Summary
質量分析 (MS) は、高分子アセンブリのダイナミクスと構造調査のための重要なツールとして浮上しています。ここでは、我々 はタンパク質複合体形成とリガンドを尋問する MS ・ ベース ・ アプローチを統合します。
Abstract
タンパク質は、遺伝子発現、代謝反応、DNA 修復や複製を触媒を含む細胞機能の多くの重要な役割を果たす生体高分子の重要なクラスです。これらのプロセスの詳細な理解がについての重要な情報を説明します。 したがって、細胞機能。統合構造 MS メソッドは、蛋白質複雑なアセンブリ、複雑な接続、サブユニット組成比、多量とリガンドの構造と力学的情報を提供しています。統合構造 MS の最近の進歩は、大規模な DNA 結合タンパク質、膜タンパク質を含む挑戦的な生物学的システムの特性評価のため許可されています。このプロトコルでは、ヘリカーゼ ヌクレアーゼ DNA への洞察を得るためにネイティブの MS とイオン移動度質量分析法 (IM MS) 分子動力学シミュレーション蛋白質複合体を修復などさまざまな MS のデータを統合する方法について説明します。結果のアプローチは、重要な生物学的プロセスに関与する他の蛋白質の複合体にリガンド結合の詳細な研究のためのフレームワークを提供します。
Introduction
ネイティブ質量分析法によるタンパク質およびその複合体を用いて非共有結合性相互作用とタンパク質の折り畳みを維持ナノ-エレクトロ スプレー イオン化 (nESI)、エレクトロ スプレー イオン化プロセス1、中に 2。ネイティブの MS でタンパク質およびその複合体の構造は、気相3,4でネイティブに近い状態に保持されます。ネイティブの MS 検出比率 (m/z) タンパク質やタンパク質-リガンドの固まりのことを充電するためにそれらの質量によると区切られている複数の荷電タンパク質イオンを計算する複雑な。この情報はそのまま蛋白質の相互作用ネットワーク3,4,5,6ligand の結合の化学量論、サブユニット組成の定量できます。ネイティブの MS が他の手法に比べていくつかの利点そのような x 線結晶構造解析と核磁気共鳴分光法5。まず、ネイティブの MS は迅速かつ高感度技術だけいくつかマイクロリットル (2-3 μ L) を必要とする低 μ M 範囲6高 nM の比較的低い最終的な複雑な濃度でのサンプルの。第二に、ネイティブの MS が可能複数の蛋白質とオリゴマーの状態を同時に解析する異種蛋白質のサンプルを調査する使用できます。第三に、ネイティブの MS では、解析の前に化学的架橋またはタンパク質ラベリングによって変更される蛋白質のサンプルは必要ありません。これらの利点は蛋白質複合体の構造の調査のための強力なツールに構造の MS にしました。
ネイティブの MS は、衝突の断面決定する (CCS) を有効にするイオンの移動度 (IM) タンパク質のイオンが電界を通過する時間を測定する手法と組み合わせることができます。CCS は、トポロジと得られるタンパク質の構造の不均一性について低解像度の構造情報を提供します。さらに、計算のアプローチによって生成されたタンパク質構造モデルの検討をことができます。
IM-質量分析法による衝突誘起展開 (CIU) 測定を使用して、タンパク質相安定性を調べることが。CIU の過程でタンパク質のイオンの加速し、質量分析計7,8,9内不活性バッファー ガス増加加速衝突を介して活性化します。この衝突活性プロセス CCS の増加に変換する部分的に展開するタンパク質を原因します。CCS とタンパク質を展開するために必要なエネルギーの変更をすることができますイムさんを使用してこのアプローチを測定、リガンド結合タンパク質安定性に及ぼす測定10をすることができます。Subcomplexes は、タンパク質複合体のネイティブのようなトポロジを監視する有機溶剤添加などのソリューションの中断方法を使用してソリューションに生成できます。タンパク質複合体の中断は、内の非共有結合性相互作用の混乱のために主にです。サブの複合体は、ネイティブのようなトポロジを維持し、MS 検出時間サブユニット接続に関する情報を明らかにします。
構造生物学の統合的なアプローチは、構造とタンパク質およびその複合体3,4,5,6のダイナミクスを研究する多様な方法を組み合わせます。ネイティブの MS と IM MS は、挑戦的な生物系の分子の詳細を明らかにするために使用されています。蛋白質アセンブリ経路11,12,13,14、蛋白質蛋白質の相互作用ネットワークの15の勉強の調査を含むアプリケーションのいくつかの例があった,16,17、膜蛋白質6,18,19,20,21、および核酸22,23 などタンパク質-リガンド相互作用 ,24。
ただし、ネイティブの MS にも制限があります。ネイティブの MS 測定はしばしば、いくつかのタンパク質が、折り畳まれたネイティブ状態3,25を保たないアンモニア酢酸などの揮発性のバッファーで実行されます。それにもかかわらず、最近の作品はタンパク質とタンパク質の複雑なイオンを高イオン強度により非揮発性のバッファーから直接形成できるように針の先端の直径 (0.5 mm ヒント) をスプレーの最適化によるこのような制限を克服できることを示しています。26生理的環境を模倣します。さらに、ネイティブの MS を使ってエレクトロ スプレー イオン化し、非共有アセンブリをソリューションからガス相; に転送したがって、検出された複合体の相対的な豊かさ表さない場合があります完全にソリューション5,27に。さらに、ソリューションに比較、ガス相の疎水性相互作用が弱くなると静電相互作用が強くなるし、それゆえ3,28を支持します。
この記事でタンパク質の同定とリガンド結合ネイティブの MS、IM MS、CIU、ソリューションの混乱を使用して、モデリングのためのプロトコル、データ分析と解釈をいたします。DNA 修理複雑、HerA ぬは、モデル システムとして使用されます。DNA 二本鎖切断 (Dsb) は遺伝的不安定性と人間の癌の最終的な開発の結果、DNA の損傷の最も細胞毒性と有害な形態の 1 つです。相同組換えは、ATP 依存ヘリカーゼ ヌクレアーゼ複雑、HerA ぬ22によって管弦楽に編曲されるプロセスの偏向を根絶する修復機構。
ネイティブの MS と IM MS を組み合わせて機能アッセイとモデリング許可の調査: i) でアセンブリ、構造および安定性複合体、ii) dsDNA と複合体間の相互作用とその全体的な影響ぬの役割複合体の安定性および iii) 化学量論とアセンブリ22ATP 結合の影響。全体的にみて、この作品は、ヌクレオチド結合タンパク質の複雑な構造変化と安定性でリンクしてヘラぬ複合体の分子基盤の理解の改善につながった。このプロトコルは、1 つまたはいくつかの ligand(s) 型と相互作用する任意のタンパク質 complex(es) のジェネリックです。
Protocol
1 タンパク質とタンパク質-リガンド複合体のネイティブの MS のサンプル準備
注: ネイティブの MS を使用してリガンド結合とタンパク質複合体の分子基盤の理解を得るためには、適切なサンプル準備キーです。このセクションの目的は、例として DNA とヌクレオチドを結合するヘラぬ錯体を用いた MS 分析の前に重要なサンプル準備の手順を強調することです。
- 1.5 mL チューブに高濃度精製タンパク質 (通常 15-30 μ M) の 20 μ L 因数を準備します。
-
ATP または ADP 結合分析のため
注: 追加の非加水分解性 ATP アナログ アデノシン 5 'O濃度を上げる-(3-thiotriphosphate)、tetralithium 塩 (ATP-γ-S) またはアデノシン 5'-二リン酸 (ADP)。非加水分解性 ATP 誘導体は、キャプチャされる ATP 結合蛋白質を可能にする安定した複雑なを生成します。テストできる他の非加水分解性 ATP アナログ アンプ PNP と ATP γ S Mg2 +があります。- ヘラぬ研究、ADP と ATP γ S の浄化された蛋白質の 5 μ M を 0-1 に至る濃度でミックス mM。
- ATP-γ-S と ADP の同時バインドをキャプチャするには、同じまたはさまざまな濃度で両方のヌクレオチドを追加します。
- 2 mM MgCl2を追加し、25 ° c 1 時間乾燥風呂インキュベーターで孵化させなさい。
注: ネイティブの MS は高濃度で artefactual バインディングにつながる nESI のヌクレオチド結合の解析、したがって非特異的結合取られなければならないアカウント29に。非特異的結合を調べるためには、追加 2 ~ 5 mM 間のヌクレオチドの高濃度)。
-
DNA 結合分析のため
- タンパク質-DNA 複合体の形成は、モル比でタンパク質や DNA をミックスします。ヘラ、ヘラぬ 1:1 の比率で DNA の浄化された蛋白質の 5 μ M をミックスします。
- ヘラぬやヘラ - DNA 混合乾燥風呂インキュベーター平衡に達するまでに 25 ° C で 30 分間インキュベートします。期間および培養温度は、調査中のタンパク質によって異なります。
- MS 互換性のあるバッファーにバッファー交換蛋白質のサンプル。一般的に、ph 7 8 5 mM 1 m アンモニア水酢酸溶液が使用されます。エチレンジアミン二酢酸一 (エッダ) と Triethylammonium (TEAA) 酢酸30他の MS の互換性のあるバッファーが含まれます。ヘラぬ研究 200 mM アンモニウム酢酸 pH 7 を使用します。
注: スピン コンセントレーターやクロマトグラフィ用カラムなど質量分析法による分析の前にバッファー交換のためいくつかの方法があります。ネイティブの MS は主バッファー付加体などは浄化中に使用されるサンプルの質によって制限されます。したがって、解決のピークを取得する十分な脱塩を行うために不可欠です。 - ヘラぬリガンド結合実験のコンセントレーターを使用して 200 mM 酢酸アンモニウムに 6-8 回 exchange サンプルをバッファーします。このメソッドはより時間がかかるが、それは確実にピークを達成、解決し、ATP/ADP 結合種の正確な質量測定を可能します。
2. ネイティブの MS の取込みと蛋白質の複合体およびタンパク質-リガンド複合体の調査のための解析
注: MS の条件は、正確な質量測定を有効にする高度に解決のピークを達成するために最適化する必要があります。このセクションの詳細は、32 k 上限 m/z 極 Q ToF 質量分析計のパラメーターを最適化されています。
- ナノ エレクトロ スプレーに備えて社内毛細血管とキルシェンバウムらによって詳細なとして正確な質量測定のための測定器の質量校正を実行1。
- 感度、肯定的なイオンの取得およびモビリティ TOF モードを選択します。
- トラップ、API および IMS のガスを入れます。IM の分離のための開始点として窒素 (60 mL/分)、アルゴン (8.4 mL/分トラップ領域) を使用して、調整します。
- 適切な m/z 収集範囲を設定します。未知の蛋白質の初期最適化のステップ 500 32,000 m など広い範囲を使用する必要があります/z。
- ゴールド コーティングされたキャピラリーに分析して毛細血管のホルダーに挿入する蛋白質の複雑な解決の 2-3 μ L をロードします。
- 優しく毛細血管を強化、エレクトロ スプレー ソース段階で毛細血管を配置、データ集録を開始する位置にステージをスライドさせます。
- 低ナノ流量のガス圧力を適用 (0.00 0.05 バー) ドロップがキャピラリーの先端に形成されるまで。スプレーの維持まで、ナノ流動圧は下がりました。
- Z 位置し、イオンの安定したイオン電流を達成するために電流を監視、x、y 毛細血管を移動することによって円錐に関して毛細血管を調整します。0.9 1.6 の範囲のキャピラリー電圧 kV。
- サンプリング コーン (50-120 V)、ソース ・ オフセット (60.0)、ソース温度 (25 ° C)、円錐形ガス流れ (0.0 L/h) を設定します。これらの提案の初期条件を調整することができます。
- うまく解決のマススペクトルを取得し、イオン伝達を最大化するには、MS パラメーターを調整し、スペクトルの結果の変更を監視します。転送の最大で最高の分離を達成するためにトラップ (2-8 mL/分)、彼のセル (180 mL/分) および IMS セル (90 mL/分) のガスの流れを調整することが含まれます。
- 電圧オフセットが十分ではない場合は、トラップの衝突エネルギーを調整します。最適な開始点は、10-50 V の間です。
注: トラップ エネルギーの増加は、付加体非共有結合削除ことができます。ただし、衝突誘起解離とタンパク質-リガンド複合体の展開を避けるために注意してください。イオン移動度測定計器保持ネイティブたたんだ状態 (ステップ 3) で蛋白質を確認するを実行します。 - トラップのバイアス電圧を最適化することにより溶媒を向上します。最適な開始点は、20-45 V です。
- 波速度と最高のモビリティの分離を達成するために波の高さを最適化します。詳細な説明とプロトコルは、31をここ発見することができます。ヘラぬ研究 40 (m/s) の波速度と 550-650 (V) の波の高さを使用します。
- 楽器の既定値として、他のすべてのパラメーターを使用します。
- (図 1) の実行ごとにコントロールとして解析用配位子の無料サンプルを準備します。リガンド結合実験のために少なくとも 3 つの独立した測定を実行します。
- Masslynx ソフトウェアを使用して生成された種の質量を測定し、ATP や ADP 結合オリゴマー状態 (図 2 、3) などのリガンド結合を識別します。UniDec32、パルサー33アムピトリーテー34利用可能なその他のソフトウェアが含まれます。
- 種の相対的な豊かさを定量化するには、(たとえばリガンド連結、異なるオリゴマーなど。) 生の MS スペクトルで観測された対応するイオン強度を使用します。また、UniDec と Massign35 (図 1 と 3 ) のような特殊なソフトウェアを使用して定量化を行います。
3. 集録および解析 IM MS
注: IM MS (質量) のサイズ、形状および料金に基づいて気相のイオンを分離します。M/z スペクトルで解決されたすべての機能は、ドリフト時間分布に関連付けられます。IM MS は、衝突断面 (CCS) を計算するため使用ことができるイオンのドリフト時間を計測します。ドリフト時間値は、IM MS ドリフト管は直線的 CCS 値36を関連付けることができますを使用して取得したデータから計測されます。IM MS (双子だものね) 測定を旅行する CCS の値を計算すると、知られている CCS 値37タンパク質基準から得られた検量線が必要です。コンパクトな構造は拡張よりも速く移動または細長い構造体減少移動セル38バッファー ガスとの相互作用。したがって、IM MS はガス相39,40でネイティブの折られた構造が保持されているかどうかを検出する使用ことができます。このセクションは、IM MS を測定、双子だものねを使用して蛋白質の CCS を計算する方法をについて説明します。
- 安定した伝送 (ステップ 2) の計測条件の最適化の後良いスペクトル品質を維持しながら衝突エネルギーと可能な限り低くサンプリング コーンを減らします。
- 最適化された波速度と波の高さを使用して IM MS (ステップ 2) を取得します。
- イオンのドリフトを測定 (例えば40 V) 同じの波の高さを維持しながら 3 つの異なる波速度 (例えば550、600 と 650 m/s) で IM MS の時間。
- タンパク質イオン CCS は、調査中のタンパク質の使用同じ計器測定蛋白質 calibrants を確認します。最適なドリフト時の校正には、知られている CCS が付いている蛋白質の測定が必要です。
- 4 つの calibrants、2 つの上の質量を持つと下調査37蛋白質の質量を持つ 2 つを選択します。最も重要なは、波の高さと波速度が調査中の蛋白質のために記録されるそれらとして同じであることを確認します。
- 計算41 CCS 手動でまたはパルサー33アムピトリーテー34 (図 5) などの特殊なソフトウェアを使用しています。
- タンパク質であるかどうかを確認するには、ネイティブのようなガス相で比較実験的理論的 CCS CCS は、高分解能構造から取得されます。ヘラ-ぬ理論 CCS MOBCAL42で使用される射影近似 (PA) メソッドを使用して計算されます。他の方法では、軌道法 (TM)42 (EHS)43を散乱正確な剛体球をご利用など。
4 ネイティブの MS と IM MS タンパク質複合体のソリューション混乱主導の構造決定
注: サブ タンパク質によって識別できます無傷の複合体として同じソリューションから。ただし、ソリューションでは、フォームのサブの複合体に蛋白質の相互作用の妨げ間サブユニット接続や複雑な組み立てなどさらに構造情報が得られます。これは有機溶剤、イオン強度を増加または pH を操作に追加するなどいくつかの方法で達成することができます。ヘラぬ複雑な亜単位の接続と複雑なアセンブリに洞察力を得るためには、サブの錯体は、サブユニットの相互作用を摂動する溶剤を追加することによってソリューションに発生しました。
- ステップ 1で説明したように酢酸アンモニウムに蛋白質のサンプルとバッファー交換を準備します。
- 10% 刻みで溶剤の 10-40% を追加します。通常使用される溶媒はメタノール (メタノール)、ジメチルスルホキシド (DMSO)、アセトニ トリル (ACN です)。
注: これは、ポリプロピレン微量遠心チューブ内で実行できます。 - 1 h の氷の混合物を孵化させなさい。
- (手順 2 および 3) (図 4) 各条件に対して IM MS スペクトルを取得します。
- サミット ソフトウェア44を使用して、割り当てるサブ タンパク質とタンパク質間相互作用ネットワークを生成します。また、予想される種の理論的な大衆の一覧を手動で生成します。
- Subcomplexes が折り畳まれていることを確認、サブの複合体の実験的 CCS 値を計算し、ステップ 3 (表 1図 5と図 6) で説明している理論的 CCS に比較します。
5. 衝突による展開 (CIU) を使用して蛋白質複雑な安定性の調査
注: CIU を使用できますその錯体の配位子が結合して蛋白質の構造安定性をプローブします。パルサー33、アムピトリーテー34 CIU スイート9などの専門家のソフトウェア パッケージは、捜査、リガンドとタンパク質のアンフォールディング気相モデルに使用できます。例として、このセクションは気相の監視の手順を説明ヘラぬ複合体の DNA や ATP 結合の安定の効果の調査と軌跡を展開します。
- 気相におけるタンパク質を徐々 に展開する 2-10 V 単位で 200 V を 10 V からトラップ加速電圧を高くしながらレコード IM MS データ。
注: プロセス、しかしこの方法より多くの解決の展開プロットするデータ ファイルの小さい増分結果の記録折り畳まれて繰り広げられる種の間の遷移点を分析のために重要であります。 - パルサー33、アムピトリーテー34または CIU スイート9を使用して取得したデータを分析し、加速電圧 (ステップ 3) の関数として CCS の単位で二次元展開プロットを生成します。各充電状態、これがそれぞれの加速電圧 (図 7 A Bi) における強度 - 正規化 CCS 分布を積層することにより作成されます。
- ソフトウェア パッケージの 1 つを使用して理論的展開プロットを生成します。データは、展開モデルに装着されます。これにより、展開の遷移が発生してバインドされている配位子33とタンパク質の安定性を決定する衝突エネルギーを定量化することが可能。アンフォールディング転移、種の遷移 (実験的 CCS 値に基づいて) 1 つの状態から大きい CCS と別の状態です。
- 遷移を量的に表わすとパルサー33などソフトウェアのアルゴリズムを使用して状態間移行 midpoint(s) を計算します。これは一般履歴書50は、特定の状態の 50% を消耗する衝突 (トラップ) 電圧値として報告されます。
- CV50値を使用して、質量中心衝突エネルギー (柯COM)45を用いたイオンの総内部エネルギーを計算します。KECOMイオンの展開の移行の合計の内部エネルギーによって定義され、10式 (1) で説明したように運動エネルギーと衝突パートナー (タンパク質イオンと中性ガス) の質量から計算されます。
KEcom (eV) =
(式 1)。
Zはイオンの電荷、MNは中性のガスの質量、Mイオンがタンパク質のイオンの質量。
注: これは蛋白質の CIU 料金 dependent46、47 は、ためにです。1 つ以上の充電状態 (図 7Aii) 柯COM分析を実行することをお勧めします。
(式 1)。6. 差動分子動力学の統合 MS で使用されるプロシージャをモデリング
注: 蛋白質の亜単位または錯体結晶構造からのモデルを使用して、差分の MD シミュレーション (タンパク質とリガンド複合体) は蛋白質の構造とダイナミクスに及ぼすたとえばリガンドの存在を決定する使用できます。このセクションは、ワークフローおよびセットアップ差動分子動力学シミュレーションに必要な手順をモデル化に必要なツールについて説明します。
- (図 8A手順 2 および 3 の) 複合体を構成するサブユニットを識別します。サブユニット、RCSB データバンク (https://www.rcsb.org) から結晶構造などの既存のモデルをソースします。UniProt タンパク質のエントリのリストが含まれますは、結晶/NMR 構造 (http://www.uniprot.org) を知っています。これらが使用できない場合は、相同性モデリング (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) のための適したテンプレートを識別するために爆発する理論的なシーケンスを入力できます。
- 正しいトポロジ (図 8A ii) の複合体を組み立てます。これは、さまざまな方法で行うことができます。個々 のサブユニットは、無傷の複合体 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/) を組み立てるため、EMDB で見つけた使用可能な電子顕微鏡マップに取り付けることができます。分子動力学フレキシブル継手 (MDFF) を使用して EM マップに Pdb をフィッティングするためのチュートリアルをここで見つけることが: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/。
- (図 8A iii) 複合体の欠損個所を特定します。結晶構造や結晶学的実験から継承された任意の突然変異に取り付けできない場合があります残基を識別する PDB と理論的なシーケンスを複数配列アラインメント (MSA) を実行します。MSA は、T-コーヒー (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular) などの web サーバを使用して実行できます。
- 相同性モデリング (図 8A iv) 経由で不足している残基を再生成します。複雑なタンパク質の残基を行方不明は、モデラー プログラム (https://salilab.org/modeller/) を使用して構築できます。モデラーは、別の再生設定で n モデルのアンサンブルを出力できます。良いモデルは、離散最適化蛋白質エネルギー (ドープ) スコアに基づいて識別できます。包括的なチュートリアルは、ソフトウェアのウェブサイト (https://salilab.org/modeller/tutorial/) で提供しています。
- 配位子の存在など、特定の環境変化に対応する蛋白質の領域を識別する (図 8B) 複雑な蛋白質の差動分子動力学 (MD) シミュレーションを実行します。このようなシミュレーションは、シミュレーションから行動パラメーター (蛋白質のみ) でシミュレーション B (タンパク質 + 配位子) から減算は、参照として機能します。計算シミュレーション A と B 間差分の二乗平均ゆらぎ (RMSF) を増減させる柔軟性のリガンド依存的蛋白質の地域に知らせることができます。
- MD シミュレーションと GROMACS (http://www.gromacs.org) を使用してダウン ストリームの解析を実行します。チュートリアルを見つけることができます: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html。Elimate モデル バイアス最初リガンド複合体の構造を生成します。タンパク質は、リガンド、リガンド複合体と同じタンパク質モデルを生成することがなく、これからコピーされます。
Representative Results
ネイティブの MS の結果では、オリゴマーの状態, 組成とヘラぬ複合体 (図 1) の位相を明らかにしました。気相における非共有結合性相互作用が保持され、ATP γ S と ADP 滴定実験のネイティブの MS 決定ヘラぬ (図 2) に一対のヌクレオチド結合、ATP γ S 濃度を高くと相対的な増加6 量体ヘラ (図 3) の輝度。ネイティブの MS が続くソリューションで破壊から得られたに同意していた相互作用サブユニットに関する構造情報と理論的大衆 (図 4 および表 1)。
タンパク質およびその複合体の実験の CCS の値は、IM MS 実験 (図 5) から派生しました。これらの値は回転平均気相分子形状の断面計算で、タンパク質の次元の状態を記述します。CCS の値は、x 線結晶構造解析から理論的な測定と比較され、良い一致を推論の本来の形状がガス相(表 1)に保持します。これは蛋白質アセンブリ48の低解像度モデルを構築するための CCS の値を使用して検証します。
実験参加状態にある各電荷のイオンを計算できます。ネイティブのようなタンパク質リガンド似た CCS 値を持つ多価イオンを充電する上昇を与える可能性があります。しかし、高い電荷状態イオンはクーロン反発理論 CCSs に比べてタンパク質相展開と大きく CCS 値につながる可能性があります増加。イオンは、したがって通常最低の電荷状態の CCS の値には、49が使用されます。ヘラ-ぬ、ヘラ、ヘラぬソリューションで破壊実験 DNA と求めモノマーと開始し、全体の 6 量体 HerA (ヘラ6) を形成アセンブリ経路の生成-複雑なぬ (ぬ2) 二量体DNA (図 6)。
(配位子無料) apo とリガンド結合の CIU 展開プロットの違いは、リガンド結合に伴う複雑な安定性に変更を定義します。高い CV50または KECOM値は、ガス相でより安定したイオンを意味します。CIU、KE のCOM分析による DNA バインド ヘラぬ、無料の DNA の複合体 (図 7Aii) よりも安定。CIU MS それぞれ ATP 結合状態の分析からは、ガス相とすべてのサイトがあるが占められる 6 -ATP γ S バインド済み状態で複雑な安定性低下がほとんどだった 4-ATP-γ-S 束縛状態は (図 7Bii) を安定しています。ネイティブの MS は離散のヌクレオチド結合内のヘラ; の状態を明らかにします。ただし、それはどのヘラ サブユニットが結合、ATP とこのバインディングが行われるを区別できません。この情報は、6 量体ヘラと要約のワークフロー (図 8) に従うヘラぬに明示的な溶媒分子動力学シミュレーションから派生することができます。
図 1。オリゴマーの状態、組成、ヘラぬ非共有結合複合体のトポロジーを尋問します。(A) マススペクトルのヘラ、ヘラぬと DNA (15.4 kDa 25 bp 二本鎖 DNA) の存在下でヘラぬ。ヘラ部分複合体は、6 量体と、heptamer の両方として存在します。ぬ二量体が結合してオリゴマー変換を課すヘラ hexamer。DNA は、形成されたヘラ-ぬ複合体 (Z. Ahdashら、2017年22から適応の結果) をバインドします。(特定の種の B) 相対強度は、UniDec32を使用して計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。ネイティブ ESI MS ヘラぬへのヌクレオチド結合のメカニズムを明らかにします。ヘラ-ぬ (A) と (B) ヘラぬ DNA (ii) ADP と ATP γ S (i) 濃度の増加と質量スペクトルは。測定された固まりと比較される理論的な固まりおよび ATP-γ-S の量または ADP が結合が決定されます。測定された固まりおよびバインドされたヌクレオチドの数はスペクトルに表示されます。ATP γ S と ADP の滴定実験と循環反応機構 (Z. Ahdashら、2017年22から適応の結果) を示す DNA 複合体でヘラぬだけで、一対の塩基配列バインディングを決定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。ヘラ オリゴマーの状態で ATP γ S 濃度の増加の効果を測定します。(ATP γ S の濃度の増加でヘラの A) 質量スペクトル(B) ネイティブの MS から異なる種の相対的強度を示すグラフは、UniDec ・ デコンボリューション ソフトウェア32を使用して計算されます。ATP-γ-S 濃度が上昇、6 量体ヘラの相対強度も増加します。バインドされている ATP γ S 分子の数は、スペクトル (Z. Ahdashら、2017年22から適応の結果) に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。大量スペクトルとヘラ (A) と (B) ヘラぬ (i) のサブ複雑な解離製品単独で、(ii) DNA 次ソリューションの中断の存在。ソリューションで中断を用いて 10-40% アセトニ トリル、メタノール (メタノール)、ジメチルスルホキシド (DMSO)、様々 な subcomplexes の形成の結果します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。イオン移動到着時間分布錯体と生成されたサブ錯体の CCS の軸に。図 4にスペクトルに注釈をつけたものと各サブ複雑な相関のアイコン。実験と計算質量とサブ錯体の CCS 値 (波イオンを旅行の解像度における典型的な不確かさを考慮した後の実験と計算値間の合意を示したすべての表 1に記載されて移動質量の ± 5-837)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。ネイティブの MS と IM さん色の円が各サブの複合が認められた状態を示すソリューションの崩壊から生成されたヘラぬ複合体のアセンブリ経路: ネイティブ (緑、中断する前に)、メタノール (黄色), DMSO (パープル) またはアセトニ トリル (赤)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7。ヘラぬと (B) atp ヘラぬ DNA と DNA (A) の安定の効果を調査しています。(i) 気相 CIU MS プロットおよび (ii) 質量中心衝突エネルギー (KEcom) 計算 dsDNA の存在がヘラぬ複合体を安定化し、6 ATP γ S バインド状態であることは最も安定していることを示します。異なる電荷状態の安定化が表示されます。プロットは、パルサー 33を使用して生成されました。Z. Ahdashら、2017年22から適応 (A) からの結果。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8。差動分子動力学モデリング手順のワークフロー。(A) 既存のサブユニットと不足している残基の再構築からトポロジを構築することにより調査の下で複合体を生成します。(B) タンパク質とリガンド複合体の分子動力学シミュレーションを実行するためのワークフロー。分子動力学シミュレーション蛋白質の参照として機能してタンパク質とリガンドのシミュレーションから減算するだけ走った。これはシミュレーションの間差分の二乗平均ゆらぎ (RMSF) を計算し、リガンド結合の効果を決定するが続きます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 複雑な/複雑なサブ | 理論的な大量 (kDa) | 実験的質量 (kDa) | 理論的な CCS (Å2) | 実験的 CCS (Å2) [料金] | HN の条件 |
| ヘラ6- ぬ2 | 416.22 | 417.85 | 14531 | 14577 42 [+] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +] |
10-20%、10-40% DMSO ACN 10% メタノール |
| ヘラ6- ぬ2- dsDNA | 431.72 | 432.27 | - | 14661 39 [+] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 42 [+] |
ACN 10%、10% メタノール |
| ぬ1 | 39.12 | 38.18 | 3254 | 2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +] |
10-40% 10% メタノール、ACN の 20-40% DMSO |
| ぬ2 | 78.24 | 78.36 | 4890 | 4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] [19 +] 4666 |
20-40 %dmso、10-40% メタノール |
| ヘラ1 | 56.33 | 56.32 | 4131 | 3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +] |
10-40 %ACN、40% DMSO |
| ヘラ2 | 112.66 | 112.95 | 6475 | 5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +] |
40% 覚醒、10-40% ACN |
| ヘラ3 | 168.99 | 169.39 | 8607 | 7501 [25 +] 7616 26 [+] 7717 [27 +] 7867 [28 +] |
10-40% メタノール、10-40% が 40% DMSO |
| ヘラ3 + DNA | 183.99 | 184.976 | - | 7655 26 [+] 7990 [27 +] 8107 [28 +] |
10-30% の ACN |
| ヘラ4 | 225.32 | 226.2 | 10477 | 9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +] |
10-40% メタノール、10-40% ACN |
| ヘラ4 + DNA | 240.82 | 241.33 | - | 9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +] |
10-30% の ACN |
| ヘラ5 | 281.65 | 282.75 | 11853 | 10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 38 [+] |
30-40% の ACN |
| ヘラ6 | 337.98 | 339.3 | 12517 | 12335 38 [+] 12386 39 [+] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 42 [+] 13019 [43 +] |
10-40% メタノール、10-40% ACN |
| ヘラ6 + DNA | 353.48 | 354.626 | - | 12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +] |
30% ACN |
| ヘラ7 | 394.3 | 395.85 | 13901 | 14154 42 [+] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +] |
10-40% メタノール、10-40 %acn、10-40% DMSO |
| ヘラ7 + DNA | 409.8 | 410.62 | - | 14414 [41 +] 14510 42 [+] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +] |
10% ACN |
表 1.実験と計算質量とヘラぬとそのサブ錯体の CCS の値は、フォーム ソリューションで中断研究を生成されます。
Discussion
MS は、化学量論、相互作用および蛋白質の複合体のサブユニット構造を特徴付けることますます重要な役割を果たしています。IM MS データは多成分複合体中のサブユニットのトポロジカルな取り決めを定義する使用できます。MS 他の既存の構造生物学の手法と比較して、いくつかの利点があります。ネイティブの MS は迅速かつ機密性の高い技術を異種蛋白質のサンプルをプローブに使用することができます。ソリューションの破壊の結果と相まって、タンパク質複合体の解離経路を監視できます。一緒に結晶構造やホモロジー モデル、構造の MS によって提供される情報はタンパク質-リガンド相互作用を調査するためのツール、ネイティブに近いモデルとアセンブリ経路11を提供します。
ここでは、我々 は統合 MS を使用して化学量論、1 つまたは複数のリガンドとタンパク質-リガンド相互作用の組成を分析するために必要な実験手順を説明します。これは、MS サンプル準備、データ集録、データの解析、および計算ツールを使用して MS データの統合が含まれています。これを行うには、私たちのモデル システムとして 3 配位子 (DNA、ATP、ADP) にバインドされている DNA 切除ヘラぬヘテロ オリゴマー蛋白質の複合体を使用しました。プロトコルは、データ分析とプレゼンテーションを支援する現在利用可能なソフトウェアの使用を示します。
リガンド結合解析の重要な質の高いスペクトルを取得は、したがって、慎重なサンプル準備のステップは重要、蛋白質の浄化、リガンドの滴定、バッファーの交換などです。1 つの制限 nESI のリガンドを勉強するときにネイティブの MS は非固有のバインド。エレクトロ スプレー プロセス全体にわたって液滴溶媒中に非特異的結合が発生します。これは配位子濃度が増加し、したがってタンパク質・ リガンド比29を変更します。ヌクレオチドの結合結果 apo とイオン化効率50,51を変更しないヌクレオチド結合タンパク質の質量差が比較的小さい。
私たちの仕事の有機 G2 Si MS システムを使いましたが、プロトコルは、他の市販のナノ-エレクトロ スプレー質量分析計を使用して他のタンパク質-リガンド複合体の異なった調査の適用。統合構造 MS がますますより複雑な生物学的問題に対処する上で重要な役割を果たしてください。ワークフローとここで説明する手法は構造の結果を理解し、従来の構造的手法を用いて研究することは困難ではないタンパク質複合体のタンパク質-リガンド形成メカニズムの構築に適しています.
Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
ご提供するヘラ、ヘラぬ蛋白質のサンプルと実験的なデザインのカール ・ ピーター ・ Hopfner とロバート ・ トーマス ・ バーンに感謝したいと思います。我々 はまた原稿の彼の評価を博士エイモン読書をありがちましょう。感謝する私たちの資金団体: Wellcome の信頼 [109854/Z/15/Z] と高貴な社会 [兼に RG150216]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
| Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
| Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
| Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
| Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |
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