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Neuroscience

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57963
Automatic Translation
*1, *2,3, 1
1Neuroscience Research Institute and Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Division of Cell Signaling, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Thermal Biology Group, Exploratory Research Center on Life and Living Systems, National Institutes of Natural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

Abstract

Muitos animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, são capazes de discriminar diferenças minutos em temperatura ambiente, o que permite que eles buscar sua paisagem termal preferida. Para definir as preferências de temperatura de larvas ao longo de um intervalo definido de linear, desenvolvemos um ensaio usando um gradiente de temperatura. Para estabelecer um gradiente de single-direcional, dois blocos de alumínio são conectados aos banhos de água independentes, cada um deles controla a temperatura dos blocos individuais. Os dois blocos defina os limites inferior e superiores do gradiente. O gradiente de temperatura é estabelecido pela colocação de uma placa de alumínio revestido com agarose sobre os dois blocos de água controlados para que a placa se estende a distância entre eles. As extremidades da placa de alumínio que é definido na parte superior dos blocos de água define as temperaturas mínimas e máximos, e as regiões entrelinhas os dois blocos formam um gradiente linear de temperatura. O ensaio de gradiente pode ser aplicado para as larvas de diferentes idades e pode ser usado para identificar os mutantes que apresentam fenótipos, tais como aqueles com mutações que afetam os genes que codificam os canais TRP e opsins, que são necessários para a discriminação de temperatura.

Introduction

Thermotaxis é empregado por animais móveis para selecionar um ambiente com as mais favoráveis condições1,2,3. Se o clima é excessivamente quente ou frio, esse comportamento é vital para a sobrevivência. Além disso, muitos animais são sensíveis às diferenças muito pequenas em temperatura na faixa de confortável e procuram ambiente com uma temperatura ideal. Isto é de particular importância para organismos poiquilotérmicos como moscas de fruta, que equilibrar a temperatura corporal com o meio ambiente. Ensaios para monitorar thermotaxis larval têm sido fundamentais para identificar e clarificar as funções dos sensores moleculares como Drosophila transitória do Receptor potencial (TRP) canais4,5,6, rhodopsins7,8e geleificação do receptor receptores (IRs)9, que dotar estes animais com sensibilidades de temperatura ao longo de intervalos de temperatura diferentes.

Um teste de escolha bidirecional fornece uma abordagem para estudar as preferências térmicas em larvas6,7. O ensaio envolve a criação de duas zonas de temperatura distintas e permite que os animais selecionar um lado sobre o outro. Os resultados dos testes de escolha de duas vias podem ser robustos, especialmente se as diferenças de temperatura entre as duas opções são grandes. Além disso, uma vez que cada ensaio envolve Tabulação apenas dois grupos, os dados podem ser expressas como um índice de preferência simples. A facilidade e simplicidade de escolha bidirecional ensaios também são aptos para telas de genéticas. No entanto, uma grande limitação é que muitos experimentos são necessários para estabelecer a temperatura preferida dos animais selvagem-tipo ou mutantes.

Um ensaio de gradiente oferece a oportunidade de estabelecer a temperatura preferida em um único ensaio8. Além disso, ao contrário do teste de escolha de duas vias, permite a avaliação da distribuição de um grupo de animais, quando confrontado com uma série contínua de temperaturas. Um ensaio de gradiente usa uma placa de Petri e único animais e é well-suited para caracterizar o comportamento detalhado de cada animal10. No entanto, desde pratos de Petri são redondos, os tamanhos das zonas de temperatura variam e são progressivamente menores dependendo da distância do centro. Portanto, esta configuração não é ideal para monitorar as seleções de temperatura das populações de animais.

Um aparelho gradiente térmico contínuo que é adequado para avaliar as preferências de temperatura dos grupos de larvas emprega uma arena rectangular e está descrito aqui. É simples de construir e montar o aparelho. Além disso, o gradiente é linear e é flexível, como ele pode ser usado para avaliar a thermotaxis ao longo de intervalos de temperatura de 10 ° C a 42 ° C. O ensaio é rápido e simples de executar e produz dados reprodutíveis. Além de relatar a temperatura favorecida de larvas, revela as preferências da população de animais sobre uma escala linear inteira em uma única experiência. Devido a estas vantagens, é uma excelente escolha para a identificação de genes necessários para thermotaxis.

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Protocol

1. equipamento fabricação e montagem de aparelhos para ensaios de gradientes

  1. Fabrica as placas de ensaio de alumínio para o ensaio de gradiente de single-direcional.
    1. Cortar e moer cada placa de ensaio de alumínio (figura 1A) fora de uma única peça de alumínio usando uma serra de fita e afiadas moinho vertical com as seguintes dimensões: o tamanho exterior é 140 x 100 x 9 mm e o tamanho interno é de 130 x 90 x 8 mm (figura 1B). Anodiza dentro de cada placa de ensaio com tinta preta para tornar mais fácil para visualizar as larvas e evitar ferrugem.
      Nota: A fabricação das placas de ensaio de alumínio para o gradiente de single-direcional é feita por uma oficina mecânica. A anodização é executada por um fornecedor comercial.
    2. Marca as bordas superiores e inferiores de cada placa de ensaio com 13 marcações, separados por 10 mm usando um marcador permanente. Coloque as primeiras e o últimas as delimitações 5 mm da borda interna das placas do ensaio (figura 1A, B).
  2. Para fabricar a placa de ensaio de alumínio para o gradiente de bidirecional, cortar uma chapa de alumínio com as seguintes dimensões usando tesouras de chapa metálica: 250 x 220 x 2 mm. anodiza as placas de ensaio com tinta preta.
    Nota: A fabricação das placas de ensaio de alumínio para os gradientes bidirecional é executada por uma oficina mecânica. A anodização é feita por um fornecedor comercial.
  3. Fabrica os blocos de alumínio.
    Nota: Dois blocos são necessários para o gradiente de single-direcional e três blocos são necessários para o gradiente bidirecional.
    1. Cortar os blocos de alumínio (Figura 1) de um pedaço único de alumínio usando uma serra de fita (dimensões de 50 x 255 x 14 mm) (Figura 1, D).
    2. Broca o canal de água dentro do bloco (7 milímetros no diâmetro) usando um moinho vertical e segmento sulcos nas extremidades abertas de um lado (Figura 1). Feche os buracos sulcados com parafusos e fita veda-rosca para formar um canal de água em forma de U (Figura 1, D).
      Nota: A fabricação dos blocos de ensaio de alumínio é executada por uma oficina mecânica.
    3. Consertar o conector no bloco de alumínio (Figura 1), com rosca e fita em uma extremidade veda rosca. Encaixa a outra extremidade com várias farpas do silicone tubo (ID 1/4" x 3/8" OD x parede 1/16").
  4. Obter dois banhos de circulação sob refrigeração/aquecimento.
  5. Monte blocos de controle de temperatura para o sistema de ensaio de gradiente.
    1. Para o gradiente de single-direcional, conecte cada um dos dois blocos de alumínio para um banho de água separado para que a temperatura de cada bloco é controlada por um sistema (Figura 2A) de circulação da água independente. Use tubos de silicone (ID 1/4" x 3/8" OD x parede 1/16") para conectar a saída de banho o conector no lado interno do bloco de alumínio (Figura 2A). Além disso, use tubos para conectar o conector do lado exterior do bloco de alumínio para a entrada de água.
    2. Para o gradiente de bidirecional, coloque dois dos três blocos sob à esquerda e à direita da placa e conectá-los para o mesmo banho de água com a tubulação (Figura 2B). Conecte o terceiro bloco de alumínio para um segundo banho de água e lugar abaixo do centro da placa (Figura 2B).
      Nota: Este aparelho e ensaio são necessárias somente se as larvas se acumulam na zona em um lado ou outro do gradiente single-direcional. Se assim for, é importante avaliar se há um efeito de borda ou não. Para testar esta possibilidade, estabelecer um gradiente de bidirecional, na qual a temperatura de zona de borda preferida pelas larvas utilizando o gradiente de single-direcional (por exemplo, 18 ° C) é a temperatura no centro da placa do gradiente bidirecional (Figura 3E , F).

2. larval sincronização

  1. Nutra de moscas, deve ser usado para a postura.
    1. Misture fermento granulado e água destilada, com um pilão para fazer o fermento pasta. Cuidadosamente, moer e mexa até a consistência da massa é semelhante à manteiga de amendoim. Evite colar excessivamente seco, que pode descamar ao transferir moscas para frascos frescos ou molhar o colar, que pode interceptar as moscas.
    2. Usando um pilão, adicione a pasta de fermento perto as paredes internas dos frascos de Drosophila padrão, apenas acima da superfície do alimento.
    3. Contagem 12-35 fêmeas e até metade machos como muitos (mas não mais de 10) em um bloco de2 CO e adicionar as fêmeas e os machos a cada frasco contendo pasta de fermento.
    4. Para manter a mosca comida com a pasta de fermento úmida, enquanto as moscas se alimentam, combinar estes frascos em uma bandeja que contém até 100 frascos com 20 frascos abertos contendo apenas água destilada. Coloque o tabuleiro em um saco plástico e selar.
    5. Incube a bandeja em uma incubadora de 25 ° C por 48 h para que as fêmeas são nutridas adequadamente, permitindo-lhes apresentar um grande número de ovos.
  2. Configure os frascos para a postura.
    1. Transferi as moscas nutridas em novos frascos de alimentos para a coleta de ovos por tocar-lhes sobre. Não utilize CO2, que pode causar as moscas a pôr menos ovos sobre a seguinte janela de curto período de tempo.
      Nota: Os frascos de alimentos padrão drosófila são usados sem fermento colar para recolha de ovos.
    2. Permitir que as moscas que põem ovos por 3 h a 25 ° C, para que todos os ovos são recolhidos ao longo de uma janela de tempo relativamente estreita.
      Nota: Isso permitirá que as larvas sejam sincronizados na mesma fase do desenvolvimento.
    3. Coloque os frascos que contêm os ovos na bandeja que contém os frascos de água e aperte o saco. Incubar a 25 ° C, sob luz de h 12:12 h ciclos escuros.
    4. Idade das larvas por um determinado número de horas após a postura de ovos (AEL) dependendo da fase larval desejado.
      Nota: A tabela 1 é uma estimativa da relação entre a AEL e a fase larval, que irá variar dependendo do estoque de voar, comida usada, temperatura, etc. , a relação exacta entre a AEL e grau de desenvolvimento precisa ser de criação verificado por cada investigador utilizando critérios físicos, tais como a morfologia da boca ganchos e espiráculos11.

3. instalação do gradiente de temperatura

  1. Preparar o gradiente de single-direcional
    1. Para criar um ambiente úmido durante os ensaios, coloque os dois blocos de alumínio ligados a dois banhos de água em toalhas de papel molhadas, separados por 10 cm (Figura 2A).
    2. Ligue os dois banhos de água ~ 2 h antes de iniciar o ensaio para permitir tempo suficiente para que a temperatura dos blocos de alumínio para equilibrar.
      Nota: É aconselhável executar um experimento de simulação para determinar a temperatura de cada banho de água que é necessário para alcançar o desejado gradiente linear de temperatura. Alguns pares de temperatura típica para definir os banhos de água estão listados na tabela 2. No entanto, note que as temperaturas de superfície são afetadas pela temperatura ambiental. O comprimento da tubulação também afeta as temperaturas como lá está esfriando nos tubos. O comprimento da tubulação em nossa configuração é de 1,5 m.
    3. Microondas 100 mL de agarose a 1% na configuração de alta potência em um 500 mL redonda garrafa de boca larga e despeje a 25 mL/placa em uma nível bancada de ensaios. Prepare duas placas de ensaio, que podem ser colocadas sobre os blocos de alumínio, ao mesmo tempo (Figura 2A).
    4. Depois que a agarose solidificou (10-20 min), esfregar suavemente cada superfície de agarose com uma esponja de cozinha padrão ou uma esponja de melamina para tornar a superfície de agarose ligeiramente grossas, para que quando a pulverização de água sobre o gel de agarose, será criada uma membrana de água fino liso, e não gotas de água irão formar.
    5. Mergulhe totalmente as placas em um recipiente com água destilada até que o ensaio está pronto para ser executada para evitar que as placas ficando desidratado.
  2. Preparar um gradiente bidirecional (opcional)
    1. Para criar um ambiente úmido durante os ensaios, coloca três blocos de alumínio 8 centímetros distante (Figura 2B) sobre toalhas de papel molhadas.
    2. Ligue os dois banhos de água ~ 2 h antes de iniciar o ensaio para permitir tempo suficiente para que a temperatura dos blocos de alumínio para equilibrar.
      Nota: É aconselhável executar um experimento de simulação para determinar a temperatura de cada banho de água para o gradiente bidirecional. Alguns pares de temperatura típica para definir os banhos de água estão listados na tabela 3. No entanto, note que as temperaturas de superfície são afetadas pela temperatura ambiental. O comprimento da tubulação também afeta as temperaturas como lá está esfriando nos tubos. O comprimento da tubulação em nossa configuração é de 1,5 m.
    3. Para impedir que a agarose derramando fora da placa, enrole as bordas da placa de alumínio com rotulagem fita para formar uma parede de 10 mm de altura (Figura 2B).
    4. Usando a configuração de alta potência, microondas 200ml de agarose a 1% em 500 mL de uma rodada a garrafa de boca larga e despeje 120 mL sobre uma placa de ensaio.
    5. Depois que a agarose solidificou (~ 30 min), esfregar suavemente cada superfície de agarose com uma esponja de cozinha padrão ou uma esponja de melamina para fazer com que a superfície de agarose ligeiramente grossas, para que quando a pulverização de água sobre o gel de agarose, uma membrana de água fino liso é criada e não forma de gotículas de água.
    6. Mergulhe totalmente as placas de ensaio em um recipiente com água destilada até que o ensaio está pronto para ser executada para evitar que sequem.
  3. Configurar o gradiente de single-direcional
    1. Prepare reagentes e itens em um banco ao lado do aparelho de ensaio de gradiente (consulte a Tabela de materiais).
    2. Para promover a transferência de temperatura eficiente, preencha eventuais lacunas entre os blocos de alumínio e as placas de ensaio por pulverização de água na interface entre os blocos e a placa.
    3. Usando luvas, retire as placas de ensaio o recipiente de água. Se a água invade entre o gel de agarose e a placa e faz com que colisões para formar na superfície, retire a água com uma micropipeta P1000.
    4. Coloque as placas de ensaio sobre os blocos de alumínio para que as demarcações que são 2 cm de cada borda exatamente coincidir com as bordas dos blocos de alumínio (Figura 2A, C).
    5. Pulverização de água sobre a superfície da placa (uma membrana fina de água cobrindo a superfície de agarose é suficiente) para impedir a secagem do gel de agarose. Certifique-se que a membrana de água é contínuo e livre de gotículas de água, desde que larvas podem ficar preso em gotículas de água.
    6. Cobrir o sistema gradiente com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação da água e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Espere por 5-10 min permitir que a temperatura equilibrar.
    7. Verifique a temperatura da superfície em 12 pontos na placa (Figura 2). Tome duas medições dentro de cada zona para estabelecer se existe ou não a variabilidade dentro de uma zona. Certifique-se que a temperatura em ambos os pontos é de ± 0,2 ° C da temperatura desejada.
      Nota: A variabilidade dentro de uma zona geralmente ocorre porque as distâncias exatas dos dois pontos para a borda dos blocos de alumínio não são idênticas. Ajuste a posição da placa sobre os blocos de alumínio para certificar-se que as demarcações que são 2 cm de cada borda exatamente coincidir com as bordas dos blocos de alumínio.
    8. Se o gradiente de temperatura medido desvia o gradiente desejado, aumentar ou diminuir o Setting (s) temperatura de banho de água e verifique novamente a temperatura de superfície após a temperatura de bath(s) a água stabilize(s).
    9. Cobrir o sistema gradiente com uma caixa de papelão até começar o ensaio.
  4. Configurar o gradiente bidirecional (opcional)
    1. Prepare reagentes e itens em um banco ao lado do aparelho de ensaio de gradiente (consulte a Tabela de materiais).
    2. Pulverizador de água nas superfícies dos três blocos de alumínio para promover temperatura eficiente transferência de blocos de alumínio para as placas de ensaio através do preenchimento de eventuais lacunas entre as superfícies.
    3. Retire cuidadosamente as placas de ensaio o recipiente de água e coloque sobre os blocos de alumínio. Se a água invade entre o gel de agarose e a placa, que pode causar solavancos a forma sobre a superfície, remova a água com uma micropipeta P1000.
    4. Coloque a placa de ensaio sobre os blocos de alumínio, para que o midlines das zonas de primeira e últimas de qualquer borda correspondem exatamente as bordas dos blocos de alumínio de duas laterais (Figura 2B, D).
    5. Pulverização de água sobre a superfície da placa (uma membrana fina de água cobrindo a superfície de agarose é suficiente) para impedir a secagem do gel de agarose. Certifique-se que a membrana de água é contínuo e livre de gotículas de água, uma vez que as larvas podem ficar preso em gotículas de água.
    6. Cobrir o sistema gradiente com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação da água e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Espere 5-10 min para permitir que a temperatura equilibrar.
    7. Verifique a temperatura da superfície em dois pontos ao longo da linha mediana de cada uma das 10 zonas (Figura 2D). Tome duas medições dentro de cada zona para estabelecer se existe ou não a variabilidade dentro de uma zona. Certifique-se que a temperatura em ambos os pontos é de ± 0,2 ° C da temperatura desejada.
      Nota: A variabilidade dentro de uma zona geralmente ocorre porque as distâncias exatas dos dois pontos para a borda dos blocos de alumínio não são idênticas. Ajuste a posição da placa sobre os blocos de alumínio para certificar-se de que o midlines das zonas de primeira e últimas mais perto de cada borda correspondem exatamente as bordas dos blocos de alumínio de dois lado.
    8. Se o gradiente de temperatura medido desvia o gradiente desejado, ajustar o Setting (s) temperatura de banho de água e verifique novamente a temperatura de superfície após a temperatura de bath(s) a água stabilize(s).
    9. Cobrir os blocos com uma caixa de papelão até o início do ensaio.

4. lavagem e coleção larval

  1. Isolar as larvas limpas (opção 1)
    1. Adicione ~ 40 mL de solução de sacarose 18% para um tubo de ensaio de 50 mL. Colher todas as larvas da comida conj com um scoopula e transferência para a solução de sacarose de 18%.
    2. Misture bem, mas delicadamente, usando uma scoopula para separar os restos de comida de larvas. Espere por 30-60 s até a boia de larvas para a camada superior do tubo. Despeje a camada superior, contendo as larvas (~ 10 mL) para um outro tubo de 50 mL e encher o tubo com solução de sacarose 18% fresca. Espere por 30-60 s até a boia de larvas para a camada superior novamente.
      Nota: As partículas de alimento grande às vezes transferência juntamente com larvas e podem afetar larval thermotaxis se eles não são removidos. Se as partículas de alimento grande permanecem na camada superior, repita etapas 4.1.1-4.1.2, ou removê-los usando um scoopula manualmente.
    3. Transferir a camada superior de larvas (~ 10 mL) para dois outros tubos de 50 mL e encher os dois tubos com água destilada para reduzir a concentração de sacarose, para que as larvas rapidamente afundam na água. Espere por 30-60 s até as larvas afundam até o fundo. Mais rapidamente possível para impedir que as larvas se afogando, realize isto e as etapas a seguir.
    4. Descartar o máximo de água possível, inclinando-se suavemente os tubos. Combinar as larvas em um tubo deitando fora as larvas com a água restante e encher o tubo com água destilada.
    5. Espere por 30-60 s até que todas as larvas afundam-se para baixo e remover tanta água quanto possível, inclinando-se suavemente os tubos. Repita essa etapa de lavagem 2 - 4 vezes a inteiramente remover sacarose e toda comida visível.
    6. Elimine o máximo de água possível e transferir as larvas para um vazio 35 mm placa de Petri por decantação. Pulverize o tubo com água e usar um pincel pequeno para ajudar a transferência das larvas.
    7. Remova o excesso de água o prato de Petri utilizando uma micropipeta P1000. Deixe ~0.5 mL de água para prevenir a desidratação das larvas.
    8. Coloque a tampa sobre o prato para impedir que as larvas escapem. Rode a tampa de cabeça para baixo para reduzir a capacidade de larvas de escape através da pequena abertura entre a tampa e prato. Permitir que as larvas se recuperar para 10-20 min.
  2. Isolar as larvas limpas (opção 2)
    Nota: Este método alternativo para a limpeza de larvas reduz a possibilidade de sufocar as larvas durante o procedimento de lavagem. Para usar esse método, prossiga com as etapas a seguir depois de executar o 4.1.1-4.1.2 passos acima.
    1. Coloque um filtro de célula (300 µm, retém as larvas 72 h AEL ou mais velho) em cima de um tubo de 50 mL.
    2. Depois de confirmar que não há nenhum adultos corpos ou restos de comida, flutuando na superfície da solução de sacarose, despeje a camada superior, contendo as larvas através do filtro para interceptar todas as larvas na tela de malha. Lave as larvas completamente com água destilada até que o tubo de 50 mL é preenchido.
    3. Remova o filtro de célula com as larvas e descarte a água usada do tubo. Coloque o filtro contendo as larvas em cima do tubo vazio e lavar as larvas novamente com água destilada até que o tubo de 50 mL é preenchido.
    4. Vire o filtro de cabeça para baixo um vazio 35 mm placa de Petri e pulverizar a água da parte superior do filtro célula para transferir as larvas para o prato de Petri. Transferi as larvas restantes usando um pincel pequeno.
    5. Vá para a etapa 4.1.7 acima antes de prosseguir para a etapa 5.

5. ensaio e cálculo

  1. Remova a caixa de papelão e verifique a temperatura da superfície do gel imediatamente antes de transferir as larvas para a placa. Minimize o tempo que a caixa está aberta para evitar perturbar o equilíbrio da temperatura. Se a superfície estiver seca, pulverize uma pequena quantidade de água na superfície.
  2. Distribuir 150 ± 50 larvas, perto do centro de cada placa (entre as zonas 3 e 4 de 6 zonas) para o gradiente de single-direcional (zona de lançamento; A Figura 2).
    Nota: Para o gradiente de bidirecional, distribuir 200-400 larvas ao longo da zona média de cada metade (Figura 2D).
  3. Coloque uma tampa de microplacas sobre cada placa de ensaio para impedir que as larvas rastejando para fora. Cobrir a instalação com uma caixa de papelão para evitar a exposição à luz, que pode afetar a escolha larval no gel do agarose.
    Nota: Para o gradiente de bidirecional, não seria necessário para cobrir o prato com uma tampa, porque a placa é maior, e a temperatura preferida das larvas é na zona média. Consequentemente, poucas larvas se acumular nas bordas e tem uma oportunidade para rastejar para fora.
  4. Permita o ensaio proceder por 10-30 min para o gradiente de single-direcional e para min. 15-35 para o gradiente de bidirecional, dependendo da idade das larvas (tabela 4).
  5. Remova a caixa de papelão e a tampa de microplacas. Fotografe as placas acima usando uma câmera digital. Tira duas fotografias de cada placa de ensaio para que o investigador pode escolher aquele com melhor contraste e brilho para análise.
  6. Remova todas as larvas das placas de ensaio e, em qualquer lugar, fora as placas por aspiração.
  7. Limpe as placas de ensaio, os tubos e o filtro célula completamente com água destilada. Reutilize as placas de ensaio preparadas naquele dia, a menos que a superfície da agarose é danificada.
  8. Calcule a distribuição de porcentagem de larvas em cada zona.
    1. Abra a imagem fotográfica dos resultados do ensaio usando qualquer software que permite adicionar marcas para a imagem. Para indicar as zonas de ensaio, desenhe linhas verticais cada 2cm baseia as demarcações na placa de ensaio.
    2. Contar o número de larvas em cada zona e gravar os números. Não contam as larvas em regiões 0,5 cm em qualquer uma das paredes. O gel é mais grosso perto das muralhas, e as temperaturas de superfície não são lineares nestas regiões.
    3. Para o gradiente de single-direcional, calcule a percentagem de distribuição em cada zona da seguinte forma:
      (número de larvas em uma determinada zona de 2 cm) / (número total de larvas em 6 zonas) x 100.
    4. Para o gradiente de bidirecional, calcule a percentagem de distribuição em cada zona da seguinte forma:
      (número de larvas em uma determinada zona de 2 cm) / (número total de larvas em 5 zonas de cada lado do gradiente) x 100.

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Representative Results

Para estabelecer um único-direcional de 18 ° C e 28 ° C gradiente, definimos as temperaturas dos dois banhos de água de 16,8 ° C e 31 ° C. As temperaturas em 13 pontos Obtém-se medindo a temperatura em 26 posições dentro as partes superior e inferiores de todas as 6 zonas, as linhas de fronteira entre as zonas e os confins extremos da superfície do gel de agarose (Figura 2, 2E). A distribuição de temperatura ao longo do gradiente foi quase linear (Y = 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961) (Figura 2E).

Nós analisada as preferências de temperatura de larvas de controle (w1118) em várias idades. 1st (24 ± 1,5 h AEL), 2nd (48 ± 1,5 h AEL) e larvas de início-3rd (72 ± 1,5 h) mostrou picos na zona de 24 ° C (Figura 3A, B). As preferências de temperatura mudadas durante 3rd ínstar larval desenvolvimento. A maior percentagem de meados-3rd ínstar (96 ± 1,5 h AEL) acumulado na zona de 18 ° C (Figura 3A, B), e este preconceito aumentou com a idade. Entre larvas de ínstar final-3rd (pre-escalada; 120 ± 1,5 h AEL), ~ 50% agrupados na zona de 18 ° C, e a seleção desta temperatura foi ~ 4-fold superior a zona adjacente a 20 ° C (zona de 18 ° C, 50,2%; zona de 20 ° C, 15,1%; Figura 3A B). A tendência a acumular-se na zona de 18 ° C no w1118 não foi devido a um efeito de borda desde o atrasado-3rd ínstar larvas ainda acumuladas na zona de 18 ° C, usando um gradiente de temperatura bidirecional (Figura 3E, F ).

Testamos também larvas de ínstar final-3rd (120 ± 1,5 h AEL) com mutações em genes necessários para discriminar as diferenças de temperatura na faixa de confortável. Estes incluem trpA1, que é necessário para a selecção de temperatura normal no 18 ° C - 24 ° C gama5,7,8. Larvas com uma mutação nula no trpA1 (trpA11) distribuem-se igualmente sobre a inteira 18 ° C — gradiente de 28 ° C (Figura 3). Larvas, faltando apenas as A e B isoformas (trpA1-ABG4), ou as isoformas C e D (trpA1-CDG4) também mostram deficiências graves (Figura 3). Moscas codificam duas isoformas de fosfolipase Cβ (PLC21C e NORPA), e mutações que afetam norpA (norpAP24) mas não plc21c (plc21cP319) também interrompem a acumulação na faixa de 18 ° C ( Figura 3D).

Figure 1
Figura 1. Aparelhos para realização do ensaio de single-direcional gradiente de temperatura. (A) de alumínio teste placa utilizada para análise do comportamento thermotaxis larval. As 13 linhas pretas no topo e no fundo demarcam 12 zonas (10 mm cada). O fundo do prato é anodizado com tinta preta, para que seja mais fácil de visualizar as larvas. (B) dimensões da placa de alumínio (indicado em milímetros). O tamanho exterior da placa de alumínio é 140 x 100 x 9 mm. O tamanho interno da placa de alumínio é 130 x 90 x 8 mm. As marcações são separadas por 10 mm. A primeira e a última demarcação é 5 mm das bordas da área interna da placa. (C) Top e vistas do lado de um dos blocos de alumínio usada para controlar a temperatura do gradiente. O bloco tem dois conectores usados para unir-se aos tubos de silicone, que se conectar a um banho de água. (D) dimensões de um bloco de alumínio. O tamanho exterior do bloco de alumínio é 255 x 50 x 14 mm. O diâmetro do caminho interior de água é de 7 mm. Dois conectores de 30 mm à esquerda conectar com tubo de silicone que se estende até o banho de água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Configurações de gradiente do ensaio de single e bidirecional. (A) gradiente configuração de Single-direcional com duas placas de ensaio de alumínio em dois blocos de alumínio. As temperaturas dos blocos de alumínio são controladas pela água de dois banhos de água de circulação. (B) o acordo dos três blocos de alumínio, banhos de água e uma placa de alumínio (250 x 220 mm) para um gradiente bidirecional. Os blocos de esquerda e direito estão conectados para o banho de água a mesma e o bloco médio está ligado ao outro banho de água. A placa de ensaio de alumínio é empacotada com fita para formar uma parede de 10 mm para conter o agarose a 1%. (C) posições para verificar temperaturas (indicadas por pontos) e liberar as larvas na placa. Antes de iniciar um experimento, verifique a temperatura em dois pontos dentro de cada zona para confirmar que o gradiente de temperatura linear desejado é estabelecido. Larvas são liberadas na área indicada, perto da linha mediana. As larvas são contadas dentro de cada uma das zonas de 2 cm. (D) posições para verificar as temperaturas (indicadas por pontos) e as zonas de lançamento para as larvas em um gradiente de bidirecional. Um número igual de larvas é liberado ao longo da linha mediana de cada metade do gradiente bidirecional. Os números de larvas são contados em cada um dos 10 (2 cm) zonas. Um conjunto típico de temperaturas (18 ° C e 26 ° C) na superfície de agarose é indicado. (E) as temperaturas medidas ao longo das linhas de borda e midlines de cada zona em um gradiente de single-direcional de amostra. Dados representam temperaturas média ± SD. n = 8 ensaios (150 ± 50 larvas/ensaio). Partes desta figura são reproduzidas de et al . Sokabe 8 com pequenas modificações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Resultados representativos usando ensaios gradientes single-direcional e bidirecional. (A, B) Quer dizer percentagens de larvas em 6 zonas do gradiente de single-direcional. Os dados incluem 3rd ínstar larvas nas horas indicadas após a postura (AEL) de ovos. n = 6-7. As barras de erro em um representam ±SEM. (C) térmica distribuições do pre-escalada final-3rd ínstar larvas de controle (w1118) e trpA1 mutantes do gradiente de single-direcional. n = 3-4. As barras de erro representam ±SEM. (D) térmica distribuições das larvas ínstar final-3rd de controle (w1118) e PLCβ mutantes do gradiente de single-direcional. n = 4-6. As barras de erro representam ±SEM. (E) distribuição representativa de pre-escalada, tarde-3rd ínstar larvas (w1118) do gradiente bidirecional. As zonas de ensaio de esquerda e direita são indicadas por linhas pontilhadas e separadas por zona não-contagem no centro (região sombreada). (F) percentagem de pre-escalada tarde-3rd ínstar larvas (w1118) em cada zona ao longo do gradiente térmico. As larvas foram colocadas no canto esquerdo e o direito zonas de lançamento. As zonas de ensaio são separadas por uma zona de não-contagem de 3 cm no centro e as distribuições são calculadas de forma independente. As barras de erro representam SEMs. n = 3 ensaios (200-400 larvas/ensaio). Partes desta figura são reproduzidas de et al . Sokabe 8 com pequenas modificações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Horas AEL Estágio larval
24 1st ínstar
48 2nd ínstar
72 Início-3rd ínstar
96 Ínstar meados-3rd
120 Ínstar final-3rd , apenas antes de subir o palco

Tabela 1. A relação entre as horas depois (AEL) de postura de ovos e estágios larvais.

Gradiente de temperatura na placa de agarose (inclinação) Temperaturas dos banhos de água Temperaturas de blocos de alumínio
10.0-25,0 ° C (1.5° C/cm) ~6.5-7°C/~28.5°C ~8.5°C/~26.8°C
18,0-28,0 ° C (1° C/cm) ~16.8°C/~31.0°C ~17.8°C/~29.7°C
14.0-34,0 ° C (2° C/cm) ~10.0°C/~40.0°C ~11.8°C/~36.8°C
12.5-42,0 ° C (2,95 ° C/cm) ~7.0°C/~55.0°C ~9.4°C/~49.4°C

Tabela 2. Gradientes de temperatura típicas e as temperaturas correspondentes dos banhos de água e blocos de alumínio para gradientes direcionais simples.

Gradiente de temperatura na placa de agarose Temperaturas dos banhos de água Temperaturas de blocos de alumínio
22/10/22 ° C (1.5 ° C/cm) ~5.0°C /~25.0°C ~7.5°C/~24.0°C
26-18-26 ° C (1° C/cm) ~15.8°C /~30.6°C ~16.9°C/~28.4°C
30-14-30 ° C (2° C/cm) ~8.5°C /~36.4°C ~10.9°C/~32.8°C
36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm) ~5.0°C /~47.2°C ~7.9°C/~40.9°C

Tabela 3. Gradientes de temperatura típicas e as temperaturas correspondentes dos banhos de água e blocos de alumínio para gradientes bidirecional.

Idade larval (AEL) Tempo de ensaio (única direcional) Tempo de ensaio (bidirecional)
24 h 30 min 35 min
48 h 22 min 27 min
72 h 16 min 21 min
96 h 13 min 18 min
120 h 10 min 15 min

Tabela 4. Diferentes idades larvas (AEL) e os tempos de ensaio correspondentes.

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Discussion

Para garantir o sucesso do presente protocolo, é importante tomar medidas para obter números adequados de larvas a realizar os experimentos. Estes incluem pre-alimentando as moscas em frascos de levedura contendo colar para 2-3 d melhorar a postura de ovos. Os frascos precisam ser colocados em uma bandeja contendo frascos de água e colocado em um saco plástico transparente, que mantém a umidade dos alimentos e promove a alimentação eficaz por larvas, permitindo a exposição aos ciclos normais de claro-escuro. No entanto, o colar de levedura não deve ser tão macio que as moscas ficam presos. O número de fêmeas por frasco depende do genótipo. No caso de w1118, é geralmente adequado permitir ~ 12 fêmeas e machos de ~ 6 para pôr ovos para 3h. Dois frascos normalmente fornecem suficiente larvas (larvas de 100-200) para colocar em um prato para o ensaio de single-direcional. Se o estoque mosca põe ovos menos do que o selvagem-tipo ou é reduzida a proporção de larvas que eclodem, adicione os machos e fêmeas adicionais (até 30-35/frasco).

Existem muitas causas de variabilidade não intencional ao realizar estes ensaios. Fase de desenvolvimento afeta a preferência de temperatura das larvas. Consequentemente, é imperativo usar cuidadosamente as larvas de um estádio definido. Para isso, coletar larvas ao longo de um estreito (por exemplo, 3h). Desde a criação de condições (temperatura, umidade, ciclo claro-escuro e tipo de alimento) e algumas mutações afetam a taxa de desenvolvimento, não dependem estritamente o tempo depois ovo deitado para analisar comparativamente com a idade as larvas. É também importante examinar características físicas, tais como o tamanho da boca ganchos e espiráculos7 para determinar se as larvas de diferentes genótipos são na mesma fase do desenvolvimento. Os tempos para 1st, 2nd e 3rd ínstar larvas para desenvolver (tabela 1) são baseadas sobre o uso de alimentos à base de farinha de milho e incubação a 25 ° C, sob luz de h 12:12 h ciclos escuros. Larvas crescem mais devagar em alimentos à base de melaço. Frescura de hidratação e alimentação adequada também afeta o crescimento das larvas. A quantidade de água no alimento deve deixa a comida muito seca a casca volta do frasco nem frouxos devido ao excesso de água. Idealmente, a camada de ~ 5 mm mais próximo da superfície do alimento é condicionada pelas larvas crescentes e move-se facilmente quando o frasco for inclinado ou aproveitado. Esta condição pode ser conseguida usando alimentos frescos com 50-100 larvas.

É essencial estabelecer um gradiente de temperatura estável antes de iniciar o ensaio. Portanto, transformar o banho de água 1-2 h antes de iniciar o ensaio, como os banhos de água produzem calor e podem alterar a temperatura ambiente, que por sua vez têm o potencial de afetar o gradiente. Após 1-2 h, a temperatura ambiente mais quartos se equilibra. No entanto, isso deve ser determinado em cada ambiente. Além disso, ao gerar um gradiente com uma escala de temperatura (> 3,0 ° C/cm), pode ser difícil obter um gradiente estável. Um pequeno movimento da placa de ensaio mais significativamente altera o gradiente de temperatura quando o intervalo é grande (por exemplo, > 3,0 ° C/cm). Nós achamos que um gradiente de 1-2 ° C/cm produz os gradientes mais estáveis.

Há várias considerações adicionais que precisam ser controlados para limitar a variabilidade em ensaios thermotaxis. Lavar as larvas é crítico, como a presença de partículas de alimentos ou sacarose sobre as larvas pode afetar o ensaio. As etapas de lavagem devem ser realizadas cuidadosamente, mas rapidamente, porque limitar seu suprimento de oxigênio excessivamente enquanto eles estão submersos na água pode afetar sua saúde. Portanto, nós recomendamos usar o coador de célula (opção 2) para limpar as larvas. Um filtro com um tamanho de poro de 300 µm funciona bem para as larvas no início-3rd ínstar palco (72 h AEL) ou mais velho. Além disso, é importante executar experimentos ao mesmo tempo do dia, tal como o de Zeitgeber tempo ZT4 (ZT) para ZT8 (ZT = 0 é quando as luzes são ativadas), para limitar a variabilidade devido aos impactos dos ritmos circadianos na selecção de temperatura. O nível de umidade na placa de agarose também pode causar a variabilidade nos resultados. Enquanto a superfície das placas precisa ser úmido, gotículas de água poderiam interceptar as larvas e, portanto, devem ser evitadas.

Limitando a variabilidade em ensaios os tornará possível obter resultados robustos sem executar um grande número de experimentos independentes. Normalmente, 3-8 experimentos independentes são suficientes para obter um resultado confiável. Correcto apuramento dos resultados também é crítico para o sucesso dos ensaios thermotaxis. Não contam as larvas distribuídas nas regiões dentro de 0,5 cm das paredes de alumínio, desde que as temperaturas não são lineares, nestas regiões. Algumas larvas serão posicionadas na fronteira entre duas zonas, na época, que conclui-se o ensaio. Se mais de 50% do comprimento do corpo reside em uma zona, em seguida, inclua a larva na Tabulação para essa zona. Se uma larva é precisamente 50% em cada uma das duas zonas, então ser considerado o animal 0,5 larvas em cada zona.

Enquanto o ensaio gradiente permite que as larvas de discriminar uma gama de diferenças de temperatura, existem limitações para as temperaturas inferiores e superiores que podem ser testadas de forma eficaz. Não é viável para testar temperaturas < 10 ° C, desde a mobilidade das larvas diminui grandemente a baixas temperaturas. Apesar de gradientes com a alta temperatura atingir 42 ° C podem ser estabelecidas, quase não há larvas controle passar em qualquer zona > 28 ° C. Portanto, ensaios de gradientes contínuos não podem ser usados para discriminar as preferências de temperatura entre diferentes zonas > 28 ° C. No entanto, gradientes ensaios a essas temperaturas elevadas podem, potencialmente, ser usados para caracterizar os mutantes se eles mudaram altamente preferências de temperatura morna.

Se um mutante tem um defeito do aparelho locomotor, pode ser necessário conduzir experimentos adicionais para certificar-se que a preferência de temperatura aparente não é imprecisa devido a uma deficiência de movimento. Para resolver esse problema potencial, pode ser necessário estabelecer tempos de ensaio mais longos para permitir que o tempo adicional de animais mover-se para as zonas desejadas. O ensaio de gradiente bidirecional também pode ser empregado para testar se os animais selecione a mesma zona preferencial, independentemente de saber onde eles são colocados inicialmente na placa.

Em conclusão, os gradientes ensaios aqui descritos têm vantagens sobre outros ensaios thermotaxis. Enquanto escolha bidirecional ensaios são úteis, como eles podem produzir resultados robustos, especialmente quando as diferenças de temperatura entre as duas zonas são grandes, eles não são eficazes em revelar a temperatura ideal, preferida por larvas em uma única experiência. Para fazer isso requer realizando muitas combinações de escolha bidirecionais para determinar a mais preferida temperatura5,6,7. Em contraste, o gradiente fornece o animal a oportunidade de selecionar a zona de temperatura preferida em um ambiente com uma paisagem única temperatura contínua. Assim, não é necessário elaborar uma grande combinação de escolhas de duas vias para determinar o ambiente térmico preferido. Estudar thermotaxis usando um prato de Petri redondo tem sido empregado para avaliar os efeitos da temperatura sobre a dinâmica de movimento de uma larva de10. No entanto, é menos útil em discriminar entre preferências entre diferentes temperaturas, desde que cada zona é um tamanho diferente. Finalmente, devido à simplicidade de ensaio e sua utilidade em discriminar as preferências de pequena da temperatura em um único ensaio, pode ser empregado para dezenas de tela de genes candidatos potencialmente envolvidos na preferência de temperatura larval que pode caso contrário, ser negligenciado usando outros ensaios

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

C.M. é suportado pelo financiamento do NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) e o NIAID (1DP1AI124453).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

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References

  1. Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
  2. Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
  3. Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
  4. Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
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  6. Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
  7. Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
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  9. Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
  10. Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
  11. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

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Neurociência edição 136 drosófila larvas thermotaxis gradiente de temperatura comportamento somatosensation
Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de <em>Drosophila</em>
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Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A… More

Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

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