Summary
イメージング分光反射率に基づくラベル無料ナノを使用して固定脳スライスの髄軸索をイメージングのためのステップバイ ステップ プロトコルを紹介します。
Abstract
哺乳類の神経系ミエリンは多層スパイラル軸索線維の enwrapping で電気絶縁を提供します。その度に編成されて細胞内建築に触発され、我々 は最近という名前のスペクトル反射 (領域)、原ライブ有髄軸索の前例のないラベル無料ナノスケール イメージングを可能にする新しいイメージング法を開発しました。基本原理は、多層の細胞レベル下の構造の反射スペクトルを分析することによりナノ構造情報を得ることです。この記事で商業共焦点顕微鏡システム、白色光レーザーと波長可変フィルターを用いた神経組織の基本的な領域イメージングを実行するための詳細なステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。スペクトル データ、およびナノ構造の情報を得るための画像処理による試料作製の手順を紹介します。
Introduction
哺乳類の神経系のミエリンは enwrapping 多層膜鞘と軸索線維によって急速な神経伝導と軸索の整合性を提供します。多層構造が細胞膜から成るなナノスケール薄膜を交互で構成される (〜 5 nm)、細胞質 (~ 3 nm)、および細胞外スペース (〜 7 nm)1,2。最近超解像顕微鏡などの光学顕微鏡は光の回折3,4、5のための不十分な解像度のためのナノスケール ミエリンの動態を観察するため適していません。電子顕微鏡は、ミエリン ナノ構造の細部を提供できますが、生物系化学固定法と ultrasectioning67,を含む高度侵襲的なサンプルの準備のために互換性がないです。.最近までなかった技術適用有髄軸索原のナノスケール動態を観察します。
Schainらは、有髄軸索がカラフルな光の反射率8を示すことを報告しました。反射光の分光分析を採用し、我々 はスペクトル反射 (領域)9の名前の有髄軸索のナノスケール イメージングのための新しいイメージング法を考案しました。領域は、髄鞘 (図 1) の多層構造で発生する薄膜干渉に基づいています。様々 な軸索の光学シミュレーションによる我々 は反射率スペクトル波数とその周期の周期関数であることを明らかにしている (
) は軸索の直径 (d) に反比例します。この簡単な関係 (
) 領域データから軸索直径の安易な定量化を提供しています。これを利用して、私たちは私たちの前のレポートで軽度外傷性脳損傷の下で膨らんだ流行している軸索を明らかにしました。
スピア システム共焦点顕微鏡に基づいて成っている特殊な光源とフィルター (図 2)。入力ソースがホワイト ライト レーザー, 広帯域スペクトル出力赤外領域に表示を提供することです。2 つの音響光学素子のスペクトル スキャン、システムが搭載されて: 入力広帯域光源と音響光ビームスプリッター (AOBS) から選択した波長を提供して反映選択を導くための音響光学波長可変フィルター (AOTF)検出器波長。ハイパー共焦点の顕微鏡検査のためソフトウェアは、さまざまな入力波長における反射率画像を順次取得するカスタマイズ可能なスペクトル スキャン オプションを提供します (材料の表を参照してください)。さらに、色収差は批判的にスペクトル測定に干渉することがしたがって、アポクロマート対物レンズの使用をお勧めします。
注記のうち、白色光レーザー出力不均一なスペクトルと光学部品もスペクトルのプロファイルに影響を与えます。したがって、得られたスペクトルは後続の定量分析用のキャリブレーションする必要があります。保護されたシルバー ミラーは通常、完全可視領域にほぼ一定の反射 (> 97%) を提供する参照として使用されます。得られたスペクトルは、ミラーからの参照スペクトルで、分かれています。
スペクトル スキャン スペクトル ステップ サイズ決定集録速度;したがって、それを最適化する必要があります。大きい軸索が高いスペクトル期間、細かいスペクトル サンプリングが必要です。例えば、直径 10 μ m、最大の生理学的な軸索の 1 つの軸索はスペクトル期間 〜 8 nm。4 のスペクトル サンプリング間隔を用いてナイキスト サンプリング条件を適用すると、マウス神経系における生理学的神経軸索をカバーする nm。このアプローチは完全スペクトル スキャンに数秒以上かかります、従っていないアプリケーションに適しています生体内で、生理学的運動 (例えば呼吸・心拍) が安定したスペクトル取得を妨害します。私たちは以前配列分析計 (集録速度 ≒ ピクセルあたり 30 ms) を使用して各ポイントの完全なスペクトルを取得するように設計、カスタマイズされた正立顕微鏡をインストルメント化することによってこの問題を解決しました。
このレポートでは、商業ハイパー スペクトル顕微鏡で行うことができる固定脳スライスの領域イメージングに関する詳細なプロトコルについて述べる (材料の表を参照してください)。したがって、プロトコルは、光計測の専門知識のない実験者で完了ことができます。私たちはまた、潜在的な問題および領域データの取得と解析のトラブルシューティングをカバーします。
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Protocol
すべての手術は、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 成均館大学によって承認されました。
1. サンプル準備
注: オートクレーブ動物処理前にすべての手術器械。手術専用ルームですべての手術のパフォーマンスを実施します。滅菌ガウンと手袋は、すべての回で手術室のすべてのスタッフが着用する必要があります。
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ティッシュの固定
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 4% パラホルムアルデヒド (PFA) PBS で満ちている各 10 mL 注射器 2 本を準備します。
- 7 12 週齢のマウス, (c57bl/6 j またはどちらかの性別を任意のマウス線) zoletil とキシラジン (1:1、20 mg/kg) または、代替の適切な麻酔体制 (例えば、ケタミン 80 mg/kg および 10 mg/kg の混合物の混合物を投与することで麻酔します。キシラジン) 腹腔内注入。
- マウスは手術麻酔 (つま先ピンチ応答メソッドを使用して) 面に達したら、はさみで皮膚と胸郭を切り落とすことにより心を公開します。
- 血液を抜くし、針で左心室を順次 PBS と PFA ソリューションを灌流する小さいハサミで右房を切り取る (灌流率 = 4 mL/分、ボリューム 10 mL の各ソリューションのための =)。
注: マウスは、手順が正常に完了した場合は堅くなります。眼軟膏や消毒の使用はプロシージャがターミナルは必要ではありません。固定プロシージャをスキップことがあります。ただし、機械的組織の損傷や虚血性軸索腫大を含む構造の変形を最小限に抑えるには、この手順の使用をお勧めします。ティッシュの固定については、ゲージ、G. J.らによる記事を参照してください。10
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脳スライスの準備
- 腹胸部と腹部を手術用はさみでマウスの首をはねます。
- 頭皮と頭蓋骨を完全に公開するまで適当に小さなはさみを使用して骨膜を削除します。
- 前頭骨を打破し、脳に損傷を与えないように注意して小さなはさみを使用して後頭骨の矢状縫合に沿って頭蓋骨を切断します。
- 頭蓋と順次微細鉗子を用いた硬膜を慎重に取り外します。
- 組織を損傷しないように注意を取って、柔らかいプラスチック スプーンを使用して脳を抽出します。
- リンス、4 ° C で 30 分間 4 %pfa 溶液で抽出した脳を浸す
- Vibratome を使用して 100-150 μ m のセクションに固定脳をスライスします。
注: ティッシュの準備の詳細についてを参照してください記事 Segevらによって11します。 以降の手順では、組織する必要がありますスライスされるセクションにスペーサーの厚さより薄く。
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脳スライスの取り付け
- 組織スライスごとにスライド 1 ガラスと 2 正方形カバー メガネ (22 × 22 × 0.17 mm) を準備します。
- 半分にカット正方形カバー メガネの 1 つ (2 つの長方形の部分) ガラス カッターを使用しています。
- スライド グラス上でスーパー接着剤を使用して半分のカバー メガネの 2 つを接続します。
注: 2 つの半分ガラスの間のスペースは組織スライスのサイズより少し大きいはずです。 - ブラシやピペットを使用して脳スライスを収穫し、スペーサーの間には、スライド ガラス上の組織を置きます。組織を折るように注意してください。
- 組織表面上の PBS 100 μ L を分注します。
- ティッシュの上に、正方形カバー ガラスを配置します。この段階で気泡を含めることを避けてください。
- 後続のイメージング セッション中にほこりが PBS の蒸発や汚染を防ぐために爪のポーランド語 (または代わりに適切な接着剤) を使用カバー ガラス周りにシールします。
注: この段階で実験者が一時停止します。
2. 校正
- 顕微鏡、少なくとも 1 h に切り替える前にレーザーの熱安定化できるようにイメージング ソース (材料の表を参照してください)。次に、スペクトル スキャン (材料の表を参照してください) のソフトウェアを有効にし、GUI (図 3 a).の上部にある [取得] ボタンをクリックしてください
- 白色光レーザー (WLL) および光電子増倍管 (PMT) (図 3 a) ソフトウェア シャッターをオンにします。
- アクイジション ・ モードでドロップダウン リストにxyΛ モードを選択し、定数 %から一定の電源をレーザーの入力モードを自動的に変更します。SP の自動巻きムーブメントのチェック ボックスをオフにします。470-670 nm と 4 スペクトル ステップ サイズを入力レーザのスペクトル ウィンドウを設定し、そしてΛの nm-励起ラムダ スキャンの設定(図 3 b)。
- ダブルクリックするか (図 3 c) のスペクトル範囲の調整バーを動かす 450 690 に光電子増倍管のスペクトル範囲を設定します。
注: このスペクトルの範囲は、入力ソースの完全な帯域幅を含める必要があります。 - 高開口数を適切に、水浸対物レンズを選択 (NA > 0.7) とAOBS 構成とライブ スキャンボタンをアクティブに PMT とレーザーの電源を任意の値を与えます。AOBS 構成(図 3 d) の反射をチェックすることによって光路を切り替えます。
- 参照ミラーをマウント (材料表参照) 顕微鏡ステージ上。鏡面は、対物レンズに対して直面する必要があります。場合顕微鏡ステージにミラーを置きやすい、フラット プレート (スライド ガラスなど) の上にミラーを接着します。
- ミラー表面に焦点面を揃えるに顕微鏡ステージを制御します。
- 光電子増倍管の利得と検出器のダイナミック レンジを考慮したレーザー パワーを調整し、一定の電源を一定パーセントからレーザーの入力モードを変更します。
注: 典型的なよう、PMT ゲイン 500 (V) と 0.1% の相対的なレーザー出力は 570 で使用される nm。 - 波長範囲にわたって彩度がないことを確認する擬似カラー モードで確認します。彩度を観察すると、(図 3 a) のレーザー出力を下げます。
- ラムダ スキャン取得を実行します。
- ステージからミラーを削除し、暗い参照 (すなわち、暗いオフセット) を取得するためにサンプルなし同じ取得を繰り返します。
- 研究 TIF形式でデータを保存します。
3. スピア画像集録
- 顕微鏡ステージ上にマウントされた組織を置いてください。対物レンズの焦点平面に組織をほぼ揃えて配置するには、目の部分を広視野蛍光モードを使用します。
- ライブ スキャンで、組織の関心領域に焦点面を揃えるに顕微鏡ステージを制御します。カバー スリップからのバック グラウンド ノイズを避けるためには、ガラス組織インターフェイスから少なくとも 15 μ m の深さのターゲット地域を選択します。
- 手順 2.1-2.10 で同じ手順を使用してターゲット領域のスペクトル画像のスタックを取得します。
- 研究 TIF形式で組織と暗いオフセットのデータを保存します。
注: この段階で実験者が一時停止します。
4. 画像処理と解析
- ImageJ で参照ミラーおよび脳組織のスペクトル データ (研究 TIF) を開きます。
- 開かれた画像のスタック ・ ロワ (興味の地域) を選択、参照ミラーと脳組織の軸索繊維のセグメントの中心部。
- 実行イメージ→スタックで選択した Roi の生のスペクトルを取得 ImageJ メニュー上のz 軸のプロットのプロファイル。
- 暗いのオフセット データ参照ミラー、他に行われ、脳の組織のための 1 つを開きます。
- 実行中のイメージ→スタック→ 暗いオフセットのスペクトルを取得 ImageJ メニュー上のz 軸のプロットのプロファイル。
- コピーと貼り付けのオプションを使用して取得したすべてのスペクトルを保存します。
注: 領域イメージング用軸外収差を最小限に抑えるために中央のイメージング分野の使用お勧めします。軸索線維は、その長さに沿って構造的に異機種混在可能性があります。したがって、小さい軸索のセグメントに ROI を選択すると、通常 < 5 μ m、部分的なボリューム アーティファクトを最小限に抑えることを推奨します。
5. 基線補正、スピア信号解析
- 参照ミラーや脳組織のスペクトルからスペクトルのオフセットを減算します。
- 各スペクトルのスペクトルの最大強度で割って正規化します。
- 参照ミラーの正規化されたスペクトルによる軸索の正規化されたスペクトルを分割し、正規化されたスペクトルから DC オフセットを減算します。
- 正弦波を集録したスペクトルをあてはめによる波の周波数を測定 (材料の表を参照)、曲線し、周期に取って逆数による買収の波数を変換します。
- 波数の周期性を図 4 の cの式を使用して軸索直径に変換します。
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Representative Results
外因性の染色、ミエリンを対象とした蛍光を持つ準備された固定脳スライス プロトコルに従って (材料の表を参照してください)。と共に使用して商業ハイパー共焦点顕微鏡共焦点蛍光イメージング (図 4 a) 脳スライスの領域イメージングを行った。スピア、入力光強度が 5 μ/μ m2 〜 1 μ s の画素のドウェル時間を設定しました。この光の線量は、大きさの順で、従来の蛍光共焦点顕微鏡12より低い。~ 17 かかる上スペクトル スキャンの s 4 の間隔で 470 670 nm nm (51 画像)。
光の反射の幾何学によって期待どおりに、有髄軸索の中心に沿ってスピア信号はローカライズされました。軸索のセグメントの反射スペクトルから軸索の直径 (図 4 b, c) に変換された後波の周期性が得られました。スピアによって測定される直径は蛍光を用いた測定 (図 4 d) とよく一致する見つかりました。回折限界の解像度蛍光ベース メソッドまたは不完全な幾何学的のいずれかから残留のマイナーなエラーが由来している可能性があります領域のモデル。
スピア イメージングは光反射に基づいて、重要なバック グラウンド ノイズを石英系観察ができるので。光セットアップ時にバック グラウンド ノイズがかなり、coverslip からイメージング深さは 5 μ m 以下がイメージングの深さが 15 μ m (図 5) を超える場合は回避されました。
図 1: スピア主義。有髄軸索は多層薄膜構造です。フレネルの法則によって説明するようオフ インターフェイスで、入射光によって部分的に反映されます。これらは光の波が互いに干渉を反映したがって、結果の反射光は、ナノ構造情報をエンコードします。スペクトル反射 (領域) は、有髄軸索からの反射光をデコードすることによってナノ構造情報を取得します。この図は、クォン、j.らから転載されています9この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: スピア システムのレイアウト。スピア システムは、共焦点反射顕微鏡に基づいています。スペクトル スキャンの 3 つの追加のコンポーネントは励起パスに沿って必要な: (1) スーパーコンティ ニューム光レーザー、(2) 音響光学波長可変フィルター (AOTF) と (3) 音響光ビームスプリッター (AOBS)。ブロード バンド光源スペクトル、狭い帯域幅を選択した波長を送信する AOTF によってフィルターされます。AOBS は、サンプルに励起された光を導くため選択した波長のビームスプリッターとして機能します。光はセルフセンシングアクチュエーション スキャナー、対物レンズを通して試料に入射し。サンプルからの反射光は descanned、共焦点ピンホールによって空間フィルターし、光電子増倍管 (PMT) によって収集されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ソフトウェアのセットアップ。(、) グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) です。メイン ウィンドウでは、主に 5 つのサブパネル: 画像ビューアー、検出器セットアップ光セットアップ レーザー セットアップ セットアップをイメージングします。(b) 画像のモードを選択するドロップ ダウン メニュー。スピア、xyλ を選択します。(c) 検出器のスペクトル ウィンドウを調整するためのパネル。(d) 音響光ビームスプリッター (AOBS) を設定するためのパネル。'反射' を選択して、反射光を検出器に導きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 脳組織にスピア。マウスの脳組織の (、) A 領域のイメージは、髄鞘 (fluoromyelin) の蛍光 counterstaining と汚れます。A (b) 代表的な反射スペクトルを取得白い破線のボックスからに。(c) スペクトルの周期性と軸索の直径を推定するシミュレーション参照カーブ。青色のアスタリスクは、(b) から得られたデータ ポイントです。(d) ボックス化された地域からの蛍光強度の横のプロファイルにします。蛍光信号を用いて推定したミエリンの外径は 〜 760 nm 領域測定と同様。残留エラーは多分蛍光計測の回折エラーからです。縮尺記号、5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: カバー スリップの効果。(、 b)組織 coverslip インターフェイスから異なる深さで同じ体位で脳の反射画像を取得: 3 μ m (a) と (b) 15 μ m。縮尺記号、10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
スピアはスペクトル干渉法による、初めてのライブの有髄軸索のナノスケール情報を提供する新しいラベル無料画像モダリティです。現在獲得プロトコルで軸索直径の空間分解能が 10 nm。また、スピア利用; 他の超解像顕微鏡と比較して桁の低光量したがって、光毒性とフォトブリーチを行なったから無料です。スピアは、有髄軸索のナノスケール動態を研究するための新しい道を提供します。
ここ記載されているプロトコルは、視聴覚とポイント検出器 (すなわち、光電子増倍管) を介するスペクトル スキャンに基づいています。このアプローチは、完全なフィールドのビューのスペクトル画像を取得で有利です。しかし、時間分解能は、通常、現在の構成 > 15 s スペクトル スキャンによって制限されます。代わりに、小さな視野の9のリアルタイム観察を可能にする高速分光器を組み込むことができます。このシステムは、分光器により分光し白色光レーザーを追加することによって、PMT を切り替えることによって単に従来の共焦点システムから構築できます。集録ソフトウェア, ガルバノ位置は分光器の実行と同期している必要があります。シングル ポイント測定時間分解能は、最近の超高速分光器の > 10 kHz は、分光器のフレーム レートによって決まります。このサブ ミリ秒時間分解能は、有髄軸索の生体内の生理学的ダイナミクスのほとんどを観察のために十分にする必要があります。スピアは光の反射に基づくしたがって、検出された光は、入射光と同じ波長を持ちます。逆に、蛍光を含むスペクトル シフト (すなわち、ストークス シフト)。したがって、検出された光は入射光からスペクトル分離です。この機能は、(図 4に示す)、領域の同時取得と同じ試料の蛍光便利です。Fluorophore による入力の光吸収のスピア計測に影響することができますが、典型的な蛍光染色から吸収はサイドス (< 1%)。
ノートでは、領域が限られた角度検出範囲だけ画像平面に対してほぼ平行軸索を検出できます。スピアのこの角度の限界は ± 13.5 ° 9周りです。興味の特定の方向を取得するには、サンプルを傾斜する場合があります。ゼブラフィッシュ胚など透明な試料の場合は、試料を回転させることにより、全体積の獲得を可能かもしれない。追加の実用的な制限はサンプルにマウントされた coverslip が図 5に示すように、高いバック グラウンド信号の生成につながる強い背面反射を生成することこの表面的な地域を避けるべきことをお勧めします。可視光の領域は、脳組織 〜 20 μ m の 1/e の減衰長。典型的な組織浸透深さ ~ 100 μ m より深いイメージングに制限されている信頼性の高いスペクトル情報を取得可能なは、もはや入力ソースを使用する場合があります。最後に、領域の検証が回折限界の蛍光顕微鏡と比較して表示されます。これはどうやら不十分ナノ精度 (図 4) の評価。相関光電子顕微鏡や拡大顕微鏡などの最新技術はナノスケール政権13,14で領域を検証する方法を提供します。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的な利益を宣言: J. クォンと M. チェは、この資料に記載されている保留中の特許技術の発明者。
Acknowledgments
この作品は、によって、研究所の基礎科学 (IBS R015 D1)、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 文部省 (2017R1A6A1A03015642) によって資金を供給にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass cutter | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Nail polish | - | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| Apochromat objective 40×, NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | Water-immersion type |
| Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used. |
| Leica SP8 TCS microscope | Leica Microsystems | SP8 | Refer to the "Configuration of microscope" in Introduction Section for details. |
| Imaging software | Leica Microsystems | LAS-X | - |
| Matlab | MathWorks | - | - |
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | Coated with protected silver. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | - |
| Paraformaldehyde | Biosolution | BP031a | 4% v/v in PBS |
| Cover slip | Thermo Fisher | 3306 | Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm) |
| Slide glass | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | Thickness: ~1 mm |
| Super glue | Henkel | Loctite 406 | Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact. |
| Syringe pump | Brainetree Scientific | BS-8000 DUAL | - |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200S | - |
| White-light laser | NKT photonics | EXB-6 | EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6. |
References
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