Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Analysera Protein arkitekturer och Protein-Ligand komplex av integrativ strukturella masspektrometri

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57966
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, King's College London

Summary

Masspektrometri (MS) har vuxit fram som ett viktigt verktyg för utredningen av struktur och dynamik av makromolekylära församlingar. Här, integrera vi MS-baserade metoder för att förhöra protein komplex bildandet och ligand bindande.

Abstract

Proteiner är en viktig klass av biologiska makromolekyler som spelar många viktiga roller i cellulära funktioner inklusive genuttryck, katalysera metaboliska reaktioner, DNA-reparation och replikering. Därför en detaljerad förståelse av dessa processer ger viktig information om hur celler fungerar. Integrativ strukturella MS metoder ge strukturella och dynamiska information om protein komplex sammansättning, komplexa connectivity, subenhet stökiometri, protein oligomerisering och ligand bindande. Senaste framstegen inom integrativ strukturella MS har tillåtit för karakterisering av utmanande biologiska system inklusive stora DNA-bindande proteiner och membranproteiner. Det här protokollet beskriver hur du integrerar olika MS data såsom infödda MS och ion rörlighet-masspektrometri (IM-MS) med molekylär dynamik simuleringar för att få insikter i en helicase-nuclease DNA reparation proteinkomplex. Den resulterande strategin ger en ram för detaljerade studier av liganden bindning till andra proteinkomplex som är inblandade i viktiga biologiska processer.

Introduction

Infödda massa spektrometriska analys av intakta proteiner och deras komplex utförs med elektrospray och nano-elektrospray jonisering (nESI), som bevarar proteinveckning och icke-kovalenta interaktioner under jonisering process1, 2. I native MS, proteiner och deras komplex struktur behålls i en nära-native stat i gas-fas3,4. Infödda MS upptäcker flera laddade protein joner, som är separerade enligt deras massa att debitera baserat (m/z) så att massan av protein eller protein-ligand komplexa ska beräknas. Denna information gör det möjligt för bestämning av en intakt protein stökiometri, subenhet sammansättning, ligand bindande och interaktion nätverk3,4,5,6. Infödda MS har flera fördelar jämfört med andra tekniker sådan röntgenkristallografi och kärnmagnetisk resonans spektroskopi5. För det första är infödda MS en snabb och mycket känslig teknik, kräver endast några mikroliter (2-3 µL) av provet vid relativt låga slutliga komplexa koncentrationer i hög nM till låga µM sortiment6. För det andra kan infödda MS användas att förhöra heterogena protein prov gör det möjligt att analysera flera proteiner och Oligomera stater samtidigt. För det tredje kräver inte infödda MS protein prover att ändras före analys av kemiska crosslinking eller protein märkning. Dessa fördelar har gjort strukturella MS ett kraftfullt verktyg för strukturella utredning av proteinkomplex.

Infödda MS kan kombineras med ion rörlighet (IM), en teknik som mäter tiden en protein Jon tar för att resa genom ett elektriskt fält, aktivera lett tvärsnittet (CCS) skall fastställas. CCS ger lågupplösta strukturell information, som möjliggör topologi och konfirmerande heterogenitet information av proteiner ska erhållas. Dessutom tillåter den undersökning av protein strukturella modeller genereras av beräkningsvetenskapliga metoder.

Protein gas-fas stabilitet kan undersökas med hjälp av kollision inducerad utspelas (CIU) mätt av IM-MS. Under processen Fondföretaget protein joner påskyndas och aktiveras genom ökad accelererande kollisioner med en inert buffert gas inom en masspektrometer7,8,9. Detta lett aktiveringen gör proteinet till delvis utvecklas, som översätter till en ökning av CCS. Denna förändring i CCS och den energi som krävs för att veckla upp proteinet kan vara mätt med hjälp av IM-MS. Detta tillvägagångssätt, effekten av liganden bindande protein stabilitet kan vara uppmätta10. Subcomplexes kan genereras i lösning med i-lösning störningar metoder såsom tillsats av organiska lösningsmedel för att följa native-liknande topologier av proteinkomplex. Störningar av proteinkomplex är främst störningar av handeln icke-kovalenta interaktioner. Sub komplexen underhålla native-liknande topologier och vid MS upptäckt, avslöja information om Inter subenhet anslutning.

Integrativ strategier inom strukturbiologi kombinera olika metoder för att studera strukturen och dynamiken i proteiner och deras komplex3,4,5,6. Infödda MS och IM-MS har använts till att avslöja de molekylära detaljerna för utmanande biologiska system. Det har funnits flera exempel på tillämpningar inklusive studien av protein församlingen vägar11,12,13,14, studera protein-protein interaktioner nätverk15 , 16 , 17, membranet proteiner6,18,19,20,21och protein-ligand interaktioner såsom nukleinsyror22,23 ,24.

Infödda MS har dock sina begränsningar. Infödda MS mätningar utförs ofta i flyktiga buffertar som aqueous ammoniumacetat där vissa proteiner inte kommer behålla sin vikta infödda statligt3,25. Ändå har senaste arbete visat att denna begränsning kan övervinnas genom optimering av sprutning nål spets diameter (0,5 mm tips) så att protein och protein komplexa joner kan bildas direkt från icke-flyktiga buffertar med ionic-höghållfasta som bättre härma den fysiologiska miljö26. Dessutom använder infödda MS elektrospray att jonisera och överföra icke-kovalenta församlingar från lösning till gasfas; Det relativa överflödet av upptäckta komplex kan inte helt representerar därför som i lösning5,27. Dessutom i jämförelse med i lösningen, gas fas hydrofoba interaktioner blir svagare och elektrostatisk interaktioner bli starkare och därmed gynnas3,28.

I denna artikel ger vi protokoll, dataanalys och tolkning för protein identifiering och ligand bindande använder infödda MS, IM-MS, Fondföretaget, i-lösning störningar, och modellering. Komplexet DNA reparation, HerA-NurA, används som modellsystem. DNA dubbelsträngat pauser (DSBs) är en av de mest cytotoxiska och skadliga formerna av DNA-skador, vilket resulterar i genetisk instabilitet och eventuell utveckling av cancer hos människor. Homolog rekombination är mekanismen reparation som utrotar DSBs, en process som är iscensatt av ATP beroende helicase-nuclease komplexa, HerA-NurA22.

Att kombinera infödda MS och IM-MS med funktionella analyser och modellering tillåtna utredningen av: i) NurA roll i församlingen, konformation, och stabilitet komplexet, ii) samspelet mellan dsDNA och anläggningen och dess påverkan på totalt stabiliteten i anläggningen, och iii) den stökiometri och effekterna av ATP bindande församling22. Övergripande, detta arbete ledde till en förbättrad förståelse av den molekylära basen för HerA-NurA anläggningen genom att länka protein komplex konfirmerande förändringar och stabilitet med nukleotid bindande. Detta protokoll är generisk för någon protein complex(es) som interagerar med en eller flera ligand(s) typer.

Protocol

1. provberedning för infödda MS av Protein och Protein-Ligand komplex

Obs: För att få en förståelse av den molekylära basen för ett proteinkomplex och ligand bindande med infödda MS, lämplig provberedning är nyckeln. Syftet med detta avsnitt är att belysa de väsentliga provberedningssteg innan MS analys med HerA-NurA komplexet som binder DNA och nukleotider som ett exempel.

  1. Förbereda 20 µL portioner av koncentrerad renat protein (normalt 15-30 µM) i en 1,5 mL tub.
  2. För ATP och ADP bindande analys
    Lägg Till ökande koncentrationer av icke-hydrolyserbar ATP analoga adenosin 5 '-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium salt (ATP-γ-S) eller 5′-adenosindifosfat (ADP). Icke-hydrolyserbar ATP derivat generera ett stabilt komplex som skulle göra det möjligt för ATP-bundna proteinet fångas. Andra icke-hydrolyserbar ATP-analoger som kunde testas inkluderar AMP-PNP och ATP-γ-S-Mg2 +.
    1. För HerA-NurA studier, blanda 5 µM av renat protein med ATP-γ-S och ADP vid koncentrationer från 0-1 mM.
    2. För att fånga samtidig ATP-γ-S och ADP bindande, lägga till båda nukleotider vid de samma eller varierande koncentrationerna.
    3. Lägg till 2 mM MgCl2 och inkubera vid 25 ° C i en torr bad inkubator för 1 h.
      Obs: Analys av nukleotid bindande använder nESI infödda MS kan resultera i tingsliga bindande vid höga koncentrationer, därför icke-specifik bindning måste ta hänsyn till konto29. För att undersöka icke-specifik bindning, lägga till en högre koncentration av nukleotider mellan 2-5 mM).
  3. För DNA bindande analys
    1. Blanda protein och DNA på en molar förhållandet som möjliggör protein-DNA komplexa bildande. HerA och HerA-NurA, blanda 5 µM av renat protein med DNA i förhållandet 1:1.
    2. Ruva HerA-NurA eller HerA - DNA blandning för 30 min vid 25 ° C i en torr bad inkubator tills den når jämvikt. Varaktighet och temperatur inkubationstiden kan variera beroende på proteinet under utredning.
    3. Buffert exchange protein prover till MS kompatibel buffertar. Vanligen, vattenhaltigt ammonium Acetat lösning mellan 5 mM-1 M vid pH 7-8 används. Andra MS kompatibel buffertar inkluderar ethylenediammonium diacetat (EDDA) och Triethylammonium acetat (TEAA)30. För HerA-NurA studier, använda 200 mM ammonium acetat pH 7.
      Obs: Det finns flera metoder för buffert exchange före analys av MS som att använda en spin koncentrator eller kromatografi kolonner. Infödda MS begränsas främst av kvaliteten på provet som buffertar och addukter används under reningen. Därför är det viktigt att utföra tillräckligt avsaltning för att få löst toppar.
    4. För HerA-NurA ligand bindningsstudier, buffert exchange prover 6 - 8 gånger i 200 mM ammoniumacetat använder en koncentrator. Även om denna metod är mer tidskrävande, det säkerställer att löst toppar uppnås och möjliggör noggrann massa Bestämning av ATP/ADP bundna arter.

2. infödda MS förvärv och analys för att undersöka proteinkomplex och Protein-Ligand komplex

Obs: MS villkor bör optimeras för att uppnå mycket löst toppar för att möjliggöra noggranna massa mätningar. I detta avsnitt anges optimerade parametrar på en Q-ToF masspektrometer med en 32 k övre gräns m/z quadrupole.

  1. Förbereda interna kapillärer nano-elektrospray och utföra massa instrumentkalibrering för noggranna massa mätningar som beskrivs av Kirshenbaum o.a. 1.
  2. Välj känslighet, positiv Jon förvärv och rörlighet TOF lägen.
  3. Slå på fällan, API och IMS gaserna. För IM separation, använda kväve (60 mL/min) och argon (8,4 mL/min för regionen trap) som utgångspunkt och sedan justera.
  4. Ange en lämplig m/z förvärv. För en okänd protein, initial optimering steg bör använda en rad såsom 500-32.000 m/z.
  5. Ladda 2-3 µL av protein komplex lösningen analyseras i en guld belagda kapillär och infoga den i en kapillär hållare.
  6. Försiktigt dra åt kapillären och placera kapillären i elektrospray källa scenen och skjut scenen i stånd att börja skaffa data.
  7. Tillämpa lågt nano-flöde gastryck (0,00-0,05 Bar) tills en droppe bildas på spetsen av kapillären. Nano-flödet kan sedan släppas tills sprayen upprätthålls.
  8. Justera kapillären med avseende på konen genom att flytta kapillären i x, y, z positioner och övervaka Jon som är aktuella att uppnå en stabil ion som är aktuella. Tillämpa en kapillär spänning i intervallet 0,9-1,6 kV.
  9. Ange provtagning kon (50-120 V), källa offset (60,0), källa rumstemperatur (25 ° C) och kon gasflödet (0,0 L/h). Dessa föreslog inledande villkor kan justeras.
  10. Att förvärva en väl löst masspektrum och maximera ion överföring, justera MS parametrar och övervaka den resulterande förändringen i spektra. Dessa inkluderar justera gasflödet i fällan (2-8 mL/min), han Cell (180 mL/min) och IMS cell (90 mL/min) för att uppnå bästa separation vid maximal överföring.
  11. Justera de fälla kollision energierna om spänning förskjutningar är otillräckliga. En optimal utgångspunkt är mellan 10-50 V.
    Obs: Öka den fälla energin kan ta bort icke-kovalent bundna addukter. Dock vara noga med för att undvika kollision inducerad dissociation och unfoldingen av protein-ligand komplexet. Utföra ion rörlighet mätningar för att kontrollera om instrumentet villkor behåller proteinet i native vikta staten (steg 3).
  12. Förbättra desolvering genom att optimera den fällan bias spänningen. En optimal utgångspunkt är 20-45 V.
  13. Optimera wave velocity och våghöjd att uppnå bästa rörlighet separation. En detaljerad förklaring och protokoll finns här31. HerA-NurA i studierna, Använd våg hastighet 40 (m/s) och våghöjden 550-650 (V).
  14. Använda alla andra parametrar som instrumentet standardvärden.
  15. Förbereda en ligand-fri prov för analys som en kontroll för varje körning (figur 1). För ligand bindande experiment, utföra minst tre oberoende mätningar.
  16. Använd programmet Masslynx att mäta massorna av genererade arter och identifiera liganden bindningen, såsom ATP och ADP bindande och Oligomera stater (figur 2 och 3). Annan tillgänglig programvara inkluderar UniDec32, PULSAR33 och Amphitrite34.
  17. För att kvantifiera det relativa överflödet av arter, använd motsvarande ion stödnivåerna observerats i raw ESI-MS spektra (till exempel ligand bundna, olika oligomerer, etc.). Alternativt utföra kvantifiering med specialiserad programvara såsom UniDec och Massign35 (figur 1 och 3 ).

3. Skaffa och analysera IM-MS

Obs: IM-MS separerar joner i gas-fas baserat på deras storlek (vikt), form och kostnad. Varje funktion som löst i m/z spektrum är associerade med en distribution med drift i tid. IM-MS mäter den drift-tid av en Jon som kan användas för att beräkna kollision tvärsnittet (CCS). Drift tidsvärden mätt från IM-MS data förvärvade i ett drift-rör kan korreleras linjärt till CCS värden36. För resande våg IM-MS (TWIMS) mätningar, kräver beräkning av CCS värden en kalibreringskurva som erhållits från protein standarder med kända CCS värden37. Kompakt strukturer färdas snabbare än utökade eller avlånga strukturer beror på nedsatt interaktioner med buffert gas i den rörlighet cell38. IM-MS kan därför användas för att upptäcka om infödda vikta strukturen har bevarats i gas fas39,40. Detta avsnitt beskriver hur man mäter IM-MS och beräkna CCS av protein med TWIMS.

  1. Efter optimering av instrumentet villkor för stabil överföring (steg 2), minska lett energi och provtagning kon så låg som möjligt med bibehållen bra spectra kvalitet.
  2. Använda optimerad wave velocity och våghöjd för att förvärva IM-MS (steg 2).
  3. Mäta ion drivan tid med IM-MS på tre olika våg hastigheter (t.ex., 550, 600 och 650 m/s) samtidigt som samma våghöjd (t.ex. 40 V).
  4. Att bestämma protein jonerna CCS, åtgärd protein calibrants på samma villkor instrument används för protein under utredning. Optimal drift-tid kalibrering krävs mätning av proteiner med kända CCS.
    1. Välj fyra calibrants, två med en massa ovanför och två med en massa därunder av protein under undersökningen37. Viktigast, se till att våghöjd och wave velocity är samma som de som registrerats för protein under utredning.
  5. Beräkna CCS manuellt41 eller använda en specialiserad programvara såsom PULSAR33 och Amphitrite34 (figur 5).
  6. Kontrollera om proteinet är native-liknande i gas-fas, jämför experimentella CCS till teoretiska CCS erhållits från högupplöst strukturer. För HerA-NurA, beräkna teoretiska CCS med metoden projektion tillnärmning (PA) som används i MOBCAL42. Andra metoder inkluderar bana metod (TM)42 och exakta hård sfär spridning (EHS)43.

4. i-lösning störningar av proteinkomplex för infödda MS och IM-MS ledde strukturbestämning

Obs: Sub proteinkomplex kan i vissa fall identifieras från samma lösning som det intakt komplexet. Dock ytterligare strukturella information såsom Inter subenhet anslutning och komplex sammansättning kan nås från störa proteininteraktioner i lösning, till formulär sub komplex. Detta kan uppnås på flera sätt såsom tillägg av organiskt lösningsmedel, öka jonstyrka eller manipulera pH. För att få inblick i HerA-NurA komplexa subenhet connectivity och komplex sammansättning, genererades sub komplex i lösning genom att tillsätta lösningsmedel som stör subenhet interaktioner.

  1. Förbereda protein prov och buffert utbyte till ammoniumacetat som beskrivs i steg 1.
  2. Lägga till 10-40% av lösningsmedlet i steg om 10%. Lösningsmedel används vanligtvis är metanol (MeOH), dimetyl sulfoxid (DMSO) eller acetonitril (ACN).
    Obs: Detta kan utföras inom en polypropylen mikrocentrifug rör.
  3. Inkubera blandningen på is för 1 h.
  4. Förvärva en IM-MS spektrum för varje villkor (steg 2 och 3) (figur 4).
  5. Använd de toppmöte programvara44 att tilldela sub proteinkomplex och generera protein interaktion nätverk. Alternativt kan du manuellt generera en lista med teoretiska massorna av de förvänta arterna.
  6. För att säkerställa subcomplexes viks, beräkna experimentella CCS värdena för de underordnade komplex och jämför teoretiska CCS som förklaras i steg 3 (tabell 1, figur 5 och figur 6).

5. undersöka Protein komplex med kollision inducerad utspelas (fondföretag)

Obs: Fondföretaget kan användas sond strukturella stabilitet proteiner och deras komplex vid ligand bindning. Specialist programvarupaket som PULSAR33, Amphitrite34 och Fondföretaget suite9 kan sedan användas till modell gas-fas unfoldingen av protein under utredning med och utan ligand. Som ett exempel, i det här avsnittet beskriver förfarandet för övervakning av gas-fas utspelas banor och utreda DNA och ATP bindande på HerA-NurA komplexa stabiliserande effekt.

  1. IM-MS postdata samtidigt öka fälla acceleration spänningen från 10 V till 200 V i 2-10 V steg successivt utvecklas proteinet i gas-fas.
    Obs: Inspelning mindre steg resultat i fler datafiler att bearbeta, men detta tillvägagångssätt ger mer löst utspelas handlingen, vilket är viktigt för att analysera övergångspunkter mellan vikta/ovikt arter.
  2. Analysera de uppgifter som erhållits med PULSAR33, Amphitrite34 eller Fondföretaget suite9 och generera tvådimensionell utspelas tomter i enheter av CCS som en funktion av accelererande spänning (steg 3). För varje laddning land skapas detta genom att stapla den intensity-normaliserade CCS distributioner på varje accelererande spänning (figur 7 A-Bi).
  3. Generera en teoretisk utspelas tomt med en av programpaket. Data kommer att monteras på en pågående modell. Detta gör det möjligt att kvantifiera lett energin som utspelas övergångar förekommer och avgöra stabilitet av proteiner med och utan bundna ligander33. En pågående övergången är när en arter övergångar från en stat (baserat på deras experimentella CCS-värden) till en annan stat med en större CCS.
  4. För att kvantifiera övergångarna, beräkna de övergångsperiod midpoint(s) mellan stater med hjälp av algoritmer och programvara såsom PULSAR33. Detta redovisas vanligen som CV50, vilket är värdet kollision (trap) spänning vid vilken 50% av ett specifikt tillstånd är förbrukad.
  5. Med hjälp av CV50 värdet, beräkna den totala inre energin av en Jon med hjälp av center-of-mass kollision energi (KECOM)45. KECOM definieras av den totala inre energin tillgänglig för pågående övergången av en Jon och beräknas från rörelseenergi och massorna kollision partner (protein ion och neutral gas) som beskrivs i ekvation (1)10
    KEcom (eV) = Equation 1 (ekvation 1).
    Där Z är den ion laddningen, MN är massan av neutral gas och MION är massan av den protein-jonen.
    Obs: Detta är att Fondföretaget av proteiner är kostnad dependent46, 47. Det rekommenderas att utföra KECOM analysen till mer än en kostnad stat ( figur 7Aii).

6. modellering förfaranden för differentiell Molecular Dynamics simuleringar används i integrativ MS

Obs: Med hjälp av modeller av proteinsubenheter eller komplex såsom från kristallen strukturerar, kan differentiell MD simuleringar (protein komplex med och utan ligand) användas att avgöra effekterna av till exempel ligand närvaro på Proteiners struktur och dynamik. Detta avsnitt beskriver ett arbetsflöde och verktyg som behövs för modellering förfaranden som behövs för set-up differentiell Molekyldynamik simulering.

  1. Identifiera subunitsna som komponerar komplexet (figur 8A, i steg 2 och 3). Källa befintliga modeller av subenheter, exempelvis kristallstrukturer från RCSB databasen (https://www.rcsb.org). Den UniProt posten av protein kommer att innehålla en lista över vet kristallografiska/NMR strukturer (http://www.uniprot.org). Om dessa inte är tillgängliga, kan den teoretiska sekvensen matas till BLAST att identifiera lämpliga mallar för homologi modellering (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
  2. Montera anläggningen i rätt topologi (figur 8A-ii). Detta kan göras genom olika metoder. Enskilda subunitsna kan monteras i tillgängliga elektronmikroskopi maps som finns på EMDB att montera intakt komplex (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). En handledning för montering PDBs i EM kartor med hjälp av Molecular Dynamics flexibel montering (MDFF) kan hittas här: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.
  3. Identifiera saknade regioner av komplexet (figur 8A-iii). Utföra flera följd justering (MSA) mellan PDB och teoretiska sekvens för att identifiera rester som kan vara oprövad i kristallen strukturerar eller någon mutationer som ärvts från kristallografiska experiment. MSA kan utföras med webbservrar som T-Coffee (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular).
  4. Regenerera saknas rester via homologi modellering (figur 8A-iv). Saknas rester av protein komplex kan byggas med hjälp av MODELLERARE programmet (https://salilab.org/modeller/). MODELLERARE kan mata en ensemble av n modeller i olika regenererad konfigurationer. Bra modeller kan identifieras utifrån sin diskreta optimerad Protein energi (knark) poäng. En omfattande handledning tillhandahålls på webbplatsen programvara (https://salilab.org/modeller/tutorial/).
  5. Utföra differential molekyldynamik (MD) simulering av protein komplex (figur 8B) för att identifiera regioner av proteiner som svarar på en viss miljöförändringar, exempelvis förekomsten av en ligand. I dessa simuleringar, beteendemässiga parametrar från simulering A (endast protein) som fungerar som en referens, subtraheras från simulering B (protein + ligand). Differentiell kvadratiska medelvärdet fluktuationer (RMSF) beräknas mellan simuleringar A och B kan informera på regioner av protein som ökar eller minskar flexibiliteten i en ligand koncentrationsberoende sätt.
    1. Utföra MD simuleringar och efterföljande analys med GROMACS (http://www.gromacs.org). En handledning finns på: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Till elimate modell bias, ska strukturera av ligand-bundna anläggningen genereras först. Proteinet kopieras sedan från detta utan liganden, ge en protein-modell som är identisk till ligand-bundet komplex.

Representative Results

Infödda MS resultat visade Oligomera staten, sammansättning och topologi av HerA-NurA komplexa (figur 1). Som icke-kovalenta interaktioner bevaras i gas-fas, infödda MS ATP-γ-S och ADP titreringar experiment beslutsamt parvisa nukleotid bindningen till HerA-NurA (figur 2) och att en ökad ATP-γ-S koncentrationen ökar relativt intensitet av hexameric HerA (figur 3). Strukturell information angående subenhet interaktioner erhölls från i-lösning störningar följt av infödda MS och var överens med och teoretiska massorna (figur 4 och tabell 1).

Experimentell CCS värdena av proteiner och deras komplex härleddes från IM-MS experiment (figur 5). Dessa värden är rotationsformade i genomsnitt gas-fas tvärsnittsdata beräkningar av molekylära form och beskriva den dimensionella proteinet. CCS värdena jämförs med teoretiska mätningar från röntgenkristallografi och ett bra avtal dragit slutsatsen att den inhemska formen i kvar i gas-fas (tabell 1). Detta bekräftar med CCS värden för bygga lågupplösta modeller av protein församlingen48.

Experimentell CCSs kan beräknas för varje kostnad stat ion. En native-liknande protein conformer kan ge upphov till ladda staten joner med liknande CCS värden. Högre kostnad stat joner ökade dock coulombic repulsions vilket kan leda till protein gas-fas utspelas och större CCS värden jämfört med de teoretiska CCSs. CCS värdet för lägsta kostnad staten joner är därför oftast används49. För HerA-NurA, i-lösning störningar experiment på HerA och HerA-NurA med och utan DNA uppmanas generering av en församling väg börjar med monomerer då bildar den hela hexameric HerA (HerA6)-dimeriskt NurA (NurA2) komplex med DNA (figur 6).

Skillnader i Fondföretaget utspelas tomterna mellan apo (ligand-fri) och ligand bunden definiera ändringen i komplexa stabilitet vid ligand bindning. Ett högre CV50 eller KECOM värde innebär en mer stabiliserad ion i gas-fas. Fondföretaget och KECOM analysen visade DNA-bundna HerA-NurA är mer stabil än komplexet DNA-fria (figur 7Aii). CIU-MS analys i respektive ATP-bindande staterna, fyra-ATP-γ-S bundna staten minskade komplexa stabilitet i gasfas- och sex -ATP-γ-S bundna tillstånd där är alla platser är upptagna var mest stabil (figur 7Bii). Infödda MS kan avslöja den diskreta nukleotid bindande påstår av HerA; men kan inte det skilja som HerA subenheter är bindande ATP och där denna bindning sker. Denna information kan härledas från explicit lösningsmedel MD simuleringar på hexameric HerA och den HerA-NurA efter sammanfattas arbetsflödet (figur 8).

Figure 1
Figur 1. Förhör Oligomera staten, sammansättning och topologi av det HerA-NurA icke-kovalenta. (A) masspektra av HerA, HerA-NurA och HerA-NurA i närvaro av DNA (15,4 kDa 25 bp dubbelsträngat DNA). HerA sub komplexet finns som både en hexamer och en heptamer. NurA dimer binder och en HerA hexamer införande av Oligomera konvertering. DNA binder bildade HerA - NurA komplexet (resultat anpassad från Z. Ahdash et al., 201722). (B) relativ intensitet av de identifiera arterna beräknas med hjälp av UniDec32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Infödda ESI-MS avslöjar mekanismen av nukleotid bindning till HerA-NurA. Masspektra (A) HerA-NurA och (B) HerA-NurA-DNA med ökande koncentrationer av (i) ATP-γ-S och (ii) ADP. Uppmätta massorna jämförs med teoretiska massorna och mängden ATP-γ-S eller ADP bunden bestäms. Uppmätta massorna och antal bundna nukleotider visas på spektra. ATP-γ-S och ADP titreringar experiment beslutsamt den parvisa nukleotid bindningen HerA-NurA ensam och när i komplex med DNA som anger en cyklisk Reaktionsmekanism (resultat anpassad från Z. Ahdash et al., 201722). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Mäta effekten av ökande ATP-γ-S koncentrationer på HerA Oligomera staten. (A) masspektra av HerA på ökande koncentrationer av ATP-γ-S. (B) diagrammet visar de relativa intensitet av olika arter från infödda MS beräknas UniDec deconvolution programvara32. När ATP-γ-S koncentrationen ökar, ökar också hexameric HerA relativ intensitet. Antal ATP-γ-S molekyler bundna visas på spektra (resultat anpassad från Z. Ahdash et al., 201722). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Massa spectra och sub komplexa dissociation produkter av HerA (A) och (B) HerA-NurA (i) ensam och i närvaro av (ii) DNA följande in-lösning störningar. I-lösning störningar experiment utfördes med 10-40% av acetonitril, metanol (MeOH) eller dimetyl sulfoxid (DMSO) och resulterade i bildandet av olika subcomplexes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Ion rörlighet ankomst tid distributioner visas på en CCS axel för komplex och genererade sub komplex. Ikon för varje sub komplexa korrelerar med dem kommenterade på spektra i figur 4. Experimentella och beräknade massorna och CCS värden av sub komplex är listade i tabell 1 som visade ett avtal mellan experimentell och beräknade värden (efter att ha övervägt den typiska osäkerheten i resolutionen av den reser våg ion rörlighet masspektrometri ±5 - 8%37). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Montering väg av HerA-NurA anläggningen genereras från i-lösning störningar infödda MS och IM-MS. färgade cirklar ange villkor där varje sub komplex observerades: native (grön, före störningar), metanol (gul), DMSO (lila) eller Acetonitril (röd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Undersöker den stabiliserande effekten a DNA på HerA-NurA och (B) ATP bindning HerA-NurA-DNA. (i) gas-fas Fondföretaget-MS tomter och (ii) center-of-mass kollision energier (KEcom) beräkning visar att att förekomsten av dsDNA stabiliserar HerA-NurA anläggningen och att de sex ATP-γ-S bundna tillstånd är den mest stabila. Stabilisering för olika laddningstillstånd visas. Tomter genererades med hjälp av PULSAR 33. Resultat från (A) anpassad från Z. Ahdash et al., 201722. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8. Arbetsflöde för modellering förfaranden för differentiell Molekyldynamik simulering. (A) genererar komplexet under utredning genom att bygga topologin från befintliga subenheter och ombyggnad saknas rester. (B) arbetsflöde för att köra molekyldynamik simuleringar på protein komplex med och utan ligand. Molekylär dynamik simuleringar är sprang för protein endast som fungerar som en referens och som dras från simulering av protein plus ligand. Detta följs genom beräkning av differentiell kvadratiska medelvärdet fluktuationer (RMSF) mellan simuleringarna och bestämma effekten av liganden bindande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Komplex / sub komplexa Teoretiska massan (kDa) Experimentell massa (kDa) Teoretiska CCS (Å2) Experimentell CCS (Å2) [charge] Villkor HN
HerA6- NurA2 416.22 417.85 14531 14577 [42 +]
14599 [43 +]
14608 [44 +]
14637 [45 +]		 10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH
HerA6- NurA2- dsDNA 431.72 432.27 - 14661 [39 +]
14728 [40 +]
14781 [41 +]
14837 [42 +]		 10% ACN, 10% MeOH
NurA1 39.12 38.18 3254 2618 [10 +]
2746 [11 +]
2878 [12 +]		 10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO
NurA2 78.24 78.36 4890 4903 [16 +]
4614 [17 +]
4537 [18 +]
4666 [19 +]		 10-40% MeOH, 20-40% DMSO
HerA1 56.33 56.32 4131 3647 [14 +]
3792 [15 +]
3950 [16 +]		 10-40% ACN, 40% DMSO
HerA2 112.66 112.95 6475 5648 [20 +]
5747 [21 +]
5842 [22 +]
5996 [23 +]		 40% meth, 10-40% ACN
HerA3 168.99 169.39 8607 7501 [25 +]
7616 [26 +]
7717 [27 +]
7867 [28 +]		 10-40% MeOH, 10-40% kan, 40% DMSO
HerA3 + DNA 183.99 184.976 - 7655 [26 +]
7990 [27 +]
8107 [28 +]		 10-30% ACN
HerA4 225.32 226,2 10477 9205 [30 +]
9287 [31]
9493 [32 +]
9961 [33 +]		 10-40% MeOH, 10-40% ACN
HerA4 + DNA 240.82 241.33 - 9637 [31 +]
9756 [32 +]
9830 [33 +]		 10-30% ACN
HerA5 281.65 282.75 11853 10847 [36 +]
10958 [37 +]
11161 [38 +]		 30-40% ACN
HerA6 337.98 339.3 12517 12335 [38 +]
12386 [39 +]
12498 [40 +]
12590 [41 +]
12676 [42 +]
13019 [43 +]		 10-40% MeOH, 10-40% ACN
HerA6 + DNA 353.48 354.626 - 12890 [40 +]
13081 [41 +]
13184 [42 +]
13273 [43 +]
13463 [44 +]
13576 [45 +]		 30% ACN
HerA7 394.3 395.85 13901 14154 [42 +]
14219 [43 +]
14261 [44 +]
14285 [45 +]
14335 [46 +]		 10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO
HerA7 + DNA 409,8 410.62 - 14414 [41 +]
14510 [42 +]
14558 [43 +]
14598 [44 +]
14630 [45 +]
14641 [46 +]		 10% ACN

Tabell 1. Experimentella och beräknade massorna och CCS värdena HerA-NurA och dess sub komplex genererade formuläret i-lösning störningar studier.

Discussion

MS spelar en allt viktigare roll i karaktärisera den stökiometri, interaktioner och subunit arkitektur av proteinkomplex. IM-MS data kan användas för att definiera topologiska arrangemang av subunits inom flerkomponents komplex. Jämfört med andra befintliga metoder för strukturbiologi, har MS flera fördelar. Infödda MS är en snabb och mycket känslig teknik och kan användas till probe heterogena protein prover. När tillsammans med i-lösning störningar experiment, kan dissociation vägar av protein aggregat övervakas. Tillsammans med kristallen strukturerar eller homologi modeller, den information som erbjuds av strukturella MS erbjuder ett verktyg för att undersöka protein-ligand interaktioner och ge nära-native modeller och församlingen vägar11.

Här beskriver vi experimentella förfarandena för att analysera stökiometri och sammansättning av protein-ligand interaktioner, med ett eller flera ligander, med integrativ MS. Detta inkluderar MS provberedning, datainsamling, dataanalys och integrationen av MS data med hjälp av datorverktyg. Detta gör använt vi DNA-resektion HerA-NurA hetero-Oligomera protein komplex, bunden till tre ligander (DNA, ATP och ADP), som vår modellsystem. Protokollet visar användningen av för närvarande tillgängliga programvaran till stöd dataanalys och presentation.

Förvärva hög kvalitet spectra är viktigt för ligand bindande analys, därför försiktig provberedningssteg är kritiska, inklusive protein rening, ligand titrering och buffert exchange. En begränsning av nESI infödda MS när man studerar ligand bindande är icke-specifik bindning. Icke-specifik bindning uppstår under droplet desolvering under hela elektrospray processen. Detta ökar koncentrationerna som ligand och därför förändrar protein/Ligand baserat på29. Bindningen av nukleotider resulterar i en relativt liten samlasskillnaden mellan apo och nukleotid-bundna protein som inte ändrar den jonisering effektivitet50,51.

Vi använde Synapt G2-Si MS systemet för vårt arbete, men protokoll som är tillämpliga för olika undersökningar av andra protein-ligand komplex med andra kommersiellt tillgängliga nano-elektrospray masspektrometrar. Integrativ strukturella MS spelar alltmer en viktig roll i att hantera biologiska problem av större komplexitet. Arbetsflöde och tekniker som beskrivs här lämpar sig väl för att förstå de strukturella konsekvenserna och bygga mekanismer av proteinkomplex och protein-ligand formation som annars är svåra att studera med hjälp av konventionella strukturella tekniker .

Disclosures

Inga intressekonflikter förklarade.

Acknowledgments

Vi skulle vilja tacka Karl-Peter Hopfner och Robert Thomas Byrne för vänligt ge HerA och HerA-NurA protein prover och för deras hjälp med experimentell design. Vi tackar också Dr Eamonn Reading för hans granskning av manuskriptet. Vi tacksamt erkänna våra finansiärer: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] och Royal Society [RG150216 till A.P.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt Merck Millipore 119120-25MG
Adenosine 5′-diphosphate  Sigma-Aldrich 20398-34-9
Ammonium acetate solution Sigma-Aldrich A2706
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 7326204
Vivaspin concentrator Sartorius Z614041-25EA
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Water TraceSelect Sigma-Aldrich 95305
Borosilicate Capillaries Harvard Apparatus 300060

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilm, M., Mann, M. Analytical Properties of the Nanoelectrospray Ion Source. Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).
  2. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecule. Science. 246 (4926), 64-71 (1989).
  3. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (3), 715-726 (2007).
  4. Heck, A. J., Van Den Heuvel, R. H. Investigation of intact protein complexes by mass spectrometry. Mass Spectrom Review. 23 (5), 368-389 (2004).
  5. Boeri Erba, E., Petosa, C. The emerging role of native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes. Protein Science. 24 (8), 1176-1192 (2015).
  6. Laganowsky, A., Reading, E., Hopper, J. T. S., Robinson, C. V. Mass spectrometry of intact membrane protein complexes. Nature. 8 (4), 639-651 (2013).
  7. Benesch, J. L. Collisional activation of protein complexes: picking up the pieces. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (3), 341-348 (2009).
  8. Tian, Y., Han, L., Buckner, A. C., Ruotolo, B. T. Collision Induced Unfolding of Intact Antibodies: Rapid Characterization of Disulfide Bonding Patterns, Glycosylation, and Structures. Analytical Chemistry. 87 (22), 11509-11515 (2015).
  9. Eschweiler, J. D., Rabuck-Gibbons, J. N., Tian, Y., Ruotolo, B. T. CIUSuite: A Quantitative Analysis Package for Collision Induced Unfolding Measurements of Gas-Phase Protein Ions. Analytical Chemistry. 87 (22), 11516-11522 (2015).
  10. Hopper, J. T., Oldham, N. J. Collision induced unfolding of protein ions in the gas phase studied by ion mobility-mass spectrometry: the effect of ligand binding on conformational stability. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (10), 1851-1858 (2009).
  11. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chemical Biology. 22 (1), 117-128 (2015).
  12. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Reports. 11 (5), 759-769 (2015).
  13. Lai, Y. T., et al. Structure of a designed protein cage that self-assembles into a highly porous cube. Nature Chemistry. 6 (12), 1065-1071 (2014).
  14. Levy, E. D., Boeri Erba, E., Robinson, C. V., Teichmann, S. A. Assembly reflects evolution of protein complexes. Nature. 453 (7199), 1262-1265 (2008).
  15. Sharon, M., et al. Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality. Structure. 17 (1), 31-40 (2009).
  16. Jurneczko, E., Barran, P. E. How useful is ion mobility mass spectrometry for structural biology? The relationship between protein crystal structures and their collision cross sections in the gas phase. Analyst. 136 (1), 20-28 (2011).
  17. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. Journal of Proteomics. 175, 34-41 (2017).
  18. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  19. Barrera, N. P., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles Protect Membrane Complexes from Solution to Vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  20. Konijnenberg, A., et al. Global structural changes of an ion channel during its gating are followed by ion mobility mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17170-17175 (2014).
  21. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Scientific Reports. 7, 44068 (2017).
  22. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Research. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  23. Pagel, K., Natan, E., Hall, Z., Fersht, A. R., Robinson, C. V. Intrinsically disordered p53 and its complexes populate compact conformations in the gas phase. Angewandte Chemie. 52 (1), 361-365 (2013).
  24. Afonso, J. P., et al. Insights into the structure and assembly of the Bacillus subtilis clamp-loader complex and its interaction with the replicative helicase. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5115-5126 (2013).
  25. van Duijn, E. Current limitations in native mass spectrometry based structural biology. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (6), 971-978 (2010).
  26. Susa, A. C., Xia, Z., Williams, E. R. Native Mass Spectrometry from Common Buffers with Salts That Mimic the Extracellular Environment. Angewandte Chemie. 56 (27), 7912-7915 (2017).
  27. Breukera, K., McLafferty, F. W. Stepwise evolution of protein native structure with electrospray into the gas phase, 10 to 10 s. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18145-18152 (2008).
  28. Robinson, C. V., et al. Probing the Nature of Noncovalent Interactions by Mass Spectrometry. A Study of Protein-CoA Ligand Binding and Assembly. Journal of the American Chemical Society. 118 (36), 8646-8653 (1996).
  29. Shimon, L., Sharon, M., Horovitz, A. A method for removing effects of nonspecific binding on the distribution of binding stoichiometries: application to mass spectroscopy data. Biophysical Journal. 99 (5), 1645-1649 (2010).
  30. Dyachenko, A., Gruber, R., Shimon, L., Horovitz, A., Sharon, M. Allosteric mechanisms can be distinguished using structural mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7235-7239 (2013).
  31. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. 19 (40), (2010).
  32. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Analytical Chemistry. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  33. Allison, T. M., et al. Quantifying the stabilizing effects of protein-ligand interactions in the gas phase. Nature Communications. 6, 8551-8561 (2015).
  34. Sivalingam, G. N., Yan, J., Sahota, H., Thalassinos, K. Amphitrite: A program for processing travelling wave ion mobility mass spectrometry data. International Journal of Mass Spectrometry. 345-347, 54-62 (2013).
  35. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Analytical Chemistry. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  36. Bush, M. F., et al. Collision Cross Sections of Proteins and Their Complexes: A Calibration Framework and Database for Gas-Phase Structural Biology. Analytical Chemistry. 82, 9557-9565 (2010).
  37. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L., Sandercock, A. M., Hyung, S. J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  38. Lanucara, F., Holman, S. W., Gray, C. J., Eyers, C. E. The power of ion mobility-mass spectrometry for structural characterization and the study of conformational dynamics. Nature Chemistry. 6 (4), 281-294 (2014).
  39. Wyttenbach, T., Bowers, M. T. Structural stability from solution to the gas phase: native solution structure of ubiquitin survives analysis in a solvent-free ion mobility-mass spectrometry environment. Journal of Physical Chemistry B. 115 (42), 12266-12275 (2011).
  40. Marcoux, J., Robinson, C. V. Twenty years of gas phase structural biology. Structure. 21 (9), 1541-1550 (2013).
  41. Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  42. Mesleh, M. F., Hunter, J. M., Shvartsburg, A. A., Schatz, G. C., Jarrold, M. F. Structural Information from Ion Mobility Measurements: Effects of the Long-Range Potential. Journal of Physical Chemistry A. 100, 16082-16086 (1996).
  43. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chemical Physics Letters. 261, 86-91 (1996).
  44. Taverner, T., Hernández, H., Sharon, M., Ruotolo, B. T., Matak-Vinković, D., Devos, D., Russell, R. B., Robinson, C. V. Subunit Architecture of Intact Protein Complexes from Mass Spectrometry and Homology Modeling. Accounts of Chemical Research. 41 (5), 617-627 (2008).
  45. Wysocki, V. H., Joyce, K. E., Jones, C. M., Beardsley, R. L. Surface-induced dissociation of small molecules, peptides, and non-covalent protein complexes. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (2), 190-208 (2008).
  46. Hall, Z., Politis, A., Bush, M. F., Smith, L. J., Robinson, C. V. Charge-state dependent compaction and dissociation of protein complexes: insights from ion mobility and molecular dynamics. Journal of the American Chemical Society. 134 (7), 3429-3438 (2012).
  47. Hyung, S. J., Robinsons, C. V., Ruotolo, B. T. Gas-Phase Unfolding and Disassembly Reveals Stability Differences in Ligand-Bound Multiprotein Complexes. Chemistry & Biology. 16, 382-390 (2009).
  48. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  49. Woods, L. A., Radford, S. E., Ashcroft, A. E. Advances in ion mobility spectrometry-mass spectrometry reveal key insights into amyloid assembly. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1257-1268 (2013).
  50. Daubenfeld, T., Bouin, A. P., van der Rest, G. A deconvolution method for the separation of specific versus nonspecific interactions in noncovalent protein-ligand complexes analyzed by ESI-FT-ICR mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 17 (9), 1239-1248 (2006).
  51. Loo, J. A. Studying noncovalent protein complexes by electrospray ionization mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 16, 1-23 (1997).

Tags

Kemi fråga 140 masspektrometri (MS) native MS ion-rörlighet proteinkomplex icke-kovalenta interaktioner nukleotid bindande DNA-bindning molekyldynamik modellering.
Analysera Protein arkitekturer och Protein-Ligand komplex av integrativ strukturella masspektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahdash, Z., Lau, A. M., Martens, C., … More

Ahdash, Z., Lau, A. M., Martens, C., Politis, A. Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e57966, doi:10.3791/57966 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter