Summary
כאן, אנו מציגים עבור הדמיה ו דנדריטים בפרוסה המוח קבוע באמצעות ננו ללא תווית הדמיה הטכניקה מבוססת על reflectometry ספקטרלי פרוטוקול צעד אחר צעד.
Abstract
במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק בידוד חשמלי על-ידי enwrapping הסיבים האקסון ספירלה מרובה שכבות. בהשראת הארכיטקטורה subcellular-מאורגן, לאחרונה פיתחנו מודאליות הדמיה חדשה, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe), המאפשרת הדמיה ננו ללא תווית חסרת תקדים של חיה ו דנדריטים בתוך באתרו. העיקרון הבסיסי הוא לקבל מידע nanostructural על-ידי ניתוח הספקטרום השתקפות של המבנה subcellular מרובה שכבות. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לביצוע של הדמיה SpeRe בסיסיים של רקמות עצבים משתמש מסחרי במערכת מיקרוסקופיים קונאפוקלית, מצוידים לייזר אור לבן, מסנן tunable. אנחנו מכסים את תהליכי הכנת הדוגמא, רכישת נתונים ספקטרלי, עיבוד להשגת מידע nanostructural תמונה.
Introduction
במערכת העצבים יונקים, המיאלין מספק גיאן מהירה ותקינות עצב על-ידי enwrapping הסיבים האקסון עם מעילי פרווה עלי הלוואי קרומיים מרובה שכבות. מבנהו מרובה שכבות מורכב לסירוגין הננומטרי דק-סרטים של ממברנות פלזמה (~ 5 nm), ציטוזול (~ 3 ננומטר), ורווחים חוץ-תאית (~ 7 ננומטר)1,2. מיקרוסקופ אופטי, כולל את מיקרוסקופ ברזולוציה-העל האחרונה, אינם מתאימים להתבוננות הדינמיקות המיאלין הננומטרי בשל הרזולוציה שלהן לא מספיק בשל עקיפה אופטי3,4,5. למרות מיקרוסקופ אלקטרונים יכול לספק פרטים עדינים של ננו-מבנה המיאלין, זה לא תואם עם המערכות הביולוגיות חיים עקב ההכנות מדגם פולשני ביותר מעורבים קיבוע כימי ו ultrasectioning6,7 . עד לאחרונה היו לא טכניקה ישים להתבונן הננומטרי דינמיקת ו דנדריטים באתרו בתוך.
. Schain et al. דיווח בעבר ו דנדריטים התערוכה השתקפות אור צבעוני8. על ידי אימוץ הניתוח spectroscopic על האור המוחזר, אנחנו תכנן מודאליות הדמיה חדשה עבור ננו הדמיה של ו דנדריטים, בשם ספקטרלי reflectometry (SpeRe)9. SpeRe מבוסס על ההפרעות סרט דק המתרחשים במבנה רב שכבתית של למעטפת מיאלין (איור 1). על ידי הדמיה אופטיים על אקסונים שונים, נחשפו כי הקשת השתקפות היא פונקציה מחזורית של מספר גל תקופתיות שלה (
) הוא ביחס הפוך ל קוטר האקסון (d). מערכת היחסים הזו פשוטה (
) מציע נתיישב כימות של קוטר האקסון של הנתונים SpeRe. ניצול זה, חשפנו את האקסון ונפוצים בולטות תחת פציעת מוח טראומטית קלה בדוח הקודם שלנו.
מערכת SpeRe מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית מורכב מקור לייזר מיוחדים, מסננים (איור 2). מקור קלט הוא לבן-אור לייזר, מתן הפס הרחב פלט ספקטרלי הגלויים לאזורים אינפרא-אדום. עבור הסריקה ספקטרלי, המערכת הינו מצויד עם שני התקנים אקוסטו אופטי: אקוסטו אופטי tunable מסנן (AOTF) להעברת אורך גל שנבחרו מן המקור פס קלט של הפיצול קרן אקוסטו אופטי (AOBS) עבור המנחה שנבחר משתקפת גל את הגלאי. התוכנה עבור היפרספקטרליות מיקרוסקופיה קונפוקלית (ראה טבלה של חומרים) מספק אפשרות להתאמה אישית סריקה ספקטרלי לרכוש ברצף התמונות השתקפות קלט באורכי גל שונים. בנוסף, אברציה כרומטית יכול להתערב באורח קשה במדידה ספקטרלי; לכן, השימוש העדשה המטרה עדשה אפוכרומטית מומלץ.
ראוי לציין, אור לבן לייזרים לייצר פלט ספקטרלי לא אחידה, רכיבים אופטיים גם להשפיע על הפרופיל ספקטרלי. לכן, ספקטרום רכשה לכייל לניתוח כמותי עוקבות. מראה כסוף מוגן משמש בדרך כלל כנקודת התייחסות, אשר מספק של השתקפות כמעט קבוע (> 97%) השתלטה על האזור מלא גלוי. ספקטרום שנרכשו לאחר מכן מחולקים לפי ספקטרום הפניה מן המראה.
גודל הצעד ספקטרלי עבור הסריקה ספקטרלי קובעת את מהירות הרכישה; לכן, זה צריך להיות מותאם. כמו האקסון גדולים יותר יש תקופה ספקטרלי גבוה יותר, זה דורש עדין ספקטרלי הדגימה. לדוגמה, האקסון בקוטר של 10 מיקרומטר, אחד האקסונים הפיזיולוגיות הגדול, יש תקופה ספקטרלי של ~ 8 nm. על-ידי החלת קריטריונים הדגימה של נייקוויסט, אנחנו מועסקים את מרווח הדגימה ספקטרלי של 4 nm כדי לכסות כל האקסונים הפיזיולוגיות ברקמות העכבר לחוץ. גישה זו נמשכת בדרך כלל במשך מספר שניות לקבלת סריקה מלאה ספקטרלי, ולכן הוא לא מתאים ליישומי ויוו , איפה הפיזיולוגיות תנועה (למשל נשימה ואת קצב לב) משבש את רכישת ספקטרלי יציב. בעבר פתרנו בעיה זו על-ידי instrumenting מיקרוסקופ זקופה המותאמת אישית, שנועדה להשיג את ספקטרום מלא עבור כל נקודה באמצעות ספקטרומטר של המערך (≈ מהירות של רכישת 30 ms לפיקסל).
בדו ח זה, אנו מתארים פרוטוקול מפורט על ההדמיה SpeRe על פרוסה המוח קבוע, אשר ניתן לבצע במיקרוסקופ היפרספקטרליות המסחרי (ראה טבלה של חומרים). כך, הפרוטוקול יכול להתבצע על ידי ניסויים ללא התמחות במכשור אופטי. אנחנו גם לכסות את בעיות אפשריות לפתרון בעיות עבור רכישת וניתוח של נתונים SpeRe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניתוחים אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת Sungkyunkwan.
1. הכנת הדוגמא
הערה: תא לחץ כל מכשירי ניתוח לפני לטיפול בבעלי חיים. לנהל את כל הביצועים כירורגית בחדר המוקדש ניתוחים. השמלות כירורגי סטרילי וכפפות לענידה על ידי כל אנשי הצוות בחדר ניתוח בכל עת.
-
קיבוע הרקמה
- להכין שני מזרקים 10 מ ל שכל מלא באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ו- 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS.
- עזים ומתנגד עכבר 7-שבוע בן 12, (C57BL/6J או שורות עכבר עם או מגדר) על ידי מתן תערובת של zoletil ו חריגות השירותים הווטרינריים (1:1, 20 מ"ג/ק"ג כל אחד) או משטר של הרדמה חלופי מתאים (למשל, תערובת של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 10 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים) עם זריקה בקרום הבטן.
- ברגע העכבר הגיע מטוס כירורגי של הרדמה (שימוש בשיטת קמצוץ-תגובה הבוהן), חושפים את הלב שתורידו את העור ואת הצלעות עם מספריים.
- לגזור אטריום ימין עם מספריים קטנות כדי לנקז את הדם perfuse את הפתרון PBS, כדורגלן ברצף דרך החדר השמאלי עם מחט (קצב זלוף = 4 mL/min, נפח = 10 מ"ל עבור כל הפתרונות).
הערה: העכבר הופך נוקשה אם התהליך הושלם בהצלחה. השימוש של העין משחה או עיקור אין צורך כפי שנהוג מסוף. אולי תדלג על ההליך קיבעון. עם זאת, השלב זה מומלץ כדי למזער את העיוותים מבניים כולל נזק לרקמות מכני ונפיחות עצב איסכמי. פרטים נוספים על קיבוע הרקמה, להפנות המאמר על ידי גייג ', ג'יי ג'י. et al. 10
-
הכנה של הפרוסה המוח
- לערוף את העכבר עם מספריים כירורגיים דרך הגחון החזה, הגב והבטן.
- הסר את עור הקרקפת ואת קרום העצם בעזרת מספריים קטנות כראוי עד מלא חושפת את הגולגולת.
- לשבור את העצם הקדמית, לחתוך את הגולגולת לאורך התפר המשונן של עצם העורף באמצעות מספריים קטנות עם טיפול שלא יגרמו נזק למוח.
- הסר בעדינות את הגולגולת ואת קרום הדורה ברצף בעזרת מלקחיים משובחים.
- לחלץ באמצעות כף פלסטיק רך, דואגת שלא יגרמו נזק לרקמת המוח.
- שוטפים ומשרים המוח שחולצו בפתרון PFA 4% למשך 30 דקות ב 4 º C.
- פורסים את המוח קבוע למקטעים מיקרומטר 100 – 150 באמצעות של vibratome.
הערה: לקבלת פרטים נוספים על הכנת הרקמה, להפנות המאמר על-ידי. שגב ואח 11. להליכי עוקבות, הרקמה צריך להיות חתוכים למקטעים דק יותר עובי מרווח.
-
הרכבה של הפרוסה המוח
- היכונו כל פרוסה רקמות שקופית 1 כוס ו- 2 כוסות שער מרובע (22 × 22 × 0.17 מ מ).
- חותכים חצי אחד של המשקפיים שער מרובע (שתי חתיכות מלבניות) על-ידי שימוש לחיתוך זכוכית.
- לצרף שתי כוסות כיסוי חצויים באמצעות דבק סופר על הזכוכית שקופיות.
הערה: הרווח בין שתי הכוסות חצויים צריך להיות מעט גדול יותר מהגודל של הפרוסה רקמות. - לקצור את הפרוסה המוח בעזרת מברשת או פיפטה ולהניח את הרקמה על הזכוכית שקופיות בין מרווח. . שמור על עצמך לא לקפל את הרקמה.
- לוותר על μL 100 ל- PBS על פני הרקמה.
- המקום השני מרובע כיסוי הזכוכית על הרקמה. הימנע ההכללה של בועות אוויר בשלב זה.
- חותם סביב הזכוכית המכסה באמצעות של לק (או לחלופין מתאימים דבקים) כדי למנוע אידוי של PBS, זיהום על ידי אבק במהלך הפגישה הדמיה עוקבות.
הערה: הנסיין עלול להיעצר בשלב זה.
2. כיול
- . הפעילי את המיקרוסקופ לפחות שעה לפני ההדמיה כדי לאפשר תרמי מייצב לייזר מקור (ראה טבלה של חומרים). לאחר מכן, הפעל את התוכנה עבור ספקטרלי סריקה (ראה טבלה של חומרים), ולחץ על הלחצן ידרשו בראש GUI (איור 3 א).
- הפעל את התריס תוכנה כדי להפוך את הלבן-אור לייזר (יקלו) שפופרת האופטיקה (PMT) (איור 3 א).
- בחר את מצב xyΛ ברשימה הנפתחת במצב רכישהולאחר מכן, מצב הקלט של לייזר משתנה אוטומטית מ אחוז קבוע כוח קבוע. בטל את תיבת הסימון של תנועה SP אוטומטי. ולאחר מכן, הגדר את חלון ספקטרלי של הלייזר קלט 470 – 670 nm והגודל ספקטרלי שלב 4 nm בΛ-עירור לסרוק למדא הגדרות (איור 3b).
- הגדר את טווח ספקטרלי של PMT 450-690 על-ידי לחיצה כפולה או הזזת הסרגל התאמה עבור טווח הספקטרום (איור 3 c).
הערה: טווח הספקטרום הזה צריך לכלול את רוחב הפס מלא של מקור קלט. - בחר עדשה המטרה טבילה במים, כראוי עם צוהר מספרית גבוהה (NA > 0.7) ולתת ערך כלשהו לשלטון PMT ולייזר להפעלת לחצן לחיות לסרוק וקביעת תצורה של AOBS . לעבור בנתיב האופטי על ידי בדיקת שיקוף במעבר התצורה AOBS (איור 3d).
- הר ראי התייחסות (ראה טבלה של חומרים) על הבמה מיקרוסקופ. צריך לעמוד בפני השטח מראה מול העדשה אובייקטיבי. אם זה לא קל לשים את המראה על הבמה מיקרוסקופ, בונד מראה על צלחת שטוחה (למשל . שקופית זכוכית).
- לשלוט על הבמה מיקרוסקופ כדי ליישר את מטוס מוקד השטח מראה.
- להתאים את עוצמת הלייזר בהתחשב הטווח הדינמי של הגלאי ורווח PMT ולאחר מכן שנה את מצב הקלט של לייזר מ אחוז קבוע לשלטון מתמדת.
הערה: כאשר הוא אופייני, PMT לקבל 500 (V) ומשמשים כוח לייזר היחסי של 0.1%-570 ננומטר. - לאשר במצב צבע מדומה כדי לבדוק שאין לא רוויה לאורך כל טווח אורך הגל. אם נצפית רוויה, הנמך את עוצמת הלייזר (איור 3 א).
- הפעל את הרכישה למדא לסרוק .
- להסיר את השיקוף מן הבמה וחזור הרכישה אותו ללא דגימה לצורך קבלת ההפניה כהה (קרי, היסט כהה).
- לשמור את הנתונים בתבנית Multistacked TIF .
3. ייבוא תמונות SpeRe
- במקום הרקמה רכוב על הבמה מיקרוסקופ. ליישור בערך הרקמה למישור המוקד של העדשה המטרה, השתמש במצב רחב-שדות קרינה פלואורסצנטית דרך עין-קטע.
- גרה סרוק על, לשלוט השלב מיקרוסקופ כדי ליישר את מטוס מוקד לאזור של עניין בתוך הרקמה. כדי למנוע את רעשי הרקע תגית כיסוי, בחר את אזור המטרה לפחות 15 עומק μm מממשק זכוכית-רקמות.
- רוכשים של אוסף התמונות ספקטרלי לאזור היעד באמצעות ההליך אותו כמתואר בצעדים 2.1 – 2.10.
- לשמור את הנתונים הרקמה, ההיסט כהה בפורמט Multistacked TIF .
הערה: הנסיין עלול להיעצר בשלב זה.
4. התמונה עיבוד וניתוח
- לפתוח את הנתונים ספקטרלי (טיף multistacked) עבור המראה התייחסות ו על רקמת המוח ב- ImageJ.
- בחר את ROIs (אזורים מעניינים) עבור אוספי תמונות נפתח — אזור מרכזי עבור המראה הפניה, על הקטע של סיב האקסון רקמת המוח.
- לרכוש ספקטרום raw עבור ROIs שנבחרו על ידי פועל התמונה ← ערימות ← מגרש ציר z פרופיל בתפריט ImageJ.
- פתח את נתוני היסט כהה, אחד נלקח במראה של ההפניה, אחרים שנלקחו עבור רקמת המוח.
- לרכוש הספקטרום עבור ההיסטים כהה על ידי פועל התמונה ← ערימות ← מגרש ציר z פרופיל בתפריט ImageJ.
- שמור כל ספקטרום שנרכשו על-ידי שימוש באפשרויות העתק והדבק .
הערה: עבור הדמיה SpeRe, שימוש בתחום הדימות המרכזי כדי למזער שיבושים אופטי מהציר מומלץ. הסיבים האקסון עשוי להיות הטרוגניות מבחינה מבנית לכל אורכם. לפיכך, בחירת רועי בקטע האקסון קטן, בדרך כלל < 5 מיקרומטר, כדי למזער את החפץ בנפח חלקי מומלץ.
5. הבסיס תיקון וניתוח האות SpeRe
- להחסיר ספקטרום ההיסט של הספקטרום של המראה התייחסות ל רקמות המוח.
- לנרמל בכל קשת על-ידי חלוקת העוצמה המרבית של הספקטרום.
- לחלק את קשת המנורמל האקסון על ידי הקשת המנורמל של השיקוף הפניה ולחסר DC היסט מהספקטרום מנורמל.
- למדוד את תדירות מספר גל על ידי התאמת הקשת רכשה את sinusoidal עקומת (ראה טבלה של חומרים) ולאחר מכן להמיר את מספר גל רכשה תקופתיות על-ידי לוקח הדדיים.
- להמיר את תקופתיות מספר גל קוטר האקסון בעזרת המשוואה איור 4ג'.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפי הפרוטוקול, פרוסה המוח קבוע הוכן עם צביעת אקסוגני, fluorophore של פילוח מיאלין (ראה טבלה של חומרים). הדמיה SpeRe בוצעה על הפרוסה המוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי היפרספקטרליות מסחרי בשיתוף עם פלורסצנטיות קונאפוקלית הדמיה (איור 4a). עבור SpeRe, עוצמת קלט אופטי היה מוגדר µW/מיקרומטר 52 עם זמן להתעכב פיקסל של ~ 1 µs. מינון אור זה נגמר סדר-הגודל של ערכים נמוכים יותר קרינה פלואורסצנטית קונבנציונאלי מיקרוסקופיה קונפוקלית12. זה לוקח ~ 17 s עבור סריקה ספקטרלי מעל 470-670 nm ב מרווח של 4 nm (51 תמונות).
האות SpeRe היה מקומי לאורך מרכז ו דנדריטים כצפוי על ידי הצורה הגיאומטרית של השתקפות אופטית. מקשת השתקפות מקטע האקסון, הושג תקופתיות מספר גל, אשר הוסב לאחר מכן קוטר האקסון (איור 4b, ג). הקוטר נמדדת SpeRe נמצאה להיות המאהבות עם מדידה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית (איור 4 d). השגיאה קטין שיורית יכול להיות שמקורם או עקיפה מוגבל לרזולוציה של השיטה מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית שגויה או לא מלאה את הגיאומטריות לדגמן בשביל SpeRe.
ההדמיה SpeRe מבוססת על השתקפות אופטית, ובכך coverslip מבוסס-סיליקה ניתן להציג את רעשי רקע משמעותי. בהגדרת אופטיים שלנו, רעשי הרקע היה ניכר כאשר העומק הדמיה של coverslip פחות מ-5 µm אך היה נמנע כאשר העומק הדמיה גדול מ- 15 מיקרומטר (איור 5).
איור 1 : עקרון SpeRe. סיבי העצב האקסון יש מבנה סרט דק מרובה שכבות. התקרית אור משתקף חלקית את-הממשקים, כפי שתואר על ידי החוק של פרנל. אלה לידי ביטוי גלי האור יפריעו אחד לשני; לפיכך, האור המשתקף וכתוצאה מכך מקודד את המידע nanostructural. Reflectometry רפאים (SpeRe) מקבל את המידע nanostructural ידי פענוח האור המוחזר מן הפעולה באקסון סיבי העצב. איור זה יש הודפס מ קוון, ג'יי. et al. 9 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : פריסה של מערכת SpeRe. מערכת SpeRe מבוסס על מיקרוסקופ קונפוקלי השתקפות. לסריקה ספקטרלי, נדרשים שלושה מרכיבים נוספים לאורך השביל עירור: (1) supercontinuum לייזר, מסנן tunable (2) אקוסטו אופטי (AOTF) ו- (3) אקוסטו אופטי לשגר ספליטר (AOBS). מקור לייזר פס רחב spectrally סוננו לפי AOTF לשדר אורך גל שנבחרו עם רוחב פס צר. AOBS מתפקד במפצל קרן עבור הגל שנבחרו להנחות את עירור אור המדגם. האור הוא ואז התקרית על הדגימה באמצעות סורק galvanometric של העדשה אובייקטיבי. האור המשתקף מדגם descanned, במרחב המסוננות לפי קונאפוקלית הקדמוניות, שנאספו על ידי הצינור האופטיקה (PMT). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : התקנת התוכנה- () ממשק המשתמש הגרפי (GUI). בחלון הראשי של, ישנם בעיקר חמישה לוחות המשנה: הדמיה התקנה, התקנת לייזר, סיב אופטי, התקנת גלאי הקמה מציג תמונה. (b) בתפריט הנפתח כדי לבחור את מצב הדמיה. עבור SpeRe, xyλ מסומנת. (ג) הפאנל של התאמת את החלון ספקטרלי של הגלאי. (ד) בחלונית ' ' להגדרת המפצל קרן אקוסטו אופטי (AOBS). 'השתקפות' נבחרה להנחות את האור משתקף הגלאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : SpeRe על רקמת המוח. () A SpeRe התמונה של רקמת המוח מאתר מוכתמים counterstaining הניאון של המיאלין (fluoromyelin). (b) A השתקפות נציג הספקטרום המתקבל מקווקו התיבה הלבנה ב (א). (ג) עיקול הפניה מדומה כדי להעריך את קוטר האקסון מ תקופתיות ספקטרלי. הכוכבית הכחולה היא נקודת הנתונים המתקבלים (b). (ד) פרופיל חציה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית מאזור מסגרת ב (א). הקוטר החיצוני המיאלין מוערך באמצעות האות פלורסצנטיות הוא ~ 760 nm, אשר מסכים גם עם מדידה SpeRe. השגיאה שיורית מתקבל מעקיפה שגיאת המדידה מבוססת על-ידי קרינה פלואורסצנטית. Scalebar, 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : השפעת מכסה. (, b) תמונות השתקפות של רקמת המוח במיקום זהה לרוחב נרכשים בעומקים שונים מממשק רקמות-coverslip: ב 3 מיקרומטר (א) ו- 15 מיקרומטר (b). Scalebar, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SpeRe הוא חדש ללא תווית הדמיה מודאליות בהתבסס על אינטרפרומטריה ספקטרלי, המציעה בפעם הראשונה, את המידע הננומטרי בשידור חי ו דנדריטים. בפרוטוקול הנוכחי רכישה, הרזולוציה המרחבית עבור קוטר האקסון הוא מסדר 10 ננומטר. יתר על כן, SpeRe מנצל הזמנות-הגודל של ערכים מינון אור נמוך יותר בהשוואה microscopies סופר רזולוציה אחרים; לכן חופשי phototoxicity photobleaching. SpeRe יספק שדרה חדש ללמוד הננומטרי הדינמיקה של האקסונים סיבי העצב.
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מבוסס על סריקת ספקטרלי מתווכת על-ידי אקוסטו-אופטיקה, גלאי בנקודה (קרי, PMT). גישה זו היא יתרון עבור רכישת תמונות ספקטרלי של מלא השדה-of-view. עם זאת, הרזולוציה זמן מוגבל על ידי סריקה ספקטרלי, שהוא בדרך כלל > 15 s בתצורת הנוכחי שלנו. לחלופין, ניתן לשלב ספקטרוסקופ במהירות גבוהה כדי לאפשר תצפית בזמן אמת של שדה-of-view קטן9. מערכת זו ניתן לבנות פשוט על ידי מיתוג את PMT באמצעות ספקטרוסקופ, והוספת לייזר אור לבן ממערכת קונאפוקלית קונבנציונלי. עבור רכישת תוכנה, המיקום גלוונומטר צריך להיות מסונכרנת עם הפעלה של spectroscope. במקרה של מידה בנקודה אחת, הפתרון הזמני נקבעת על ידי קצב המסגרות של spectroscope, אשר יכול להיות > 10 קילו-הרץ עבור spectroscopes מרביים האחרונות. רזולוציה טמפורלית הזה אלפית המשנה צריך להיות מספיק להתבוננות ברוב הדינמיקות פיזיולוגיים של ו דנדריטים vivo בתוך. SpeRe מבוסס על השתקפות אור; לכן, האור שאותרו יש באותם אורכי גל כמו האור קלט. להפך, קרינה פלואורסצנטית כרוך משמרת רפאים (קרי, סטוקס shift); לפיכך, האור שזוהו הוא ספרבילי spectrally מן האור קלט. תכונה זו שימושית עבור רכישת סימולטני של SpeRe וזריחה על הדגימה זהה (כפי הפגינו איור 4). קליטת האור קלט על-ידי fluorophore יכול להשפיע על המדידה SpeRe, אך קליטתם של צביעת פלורסנט טיפוסי הוא החזרה נמוך (< 1%).
ראוי לציין, SpeRe יש מוגבלת זוויתי זיהוי טווח בלבד שהאקסונים כמעט מקביל למישור ההדמיה יכולה להתגלות. המגבלה זוויתי של SpeRe הוא סביב 13.5 מעלות ± 9. לרכוש כיוון מסוים של הריבית, עלול להיות מוטה המדגם. במקרה של דגימות שקופים כגון דג זברה העובר, רכישה מלא נפח ייתכן שניתן על-ידי סיבוב הדגימה. מגבלה מעשית נוסף הוא כי coverslip רכוב על מדגם מייצרת חזק מאחור-השתקפות שמוביל הדור של האות רקע כמוצג באיור 5; מומלץ כי שטחי האזור להימנע. SpeRe מבוסס על האור הנראה יש אורך הנחתה 1/e ~ 20 מיקרומטר ברקמות המוח. עומק חדירה רקמות טיפוסי עבור רכישת מידע ספקטרלי אמין הוא מוגבל ל ~ 100 מיקרומטר. עמוק הדמיה ייתכן אם מקור קלט כבר משמש. בסופו של דבר, האימות של SpeRe מוצג על-ידי השוואתה עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות עקיפה-מוגבלת. זו כנראה הייתה מספיקה להערכת מידת הדיוק ננו (איור 4). טכניקות האחרונים, כגון מיקרוסקופ אור-אלקטרונים correlative הרחבה מיקרוסקופ, תציע דרך לאמת את SpeRe ב הננומטרי המשטר13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים להכריז על אינטרסים כלכליים מתחרים: ג'יי קוואן וצ'וי מ הם הממציאים של טכנולוגיית פטנט המתוארות במאמר זה.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון בסיסי למדע (IBS-R015-D1), על-ידי תוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1A6A1A03015642).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cutter | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Nail polish | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Apochromat objective 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersion type |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used. |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica Microsystems | SP8 | Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details. |
| Imaging software | Leica Microsystems | LAS-X | - |
| Matlab | MathWorks | - | - |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Coated with protected silver. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | - |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Cover slip | Thermo Fisher | 3306 | Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm) |
| Slide glass | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Thickness: ~1 mm |
| Super glue | Henkel | Loctite 406 | Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact. |
| Syringe pump | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | - |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | - |
| White-light laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6. |
References
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
- Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
- De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564 (2012).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024 (2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348 (2015).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).
