Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Drosophila larva termal tercihlerini belirlemek için bir sıcaklık gradyanı tahlil

Published: June 25, 2018 doi: 10.3791/57963
Automatic Translation
*1, *2,3, 1
1Neuroscience Research Institute and Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara, 2Division of Cell Signaling, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 3Thermal Biology Group, Exploratory Research Center on Life and Living Systems, National Institutes of Natural Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Burada, Drosophila larva sürekli termal degrade kullanarak tercih edilen ortam sıcaklığında belirlemek için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Meyve sineği Drosophila melanogaster, dahil olmak üzere birçok hayvan onların tercih edilen termal manzara aramaya sağlayan çevre sıcaklığı, ayrımcılık dakika farklılıklar yeteneğine sahiptirler. Larva sıcaklık tercihleri üzerinde tanımlanmış bir doğrusal Aralık tanımlamak için biz bir sıcaklık gradyanı kullanarak bir tahlil geliştirilmiştir. Bir tek yönlü eğim kurmak için iki Alüminyum blok her biri bireysel blok sıcaklığını denetler bağımsız su hamama bağlanır. İki blok geçişin alt ve üst sınırlarını ayarlayın. Sıcaklık gradyanı plaka aralarındaki uzaklığı kapsaması su kontrollü iki blok ötede bir özel kaplamalı alüminyum levha koyarak kurulur. Su blok üst kısmında ayarlanır alüminyum plaka uçları minimum ve maksimum sıcaklık tanımlar ve bölgeler arasında doğrusal bir sıcaklık gradyanı iki blok oluştururlar. Degrade tahlil farklı yaş larva için uygulanabilir ve mutasyonlar TRP kanalları ve sıcaklık ayrımcılık için gerekli olan opsins, kodlama genler etkileyen olanlar gibi fenotipleri sergi mutantlar tanımlamak için kullanılan.

Introduction

Thermotaxis hareket eden hayvanlar tarafından en uygun koşulları1,2,3bir ortam seçmek için istihdam edilmektedir. Eğer iklim aşırı sıcak veya soğuk, bu davranış yaşam için hayati önem taşımaktadır. Buna ek olarak, birçok hayvan çok küçük rahat aralığında sıcaklık farklılıkları duyarlıdır ve çevresi ile ideal bir sıcaklık ararlar. Bu onların vücut ısısı çevre ile equilibrate meyve sinekleri gibi poikilothermic organizmalar için belirli önem taşıyor. Larva thermotaxis izlemek için deneyleri ve moleküler sensörler Drosophila geçici potansiyel reseptör (TRP) kanalları4,5,6gibi rolleri açıklığa kavuşturulması enstrümantal oldunuz. rhodopsins7,8ve ionotropic reseptör reseptörleri (IRS)9, hangi sıcaklık hassasiyeti ile bu hayvanların farklı sıcaklık aralıklarında bağışlamak.

Bir iki yönlü seçim test termal larvaları6,7tercihlerinde çalışmaya bir yaklaşım sağlar. Tahlil iki farklı sıcaklık bölgeleri kurulması üzerine kuruludur ve hayvanlar üzerinde başka bir tarafı seçmek izin verir. Çift yönlü seçenek test sonuçlarından sağlam, özellikle sıcaklık iki seçenek arasında büyük farklar olabilir. Her tahlil sadece iki grup tabulating gerektirdiğinden, buna ek olarak, verileri bir basit tercih dizin olarak ifade edilebilir. Rahatlık ve kolaylık-in iki yönlü seçim deneyleri de genetik ekranlara mükellef bulunmaktadır. Ancak, büyük bir sınırlama birçok deney vahşi-türü veya mutant hayvanlar tercih edilen sıcaklığını kurmak için gerekli olmasıdır.

Degrade bir tahlil tercih edilen sıcaklık tek tahlil8' kurmak için bir fırsat sunuyor. Ayrıca, iki yönlü seçim test farklı olarak, bu hayvan, bir grup dağılımı değerlendirilmesi sıcaklıklar sürekli bir dizi ile karşı karşıya izin verir. Bir degrade tahlil bir petri ve tek hayvan kullanır ve bireysel hayvanlar10ayrıntılı davranışını karakterize için uygundur. Ancak, Petri yemekler yuvarlak olduğundan, sıcaklık bölgeleri boyutları değişir ve Merkezi'nden mesafeye göre aşamalı olarak daha küçüktür. Bu nedenle, bu kurulum nüfus hayvanların sıcaklığı seçimleri izlemek için ideal değildir.

Larva grupları sıcaklık tercihlerini değerlendirmek için uygundur sürekli bir termal degrade aparatı ve dikdörtgen bir arena istihdam burada açıklanmıştır. Aparatı oluşturmak ve montajı kolaydır. Buna ek olarak, gradyandaki doğrusal ve 42 ° C. 10 ° C arasında büyük sıcaklık aralıkları üzerinden thermotaxis değerlendirmek için kullanılabilir gibi esnektir Tahlil hızlı ve doğru sözlü gerçekleştirmek ve tekrarlanabilir veri verir. Larva tercih sıcaklığını raporlama yanı sıra, hayvan nüfusu tercihleri tek bir deneyde bir tüm doğrusal aralığında ortaya çıkarır. Bu avantajlar nedeniyle thermotaxis için gerekli genler tanımlamak için mükemmel bir seçimdir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ekipman imalat ve Montaj cihazları, degrade deneyleri için

  1. Alüminyum tahlil plakaları tek yönlü degrade tahlil için imal.
    1. Trim ve her alüminyum tahlil plaka (Şekil 1A) alüminyum şerit testere kullanarak tek bir parça dışarı eziyet ve aşağıdaki boyutları ile dikey değirmen keskin: dış boyutu 140 x 100 x 9 mm ve iç boyutu 130 x 90 x 8 mm (Şekil 1B). Larvalar görselleştirmek ve pas önlemek kolaylaştırmak için siyah boya ile her tahlil plaka içine Eloksal.
      Not: Tek yönlü eğim için alüminyum tahlil plakaların imalat makinesi salonu tarafından yapılır. Anodization ticari bir satıcı tarafından gerçekleştirilir.
    2. Her tahlil plaka ile 13 demarcations, kalıcı bir kalem kullanarak 10 mm tarafından ayrılmış alt ve üst jantlar işaretleyin. İlk ve son demarcations 5 mm iç kenarından tahlil plakaların (Şekil 1A, B) yerleştirin.
  2. Alüminyum tahlil plaka çift yönlü gradyan için imal etmek, bir alüminyum levha sac makası kullanarak aşağıdaki boyutları ile kesme: 250 x 220 x 2 mm. Eloksal siyah boya ile tahlil plakalar.
    Not: Çift yönlü degradeler için alüminyum tahlil plakaların imalat makinesi salonu tarafından gerçekleştirilir. Anodization ticari bir satıcı tarafından yapılır.
  3. Alüminyum blok imal.
    Not: İki blok tek yönlü eğim için gerekli olan ve üç blok çift yönlü degrade için ihtiyaç vardır.
    1. Alüminyum blok (Şekil 1 c) alüminyum şerit testere (50 x 255 x 14 mm boyutlarında) kullanarak tek bir parçası uzak kesmek (Şekil 1 c, D).
    2. Matkap dikey bir değirmen ve iş parçacığı yiv açık biter bir tarafta (Şekil 1 d) kullanılarak su kanalı (7 mm içinde çap) bloktaki. Cıvata ve U şeklinde su kanalı (Şekil 1 c, D) oluşturmak için iplik mühür bandı ile yivli delikleri kapatın.
      Not: Alüminyum tahlil blok imalatı imalat tarafından gerçekleştirilir.
    3. Alüminyum blok (Şekil 1 d) konektöre vidaların ile düzeltmek ve iplik mühür bandı bir ucunda. Birden çok barbs ile diğer ucunu silikon (ID 1/4" x 3/8" x 1/16" duvar OD) boru içine sığacak.
  4. Buzdolabında/ısıtmalı iki dolaşımdaki banyo almak.
  5. Degrade tahlil sistemi için ısı kontrollü taşları bir araya getirin.
    1. Böylece her bloğu sıcaklığı bağımsız bir su sistemi (Şekil 2A) dolaşan tarafından kontrol edilir tek yönlü eğim için her iki alüminyum blokların ayrı su banyosu için bağlanma. Silikon tüp (ID 1/4" x 3/8" x 1/16" duvar OD) su banyosu çıkış Alüminyum blok (Şekil 2A) iç tarafında konektörüne bağlamak için kullanın. Ayrıca, boru su banyosu koya Alüminyum blok dış yan konektörüne bağlamak için kullanın.
    2. Çift yönlü gradyan için iki üç blok altında sol ve sağ taraflarındaki, plaka koyun ve onları aynı su banyosu (Şekil 2B) boru ile bağlanın. Üçüncü Alüminyum blok ikinci bir su banyosu ve yer aşağıda (Şekil 2B) plaka ortasına takın.
      Not: Eğer larvalar bir kenar veya diğer tek yönlü eğim bölgede birikir bu cihazları ve tahlil tek gerekli olan. Eğer öyleyse, olsun veya olmasın bir kenar efekti değerlendirmek önemlidir. Bu olasılığı sınamak için tek yönlü eğim (örneğin 18 ° C) kullanarak larva tarafından tercih edilen kenar bölge sıcaklık sıcaklık çift yönlü eğim (Şekil 3E tabak ortasında olduğu bir çift yönlü degrade oluşturmak , F).

2. larva eşitleme

  1. Sinekler yumurta döşeme için kullanılacak besler.
    1. Mix Maya granül ve hamur maya yapmak bir havaneli ile distile su. İyice eziyet ve hamur tutarlılık fıstık ezmesi için benzer kadar karıştırın. Sinekler için taze ampul aktarırken pul, veya sinekler tuzak Yapıştır ıslak aşırı kuru hamur, kaçının.
    2. Bir havaneli ile kullanarak, Maya Yapıştır gıda yüzeyinin hemen üzerinde standart Drosophila şişeleri iç duvarları yakın ekleyin.
    3. Sayısı 12-35 kadın bir CO2 yastık üzerinde (ama hayır daha--dan 10) yarım gibi birçok erkek için ve kadın ve erkek her Maya Yapıştır içeren flakon için ekleyin.
    4. Anında tutmak için Maya-hamur nemli, yemekle sinekler yemek yerken birleştirmek ilâ 100 şişe içeren 20 açık şişeleri ile distile su sadece tutan bir tepsi içinde bu tüpleri. Tepsiyi şeffaf plastik bir torbaya koyun ve kapatın.
    5. Böylece kadın yeterince, böylece çok sayıda yumurta bırakmaya sağlayarak beslenir tepsiyi 25 ° C kuluçka 48 h için kuluçkaya.
  2. Tüpleri yumurta döşenmesi için ayarlayın.
    1. Beslenen sinekler üzerinden dokunarak yeni gıda tüpleri yumurta toplamak için içine aktarın. CO2, sinekler aşağıdaki kısa süre penceresi üzerinde daha az yumurtlamak neden olabilir kullanmayın.
      Not: Standart Drosophila gıda tüpleri yumurta toplama için Maya Yapıştır kullanılır.
    2. Böylece tüm yumurta bir nispeten dar zaman pencere üzerinde toplanan 25 ° C'de 3 h için yumurtlamak sinekler izin.
      Not: Bu aynı gelişim aşamasında eşitlenecek larvalar sağlayacaktır.
    3. Su flakonluk tepsi içinde yumurta içeren şişeleri yerleştirin ve çanta sıkın. 25 ° c altında 12 s ışık: 12 kuluçkaya s karanlık döngüleri.
    4. Larvalar saat sonra yumurta (AEL) bağlı olarak larva sahne döşeme istenen belirli bir dizi için yaş.
      Not: Tablo 1 saat AEL ve sinek hisse senedi bağlı olarak değişir, larva sahne arasındaki ilişkinin bir tahmin olduğunu kullanılan, gıda sıcaklık AEL ve gelişimsel sahne kesin ilişkisi olması gerekir vb yetiştirme ağız kanca ve vızıltısı11morfolojisi gibi fiziksel ölçütler kullanarak her araştırmacı tarafından doğrulanmadı.

3. Sıcaklık gradyanı Kur

  1. Tek yönlü eğim hazırlamak
    1. Deneyleri sırasında bir nemli ortam ortam oluşturmak için iki su banyo 10 cm (Şekil 2A) tarafından ayrılmış ıslak kağıt havlu üzerinde bağlı iki Alüminyum blok yerleştirin.
    2. İki su banyo ~ 2 h equilibrate için alüminyum blokların sıcaklık için yeterli zaman tanımak için tahlil başlatılıyor önce açın.
      Not: İstenen lineer sıcaklık gradyanı sağlanması için gerekli her su banyosu sıcaklığı belirlemek için sahte bir deney gerçekleştirmek için önerilir. Su banyoları ayarlamak için bazı tipik sıcaklık çiftleri Tablo 2' de listelenmiştir. Ancak, yüzey sıcaklıkları ortam sıcaklığı tarafından etkilendiğini unutmayın. Ayrıca etkiler boru uzunluğu sıcaklık olarak orada soğutma tüplerde. Bizim kurulumunda boru 1,5 m uzunluğundadır.
    3. % 1'özel, yüksek güçlü ayarında yuvarlak geniş ağız şişe 500 ml 100 mL mikrodalga ve 25 mL dökün/plaka üzerinde bir düzey benchtop tahlil. Alüminyum bloklar üzerinde aynı anda (Şekil 2A) yerleştirilen iki tahlil tabak hazırlamak.
    4. Sonra özel (10-20 dk) katılaşmış, böylece su üzerinde özel jel ilaçlama, düz ince su membran oluşturulur bir standart mutfak sünger veya özel yüzeyi biraz kaba olmak için bir Melamin Sünger ile her özel yüzey hafifçe ovalayın, ve hiçbir su damlacıkları oluşturacak.
    5. Tahlil plakaları kurumuş gelen önlemek için yapılması hazır olması ne kadar tamamen distile su ile bir kapta plakaları daldırın.
  2. Bir çift yönlü eğim (isteğe bağlı) hazırlamak
    1. Deneyleri sırasında bir nemli ortam ortam oluşturmak için üç Alüminyum blok 8 cm arayla (Şekil 2B) ıslak kağıt havlu üzerine yerleştirin.
    2. İki su banyo ~ 2 h equilibrate için alüminyum blokların sıcaklık için yeterli zaman tanımak için tahlil başlatılıyor önce açın.
      Not: Her su banyosu için çift yönlü degrade sıcaklığı belirlemek için sahte bir deney gerçekleştirmek için önerilir. Bazı tipik sıcaklık çift su banyoları ayarlamak için Tablo 3' te listelenir. Ancak, yüzey sıcaklıkları ortam sıcaklığı tarafından etkilendiğini unutmayın. Ayrıca etkiler boru uzunluğu sıcaklık olarak orada soğutma tüplerde. Bizim kurulumunda boru 1,5 m uzunluğundadır.
    3. Özel plaka dışarı dökülmesini önlemek için bir 10 mm-yüksek duvar (Şekil 2B) oluşturmak için teyp etiketleme ile alüminyum plaka kenarlarını sarın.
    4. Yüksek güç ayarı, mikrodalga 200 mL % 1'özel bir 500 ml kullanarak geniş ağız şişe yuvarlak ve 120 mL bir tahlil tabağa dökün.
    5. Her özel yüzey bir standart mutfak sünger veya özel yüzey üzerinde özel jel su püskürtme, düz ince su membran oluşturulur ki biraz kaba, yapmak için bir Melamin Sünger ile ve Hayır özel (~ 30 min) katılaşmış sonra hafifçe ovalayın su damlacıkları formu.
    6. Tahlil kurumasını engellemek için yapılması hazır olması ne kadar tamamen distile su ile bir kap içinde tahlil plakaları daldırın.
  3. Tek yönlü eğim ayarla
    1. Reaktifler ve öğeleri ( Tablo reçetesigörmek) degrade tahlil aparatı yanında bir bankta hazırlayın.
    2. Verimli ısı transferi teşvik etmek, blok ve plaka arasında arayüz, su püskürtülerek Alüminyum blok ve tahlil plakaları arasındaki boşlukları doldurun.
    3. Eldiven kullanarak, tahlil plakaları su kapsayıcıdan kaldır. Su özel jel ve plaka arasında işgal etti ve yüzeyde darbe forma neden olursa, P1000 micropipette suyla kaldırın.
    4. Her iki kenarından 2 cm tam olarak vardır demarcations kenarları alüminyum blokların (Şekil 2A, C) eşleşecek şekilde tahlil Levha alüminyum bloklar üzerinde yerleştirin.
    5. Sprey su (özel yüzeyini örten bir ince su membran yeterli) plaka yüzeyine özel jel kurumasını önlemek için. Larva su damlacıkları tuzağa olsun bu yana su membran sürekli ve su damlacıkları ücretsiz olduğundan emin olun.
    6. Degrade sistemi su buharlaşma azaltmak için bir karton kutu ile kapak ve jel yüzey sıcaklığını istikrara yardımcı. 5-10 dakika için sıcaklık equilibrate izin vermek bekleyin.
    7. Plaka (Şekil 2C) üzerinde 12 noktalarda yüzey sıcaklığını kontrol edin. Olup olmadığını bir bölgedeki değişkenlik kurmak için her bölgedeki iki ölçümler almak. Her iki noktalar sıcaklığında ± 0.2 ° C istenilen sıcaklık içinde olduğundan emin olun.
      Not: Alüminyum blok kenarına iki noktalar tam mesafeleri aynı değildir değişkenlik bir bölgedeki genellikle kaynaklanır. Her iki kenarından 2 cm tam olarak vardır demarcations kenarları alüminyum blokların eşleştiğinden emin olmak için alüminyum blok tabağa konumunu ayarlamak.
    8. Ölçülen sıcaklık değişimi istediğiniz degrade sapma, artırmak veya su banyo sıcaklığı setting(s) azaltmak ve su bath(s) sıcaklığını stabilize(s) sonra yüzey sıcaklığı tekrar kontrol.
    9. Bir karton kutu degrade sistemiyle tahlil başlangıç kadar kapsar.
  4. Çift yönlü degrade kadar (isteğe bağlı) ayarla
    1. Reaktifler ve öğeleri ( Tablo reçetesigörmek) degrade tahlil aparatı yanında bir bankta hazırlayın.
    2. Sprey su verimli ısı transferi Alüminyum blok ötede tahlil plakaları yüzeyler arasındaki boşlukları doldurarak tanıtmak için üç Alüminyum blok yüzeylerde.
    3. Tahlil plakaları dikkatle su kapsayıcıdan kaldır ve alüminyum bloklar üzerinde yerleştirin. Özel jel ile çarpmak forma yüzeyde neden olabilir, plaka arasında su işgal P1000 micropipette suyla kaldırın.
    4. Böylece ilk ve son bölgeleri her iki kenarından midlines tam olarak iki yan alüminyum blok (Şekil 2B, D) kenarlarına uyacak tahlil plaka alüminyum bloklar üzerinde yer.
    5. Sprey su (özel yüzeyini örten bir ince su membran yeterli) plaka yüzeyine özel jel kurumasını önlemek için. Larva su damlacıkları tuzağa olsun bu yana su membran sürekli ve su damlacıkları ücretsiz olduğundan emin olun.
    6. Degrade sistemi su buharlaşma azaltmak için bir karton kutu ile kapak ve jel yüzey sıcaklığını istikrara yardımcı. Equilibrate sıcaklık izin vermek için 5-10 dk bekle.
    7. Her 10 bölgeleri (Şekil 2B) orta hat boyunca iki noktalarda yüzey sıcaklığını kontrol edin. Olup olmadığını bir bölgedeki değişkenlik kurmak için her bölgedeki iki ölçümler almak. Her iki noktalar sıcaklığında ± 0.2 ° C istenilen sıcaklık içinde olduğundan emin olun.
      Not: Alüminyum blok kenarına iki noktalar tam mesafeleri aynı değildir değişkenlik bir bölgedeki genellikle kaynaklanır. Midlines ilk ve son bölgeleri her kenarı en yakın tam olarak iki yan alüminyum blokların kenarlarına uyacak emin olmak için alüminyum blok tabağa konumunu ayarlamak.
    8. Ölçülen sıcaklık değişimi istediğiniz degrade sapma, su banyo sıcaklığı setting(s) ayarlamak ve su bath(s) sıcaklığını stabilize(s) sonra yüzey sıcaklığı tekrar kontrol.
    9. Bir karton kutu bloklarla tahlil başlayana kapsar.

4. larva toplama ve yıkama

  1. Temiz larva (seçenek 1) izole
    1. ~ 40 mL % 18 sükroz çözüm 50 mL tüp bebek için ekleyin. Gıda vial(s) bir scoopula ve transferi ile-% 18 sükroz çözüm bütün larva kepçe.
    2. Yavaşça bir scoopula larvalar yiyecek enkazı ayırarak ama iyice karıştırın. 30-60 s için tüp üst tabakası için larva kayan nokta kadar bekleyin. Larva (~ 10 mL) içeren üst tabaka için başka bir 50 mL tüp dökün ve tüp taze % 18 sükroz çözüm ile doldurun. 30-60 s için tekrar üst tabaka için larva kayan nokta kadar bekleyin.
      Not: Büyük yemek parçaları bazen birlikte larva transfer ve değil kaldırılırsa larva thermotaxis etkileyebilir. Büyük yiyecek parçacıklarının üst katmanda kalırsa, adımları 4.1.1-4.1.2 yinelemek veya bir scoopula kullanarak bunları el ile kaldırın.
    3. Larva (~ 10 mL) üst tabakası iki diğer 50 mL tüpler için aktarmak ve larva hızla suya lavabo iki tüp sükroz konsantrasyon azaltmak için distile su ile doldurun. Larvalar lavabo altına kadar 30-60 s için bekleyin. Larvalar boğulmaktan önlemek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde bu ve aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    4. Daha fazla su mümkün olduğunca tüpler hafifçe eğerek atmak. Kalan su ile larva dökülen bir tüpün içine larva birleştirin ve tüp distile su ile doldurun.
    5. 30-60 s için tüm larvaların lavabo ve tüpler hafifçe eğerek mümkün olduğu kadar su kaldırın bekleyin. 2 - 4 kez tamamen kaldır sukroz ve tüm görünür yemek için bu çamaşır tekrarlayın.
    6. Su mümkün olduğunca daha fazla atın ve larvalar decanting tarafından bir boş 35 mm Petri kabına aktarmak. Tüp su ile sprey ve larva transferi yardım için küçük bir boya fırçası kullanın.
    7. Aşırı su Petri kabına P1000 micropipette kullanarak kaldırın. ~0.5 mL larva susuzluktan önlemek için su bırakın.
    8. Kapağı larvalar kaçan gelen önlemek için çanak yerleştirin. Baş aşağı larva küçük boşluk çıkış kapağı ve yemek arasında yeteneği azaltmak için kapağı açın. Larvalar 10-20 dk için kurtarmak izin verir.
  2. Temiz larva (seçenek 2) izole
    Not: larva temizlik için bu alternatif yöntemi larvalar yıkama işlemi sırasında boğucu olasılığını açığının etkisini azaltır. Bu yöntemi kullanmak için yukarıdaki adımları 4.1.1-4.1.2 yaptıktan sonra aşağıdaki adımlara devam edin.
    1. Bir hücre süzgeç koyun (300 µm, larva 72 h AEL korur veya daha büyük) 50 mL tüp üstüne.
    2. Hiçbir yetişkin organları veya sukroz çözüm yüzeyinde yüzen gıda artıkları olduğunu onayladıktan sonra mesh ekrandaki bütün larva yakalamak için süzgeç aracılığıyla larva içeren üst tabaka dökün. 50 mL tüp doldurulana kadar larva distile su ile iyice yıkayın.
    3. Larva ve kullanılan su atmayın hücre süzgeç tüm tüpünden kaldırın. Boş tüp üzerine larva içeren süzgeç koyun ve 50 mL tüp doldurulana kadar larva tekrar distile su ile yıkayın.
    4. Süzgeç baş aşağı bir boş 35 mm Petri kabına açmak ve sprey su larvalar Petri kabına aktarmak için hücre süzgeç tepesinden. Küçük bir boya fırçası kullanarak kalan larvalar aktarın.
    5. Devam etmeden önce yukarıda 4.1.7 adım adım 5'e devam.

5. tahlil ve hesaplama

  1. Çıkarmak belgili tanımlık karton kutu ve hemen plakasına larvalar aktarmadan önce jel yüzey sıcaklığını kontrol edin. Karton kutu sıcaklık denge etkilemesini önlemek için açık olduğu süreyi en aza indirmek. Yüzey kuru ise, sprey su küçük bir miktar yüzeyi.
  2. Her plaka (bölgeler arasında 3 ve 4 6 bölgeleri dışında) için tek yönlü eğim (bırakma bölgesine; merkezine yakın 150 ± 50 larva dağıtmak Şekil 2C).
    Not: çift yönlü degrade için 200-400 larva her yarı orta bölge boyunca dağıtmak (Şekil 2B).
  3. Mikroplaka kapak larvalar dışarı taramasını engellemek için her tahlil plaka üzerine getirin. Kur özel jel larva seçim etkileyebilir ışığa maruz önlemek için bir karton kutu ile kapak.
    Not: çift yönlü degrade için bir kapak ile plaka plaka daha büyük olduğu ve larvalar tercih edilen sıcaklığını Orta bölgesinde karşılamak gerekli olması gerektiği değil. Sonuç olarak, birkaç larva kenarlarında birikir ve sürünerek fırsatınız.
  4. Tahlil için 10-30 dakika ve 15-35 dk larva (Tablo 4) yaş bağlı olarak çift yönlü gradyan için tek yönlü eğim için devam etmek izin verir.
  5. Karton kutu ve Mikroplaka kapağı kaldırın. Bir dijital kamera ile yukarıda plakaları fotoğraf. Böylece araştırmacı olan daha iyi bir kontrast ve parlaklık analiz için seçebilirsiniz her tahlil plaka iki fotoğraf çekmek.
  6. Tüm larvalar tahlil plakaları ve herhangi bir yeri plakaları dışında aspirasyon tarafından kaldırmak.
  7. Tahlil tabaklar, tüpler ve hücre süzgeç distile su ile iyice temizleyin. Özel yüzeyi hasarlı sürece o gün hazırlanan tahlil levhaları yeniden.
  8. Larva her bölge yüzde dağılımı hesaplayın.
    1. Fotoğrafik görüntü işaretler görüntüye eklemek verir herhangi bir yazılım kullanarak tahlil sonuçları açın. Tahlil bölgeleri belirtmek için her 2 cm demarcations tahlil plaka üzerinde temel alan dikey çizgiler çizin.
    2. Larva her bölge saymak ve sayıları kaydetmek. Larva bölgelerde herhangi bir duvar 0.5 cm dikkate alınmaz. Jel duvarlar kalındır ve yüzey sıcaklıkları bu bölgelerde doğrusal değildir.
    3. Tek yönlü eğim için her bölgedeki yüzde dağılımını aşağıdaki gibi hesaplar:
      (verilen 2 cm bölgesinde larva sayısı) / (Toplam sayısı 6 bölgelerinde larva) x 100.
    4. Çift yönlü degrade için her bölgedeki yüzde dağılımını aşağıdaki gibi hesaplar:
      (verilen 2 cm bölgesinde larva sayısı) / (larva geçişin her tarafta 5 bölgelerinde toplam sayısı) x 100.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bir 18 ° C - 28 ° C tek yönlü kurmak için degrade, biz iki su banyo sıcaklıklarında 16.8 ° C ile 31 ° c için ayarla Biz 13 puan sıcaklıklarda tüm 6 bölgeler, bölgeler arasında kenarlık çizgisi üst ve alt bölümleri içinde 26 pozisyonlarda ve özel jel yüzeyi (Şekil 2C, 2E) aşırı ucundaki sıcaklık ölçülerek elde. Sıcaklık dağılımı degrade boyunca yaklaşık doğrusal (Y 0.9672 * X + 16.19, R2 = 0.9961 =) (Şekil 2E).

Çeşitli yaş denetim (w1118) larvaları sıcaklık tercihlerini denetlesinler. tepeler 24 ° C bölgesinde (Şekil 3A, B) gösterdi 1st (24 ± 1,5 saat AEL), 2nd (48 ± 1,5 saat AEL) ve erken-3rd larva (72 ± 1,5 saat). 3rd sırasında değişti sıcaklık Tercihleri Larva geliştirme biçim. 3 ortard biçim (96 ± 1,5 saat AEL) büyük yüzdesi (Şekil 3A, B) 18 ° C bölgesinde biriken ve bu önyargı ile yaşını arttı. (Önceden tırmanma; 120 ± 1,5 saat AEL) geç-3rd INSTAR larva arasında ~ %50 18 ° C bölgesinde kümelenmiş ve bu sıcaklık yelpazesi oldu ~ 4'e katlanmış bitişik 20 ° C bölgesi daha yüksek (18 ° C bölgesi, %50.2; 20 ° C bölgesi, %15,1; Şekil 3A B). Geç-3rd biçim w1118 18 ° C bölgesinde birikir meyil bir kenar etkisi nedeniyle hala 18 ° C bölgesinde birikmiş larva bir çift yönlü sıcaklık değişimi (Şekil 3E, F kullanarak değildi ).

Biz de rahat aralığı ayrımcılık sıcaklık farklılıkları için gerekli genler geç-3rd INSTAR larva (120 ± 1,5 saat AEL) mutasyonlar ile test. Bunlar trpA1, normal sıcaklık seçimi 18 ° C - 24 ° C aralığı5,7,8için gereken içerir. Larva trpA1 (trpA11) boş bir mutasyon ile eşit olarak tüm 18 ° C üzerinde dağıtmak — 28 ° C degrade (Şekil 3 c). Sadece A ve B izoformlarının (trpA1-ABG4) veya C ve D izoformlarının (trpA1-CDG4) Ayrıca eksik larva ciddi bozukluklar (Şekil 3 c) göster. Fosfolifaz Cβ (PLC21C ve NORPA) iki izoformlarının sinekler kodlamak ve mutasyonlar da değil plc21c (plc21cP319) norpA (norpAP24) etkileyen birikimi 18 ° C aralığında ( bozabilir Şekil 3D).

Figure 1
Şekil 1. Tek yönlü Sıcaklık gradyanı tahlil gerçekleştirmek için aparat. (A) bir alüminyum plaka larva thermotaxis davranış raporlaması için kullanılan test. 13 siyah çizgiler üst ve alt 12 bölgeleri (10 mm her) ayırma. Böylece larvalar görselleştirmek daha kolay alt plaka siyah boya ile Eloksal. (B) Boyutlar (mm olarak gösterilen) alüminyum plaka. Dış alüminyum plaka 140 x 100 x 9 mm uzunluğundadır. İç alüminyum plaka 130 x 90 x 8 mm uzunluğundadır. Demarcations tarafından 10 mm ayrılır. İlk ve son sınır plaka iç alanının kenarları üzerinden 5 mm'dir. (C) Top ve görünümleri bir alüminyum blokların geçişin sıcaklık kontrol etmek için kullanılır. Blok bir su banyosu bağlanmak silikon tüpler bağlamak için kullanılan iki bağlayıcı içermiyor. (D) boyutlarında bir alüminyum blok. Dış alüminyum blok 255 x 50 x 14 mm uzunluğundadır. İç su yolu çapı 7 mm olduğunu. Sol iki 30 mm konektörünü su banyosu uzanır silikon tüp bağlantı kurun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Tek ve çift yönlü degrade tahlil ayarları. (A) tek yönlü degrade kurulum iki Alüminyum blok üzerinde iki alüminyum tahlil plakalı. Alüminyum blok sıcaklıklarında iki su banyo su dolaşan tarafından kontrol edilir. (B) çift yönlü degrade için düzenleme üç Alüminyum blok, su banyoları ve alüminyum levha (250 x 220 mm). Sol ve sağ blok aynı su banyosu bağlı olan ve Orta blok diğer su banyosu bağlı. Alüminyum tahlil plaka % 1'özel içerecek bir 10 mm duvar oluşturmak için bant ile sarılır. (C) pozisyonlar (nokta ile gösterilen) sıcaklık kontrol etmek ve larva plaka üzerinde serbest bırakmak için. Bir deneme işlemini başlatmadan önce istenen lineer sıcaklık gradyanı kurulur onaylamak için her bölgedeki iki noktalarda sıcaklığını kontrol edin. Larva orta hat yakınındaki belirtilen alanı içinde serbest bırakılır. Larvalar her 2 cm bölgeleri içinde sayılır. (D) pozisyonlar (nokta ile gösterilen) sıcaklık ve serbest bölgeler üzerinde bir çift yönlü degrade larva için kontrol etmek. Larva eşit sayıda her yarı çift yönlü geçişin orta çizgi serbest bırakılır. Larva sayıları her 10 (2 cm) bölgeleri sayılır. Sıcaklıklar (18 ° C - 26 ° C) özel yüzeyi bir tipik kümesi gösterilir. (E) kenarlık çizgisi ve midlines bir örnek tek yönlü eğim her bölgesi boyunca sıcaklıklar ölçüldü. Verileri temsil eden ortalama sıcaklıklar ± SD n = 8 deneyleri (150 ± 50 larva/tahlil). Bu rakam bölümlerini Sokabe vd çoğaltılabilir 8 hafif değişiklikler ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Tek yönlü ve çift yönlü degrade deneyleri kullanarak temsilcisi sonuçları. (A, B) Tek yönlü eğim üzerinde 6 bölgelerinde larva oranlarda demek. Verileri 3rd INSTAR larva (AEL) döşeme yumurta sonra belirtilen saat içerir. n = 6-7. Bir temsil ±SEM. (C) termal dağılımları önceden tırmanma geç-3rd bulunan hata çubuklarını kontrol (w1118) ve trpA1 mutantlar üzerinde tek yönlü eğim larva biçim. n = 3-4. Hata çubukları ±SEM. (D) termal dağılımları kontrolü (w1118) ve PLCβ mutantlar üzerinde tek yönlü eğim geç-3rd INSTAR larvaları temsil eder. n = 4-6. Hata çubukları ±SEM. (E) temsilcisi dağılımı üzerinde çift yönlü degrade önceden tırmanma, geç-3rd INSTAR larva (w1118) temsil eder. Sol ve sağ tahlil bölgeler noktalı çizgilerle gösterilir ve no-saymak bölge merkezi (gölgeli bölge) tarafından ayrılmış. Geç-3rd önceden tırmanışı (F) yüzde her bölge termal degrade boyunca larva (w1118) biçim. Larva sol yerleştirildi ve bölgeleri sağ bırakın. Tahlil bölgeleri 3 cm no-saymak bölge merkezinde ayrılır ve dağılımları bağımsız olarak hesaplanır. Hata çubukları SEM'ler temsil eder. n = 3 deneyleri (200-400 larva/tahlil). Bu rakam bölümlerini Sokabe vd çoğaltılabilir 8 hafif değişiklikler ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Saat AEL Larva sahne
24 1st biçim
48 2nd biçim
72 Erken-3rd biçim
96 3 ortard biçim
120 Geç-3rd biçim, hemen önce sahne tırmanma

Tablo 1. Saat sonra (AEL) döşeme yumurta ve larva evreleri arasındaki ilişki.

Sıcaklık gradyanı özel plaka (yamaç) üzerinde Sıcaklıklarda su Hamam Sıcaklıklar alüminyum blokların
10,0-25,0 ° C (1,5 ° C/cm) ~6.5-7°C/~28.5°C ~8.5°C/~26.8°C
18,0-28.0° C (1° C/cm) ~16.8°C/~31.0°C ~17.8°C/~29.7°C
14.0-34.0° C (2° C/cm) ~10.0°C/~40.0°C ~11.8°C/~36.8°C
12,5-42.0° C (2,95 ° C/cm) ~7.0°C/~55.0°C ~9.4°C/~49.4°C

Tablo 2. Tipik sıcaklık degradeler ve su banyoları ve Alüminyum blok tek yönlü degradeler için karşılık gelen sıcaklık.

Sıcaklık gradyanı özel plaka üzerinde Sıcaklıklarda su Hamam Sıcaklıklar alüminyum blokların
22-10-22 ° C (1,5 ° C/cm) ~5.0°C /~25.0°C ~7.5°C/~24.0°C
26-18-26 ° C (1° C/cm) ~15.8°C /~30.6°C ~16.9°C/~28.4°C
30-14-30 ° C (2° C/cm) ~8.5°C /~36.4°C ~10.9°C/~32.8°C
36-12,5-36 ° C (2,95 ° C/cm) ~5.0°C /~47.2°C ~7.9°C/~40.9°C

Tablo 3. Tipik sıcaklık degradeler ve su banyoları ve Alüminyum blok çift yönlü degradeler için karşılık gelen sıcaklık.

Larva yaş (AEL) Tahlil zaman (tek yönlü) Tahlil zaman (çift yönlü)
24 h 30 dk 35 dk.
48 h 22 dk 27 min
72 h 16 dk 21 dk
96 h 13 dk 18 dk
120 h 10 dk 15 dk

Tablo 4. Farklı larva yaş (AEL) ve karşılık gelen tahlil saatleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokolü başarılı olmasını sağlamak için larva deneyler yapmak için yeterli sayıda elde etmek için ilgili adımları uygulamak önemlidir. Bu Maya tüpler için 2-3 yumurta atarken geliştirmek d Yapıştır içeren sinekli ön besleme içerir. Şişeleri su şişeleri içeren bir tepsiye yerleştirilir ve gıda nem korur ve etkili tarafından larvaları besleme iken normal koyu döngüleri maruz izin teşvik şeffaf plastik bir torbaya alınmış gerekir. Ancak, Maya Yapıştır sinekler tuzak haline çok yumuşak olmamalıdır. Kadın başına şişe üzerinde genotip bağlıdır. W1118söz konusu olduğunda, genellikle ~ 12 kadın ve ~ 6 erkek 3 h için yumurtalarını bırakmak izin vermek yeterli olduğunu. İki şişe tipik olarak tek yönlü tahlil için bir tabağa yerleştirin için yeterli larva (100-200 larva) sağlar. Sinek stok yaban tipi daha az sayıda yumurta bırakır veya yumurtadan larva oranda azalır, (en çok 30-35/flakon) ek dişi ve erkek ekleyin.

Bu deneyleri yapılırken istenmeyen değişkenlik birçok nedeni vardır. Gelişimsel sahne larvalar sıcaklık tercih etkiler. Bu nedenle, dikkatli bir şekilde tanımlanmış bir sahne larvaları kullanmak zorunludur. Bunu yapmak için üzerinde dar bir zaman dilimi (3 h gibi) larvaları toplamak. Kesinlikle bu yana yetiştirme koşulları (sıcaklık, nem, koyu döngüsü ve yiyecek türü) ve bazı mutasyonlar kalkınma hızını etkiler, kıyaslanabilir analiz etmek için döşeme yumurta larva yaşlı sonra zamanında güvenmeyin. Farklı genotip larvaları aynı gelişim aşamasında olup olmadığını belirlemek için ağız kanca ve vızıltısı7 boyutu gibi fiziksel özellikleri incelemek önemlidir. 1st, saatleri 2nd ve 3rd INSTAR larva (Tablo 1) geliştirmek için temel alan altında 12 s ışık: 12 25 ° C'de mısır yemek-esaslı yiyecek ve kuluçka kullanarak s karanlık döngüleri. Larvalar daha yavaş pekmez tabanlı gıda büyümek. Uygun hidrasyon ve gıda tazelik da larvalar büyüme etkiler. Su gıda miktarı ne çok kuru şişeyi soymak için ne de çok gevşek aşırı su nedeniyle gıda bıraksam iyi olur. İdeal olarak, ~ 5 mm katman gıda yüzeye en yakın büyüyen larva tarafından şartına ve şişe hareket ettirildiğinde veya vurdu zaman kolayca hareket eder. Bu durum taze yapılmış gıda 50-100 larvaları ile kullanılarak elde edilebilir.

İstikrarlı bir sıcaklık gradyanı tahlil işlemini başlatmadan önce kurmak için önemlidir. Bu nedenle, su banyosu 1-2 h su banyoları ısı üretmek ve ortam oda sıcaklığı, hangi sırayla geçişin etkileme potansiyeline sahip değişebilir tahlil başlatmak için önceden açmak. 1-2 h sonra en adet klimalı ortam sıcaklığı sakinleştiği. Ancak, bu her ortamda belirlenmelidir. Buna ek olarak, bir büyük sıcaklık aralığı degradeyle oluştururken (> 3.0 ° C/cm), istikrarlı bir degrade elde etmek zor olabilir. Aralığı büyük olduğunda Sıcaklık gradyanı tahlil plaka küçük bir hareket daha önemli değişiklikler oldu (Örneğin > 3.0 ° C/cm). Bulduğumuz bir 1-2 ° C/cm degrade en istikrarlı degradeleri üretir.

Thermotaxis deneyleri değişkenlik sınırlamak için denetlenmesi gereken birkaç ek konuları vardır. Larvalar yıkama, yiyecek parçacıklarının varlığı önemlidir veya sukroz larva üzerinde tahlil etkileyebilir. Çamaşır adımları iyice yapılması gerekiyor ama onlar içinde batık iken hızlı bir şekilde, çünkü onların oksijen kaynağı sınırlayan aşırı su sağlıklarını etkileyebilir. Bu nedenle, larvalar temizlemek için hücre süzgeç (seçenek 2) kullanmanızı öneririz. Gözenek boyutu 300 µm eserler larva erken-3rd , sahne (72 h AEL) biçim için iyi olan bir süzgeç veya daha büyük. Buna ek olarak, günün, öyle aynı derecede Zeitgeber--dan (ZT) ZT4 ZT8 için zaman aynı zamanda deney gerçekleştirmek önemlidir (ZT = 0 ise ışıklar açık olduğunda), değişkenlik sirkadiyen ritim sıcaklık seçimine etkileri nedeniyle sınırlamak için. Özel plaka üzerinde nem düzeyini de sonuçlar değişkenlik neden olabilir. Plakaların yüzey nemli olması gerekir iken, su damlacıkları larvalar tuzak ve bu nedenle kaçınılması gerekir.

Deneyleri değişkenlik sınırlama çok sayıda bağımsız deney yapmadan sağlam sonuçlar elde etmek mümkün hale getirecek. Genellikle 3-8 bağımsız deneyler güvenilir bir sonuç elde etmek yeterlidir. Sonuçların doğru çizelgeleme da thermotaxis deneyleri başarısı için önemlidir. 0.5 cm alüminyum duvarlarından bölgelerde sıcaklıklar bu bölgelerde doğrusal olmadığı dağıtılmış larva dikkate alınmaz. Bazı larvaların tahlil sonucuna zaman iki bölge arasındaki sınırda yerleştirilmiş olacaktır. Vücut uzunluğu % 50'den fazla bir bölgede bulunuyorsa, larva o bölge için sekme ekleyin. O zaman bir larva iken her iki bölge tam % 50 ise, hayvan her bölge 0.5 larva olarak sayılır.

Degrade tahlil sıcaklık farklılıkları bir dizi ayrımcılık larvalar izin verirken, etkili bir şekilde sınanabilir alt ve üst sıcaklıklar için sınırlamalar vardır. Sıcaklıklarda test etmek mümkün değildir < larvalar hareketliliğini beri 10 ° C daha düşük sıcaklıklarda büyük ölçüde azaltır. Gradyanlar 42 ° C ulaşan üst sıcaklık ile kurulan rağmen hemen hemen hiç kontrol larvaları tüm bölgelerde kalın > 28 ° C. Bu nedenle, sürekli degrade deneyleri sıcaklık Tercihler çeşitli bölgeler arasında ayırımcılık için kullanılamaz > 28 ° C. Ancak, bu yüksek sıcaklıklardaki degrade deneyleri çok sıcak sıcaklık tercihlerini değiştirdi Eğer mutantlar karakterize etmek için potansiyel olarak kullanılabilir.

Bir mutant lokomotor bir kusur varsa, belirgin sıcaklık tercih hareket bozukluğu nedeniyle yanlış değil emin olmak için ek deney gerekli olabilir. Bu olası sorunu gidermek için onların istenilen bölgelere taşımak hayvanlar ek süre vermek amacıyla uzun tahlil kez kurmak gerekli olabilir. Çift yönlü degrade tahlil de hayvanlar aynı tercih edilen bölge, onlar başlangıçta plaka üzerinde yerleştirileceği yeri olarak ne olursa olsun seçin olup olmadığını sınamak için istihdam edilebilir.

Sonuç olarak, burada açıklanan degrade deneyleri diğer thermotaxis deneyleri üstünlükleri vardır. Özellikle iki bölge arasındaki sıcaklık farkları büyük olduğunda onlar sağlam, sonuçlar olabilir gibi bir iki yönlü seçim deneyleri yararlı olsa da, onlar tercih ettiği tek denemede larvalar için ideal sıcaklık vermeden etkili değildir. Bunu yapmak için en çok tercih edilen sıcaklık5,6,7belirlemek için iki yönlü seçim kombinasyon gerçekleştirmek gerekir. Buna ek olarak, degrade tahlil hayvan olan bir tek sürekli sıcaklık manzara bir ortamda onların tercih edilen sıcaklık bölgesi seçmek için bir fırsat sağlar. Böylece, tercih edilen termal çevre belirlemek için iki yönlü seçimleri büyük bir arada hazırlamak gereksizdir. Yuvarlak bir petri kullanarak thermotaxis okuyan bir larva10hareket dinamiklerini sıcaklık etkilerini değerlendirmek için istihdam edilmiştir. Ancak, Tercihler her bölgenin farklı bir boyutta olduğundan farklı sıcaklıklarda arasında arasında ayrımcılık daha az yararlıdır. Son olarak, tahlil ve yararını tek bir tahlil ayrımcılık küçük sıcaklık tercihlerinde kolaylığı nedeniyle, bu potansiyel olarak olabilir larva sıcaklık tercih olarak katılan aday genler düzinelerce ekran istihdam edilebilir Aksi halde diğer deneyleri kullanarak gözden olmak

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

C.M. (DC007864, DC016278) NIDCD (EY008117, EY010852), NEI fon tarafından desteklenmektedir ve NIAID (1DP1AI124453).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gradient assay apparatus
PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath Thomas Scientific 9106 This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz.
Aluminum assay plate (for single directional gradient) Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized.
Aluminum plate (for bidirectional gradient) 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized.
Aluminum block Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D.
Connector for aluminum blocks and tubing McMaster-Carr 91355K82
Tygon Sanitary Silicone Tubing Tygon 57296 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall
Name Company Catalog Number Comments
Items and reagents for assay
Pestle USA Scientific 17361 Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes
Thermometer Fluke 51II
Thermocouple Fluke K type
Universal microplate lid Corning 6980A77
35 mm dish Corning 9380D40
Labeling tape (for bidirectional gradient) Fisher Scientific 15-951 Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds
Agarose Invitrogen 16500500 Prepare 1% solution
Sucrose Sigma S0389-5KG Prepare 18% solution right before starting assay
Paint brush Fisher Scientific 11860
50 mL centrifuge tubes Denville C1062-P
Scoopula Fisher Scientific 14-357Q
500 mL round wide-mouth bottle Pyrex 1395-500
Cell strainer (300 mm pore) PluriSelect 43-50300 Optional item for larvae washing
Cardboard box (vial tray) Genesee Scientific FS32-124
Name Company Catalog Number Comments
Drosophila food
Distilled water 22,400 mL
Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg LabScientific Inc. NC0535320 1,609 g
Brewers yeast 100 lbs MP Biomedicals ICN90331280 379 g
NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) Genesee Scientific 62-115 221 g
Drosophila Agar, Type II (5 kg) Genesee Scientific 66-103 190 g
Karo light corn syrup Karo 1,700 mL
Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) Sigma Aldrich H5501-5KG 72 g/240 mL
Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) Sigma Aldrich 81910-1 L 108 mL
Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O Sigma Aldrich 438081-500 mL 8.5 mL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
  2. Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
  3. Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
  4. Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
  5. Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
  6. Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
  7. Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
  8. Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
  9. Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
  10. Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
  11. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Tags

Neuroscience sayı: 136 Drosophila larva thermotaxis sıcaklık değişimi davranış somatosensation
<em>Drosophila</em> larva termal tercihlerini belirlemek için bir sıcaklık gradyanı tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A… More

Liu, J., Sokabe, T., Montell, C. A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (136), e57963, doi:10.3791/57963 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter