Summary
质谱 (MS) 已成为研究大分子组件结构和动力学的重要工具。在这里, 我们整合了基于 MS 的方法来询问蛋白质复合形成和配体结合。
Abstract
蛋白质是一种重要的生物大分子类, 在细胞功能中发挥许多关键作用, 包括基因表达、催化代谢反应、DNA 修复和复制。因此, 对这些过程的详细理解提供了有关细胞功能的重要信息。综合结构 MS 方法提供结构和动态信息的蛋白质复杂的组装, 复杂的连接, 亚基化学计量, 蛋白质齐聚和配体结合。在集成结构 MS 的最新进展允许表征具有挑战性的生物系统, 包括大 DNA 结合蛋白和膜蛋白。本协议描述如何将各种 ms 数据 (如本机 ms 和离子迁移率-质谱 (IM ms)) 与分子动力学模拟相集成, 从而深入了解解旋酶-核酸酶 DNA 修复蛋白复合物。由此产生的方法提供了一个框架, 详细研究配体结合到其他蛋白质复合物参与重要的生物过程。
Introduction
使用电喷雾和纳米电喷雾电离 (内西) 对完整蛋白质及其配合物进行原生质谱分析, 在电离过程中保留蛋白质折叠和非共价相互作用1, 2。在本机 MS 中, 蛋白质及其配合物的结构在气相3、4中保持在近原生状态。本机 MS 检测多个电荷蛋白离子, 它们根据其质量与电荷比 (m/z) 分离, 从而可以计算出蛋白质或蛋白质配体复合物的质量。此信息可以确定完整的蛋白质的化学计量学、亚基组成、配体结合和相互作用网络3、4、5、6。与其他技术相比, 本机 MS 具有多种优点, 如 X 射线晶体学和核磁共振波谱学5。首先, 本机 MS 是一种快速且高度灵敏的技术, 仅需少量微升 (2-3 µL) 的样品在高 nM 至低µM6范围内相对较低的最终复合浓度。其次, 本机 MS 可用于查询异构蛋白质样本, 从而可以同时分析多种蛋白质和寡聚状态。第三, 在通过化学交联或蛋白质标签进行分析之前, 本机 MS 不需要修改蛋白质样品。这些优势使结构 MS 成为蛋白质复合体结构研究的有力工具。
本机 MS 可与离子迁移 (IM) 相结合, 这是一种测量蛋白质离子在电场中穿行所需时间的技术, 能够确定碰撞剖面 (CCS)。CCS 提供低分辨率的结构信息, 可实现蛋白质的拓扑结构和构象异质性信息。此外, 它允许检查计算方法产生的蛋白质结构模型。
利用 CIU 测量的碰撞诱导展开法, 可以研究蛋白质气相稳定性。在 CIU 过程中, 通过在质谱仪7、8、9中使用惰性缓冲气体增加加速碰撞, 加速和激活蛋白质离子。这种碰撞活化过程导致蛋白质部分地展开, 这转化为 CCS 的增加。CCS 的这种变化和展开蛋白质所需的能量可以通过 IM MS 来测量. 采用这种方法, 可以测定配体结合对蛋白质稳定性的影响10。Subcomplexes 可以在溶液中生成, 使用溶液中的破坏方法, 如添加有机溶剂来监测蛋白络合物的类似于本机的拓扑。蛋白质复合物的破坏主要是由于内部非共价相互作用的破坏。子复合体维护类似于本机的拓扑结构, 并在 MS 检测时显示有关亚单位间连接的信息。
结构生物学中的综合方法结合多种方法研究蛋白质及其配合物的结构和动力学3、4、5、6。本机 ms 和 IM ms 已被用来揭示具有挑战性的生物系统的分子细节。有几个例子的应用, 包括研究蛋白质组装通路11,12,13,14, 研究蛋白质-蛋白质相互作用网络15,16,17、膜蛋白6、18、19、20、21和蛋白质配体相互作用, 如核酸22、23 ,24。
但是, 本机 MS 也有其局限性。本机 MS 测量通常在挥发性缓冲液中进行, 例如醋酸铵, 某些蛋白质不会保留其折叠的原生状态3,25。然而, 最近的工作表明, 这一限制可以通过优化喷涂针尖端直径 (0.5 mm 尖端) 来克服, 这样就可以直接从具有高离子强度的非挥发性缓冲液中形成蛋白质和蛋白质复合离子, 从而更好地模仿生理环境26。此外, 本机 MS 使用电喷雾电离和转移非共价组件从溶液到气相;因此, 检测到的复合物的相对丰度可能并不完全表示在溶液5、27中。此外, 与溶液相比, 气相疏水性相互作用变得较弱, 静电相互作用变得更强, 因此青睐3,28。
在本文中, 我们提供了用于蛋白质识别和配体结合的协议、数据分析和解释, 使用本机 ms、IM ms、CIU、解决方案中断和建模。DNA 修复复合物, 赫拉-NurA, 被用作模型系统。dna 双链断裂 (DSBs) 是 dna 损伤的最毒和有害形式之一, 导致基因不稳定和人类癌症的最终发展。同源重组是根除 DSBs 的修复机制, 是由 ATP 依赖解旋酶-核酸酶复合物, 赫拉-NurA22所编排的过程。
将本机 ms 和 IM 与功能性检测和建模相结合, 可以调查: i) NurA 在复合体的装配、构象和稳定性中的作用, ii) dsDNA 与复合体的相互作用及其对整体的影响复合物的稳定性和 iii) ATP 结合对大会22的计量和影响。总的来说, 这项工作使人们更好地了解赫拉-NurA 复合物的分子基础, 将蛋白质复合构象变化和稳定性与核苷酸结合起来。该协议对于任何与一个或多个配体类型进行交互的蛋白复合体 (es) 都是通用的。
Protocol
1. 蛋白质和蛋白质配体配合物的原生 MS 样品制备
注意: 为了了解蛋白质复合物的分子基础和使用本机 MS 的配体结合, 合适的样品制备是关键。本节的目的是通过将 DNA 和核苷酸结合在一起的 NurA 复合物, 在 MS 分析之前强调必要的样品制备步骤。
- 在1.5 毫升管中制备20µL 等份浓缩纯化蛋白 (通常为 15-30 µM)。
-
用于 ATP 或 ADP 绑定分析
注: 增加非可水解 ATP 模拟腺苷 5′O型 (3-thiotriphosphate)、tetralithium 盐 (ATP-γ) 或腺苷5′二磷酸 (ADP) 的浓度。非可水解 atp 衍生物产生一个稳定的复杂, 这将使 atp 束缚的蛋白质被捕获。其他可测试的非水解 ATP 类似物包括 AMP-PNP 和 atp-γ S-Mg2 +。- 对于赫拉-NurA 研究, 混合5µM 纯化蛋白与 ATP γ S 和 ADP 在浓度范围从0-1 毫米。
- 要同时捕获 ATP-γ S 和 ADP 结合, 请在相同或不同浓度下添加两个核苷酸。
- 添加2毫米氯化镁2和孵育在25摄氏度在一个干燥的浴孵化器1小时。
注: 使用内西本机 MS 分析核苷酸结合可能导致 artefactual 在高浓度下绑定, 因此必须考虑到非特定绑定29。要调查非特异性结合, 在2-5 毫米之间添加更高浓度的核苷酸)。
-
用于 DNA 结合分析
- 混合蛋白质和脱氧核糖核酸在摩尔比率, 允许蛋白质 DNA 复杂形成。对于赫拉和赫拉-NurA, 将5µM 纯化蛋白与 DNA 混合在1:1 的比例。
- 将赫拉-NurA 或赫拉-DNA 混合物孵育30分钟, 在25摄氏度的干燥浴孵化器中, 直至达到平衡。孵育的持续时间和温度可能因正在调查的蛋白质而异。
- 缓冲交换蛋白质样本到 MS 兼容的缓冲区。通常, 使用 pH 7-8 在 5 mM-1 M 之间的醋酸铵溶液。其他 MS 兼容缓冲液包括铵双乙酸 (埃达) 和铵缓冲液醋酸酯 (TEAA)30。对于赫拉-NurA 研究, 使用200毫米乙酸铵 pH 7。
注意: 在 MS 分析之前有几种缓冲交换方法, 例如使用旋转浓缩器或色谱柱。本机 MS 主要受样品质量的限制, 例如在纯化过程中使用的缓冲器和加合物。因此, 必须进行足够的脱盐以获得已解决的峰值。 - 对于赫拉-NurA 配体结合研究, 缓冲液交换样品6-8 次到200毫米醋酸铵使用选矿厂。虽然这种方法更耗时, 但它确保达到了已解决的峰值, 并允许对 ATP/ADP 绑定物种进行精确的质量测定。
2. 研究蛋白质复合物和蛋白质配体配合物的原生 MS 采集和分析
注意: MS 条件应进行优化, 以实现高度分辨率的峰值, 以便进行精确的质量测量。本节详细介绍了使用32k 上限 m-/z 四极杆的 q-ToF 质谱仪的优化参数。
- 为纳米电喷雾准备内部毛细血管, 并进行仪器质量校准, 以获得科什鲍姆等详细的精确质量测量。1。
- 选择灵敏度、正离子采集和移动 TOF 模式。
- 打开陷阱、API 和 IMS 气体。对于 IM 分离, 使用氮气 (60 毫升/分钟) 和氩 (陷阱区域的8.4 毫升/分钟) 作为起始点, 然后进行调整。
- 设置合适的 m/z 采集范围。对于未知蛋白质, 初始优化步骤应使用宽范围, 如500-32,000 米/z。
- 加载2-3 µL 的蛋白质复合溶液, 分析成金涂层毛细管, 并将其插入毛细管支架。
- 轻轻拧紧毛细管, 将毛细管置于电喷雾源阶段并将其滑入原位, 开始获取数据。
- 应用低纳米流量气体压力 (0.00-0. 05 Bar) 直到在毛细管尖端形成滴。在保持喷雾之前, 可将纳米流量压降。
- 通过在 x、y、z 位置移动毛细管, 并监测离子电流以达到稳定的离子电流, 调整毛细管与锥的角度。在 0.9-1.6 kV 范围内应用毛细管电压。
- 设置取样锥 (50-120 V)、源偏移量 (60.0)、源温度 (25 °c) 和锥气体流量 (0.0 升/小时)。这些建议的初始条件可以调整。
- 要获得良好分辨的质谱并最大化离子传输, 请调整 MS 参数并监测光谱中所产生的变化。这些包括调整疏水阀中的气体流量 (2-8 毫升/分钟), 他的细胞 (180 毫升/分钟) 和 IMS 细胞 (90 毫升/分钟), 以实现最佳的分离在最大的传输。
- 如果电压失调不足, 调整疏水阀碰撞能量。最佳起始点介于 10-50 v 之间。
注: 增加疏水阀能量可以去除非共价的束缚加合物。然而, 注意避免碰撞诱导的蛋白质配体复合物的分离和展开。执行离子移动性测量, 检查仪器条件是否在本机折叠状态下保留蛋白质 (步骤 3)。 - 优化疏水阀偏置电压, 提高脱除。最佳起始点为 20-45 v。
- 优化波浪速度和波浪高度, 实现最佳的移动分离。详细的解释和协议可以在这里找到31。对于赫拉-NurA 研究, 使用 40 (米/秒) 和波高 550-650 (V) 的波速度。
- 使用所有其他参数作为仪器默认值。
- 准备一个无配体样本进行分析, 作为每次运行的控制 (图 1)。对于配体结合实验, 至少进行三次独立测量。
- 使用 Masslynx 软件测量生成的物种的质量并确定配体绑定, 如 ATP 和 ADP 结合和寡聚状态 (图 2 和 3)。其他可用的软件包括 UniDec32、脉冲星33和安菲特里特34。
- 要量化物种的相对丰度, 请使用原始 ESI-MS 谱中观察到的相应离子强度 (例如配体绑定、不同的寡聚物等)。或者, 使用 UniDec 和 Massign35等专业软件进行量化 (图 1 和 3 )。
3. 获取和分析 IM MS
注: IM MS 根据其大小 (质量)、形状和电荷将离子分离在气相中。在 m/z 频谱中解析的每个特征都与漂移时间分布相关。IM MS 测量可用于计算碰撞剖面 (CCS) 的离子的漂移时间。通过使用漂移管获取的 IM MS 数据测量的漂移时间值可与 CCS 值36线性关联。对于行波 IM (TWIMS) 测量, 计算 ccs 值需要根据已知 CCS 值37的蛋白质标准获得校准曲线。由于在移动单元38中与缓冲气体的相互作用减少, 紧凑结构的行驶速度比延伸或拉长结构快。因此, IM MS 可用于检测本机折叠结构是否已保留在气相39、40中。本节概述如何测量 TWIMS 和计算使用的蛋白质的 CCS。
- 在优化仪器条件以稳定传输 (步骤 2) 后, 尽可能减少碰撞能量和取样锥, 同时保持良好的光谱质量。
- 使用优化的波速度和波高来获取 IM MS (步骤 2)。
- 以三种不同的波速度 (例如, 550、600和650米/秒) 测量离子漂移时间, 同时保持相同的波高 (例如, 40 V)。
- 为了确定蛋白质离子的 CCS, 测量蛋白质品在同一仪器条件下用于蛋白质的调查。最佳漂移时间校准需要使用已知的 CCS 测量蛋白质。
- 选择四品, 两个质量高于和两个质量低于该蛋白质在调查37。最重要的是, 要确保波浪高度和波速与被调查的蛋白记录的速度相同。
- 手动计算 CCS41或使用一个专门的软件, 如脉冲星33和安菲特里特34 (图 5)。
- 为了检查在气相中蛋白质是否与本机相似, 将实验 ccs 与从高分辨率结构获得的理论 ccs 进行比较。对于赫拉-NurA, 使用 MOBCAL42中使用的投影逼近 (PA) 方法计算理论 CCS。其他方法包括弹道法 (TM)42和精确的硬球散射 (EHS)43。
4. 蛋白质配合物在本机 ms 和 IM ms Led 结构测定中的解决方案中断
注: 在某些情况下, 蛋白质子配合物可以从与完整的复杂的相同溶液中识别出来。然而, 进一步的结构信息, 如亚单位间的连接和复杂的组装可以从中断溶液中的蛋白质相互作用, 形成子复合体。这可以通过多种方式实现, 如添加有机溶剂、增加离子强度或操纵 pH 值。为了深入了解赫拉-NurA 复合亚基的连接性和复杂的组装, 在溶液中通过添加扰动亚基相互作用的溶剂来生成子配合物。
- 如步骤 1所述, 准备蛋白质样品和缓冲液与醋酸铵的交换。
- 以10% 的增量添加10-40% 的溶剂。通常使用的溶剂是甲醇 (甲醇)、二甲基亚砜 (DMSO) 或乙腈 (华置)。
注意: 这可以在聚丙烯微量离心管内执行。 - 在冰上孵育混合物1小时。
- 获取每个条件的 IM MS 频谱 (步骤2和 3) (图 4)。
- 使用峰会软件44分配蛋白质子配合物并生成蛋白质相互作用网络。或者, 手动生成预期物种的理论质量列表。
- 为确保 subcomplexes 折叠, 请计算子配合物的实验 ccs 值, 并与步骤 3 (表 1、图 5和图 6) 中所述的理论 ccs 进行比较。
5. 利用碰撞诱导展开研究蛋白质复合稳定性 (CIU)
注: CIU 可用于探讨蛋白质及其配合物在配体结合时的结构稳定性。例如, 脉冲星33、安菲特里特34和 CIU 套件9等专业软件包可用于模拟与无配体一起调查的蛋白质的气相展开。例如, 本节概述了监测气相展开轨迹的过程, 并研究了 DNA 和 ATP 结合对赫拉-NurA 复合体的稳定作用。
- 记录 IM MS 数据, 同时将陷波加速度电压从 10 v 增加到 200 v (以 2-10 v 为增量), 逐步展开气相中的蛋白质。
注意: 记录较小的增量会导致更多的数据文件进行处理, 但是此方法提供了更解决的展开图, 这对于分析折叠/展开物种之间的过渡点非常重要。 - 分析使用脉冲星33、安菲特里特34或 CIU 套件9获取的数据, 并在 CCS 单元中生成二维展开图作为加速电压的功能 (步骤 3)。对于每个电荷状态, 这是通过在每个加速电压下堆叠强度标准化 CCS 分布 (图 7 A Bi) 来创建的。
- 使用其中一个软件包生成理论展开图解。数据将安装到展开模型中。这使得可以量化发生过渡的碰撞能量, 并确定具有和不带束缚配体33的蛋白质的稳定性。一个正在展开的过渡是当一个物种从一个状态 (根据其实验 ccs 值) 过渡到另一个具有较大 CCS 的状态时。
- 要定量过渡, 请使用算法和软件 (如脉冲星33) 计算状态之间的过渡中点。这通常报告为 CV50, 这是在50% 的特定状态耗尽的碰撞 (陷印) 电压值。
- 使用 CV50值, 使用质心碰撞能量 (KECOM)45计算离子的总内部能量。KECOM由可用于离子展开过渡的总内部能量定义, 并根据方程式 (1)10中所述的碰撞伙伴 (蛋白质离子和中性气体) 的动能和质量计算。
KEcom (eV) =
(方程式 1)。
其中Z是离子电荷, mN是中性气体的质量, m离子是蛋白质离子的质量。
注意: 这是因为 CIU 的蛋白质是电荷 dependent46,47。建议对多个电荷状态执行 KECOM分析 (图 7全部)。
(方程式 1)。6. 用于综合 MS 的微分分子动力学模拟的建模程序
注: 使用蛋白质亚基或复合物的模型, 如晶体结构, 微分 MD 模拟 (具有和不带配体的蛋白质复合物) 可用于确定例如配体存在对蛋白质结构和动力学的影响。本节详细介绍了建立微分分子动力学模拟所需的建模过程所需的工作流和工具。
- 识别构成复杂的亚基 (图 8A,在步骤2和 3)。源现有的亚基模型,例如蛋白质数据库中的晶体结构 (https://www.rcsb.org)。蛋白质的 UniProt 进入将包含已知的晶体/核磁共振结构 (http://www.uniprot.org) 的列表。如果这些信息不可用, 则可以将理论序列输入到爆炸中, 以确定同源建模 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 的合适模板。
- 将复杂结构组装在正确的拓扑中 (图 8A ii)。这可以通过各种方法来完成。各个亚基可安装在技术上的可用电子显微图中, 以组装完整的复合物 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/)。使用分子动力学柔性拟合 (MDFF) 在 EM 图中拟合 PDBs 的教程可以在这里找到: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/。
- 识别复杂的缺失区域 (图 8A-iii)。在 PDB 和理论序列之间执行多个序列对齐 (MSA), 以确定可能被不合身到晶体结构中的残余物, 或从晶体实验中继承的任何突变。MSA 可以使用 web 服务器, 如 T 咖啡 (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular) 执行。
- 通过同源建模再生缺失的残余物 (图 8A iv)。使用建模师程序 (https://salilab.org/modeller/) 可以构建蛋白质复合物的缺失残留。建模师可以在不同的再生配置中输出 n 模型的集合。良好的模型可以根据其离散优化的蛋白质能量 (涂料) 分数来确定。软件网站 (https://salilab.org/modeller/tutorial/) 提供了一个全面的教程。
- 对蛋白质复合物进行微分分子动力学 (MD) 模拟 (图 8B), 以确定应对特定环境变化 (例如,配体存在) 的蛋白质区域。在这种模拟中, 模拟 a (仅蛋白质) 的行为参数作为参考, 从模拟 B (蛋白质 + 配体) 中减去。在模拟 a 和 B 之间计算出的微分平均平方涨落 (RMSF) 可以在与配体依赖的方式中增加或减少弹性的蛋白质区域进行通知。
- 使用 GROMACS (http://www.gromacs.org) 执行 MD 模拟和下游分析。教程可在: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html 中找到。对目的模型偏置, 应首先生成配体约束复合体的结构。然后在没有配体的情况下复制蛋白质, 产生与配体绑定复合物相同的蛋白质模型。
Representative Results
本机 MS 结果揭示了赫拉-NurA 复合物的寡聚状态、组成和拓扑 (图 1)。由于非共价相互作用在气相中保留, atp γ S 和 ADP 滴定实验的本机 MS 确定了对赫拉-NurA 的成对核苷酸结合 (图 2), 增加 ATP-γ s 浓度增加了相对hexameric 赫拉的强度 (图 3)。关于亚单位相互作用的结构信息是从溶液中的干扰中获得的, 其次是本机 MS, 并与理论质量一致 (图 4 和表 1)。
蛋白质及其配合物的实验 CCS 值来源于 IM MS 实验 (图 5)。这些值是旋转平均气相截面计算的分子形状, 并描述蛋白质的维度状态。CCS 值与 x 射线晶体学的理论测量相比较, 良好的协议推断出在气相中保留的本机形状(表 1)。这将验证使用 CCS 值构建低分辨率的蛋白质组件48模型。
可以计算每个电荷状态离子的实验社会保障机构。像本机一样的蛋白质 conformer 可能会产生电荷状态离子具有类似的 CCS 值。然而, 较高电荷态离子增加库仑斥力, 这可能导致蛋白质气相展开和更大的 CCS 值相比, 理论社会保障机构。因此, 最低电荷态离子的 CCS 值通常使用49。对于赫拉-NurA, 在赫拉和赫拉-NurA 与无 DNA 的解决方案中断实验促使生成的组装通路开始与单体然后形成整个 hexameric 赫拉 (赫拉6)-二聚 NurA (NurA2) 复杂与 DNA (图 6)。
在 CIU 展开图之间的差异在 apo (无配体) 和配体绑定定义了复杂稳定性的变化, 在配体结合。较高的 CV50或柯式COM值意味着在气相中更稳定的离子。CIU 和科COM分析发现 dna 绑定的赫拉-NurA 比无 dna 的复合物更稳定 (图 7所有)。从 CIU 在各自 ATP 结合状态的分析中, 四-ATP-γ s 约束状态降低了气相的复杂稳定性和六-atp-γ s 绑定状态, 其中所有站点被占用的是最稳定的 (图 7Bii)。本机 MS 可以揭示赫拉的离散核苷酸结合状态;然而, 它不能区分哪些赫拉亚基是绑定 ATP 和此绑定发生在哪里。此信息可从 hexameric 赫拉的显式溶剂 MD 模拟和赫拉-NurA 在总结工作流程之后获得 (图 8)。
图 1。讯问 NurA 非共价复合物的寡聚状态、组成和拓扑。(A) 在 DNA 存在的情况下, 赫拉、赫拉-NurA 和赫拉-NurA 的质谱 (15.4 kDa 25 bp 双链 dna)。赫拉分复体作为赫克萨默和 heptamer 存在。NurA 二聚体结合, 并对赫拉赫克萨默强加寡的转化。DNA 结合形成的赫拉-NurA 复合物 (结果改编自 z Ahdash等, 201722)。(B) 使用 UniDec32计算确定物种的相对强度。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2。本 NurA 揭示了核苷酸与赫拉结合的机制。质谱 (A) 赫拉-NurA 和 (B) 赫拉-NurA-DNA 的浓度增加 (i) ATP-γ S 和 (ii) ADP。测量质量与理论质量相比较, 确定了 ATP-γ-S 或 ADP 约束的量。测量的质量和束缚核苷酸的数量显示在光谱上。ATP-γ S 和 ADP 滴定实验确定了对赫拉-NurA 单独的成对核苷酸结合, 当在复杂与脱氧核糖核酸表明周期性反应机制 (结果改编自 z Ahdash等, 201722)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3。测定提高 ATP-γ浓度对赫拉寡聚状态的影响。(A) 赫拉的质谱在增加 ATP-γ的浓度。(B) 使用 UniDec 反褶积软件32计算出本机 MS 中不同物种的相对强度的图。随着 ATP-γ浓度的增加, hexameric 赫拉的相对强度也随之增加。在光谱上显示的 ATP-γ S 分子的数量 (结果改编自 z Ahdash等, 201722)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4。(A) 赫拉和 (B) 赫拉-NurA (i) 的质谱和亚复杂解离产物 (i) 单独和存在 (ii) 在解决方案内中断的 DNA。采用10-40% 乙腈、甲醇 (甲醇) 或二甲基亚砜 (DMSO) 进行了溶液内破坏试验, 形成各种 subcomplexes。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5。离子迁移到达时间分布显示在 CCS 轴上的配合物和生成的亚络合物。每个子复杂的图标与图 4中的光谱注释相关。在表 1中列出了试验和计算的质量和 CCS 值, 其中所有结果均显示了实验值与计算数值之间的一致性 (考虑了行波离子分辨率的典型不确定度)。±5-8%37的移动质谱分析)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 6。从解决方案中断中生成的赫拉-NurA 复合体的组装路径本机 ms 和 IM ms. 彩色圆圈表示每个子复合体观察到的条件: 原生 (绿色, 中断之前), 甲醇 (黄色), DMSO (紫色) 或乙腈 (红色)。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 7。研究 (A) DNA 对赫拉-NurA 和 (B) ATP 结合到赫拉-NurA-dna 的稳定作用。(i) 气相 CIU 图和 (ii) 质量中心碰撞能量 (KEcom) 计算表明, dsDNA 的存在稳定了赫拉-NurA 复合体, 六 ATP-γ S 的束缚态是最稳定的。显示不同电荷状态的稳定。使用脉冲星33生成图解。结果从 (A) 改编自 z Ahdash等, 201722。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 8。用于微分分子动力学模拟的建模过程的工作流程。(A) 通过建立现有亚基的拓扑结构和重建缺失的残余物, 产生正在调查中的复杂情况。(B) 在具有和不带配体的蛋白复合物上运行分子动力学模拟的工作流程。分子动力学模拟是运行的蛋白质仅作为参考, 并减去从模拟蛋白质加配体。其次是计算模拟之间的微分根均方根涨落 (RMSF), 并确定配体结合的效果。请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 复杂/亚复杂 | 理论质量 (kDa) | 实验质量 (kDa) | 理论 CCS (Å2) | 实验 CCS (Å2) [收费] | 条件 |
| 赫拉6-NurA2 | 416.22 | 417.85 | 14531 | 14577 [42 +] 14599 [43 +] 14608 [44 +] 14637 [45 +] |
10-20% 华置, 10-40% DMSO, 10% 甲醇 |
| 赫拉6-NurA2-dsDNA | 431.72 | 432.27 | - | 14661 [39 +] 14728 [40 +] 14781 [41 +] 14837 [42 +] |
10% 华置, 10% 甲醇 |
| NurA1 | 39.12 | 38.18 | 3254 | 2618 [10 +] 2746 [11 +] 2878 [12 +] |
10-40% 华置, 10% 甲醇, 20-40% DMSO |
| NurA2 | 78.24 | 78.36 | 4890 | 4903 [16 +] 4614 [17 +] 4537 [18 +] 4666 [19 +] |
10-40% 甲醇, 20-40% DMSO |
| 赫拉1 | 56.33 | 56.32 | 4131 | 3647 [14 +] 3792 [15 +] 3950 [16 +] |
10-40% 华置, 40% DMSO |
| 赫拉2 | 112.66 | 112.95 | 6475 | 5648 [20 +] 5747 [21 +] 5842 [22 +] 5996 [23 +] |
40% 冰毒, 10-40% 华置 |
| 赫拉3 | 168.99 | 169.39 | 8607 | 7501 [25 +] 7616 [26 +] 7717 [27 +] 7867 [28 +] |
10-40% 甲醇, 10-40% CAN, 40% DMSO |
| 赫拉3 + DNA | 183.99 | 184.976 | - | 7655 [26 +] 7990 [27 +] 8107 [28 +] |
10-30% 华置 |
| 赫拉4 | 225.32 | 226。2 | 10477 | 9205 [30 +] 9287 [31] 9493 [32 +] 9961 [33 +] |
10-40% 甲醇, 10-40% 华置 |
| 赫拉4 + DNA | 240.82 | 241.33 | - | 9637 [31 +] 9756 [32 +] 9830 [33 +] |
10-30% 华置 |
| 赫拉5 | 281.65 | 282.75 | 11853 | 10847 [36 +] 10958 [37 +] 11161 [38 +] |
30-40% 华置 |
| 赫拉6 | 337.98 | 339。3 | 12517 | 12335 [38 +] 12386 [39 +] 12498 [40 +] 12590 [41 +] 12676 [42 +] 13019 [43 +] |
10-40% 甲醇, 10-40% 华置 |
| 赫拉6 + DNA | 353.48 | 354.626 | - | 12890 [40 +] 13081 [41 +] 13184 [42 +] 13273 [43 +] 13463 [44 +] 13576 [45 +] |
30% 华置 |
| 赫拉7 | 394。3 | 395.85 | 13901 | 14154 [42 +] 14219 [43 +] 14261 [44 +] 14285 [45 +] 14335 [46 +] |
10-40% 甲醇, 10-40% 华置, 10-40% DMSO |
| 赫拉7 + DNA | 409。8 | 410.62 | - | 14414 [41 +] 14510 [42 +] 14558 [43 +] 14598 [44 +] 14630 [45 +] 14641 [46 +] |
10% 华置 |
表 1.NurA 及其子配合物的实验和计算质量和 CCS 值是在溶液破坏研究中产生的。
Discussion
MS 在表征蛋白质复合物的化学计量、相互作用和亚基结构方面发挥着越来越重要的作用。IM MS 数据可用于定义多组分复合物中亚基的拓扑安排。与其他现有的结构生物学方法相比, MS 有几个优点。本机 MS 是一种快速且高度灵敏的技术, 可用于探测异构蛋白质样品。当与溶液内中断实验结合时, 可以监测蛋白质组件的分离通路。与晶体结构或同源模型一起, 结构 MS 提供的信息提供了研究蛋白质配体相互作用的工具, 并提供近原生模型和组装路径11。
在这里, 我们描述了必要的实验程序分析的化学计量和组成的蛋白质-配体相互作用, 用一个或多个配位, 使用集成 MS。这包括 ms 样品制备、数据采集、数据分析和使用计算工具集成 ms 数据。为此, 我们使用了 dna 切除赫拉-NurA 杂寡聚蛋白复合物, 绑定到三配体 (DNA、ATP 和 ADP), 作为我们的模型系统。该协议显示了使用当前可用的软件来帮助数据分析和演示。
获得高质量的光谱对配体结合分析非常重要, 因此, 仔细的样品制备步骤至关重要, 包括蛋白质纯化、配体滴定和缓冲液交换。在研究配体结合时, 内西本机 MS 的一个局限性是非特定绑定。在整个电喷雾过程中, 在液滴脱除过程中发生非特定的束缚。这增加了配体浓度, 因此改变了蛋白质/配体比29。核苷酸的结合会导致 apo 和核苷酸束缚蛋白之间的质量差异相对较小, 不会改变电离效率50,51。
我们使用 Synapt G2-Si MS 系统为我们的工作, 但协议适用于其他蛋白质配体配合物的不同研究使用其他商业可用的纳米电喷雾质谱仪。综合结构 MS 在处理更复杂的生物问题方面日益发挥着重要作用。这里描述的工作流程和技术非常适合于了解蛋白质复合物和蛋白质配体形成的结构影响和构建机制, 而这种结构在使用传统的构造技术时难以研究。.
Disclosures
没有申报利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢卡尔-彼得 Hopfner 和罗伯特. 伯恩好心提供赫拉和赫拉-NurA 蛋白样品, 并为他们的实验设计帮助。我们也感谢埃蒙·博士宣读了他对手稿的评论。我们感谢我们的资助机构: 威康信托基金 [109854/z/15/z] 和皇家学会 [RG150216 到美联社]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt | Merck Millipore | 119120-25MG | |
| Adenosine 5′-diphosphate | Sigma-Aldrich | 20398-34-9 | |
| Ammonium acetate solution | Sigma-Aldrich | A2706 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad | 7326204 | |
| Vivaspin concentrator | Sartorius | Z614041-25EA | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Water TraceSelect | Sigma-Aldrich | 95305 | |
| Borosilicate Capillaries | Harvard Apparatus | 300060 |
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