכיל עד 100 צלוחיות עם 20 בקבוקונים פתוח המכיל רק מים מזוקקים. מניחים את המגש בשקית פלסטיק שקוף, אטום.
    5. דגירה המגש ב חממה 25 ° C במשך 48 שעות כך הנקבות מוזנים כראוי, ובעקבותיו אותם להניח מספר רב של ביצים.
  2. להגדיר את הבקבוקונים להטלת ביצים.
    1. העברת הזבובים ניזונים לתוך צלוחיות אוכל חדש לאיסוף ביצים על ידי הקשה אותם מעל. אל תשתמש CO2, מה שעשוי לגרום הזבובים להטיל ביצים פחות מעל חלון זמן קצר הבאים.
      הערה: בקבוקונים מזון רגיל דרוזופילה משמשים ללא שמרים הדבק לאוסף ביצה.
    2. לאפשר את הזבובים להטיל ביצים במשך 3 שעות 25 ° c כך כל הביצים נאספים מעל חלון זמן קצר יחסית.
      הערה: זה יאפשר את הזחלים לסינכרון בשלב התפתחותי זהה.
    3. מקם את הבקבוקונים המכיל את הביצים במגש המכיל את הבקבוקונים מים והדק את התיק. דגירה 25 ° c תחת אור 12 h: 12 מחזורים כהה h.
    4. גיל הזחלים עבור מספר נתון של שעות אחרי ביצה הנחת (AEL) בהתאם הזחל הרצוי.
      הערה: בטבלה 1 הוא הערכה של היחס בין השעות AEL, הזחל, אשר עשויות להשתנות בהתאם למלאי לטוס המזון נעשה שימוש, לגידול טמפרטורה וכו היחס המדויק בין AEL, שלב התפתחותי צריך להיות אומת על-ידי כל חוקר באמצעות קריטריונים פיזי, כגון המורפולוגיה של הפה ווים, spiracles11.

3. שינוי טמפרטורה ההתקנה

  1. להכין מעבר חד כיווני
    1. כדי ליצור סביבה אמביינט לח במהלך מבחני, למקם את שני רחובות אלומיניום מחובר שתי אמבטיות מים על מגבות נייר רטוב, מופרדים על-ידי 10 ס מ (איור 2 א).
    2. הפעל את שתי אמבטיות מים ~ 2 h לפני ייזום וזמינותו כדי לאפשר מספיק זמן הטמפרטורה של הבלוקים אלומיניום כדי equilibrate.
      הערה: מומלץ לבצע ניסוי מדומה כדי לקבוע את הטמפרטורה של כל המים הרותחים הדרוש כדי להשיג את מעבר הצבע הרצוי טמפרטורה לינארי. כמה טמפרטורה אופיינית זוגות להגדרת המרחצאות מים מפורטים בטבלה 2. עם זאת, שים לב כי הטמפרטורות המשטח הושפעו טמפרטורת הסביבה. אורך צינורות גם משפיעה על הטמפרטורות כמו שיש היא לקרר את החצוצרות שלה. אורך הצנרת בהגדרת שלנו הוא 1.5 m.
    3. מיקרוגל 100 מ של 1% agarose-ההגדרה ובעוצמת ב- 500 מ ל סביב הבקבוק. הפה רחב, יוצקים 25 מ ל/assay לוחית הזיהוי רמת benchtop. להכין שתי צלחות assay, שבו ניתן להציב על בלוקים אלומיניום בו זמנית (איור 2 א).
    4. לאחר agarose פני השטח הפך למוצק (10-20 דקות), יש לשפשף בעדינות כל משטח agarose עם ספוג מטבח סטנדרטי או ספוג מלמין כדי להפוך את השטח agarose מעט גסה, כך כאשר התזת מים על הג'ל agarose, ייווצר קרום המים דק וחלק, טיפות מים לא יהוו.
    5. מלא להטביע את הצלחות במיכל עם מים מזוקקים עד וזמינותו יהיה מוכן שיש לבצע כדי למנוע הגעה desiccated הלוחות.
  2. להכין הדרגתי דו-כיווני (אופציונלי)
    1. כדי ליצור סביבה אמביינט לח במהלך מבחני, במקום אלומיניום שלושה רחובות 8 ס"מ אחד מהשני (איור 2B) על מגבות נייר רטוב.
    2. הפעל את שתי אמבטיות מים ~ 2 h לפני ייזום וזמינותו כדי לאפשר מספיק זמן הטמפרטורה של הבלוקים אלומיניום כדי equilibrate.
      הערה: מומלץ לבצע ניסוי מדומה כדי לקבוע את הטמפרטורה של כל המים הרותחים למעבר הצבע דו-כיווניים. כמה טמפרטורה אופיינית זוגות להגדרת המרחצאות מים מפורטים בטבלה3. עם זאת, שים לב כי הטמפרטורות המשטח הושפעו טמפרטורת הסביבה. אורך צינורות גם משפיעה על הטמפרטורות כמו שיש היא לקרר את החצוצרות שלה. אורך הצנרת בהגדרת שלנו הוא 1.5 m.
    3. כדי למנוע את agarose לשפוך הצלחת, לעטוף את הקצוות של צלחת אלומיניום עם תיוג הקלטת כדי ליצור קיר 10 מ מגבוהה (איור 2B).
    4. באמצעות הגדרת ובעוצמת, מיקרוגל 200 מ של 1% agarose ב 500 מ"ל סביב הבקבוק. הפה רחב ויוצקים 120 מ ל צלחת וזמינותו.
    5. לאחר agarose פני השטח הפך למוצק (~ 30 דקות), יש לשפשף בעדינות כל משטח agarose עם ספוג מטבח סטנדרטי או ספוג מלמין לעשות את השטח agarose מעט גסה, כך כאשר התזת מים על הג'ל agarose, נוצר קרום המים דקים חלקה ולא טופס טיפות מים.
    6. מלא להטביע את הצלחות assay במיכל עם מים מזוקקים עד וזמינותו יהיה מוכן שיש לבצע כדי למנוע ייבוש.
  3. הגדרת צבע חד כיווני
    1. להכין ריאגנטים ופריטים על ספסל ליד המנגנון assay הדרגתי (ראה את הטבלה של חומרים).
    2. כדי לקדם את העברת החום יעיל, למלא פערים בין הבלוקים אלומיניום הלוחות assay על ידי התזת מים על הממשק בין רחובות צלחת.
    3. באמצעות כפפות, הסר את הצלחות assay מיכל המים. אם המים פולש בין הג'ל agarose את הצלחת וגורם בליטות לטופס על פני השטח, להסיר את המים עם micropipette P1000.
    4. המקום הלוחות assay על בלוקים אלומיניום כך מטוס כי הם 2 ס מ מקצה אחד בדיוק תואם את הקצוות של הבלוקים אלומיניום (איור 2 א, ג).
    5. להתיז מים על גבי המשטח של הצלחת (קרום דק מים המשתרע על פני agarose מספיקה) כדי למנוע את הג'ל agarose ממנו להתייבש. ודא כי קרום המים היא רציפה וללא טיפות מים מאז הזחלים יכולים להילכד בתוך טיפות מים.
    6. לכסות את המערכת מעבר צבע עם קופסת קרטון כדי להקטין התאדות המים ולסייע לייצב את הטמפרטורה של פני השטח ג'ל. ממתינים 5-10 דקות לאפשר לטמפרטורה equilibrate.
    7. בדוק את טמפרטורת פני השטח בנקודות 12 בצלחת (איור 2C). קחו שתי מדידות בתוך כל אזור כדי לקבוע אם יש השתנות בתוך אזור. ודא כי הטמפרטורה בשני היא בטווח של ± 0.2 ° C של הטמפרטורה הרצויה.
      הערה: השתנות בתוך אזור מתרחשת בדרך כלל מאחר מרחקים מדויקים שתי נקודות על הקצה של הבלוקים אלומיניום אינם זהים. להתאים את המיקום של הצלחת על בלוקים אלומיניום כדי לוודא מטוס כי הם 2 ס מ מקצה אחד בדיוק תואם את הקצוות של הבלוקים אלומיניום.
    8. אם המילוי ההדרגתי הטמפרטורה שנמדדה חורגת מעבר הצבע הרצוי, להגדיל או להקטין את setting(s) טמפרטורה של אמבט מים, בדוק את טמפרטורת פני השטח לאחר הטמפרטורה של bath(s) המים stabilize(s).
    9. מכסים את המערכת מעבר צבע עם קופסת קרטון עד לתחילת וזמינותו.
  4. הגדרת צבע דו-כיווני (אופציונלי)
    1. להכין ריאגנטים ופריטים על ספסל ליד המנגנון assay הדרגתי (ראה את הטבלה של חומרים).
    2. תרסיס מים על פני השטח של שלושה רחובות אלומיניום כדי לקדם את העברת החום יעיל של הבלוקים אלומיניום אל צלחות assay באמצעות מילוי פערים בין המשטחים.
    3. הסר את הצלחות assay בקפידה מיכל המים ומניחים על הבלוקים אלומיניום. אם המים פולש בין הג'ל agarose את הצלחת, אשר עלול לגרום בליטות לטופס על פני השטח, להסיר את המים עם micropipette P1000.
    4. המקום לצלחת assay על בלוקים אלומיניום כך midlines של האזורים הראשונים והאחרונים מקצה גם להתאים במדויק את הקצוות של הבלוקים אלומיניום דו צדדי (איור 2B, יח).
    5. להתיז מים על גבי המשטח של הצלחת (קרום דק מים המשתרע על פני agarose מספיקה) כדי למנוע את הג'ל agarose ממנו להתייבש. ודא כי קרום המים היא רציפה וללא טיפות מים, מאז הזחלים יכולים להילכד בתוך טיפות מים.
    6. לכסות את המערכת מעבר צבע עם קופסת קרטון כדי להקטין התאדות המים ולסייע לייצב את הטמפרטורה של פני השטח ג'ל. המתן 5-10 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה equilibrate.
    7. בדוק את טמפרטורת פני השטח-שתי נקודות לאורך הקו האמצעי של כל אחד מהאזורים 10 (איור דו-ממדי). קחו שתי מדידות בתוך כל אזור כדי לקבוע אם יש השתנות בתוך אזור. ודא כי הטמפרטורה בשני היא בטווח של ± 0.2 ° C של הטמפרטורה הרצויה.
      הערה: השתנות בתוך אזור מתרחשת בדרך כלל מאחר מרחקים מדויקים שתי נקודות על הקצה של הבלוקים אלומיניום אינם זהים. להתאים את המיקום של הצלחת על בלוקים אלומיניום כדי לוודא כי midlines של האזורים הראשונים והאחרונים הקרוב מקצה אחד להתאים במדויק את הקצוות של הבלוקים אלומיניום דו צדדי.
    8. אם המילוי ההדרגתי הטמפרטורה שנמדדה חורגת מעבר הצבע הרצוי, להתאים את setting(s) טמפרטורה של אמבט מים, בדוק את טמפרטורת פני השטח לאחר הטמפרטורה של bath(s) המים stabilize(s).
    9. מכסים את הבלוקים עם קופסת קרטון עד תחילת וזמינותו.

4. אוסף זחל, כביסה

  1. לבודד את הזחלים נקי (אפשרות 1)
    1. להוסיף ~ 40 מ ל 18% סוכרוז פתרון מבחנה 50 מ. סקופ כל, הזחלים vial(s) מזון עם scoopula, העברת הפיתרון 18% סוכרוז.
    2. מערבבים ביסודיות אבל בעדינות באמצעות scoopula להפריד פסולת המזון הזחלים. המתן 30-60 s עד לבמה הזחלים לשכבה העליונה של הצינור. יוצקים בשכבה העליונה הכוללת את הזחלים (~ 10 מ"ל) עוד 50 מ ל צניעותו ולמלא את הצינור עם טרי 18% סוכרוז פתרון. המתן 30-60 s עד לבמה הזחלים לשכבה העליונה שוב.
      הערה: חלקיקי מזון גדולים לפעמים להעביר יחד עם הזחלים, עשוי להשפיע על זחל thermotaxis אם הם לא יוסרו. אם חלקיקי מזון גדול נשארים בשכבה העליונה, חזור על השלבים 4.1.1-4.1.2 או להסיר אותם באמצעות scoopula באופן ידני.
    3. להעביר את השכבה העליונה של הזחלים (~ 10 מ"ל) שני צינורות אחרים 50 מ ל, למלא את שני צינורות מים מזוקקים כדי להפחית את ריכוז סוכרוז, כך הזחלים במהירות טובע במים. חכו 30-60 s עד הזחלים שקעו. מבצע זה, השלבים הבאים במהירות האפשרית כדי למנוע את הזחלים מטביעה.
    4. להתעלם כל כך הרבה של המים ככל האפשר בהטיית בעדינות את הצינורות. לשלב הזחלים לתוך שפופרת אחת על-ידי שמוציא את הזחלים עם המים שנותרו ולמלא את הצינור מים מזוקקים.
    5. חכו 30-60 s עד כל הזחלים יישאבו ולהסיר כמה שיותר מים ככל האפשר בהטיית בעדינות את הצינורות. חזור על שלב זה כביסה 2 - 4 פעמים כדי לחלוטין להסיר סוכרוז ומזון לעין כל.
    6. למחוק את כמות המים ככל האפשר ולהעביר את הזחלים ריקה 35 מ"מ פטרי מאת decanting. לרסס את הצינור עם מים ולהשתמש מכחול קטנות כדי לעזור להעביר את הזחלים.
    7. הסר את המים העודפים הפטרי באמצעות micropipette של P1000. יוצאים ~0.5 מ ל מים כדי למנוע התייבשות של הזחלים.
    8. מניחים את המכסה על המנה כדי למנוע את הזחלים של בריחה. הפעל את המכסה הפוך כדי להפחית את היכולת של הזחלים לברוח דרך פער קטן בין המכסה המנה. לאפשר את הזחלים להתאושש במשך 10-20 דקות.
  2. לבודד את הזחלים נקי (אפשרות 2)
    הערה: זו שיטה חלופית לניקוי הזחלים מפחית את הסיכון של האפשרות חונק את הזחלים במהלך ההליך כביסה. כדי להשתמש בשיטה זו, להמשיך עם השלבים הבאים לאחר ביצוע של 4.1.1-4.1.2 השלבים לעיל.
    1. מניחים מסננת תא (300 מיקרומטר, שומר על הזחלים 72 h AEL ומעלה) על גבי צינור 50 מ ל.
    2. לאחר שנוכח כי אין הגופות בוגרת או פסולת מזון צפים על פני הפתרון סוכרוז, יוצקים בשכבה העליונה הכוללת את הזחלים דרך מסננת מלכודת כל הזוחלים על המסך רשת. לשטוף את הזחלים ביסודיות עם מים מזוקקים עד הצינור 50 מ ל מלא.
    3. הסר את מסננת תא עם הזחלים, השלך המים מהצינור. מניחים על מסננת המכילה את הזחלים על גבי הצינור ריק ולשטוף את הזחלים שוב עם מים מזוקקים עד הצינור 50 מ ל מלא.
    4. להפוך את מסננת הפוכה ריקה 35 מ"מ פטרי, לרסס מים מחלקו העליון של מסננת התא כדי להעביר את הזחלים הפטרי. להעביר את הזחלים הנותרים בעזרת מברשת צבע קטנים.
    5. ממשיכים לצעוד 4.1.7 מעל לפני שתמשיך לשלב 5.

5. assay וחישוב

  1. הסר את תיבת הקרטון, בדוק את טמפרטורת פני השטח של ג'ל מיד לפני העברת הזחלים לצלחת. למזער את הזמן תיבת קרטון פתוחה כדי למנוע שיבוש equilibration את הטמפרטורה. אם המשטח יבש, לרסס כמות קטנה של מים על פני השטח.
  2. להפיץ את הזחלים 150 ± 50 במרכזה של כל צלחת (בין אזורי 3 ו- 4 מתוך האזורים 6) למעבר הצבע חד כיווני (אזור שחרור; איור 2C).
    הערה: עבור מעבר הצבע דו-כיווני, להפיץ 200-400 הזחלים לאורך האזור האמצעי של כל חצי (איור דו-ממדי).
  3. הצב מכסה microplate מעל כל צלחת assay כדי למנוע את הזחלים של זוחלים החוצה. מכסים את ההתקנה עם קופסת קרטון כדי למנוע חשיפה קלה, דבר שעשוי להשפיע על הבחירה זחל על הג'ל agarose.
    הערה: עבור מעבר הצבע דו-כיווני, זה צריך שלא יהיה צורך לכסות את הצלחת עם מכסה, כי הצלחת הוא גדול יותר, הטמפרטורה המועדף של הזחלים היא באזור האמצעי. כתוצאה מכך, כמה הזחלים לצבור בקצוות, יש הזדמנות לזחול החוצה.
  4. לאפשר וזמינותו להמשיך למשך 10-30 דקות במעבר חד כיווני, ולכל 15-35 דקות של מעבר הצבע דו-כיווני, תלוי בגילו של הזחלים (טבלה 4).
  5. הסר את תיבת הקרטון המכסה microplate. לצלם את הצלחות מלמעלה באמצעות מצלמה דיגיטלית. קח שתי תמונות של כל צלחת assay החוקר יכול לבחור עם ניגודיות ובהירות יותר לניתוח.
  6. להסיר את כל הזחלים של הלוחות assay ובכל מקום בחוץ את הצלחות על-ידי שאיפה.
  7. נקו את הצלחות assay, הצינורות, את מסננת תא ביסודיות עם מים מזוקקים. שימוש חוזר הלוחות assay מוכן באותו היום אלא אם השטח של agarose פגומה.
  8. לחשב את ההתפלגות באחוזים של זחלים. בתוך כל אזור.
    1. פתחו את התמונה הצילום של התוצאות assay באמצעות תוכנה המאפשרת הוספת סימונים על התמונה. כדי לציין את אזורי assay, צייר קווים אנכיים כל 2 ס מ בהתאם מטוס על הצלחת וזמינותו.
    2. לספור את מספר זחלים. בתוך כל אזור ולהקליט את המספרים. לא נחשבות הזחלים באזורים 0.5 ס מ כל אחד הקירות. הג'ל הוא עבה יותר ליד החומות, הטמפרטורות המשטח אינם ליניאריים באזורים אלה.
    3. למעבר הצבע חד כיווני, לחשב את ההתפלגות באחוזים באזור כל כדלקמן:
      (מספר של הזחלים בתוך אזור נתון 2-ס מ) / (מספר כולל של הזחלים באזורי 6) x 100.
    4. למעבר הצבע דו-כיווני, לחשב את ההתפלגות באחוזים באזור כל כדלקמן:
      (מספר של הזחלים בתוך אזור נתון 2-ס מ) / (מספר כולל של הזחלים ב 5 אזורי בכל צד של מעבר הצבע) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

להקים 18 ° C - 28 מעלות צלזיוס חד כיווני ההדרגתי, נוכל להגדיר הטמפרטורות של שתי אמבטיות מים 16.8 ° C ו- 31 מעלות צלזיוס. אנו משיגים את הטמפרטורות ב 13 נקודות על ידי מדידת הטמפרטורה ב 26 תנוחות בתוך החלק העליון והחלק התחתון של כל האזורים 6, קווי הגבול בין אזורי, ולא בקצוות הקיצוניים של המשטח ג'ל agarose (איור 2C, 2E). התפלגות טמפרטורה לאורך מעבר הצבע היה כמעט ליניארי (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (2E איור).

אנחנו לבדיקה בהעדפות טמפרטורה של הזחלים שליטה (w1118) בגילאים שונים. 1סנט (24 ± 1.5 h AEL), 2nd (48 ± 1.5 h AEL) וזחלים מוקדם-3rd (72 ± 1.5 h) הראה הפסגות באזור 24 ° C (איור 3 א, ב'). ההעדפות טמפרטורה השתנה במהלך 3rd instar התפתחות הזחל. האחוז הגבוה ביותר של אמצע-3rd לחלל (96 ± 1.5 h AEL) שהצטברו באזור 18 ° C (איור 3 א, ב'), הנטיה הזו עולה עם הגיל. בין הזחלים לחלל מאוחר-3rd (טיפוס מראש; 120 ± 1.5 h AEL), ~ 50% מקובצים באזור 18 ° C, הבחירה של טמפרטורה זו היה ~ 4-fold גבוה יותר מאשר אזור הסמוך-20 ° C (אזור 18 ° C, 50.2%; אזור 20 ° C, 15.1%; איור 3 א ב'). נטייה לצבור באזור 18 ° C ב- w1118 שלא מיועד אפקט הקצה מאז המנוח-3rd instar הזחלים עדיין שהצטברו באזור 18 ° C, באמצעות הדרגתי טמפרטורת דו-כיווני (איור 3E, נ ).

בדקנו גם את הזחלים לחלל מאוחר-3rd (120 ± 1.5 h AEL) עם מוטציות בגנים הדרושות מפלה הבדלי טמפרטורה בטווח נוח. אלה כוללים trpA1, אשר נדרש לבחירה לחום 18 ° C - 24 מעלות צלזיוס טווח5,7,8. הזחלים עם מוטציה null ב- trpA1 (trpA11) להפיץ באופן שווה על פני כל 18 ° C-28 מעלות צלזיוס הדרגתי (איור 3C). הזחלים חסר רק את A ו- B איזופורמים (trpA1-ABG4), או את איזופורמים C ו- D (trpA1-CDG4) גם הצג מגבלות קשות (איור 3C). זבובים לקודד שני איזופורמים של phospholipase Cβ (PLC21C ו- NORPA), וכן מוטציות המשפיעות גם על norpA (norpAP24) אבל לא plc21c (plc21cP319) לשבש הצטברות בטווח 18 ° C ( איור תלת-ממד).

Figure 1
איור 1. מכשירי ביצוע וזמינותו שינוי טמפרטורה חד כיווני. (א) אלומיניום מבחן לצלחת משמש assaying thermotaxis הזחל התנהגות. הקווים השחורים 13 בחלק העליון והתחתון לתיחום אזורי 12 (10 מ מ כל אחד). החלק התחתון של הלוח הוא anodized בצבע שחור כך שיהיה קל יותר לדמיין את הזחלים. מידות (B) של צלחת אלומיניום (מסומן במ מ). הגודל החיצוני של צלחת אלומיניום הוא 140 x 100 x 9 מ מ. הגודל הפנימי של צלחת אלומיניום הוא 130 x 90 x 8 מ מ. מטוס מופרדים באמצעות 10 מ מ. להבחנה הראשון והאחרון הוא 5 מ מ קצות האזור הפנימי של הצלחת. (ג) ראש ומשמשת נופים צדדיים של אחת מאבני אלומיניום לשלוט בטמפרטורה של מעבר הצבע. הרחוב יש שני מחברים נהגו לצרף שפופרות סיליקון, אשר להתחבר באמבט מים. (ד) מידות בלוק אלומיניום. הגודל החיצוני של בלוק אלומיניום הוא 255 x 50 x 14 מ מ. הקוטר של נתיב המים הפנימי הוא 7 מ מ. שני מחברים 30 מ מ בצד השמאל להתחבר עם צינורות סיליקון זה מרחיב את האמבט במים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. כיוונוני assay מעבר צבע יחיד וכן הדו-כיווניים. (א) ההתקנה מעבר חד כיווני עם שתי צלחות assay אלומיניום על שתי קוביות אלומיניום. הטמפרטורות של הבלוקים אלומיניום נשלטים על ידי במחזור מים שתי אמבטיות מים. (B) הסידור של שלושה בלוקים אלומיניום, אמבטיות מים, צלחת אלומיניום (250 x 220 מ מ) עבור הדרגה דו-כיווניים. בלוקים ימינה ושמאלה מחוברים לאמבט מים באותו ומחובר הרחוב האמצעי לאמבטיה מים אחרים. הצלחת assay אלומיניום עטופים עם הקלטת כדי ליצור קיר 10 מ מ כדי להכיל את agarose 1%. (ג) עמדות לבדוק טמפרטורות (שצוין על-ידי נקודות), כדי לשחרר את הזחלים על הצלחת. לפני ביצוע ניסוי, בדוק, הטמפרטורה של שתי נקודות בתוך כל אזור לאשר מעבר הצבע טמפרטורה לינארי הרצויה היא הוקמה. הזחלים משתחררים בתוך השטח המסומן ליד האמצע. הזחלים נספרים בתוך כל אחד מהאזורים 2-ס מ. (ד) עמדות כדי לבדוק טמפרטורות (שצוין על-ידי נקודות) ואת אזורי שחרור עבור הזחלים על מעבר הדרגתי דו-כיווניים. מספר שווה של הזחלים משתחררים לאורך הקו האמצעי של חצי אחד של מעבר הצבע דו-כיווניים. המספרים של הזחלים נספרים בכל אחד 10 (2 ס מ) אזורי. סט אחד טיפוסי של טמפרטורות (18 ° C - 26 ° C) על פני השטח agarose מצוינת. (ה) הטמפרטורות נמדד לאורך קווי הגבול, midlines של כל אזור מעבר הדרגתי חד-כיוונית מדגם. נתונים מייצגים טמפרטורות ± SD. n = 8 מבחני (150 ± 50 הזחלים/assay). חלקים של דמות זו משוחזרות מ. Sokabe et al. 8 עם שינויים קלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. נציג תוצאות באמצעות מבחני מעבר חד-כיוונית וכן הדו-כיווניים. (A, B) זאת אומרת באחוזים של הזחלים באזורי 6 במעבר הצבע חד כיווני. הנתונים כוללים 3rd לחלל הזחלים על השעות המוצע לאחר ביצה הנחת (AEL). n = 6-7. קווי השגיאה בהתפלגויות מייצגים ±SEM. (ג) תרמית המנוח-3 מראש טיפוסרואד instar הזחלים של שליטה (w1118) ו trpA1 מוטציות במעבר הצבע חד כיווני. n = 3-4. קווי השגיאה מייצגים ±SEM-(D) הפצות תרמי של הזחלים לחלל מאוחר-3rd של שליטה (w1118) ו PLCβ מוטציות במעבר הצבע חד כיווני. n = 4-6. קווי השגיאה מייצגים ±SEM-(E) הפצה נציג של טיפוס מראש, מאוחר-3rd לחלל הזחלים (w1118) במעבר הצבע דו-כיווניים. אזורי assay ימינה ושמאלה שצוין על-ידי קווים מנוקדים, מופרדים על-ידי האזור לא-לספור במרכז (אזור מוצל). (F) אחוז מראש טיפוס מאוחר-3rd instar הזחלים (w1118) בתוך כל אזור לאורך מעבר הצבע תרמי. הזחלים הונחו בפינה השמאלית ולשחרר הזכות אזורי. אזורי assay מופרדות על ידי אזור לא-לספור 3-ס"מ במרכז וכל ההפצות מחושבות באופן עצמאי. קווי השגיאה מייצגים SEMs. n = 3 מבחני (200-400 הזחלים/assay). חלקים של דמות זו משוחזרות מ. Sokabe et al. 8 עם שינויים קלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שעות AEL הפרפרים והעשים
24 1סנט לחלל
48 2nd לחלל
72 בראשית-3rd לחלל
96 אמצע-3rd לחלל
120 לחלל מאוחר-3rd , ממש לפני טיפוס על הבמה

טבלה 1. הקשר בין השעות לאחר ביצה הנחת (AEL) דרגות זחל.

שינוי טמפרטורה בצלחת agarose (שיפוע) טמפרטורות של אמבטיות מים טמפרטורות של קוביות אלומיניום
10.0-25.0° C (1.5° C/ס מ) ~6.5-7°C/~28.5°C ~8.5°C/~26.8°C
18.0-28.0° C (1° C/ס מ) ~16.8°C/~31.0°C ~17.8°C/~29.7°C
14.0-34.0° C (2° C/ס מ) ~10.0°C/~40.0°C ~11.8°C/~36.8°C
12.5-42.0° C (2.95° C/ס מ) ~7.0°C/~55.0°C ~9.4°C/~49.4°C

בטבלה 2. בגראדיאנט טיפוסי, הטמפרטורות המתאימות של אמבטיות מים וקוביות אלומיניום למעברי כיוונית יחיד.

שינוי טמפרטורה בצלחת agarose טמפרטורות של אמבטיות מים טמפרטורות של קוביות אלומיניום
22-10-22 ° C (1.5° C/ס מ) ~5.0°C /~25.0°C ~7.5°C/~24.0°C
26-18-26 ° C (1° C/ס מ) ~15.8°C /~30.6°C ~16.9°C/~28.4°C
30-14-30 ° C (2° C/ס מ) ~8.5°C /~36.4°C ~10.9°C/~32.8°C
36-12.5-36 ° C (2.95° C/ס מ) ~5.0°C /~47.2°C ~7.9°C/~40.9°C

בטבלה 3. מעברי צבע חום טיפוסי, הטמפרטורות המתאימות של אמבטיות מים וקוביות אלומיניום למעברי דו-כיווניים.

גיל הזחל (AEL) זמן assay (כיווני בודד) זמן assay (דו-כיווני)
h 24 שעות ביממה 30 דקות 35 דקות
48 שעות 22 דקות 27 דקות
72 h 16 דקות 21 דקות
96 h 13 דקות 18 דקות
120 h 10 דקות 15 דקות

בטבלה 4. בגילאים שונים זחל (AEL) והשעות assay המתאימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להבטיח את ההצלחה של פרוטוקול זה, חשוב לנקוט צעדים כדי להשיג נאותה מספרים של הזחלים לביצוע הניסויים. אלה כוללים מראש האכלה של זבובים בקבוקונים המכילים הדבק שמרים במשך 2-3 d כדי לשפר את הנחת הביצה. הבקבוקונים צריך להיות מניחים במגש המכיל מים בקבוקונים בתוך שקית פלסטיק שקוף, אשר שומרת על הלחות של המזון ומקדם האכלה יעיל על ידי הזחלים בזמן המתיר חשיפה מחזורים בהירה-כהה נורמליים. עם זאת, הדבק שמרים לא צריך להיות כל כך רך הזבובים הופכים לכוד. מספר נקבות לכל מבחנה תלויה גנוטיפ. במקרה של w1118, זה בדרך כלל מספיקה לאפשר ~ 12 נקבות וזכרים ~ 6 להטיל ביצים במשך 3 שעות. שתי מבחנות מספקים בדרך כלל מספיק הזחלים (100-200 הזחלים) להניח על צלחת וזמינותו חד כיווני. אם המניה לטוס מטילה ביצים פחות מאשר פראי-סוג או חלקם של הזחלים שבוקעים מצטמצם, להוסיף נקבות נוספים (עד 30-35/מבחנה) וזכרים.

ישנם גורמים רבים ההשתנות לא מכוונות בעת ביצוע מבחני אלה. השלב ההתפתחותי משפיעה הטמפרטורה ההעדפה של הזחלים. לכן, זה הכרחי לשימוש בזהירות את הזחלים של שלב מוגדרים. כדי לעשות זאת, לאסוף את הזחלים על מסגרת הזמן צר (כגון 3h). מאז ומועדף תנאים (טמפרטורה, לחות, מחזור בהירה-כהה, סוג של מזון), כמה מוטציות משפיעה על קצב ההתפתחות, לא להסתמך אך ורק על הזמן אחרי ביצה הנחת לנתח וזהובה בגילאי הזחלים. חשוב גם לבחון מאפיינים פיזיים, כגון הגודל של הפה ווים ו spiracles7 כדי לקבוע הזחלים של אחרים שונים, מאותו שלב התפתחותי. זמני עבור 1סנט, 2nd וזחלים 3rd לחלל לפתח (טבלה 1) מבוססות על שימוש מזון המבוסס על כשהתירס הדגירה 25 ° c תחת אור 12 h: 12 מחזורים כהה h. הזחלים גדלים לאט יותר על מזון המבוסס על מולסה. הידרציה נאותה וטריות המזון משפיע גם את הצמיחה של הזחלים. כמות המים במזון צריך להשאיר את האוכל לא יבש מדי לקלף ממנו המבחנה ולא רפוי מדי עקב מים מופרזת. באופן אידיאלי, השכבה ~ 5 מ"מ הקרוב ביותר פני מזון מותנה על ידי גידול הזחלים ועובר בקלות כאשר המבחנה מוטה או הקיש. במצב זה יכולה להיות מושגת באמצעות מזון טרי עם הזחלים 50-100.

זה חיוני כדי ליצור מעבר הדרגתי טמפרטורה יציבה לפני ביצוע וזמינותו. לכן, הפעל את המים הרותחים 1-2 h מוקדמת לראשיתו וזמינותו, המרחצאות מים לייצר חום, עלול לשנות את טמפרטורת החדר, אשר בתורו יש את היכולת להשפיע על מעבר הצבע. לאחר 1-2 h, טמפרטורת הסביבה של החדרים הממוזגים ביותר equilibrates. עם זאת, זה חייב להיקבע בסביבה בכל. בנוסף, בעת יצירת מעבר צבע עם טווח טמפרטורה גדול (> 3.0 מעלות צלזיוס/ס מ), זה יכול להיות קשה להשיג מעבר צבע יציב. תנועה קטנה של צלחת assay משתנה יותר באופן משמעותי מעבר הצבע החום כאשר הטווח הוא גדול (לדוגמא > 3.0 מעלות צלזיוס/ס מ). מצאנו כי מעבר צבע 1-2 ° C/cm מייצרת מעברי הצבע הכי יציב.

ישנם מספר שיקולים נוספים שצריכים להיות נשלט כדי להגביל את דרגות השונות מבחני thermotaxis. לשטוף את הזחלים הוא קריטי, כמו הנוכחות של חלקיקי מזון או סוכרוז על הזחלים יכולים להשפיע וזמינותו. יש לבצע את השלבים כביסה ביסודיות אבל מהר, כי הגבלת אספקת החמצן שלהם בצורה מוגזמת בזמן שהם הם שקועים מים עשוי להשפיע על בריאותם. לכן, אנו ממליצים להשתמש מסננת את התא (אפשרות 2) כדי לנקות את הזחלים. מסננת עם גודל הנקבוביות של 300 מיקרומטר עובד היטב עבור הזחלים ב המוקדמות-3rd instar הבמה (72 h AEL) ומעלה. בנוסף, חשוב לבצע ניסויים באותו זמן של יום, כגון מזמן Zeitgeber (ZT) ZT4 כדי ZT8 (ZT = 0 הוא כאשר אורות דולקים), כדי להגביל את השתנות בשל ההשפעות של השעון הביולוגי מקצבים על הבחירה טמפרטורה. רמת לחות בצלחת agarose יכול גם לגרום השתנות בתוצאות. בעוד פני השטח של הלוחות צריך להיות לח, טיפות מים יכול ללכוד את הזחלים, לכן צריך להימנע.

הגבלת דרגות השונות מבחני יעשה את זה ניתן לקבל תוצאות חזקות מבלי לבצע מספר רב של ניסויים עצמאית. בדרך כלל, 3-8 ניסויים עצמאית מספיקים להשיג תוצאה אמינה. לטבלאות נכונה של התוצאות הוא גם קריטי להצלחת מבחני thermotaxis. לא נחשבות הזחלים מופץ בהאזורים בתוך 0.5 ס מ בקירות אלומיניום, מאז הטמפרטורות אינן לינאריות באזורים אלה. הזחלים מסוימים ימוקמו בגבול שבין שני אזורי, בזמנו שוזמינותו הסתיימה. אם יותר מ- 50% של אורך הגוף נמצא באזור אחד, ואז לכלול הזחל לטבלאות עבור אזור זה. אם זחל בדיוק 50% בכל אחד לשני אזורים, ואז נחשבים לחיה 0.5 זחלים. בתוך כל אזור.

בעוד וזמינותו ההדרגתי מאפשר את הזחלים להפלות מגוון של הבדלי טמפרטורה, קיימות מגבלות לטמפרטורות העליון והתחתון זה יכול להיבדק באופן יעיל. . זה לא ריאלי כדי לבדוק את הטמפרטורות < 10 ° C מאז הניידות של הזחלים מקטין באופן משמעותי בטמפרטורות נמוכות. אמנם ניתן ליצור מעברי צבע עם הטמפרטורה העליון להגיע ל־42 ° C, כמעט אין שליטה הזחלים להישאר בכל אזור > 28 ° C. לכן, מבחני מעבר רציף אינה יכולה לשמש להפלות העדפות טמפרטורה בין האזורים השונים > 28 ° C. עם זאת, מבחני הדרגה בטמפרטורות גבוהות אלה יכול לשמש שעלולים לאפיין מוטנטים אם הם זזו מאוד טמפרטורה חמימה העדפות.

אם מוטציה יש פגם גינקולוגיות, ייתכן צורך לערוך ניסויים נוספים כדי לוודא כי ההעדפה טמפרטורה לכאורה אינה מדויקת בשל לקות תנועה. כדי לתקן בעיה פוטנציאלית זו, ייתכן צורך להקים עוד פעמים assay כדי לאפשר את הזמן הנוסף של בעלי חיים לעבור אל אזורי הרצוי שלהם. גם יכול להיות מועסק וזמינותו הדרגתיות דו-כיוונית כדי לבדוק אם החיות בחר אזור מועדף אותו, בלי קשר לגבי היכן הם ממוקמים בתחילה על הצלחת.

לסיכום, מבחני הדרגה המתוארים כאן יש יתרונות אחרים מבחני thermotaxis. בעוד הבחירה דו-כיווני מבחני שימושיות, כפי שהם יכולות להניב תוצאות חזקות, במיוחד כאשר ההבדלים בטמפרטורה בין שני אזורי גדולים, הם אינם יעילים חושפים את הטמפרטורה האידיאלית המועדף על הזחלים בניסוי יחיד. לשם כך דורש ביצוע שילובים רבים של ברירה דו-כיוונית כדי לקבוע את המועדפת ביותר הטמפרטורה5,6,7. לעומת זאת, וזמינותו הדרגתיות מספק החיה הזדמנות לבחור אזור הטמפרטורה שלהם בסביבה עם נוף טמפרטורה רציפה אחת. לכן צורך לתכנן שילוב גדול של אפשרויות דו-כיוונית כדי לקבוע תרמי הסביבה המועדפת. כדי להעריך את השפעת הטמפרטורה על הדינמיקה נע של זחל10כבר מועסקים לומד thermotaxis באמצעות צלחת פטרי עגול. עם זאת, פחות שימושי האפליה בין העדפות בין טמפרטורות שונות, שכן כל אזור הוא בגודל שונה. לבסוף, בגלל הפשטות וזמינותו, השירות שלה בהעדפות קטנים בטמפרטורה מפלה ב וזמינותו יחיד, זה יכול להיות מועסק מסך עשרות גנים מועמד פוטנציאלי המעורבים העדפה טמפרטורה זחל שעשוי אחרת תהיה תסולא בפז באמצעות מבחני אחרים

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

C.M. נתמך על ידי מימון NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278), של NIAID (1DP1AI124453).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
  2. Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
  3. Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
  4. Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
  5. Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
  6. Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
  7. Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
  8. Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
  9. Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
  10. Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
  11. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Tags

מדעי המוח גיליון 136 דרוזופילה הזחלים thermotaxis שינוי טמפרטורה התנהגות somatosensation
וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים <em>דרוזופילה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A… More

Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter