Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

Published: October 15, 2018 doi: 10.3791/57966
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, King's College London

Summary

ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.

Abstract

חלבונים הם מחלקה חשובה של מקרומולקולות ביולוגיות לשחק תפקידים מרכזיים רבים תאיים כולל ביטוי גנים, ותזרז תגובות חילוף החומרים, תיקון ה-DNA, שכפול. לכן, הבנה מפורטת של תהליכים אלה מספק מידע חיוני על איך תאים פונקציה. שיטות MS מבניים אינטגרטיבית מציע מידע דינמיות מבניים על מכלול מורכבים חלבון, קישוריות מורכבים, יחידת משנה סטויכיומטריה, חלבון oligomerization ואיגוד ליגנד. התפתחויות אחרונות MS מבניים אינטגרטיבית אפשרו עבור אפיון מערכות ביולוגיות מאתגר כולל גדול DNA מחייבת חלבונים וחלבונים ממברנה. פרוטוקול זה מתאר את אופן שילוב נתונים MS מגוונים כגון MS מקורית, יון ניידות-ספקטרומטריית (IM-MS) עם דינמיקה מולקולרית סימולציות לקבלת תובנות לתוך ה-DNA נוקלאז הליקאז תיקון החלבונים. הגישה המתקבלת מספקת מסגרת ללימודי מפורט של ליגנד מחייב מתחמי חלבונים אחרים המעורבים בתהליכים ביולוגיים חשובים.

Introduction

ניתוח המוני spectrometric מקורית של חלבונים שלמים, מתחמי שלהם מתבצעת באמצעות ספקטרומטריית electrospray ו ננו-ספקטרומטריית electrospray יינון (נאסי), המשמרים קיפול חלבונים ואינטראקציות שאינם קוולנטיות במהלך תהליך יינון1, 2. ב- MS מקורית, המבנה של חלבונים, מתחמי שלהם נשמרות במצב קרובה לשפת אם3,גז-שלב4. MS יליד מזהה יונים חלבון טעונה מרובים, אשר מופרדים על-פי מסת לחייב יחס (מ/z) המאפשר את המסה של חלבון או חלבון-ליגנד מורכבים לחשב. מידע זה מאפשר קביעת של חלבון שלם סטויכיומטריה, יחידת משנה הרכב, איגוד ליגנד ו אינטראקציה רשתות3,4,5,6. MS מקורי יש כמה יתרונות לעומת טכניקות אחרות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה5. ראשית, יליד MS הוא טכניקה מהירה, רגישה מאוד, המחייב רק כמה microliters (2-3 µL) מדגם בריכוזים מורכבות נמוכה יחסית הסופי ב- nM גבוהה מיקרומטר נמוכה בטווח6. שנית, יליד MS יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגנית בכך ניתן לנתח מספר חלבונים ומדינות oligomeric בו זמנית. שלישית, יליד MS לא דורשת דגימות חלבון כדי להיות שונה לפני ניתוח על-ידי crosslinking כימי או חלבון תוויות. יתרונות אלה הפכו מבניים MS כלי רב עוצמה עבור החקירה מבנית של מתחמי חלבון.

MS מקורית ניתן לשלב עם יון ניידות (IM), טכניקה המודד את הזמן שיון חלבון לוקח לנסוע דרך שדה חשמלי, המאפשר את חתך collisional (מיליגרם) נקבע. CCS מספקת מידע מבניים ברזולוציה נמוכה, המאפשרת טופולוגיה ומידע הסתגלותי הטרוגניות של חלבונים כדי להתקבל. יתר על כן, היא מאפשרת הבחינה של מודלים מבניים חלבון שנוצר על ידי גישות חישובית.

יציבות גז-פאזי חלבון יכול ייחקרו באמצעות התנגשות המושרה התגלגלות (ciu לקדם) נמדד מאת IM-MS. במהלך תהליך ciu לקדם, חלבון יונים מואצת, מופעלת באמצעות מוגברת מאיץ התנגשויות גז אינרטי מאגר בתוך ספקטרומטר מסה7,8,9. תהליך ההפעלה collisional זה גורם החלבון להתגלות חלקית, אשר מיתרגם עלייה מיליגרם. שינוי זה CCS, האנרגיה הדרושה כדי לגולל את החלבון יכול להיות נמדד באמצעות IM-גב' בגישה זו, ההשפעה של ליגנד מחייב על יציבות חלבון יכול להיות נמדדו10. ניתן להפיק subcomplexes בתמיסה בשיטות הפרעה בפתרונות כגון התוספת של ממיסים אורגניים לפקח טופולוגיות כמו מקורי של מתחמי חלבון. שיבוש מתחמי חלבון הוא בעיקר עקב שיבוש אינטראקציות אי-קוולנטיות "אינטרה". מתחמי משנה לשמור על ילידים דמויי טופולוגיות, זיהוי MS, לחשוף מידע אודות קישוריות בין יחידה משנית.

גישות אינטגרטיבית בביולוגיה מבנית לשלב שיטות מגוונות כדי ללמוד את המבנה ואת הדינמיקה של חלבונים ו שלהם מתחמי3,4,5,6. יליד MS ו- IM-MS שימשו לגלות את הפרטים המולקולרי של מערכות ביולוגיות מאתגר. היו מספר דוגמאות של יישומים כולל המחקר של חלבון הרכבה מסלולים11,12,13,14, לומד רשתות אינטראקציית חלבון-חלבון15 , 16 , 17קרום חלבונים6,18,19,20,21, אינטראקציות חלבון-ליגנד כגון חומצות גרעין22,23 ,24.

עם זאת, יליד MS יש גם המגבלות. יליד MS מדידות מבוצעות לעתים קרובות במאגרי נדיפים כגון אמוניה מימית אצטט שבו כמה חלבונים לא ישמרו שלהם במצב מקופל יליד3,25. בכל זאת, העבודה האחרונה הראו כי מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי אופטימיזציה של ריסוס בקוטר קצה המחט (טיפים 0.5 מ מ) כך חלבון ו יונים מורכבים חלבון יכול להיווצר ישירות מתוך מאגרי לא נדיף עם יונית-חזקה יותר לחקות סביבה פיזיולוגיים26. בנוסף, יליד MS משתמשת ספקטרומטריית electrospray ionize ולהעביר את הרכבות קשרי ערכיות מהפתרון לשלב גז; לכן, שפע יחסי של מתחמי שאותרו לא מלאה מייצג זה פתרון5,27. יתר על כן, לשם השוואה כדי בתמיסה, אינטראקציות הידרופוביות שלב גז הפך חלש יותר, אלקטרוסטאטיות להתחזק, ולכן העדיף3,28.

במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקולים, ניתוח נתונים, פרשנות עבור זיהוי חלבונים וליגנד איגוד באמצעות MS מקורית, IM-MS, ciu לקדם, הפרעה בפתרונות, ו דוגמנות. המתחם תיקון ה-DNA, הרה-נורא, משמשת כמערכת מודל. מעברי כפול גדילי הדנ א (DSBs) הם אחת הצורות ביותר ציטוטוקסיות, ברישול של נזק לדנ א, וכתוצאה מכך לחוסר יציבות גנטית, ההתפתחות של סרטן בבני אדם. רקומבינציה הומולוגית היא מנגנון תיקון אשר משורשה DSBs, תהליך אשר הוא בניצוחו של ה ATP הליקאז התלויים-נוקלאז מתחם הרה-נורא22.

שילוב מקורי MS ו- IM-MS עם מבחני פונקציונלי, דגמי מותר החקירה של: i) את התפקיד של נורה הרכבה, קונפורמציה ולאחר היציבות של המתחם, ii) האינטראקציה בין dsDNA לבין המתחם והשפעתו על הכולל יציבות של המתחם, ו- iii) סטויכיומטריה וההשפעה של ATP מחייב מכלול22. בסך הכל, הוביל להבנה משופרת הבסיס המולקולרי של המתחם הרה-נורה על-ידי קישור חלבונים מורכבים שינויים הסתגלותי ויציבות עם נוקלאוטיד מחייב. פרוטוקול זה הוא כללי עבור כל complex(es) חלבון אשר מקיים אינטראקציה עם אחד או מספר סוגי ligand(s).

Protocol

1. מדגם הכנה MS מקורית של חלבונים, חלבונים-ליגנד מתחמי

הערה: כדי להשיג הבנה של הבסיס המולקולרי של קומפלקס החלבונים ואיגוד ליגנד באמצעות MS מקורית, הכנת הדוגמא המתאימה היא המפתח. מטרת סעיף זה היא כדי להדגיש את הצעדים הכנה מדגם חיוני לפני ניתוח MS באמצעות המתחם הרה-נורא הכובל DNA ו נוקלאוטידים כדוגמה.

  1. להכין 20 aliquots µL של חלבון מטוהרים מרוכז (בדרך כלל 15-30 מיקרומטר) צינור 1.5 מ.
  2. לניתוח איגוד ATP או ADP
    הערה: להוסיף הגדלת ריכוזים של ה-hydrolyzable ATP אדנוזין אנלוגי יונקות-O-(3-thiotriphosphate), tetralithium מלח (ATP-γ-S) או אדנוזין יונקות-diphosphate (ADP). Non-hydrolyzable ATP נגזרים ליצור מורכבות יציבה שיאפשר החלבון ATP-מחויב להיות בשבי. אחרים מקבילים שאינם hydrolysable ATP זה נבדק כוללים AMP-PNP ATP-γ-S-Mg2 +.
    1. ללימודים הרה-נורא, מערבבים 5 מיקרומטר של חלבון מטוהרים עם ATP-γ-S ו ADP בריכוזים הנע בין 0-1 מ מ.
    2. כדי ללכוד בו זמנית איגוד ATP-γ-S ו ADP, הוסף שני נוקלאוטידים בריכוזים זהים או שונים.
    3. להוסיף 2 מ מ MgCl2 , דגירה 25 ° c בחממה יבש אמבטיה עבור 1 h.
      הערה: ניתוח של נוקלאוטיד כריכת נאסי שיליד MS יכול לגרום artefactual מחייב בריכוזים גבוהים, ולכן מחייב שאינם ספציפיים שצריך להתחשב בו חשבון29. כדי לחקור מחייב שאינם ספציפיים, להוסיף ריכוז גבוה יותר של נוקלאוטידים בין 2-5 מ מ).
  3. לניתוח איגוד ה-DNA
    1. לערבב חלבונים ו- DNA ביחס של שן טוחנת המאפשרת היווצרות מורכבות חלבון-DNA. הרה, הרה-נורא, מערבבים 5 מיקרומטר של חלבון מטוהרים עם ה-DNA ביחס של 1:1.
    2. דגירה של הרה-נורא או הרה - DNA התערובת במשך 30 דקות ב- 25 ° C בחממה אמבט יבש עד שהוא מגיע שיווי משקל. משך זמן וטמפרטורה של דגירה עשוי להשתנות בהתאם החלבון תחת חקירה.
    3. מאגר exchange חלבון דגימות מאגרי תואמת של MS. בדרך כלל, משמשים אמוניה מימית אצטט פתרון בין 5 מ מ- 1 מ' ב- pH 7-8. אחרים מאגרי תואמת של MS כוללים ethylenediammonium diacetate (EDDA), אצטט (TEAA) Triethylammonium30. ללימודים הרה-נורא, השתמש 200 מ"מ אמוניום אצטט pH 7.
      הערה: קיימות מספר שיטות עבור מאגר exchange לפני ניתוח על-ידי MS כגון שימוש concentrator ספין או עמודות כרומטוגרפיה. MS יליד מוגבל בעיקר על פי איכות המדגם כגון אנשים רגילים או adducts משמש במהלך טיהור. לכן, חיוני לבצע desalting מספיק כדי להשיג פסגות נפתרה.
    4. ללימודים איגוד ליגנד הרה-נורא, מאגר exchange דגימות 6 - 8 פעמים לתוך אצטט אמוניום 200 מ"מ באמצעות רכז. שיטה זו אמנם זמן רב יותר, הוא מבטיח כי נפתרה פסגות מושגות ומאפשר לקביעת מסה מדויק של מינים מאוגד ATP/ADP.

2. יליד MS רכישה וניתוח על חקירת קומפלקסים של חלבונים, חלבונים-ליגנד מתחמי

הערה: צריך להיות מוטבת MS תנאים להשגת פסגות נפתרה מאוד כדי לאפשר מדידות מדויקות המוני. הפרטים בסעיף זה מיטבי פרמטרים ב- Q-תוף ספקטרומטר מסה עם k 32 הגבול העליון מ/z פאול.

  1. להתכונן נימים שבאתר ננו-ספקטרומטריית electrospray ולבצע כלי כיול מסה עבור מדידות מדויקות המוני כמפורט מאת קירשנבאום. et al. 1.
  2. בחר את רגישות, רכישת יון חיובי ומצב TOF ניידות.
  3. הפעל השמנה, API, IMS הגזים. IM לפרידה, להשתמש חנקן (60 מ לדקה) וארגון (8.4 mL/min עבור האזור מלכודת) כנקודות התחלה ולאחר מכן התאם.
  4. הגדר טווח רכישת מ המתאים/z. חלבון לא ידוע, אופטימיזציה הראשונית צעדים עליך להשתמש במגוון רחב כגון 500-32,000 m/z.
  5. לטעון 2-3 µL של חלבונים מורכבים לפתרון להיות מנותח לתוך נימי מצופה זהב והכנס אותו בעל נימי.
  6. בעדינות להדק את נימי, למקם את נימי בשלב מקור ספקטרומטריית electrospray והחלק את הבמה לעמדה בשביל לרכוש נתונים.
  7. הפעילו לחץ גז ננו-זרם נמוך (0.00-0.05 בר) עד טיפה נוצר בקצה נים. אז יכול להיות ירד הלחץ ננו-flow עד הריסוס נשמר.
  8. להתאים את נימי ביחס חרוט ידי הזזת את נימי ב- x, y, z עמדות ולנטר את יון הנוכחי כדי להשיג את יון יציב הנוכחי. החל מתח נימי בטווח של 0.9-1.6 kV.
  9. הגדר את הדגימה קונוס (50-120 V), מקור היסט (60.0), מקור חום (25 ° C) ואת זרימת הגז קונוס (0.0 L/h). אלה הציע תנאים הראשונית ניתן להתאים.
  10. לרכוש קשת המוני לפתרון טוב וכדי להגדיל את יון שידור, להתאים את הפרמטרים MS ונטר בשינוי הספקטרום המתקבל. אלה כוללים התאמת זרימת הגז השמנה (2-8 mL/min), הוא תא (180 mL/min), תא IMS (90 מ לדקה) כדי להשיג את ההפרדה הטוב ביותר על העברה.
  11. התאם את האנרגיות התנגשות המלכודת אם ההיסטים מתח אינן מספיקות. נקודת מוצא אופטימלית הוא בין 10-50 V.
    הערה: הגברת האנרגיה השמנה יכולה להסיר ללא covalently מאוגדים adducts. עם זאת, לטפל כדי למנוע התנגשות המושרה דיסוציאציה התגלגלות של המתחם חלבון-ליגנד. לבצע מדידות יון ניידות לבדוק. אם מכשיר תנאים שומרים על החלבון במצב מקופל מקורי (שלב 3).
  12. לשפר את desolvation על-ידי מיטוב המתח הסטייה מלכודת. נקודת מוצא אופטימלית הוא V 20-45.
  13. למטב את גל מהירות וגובה גל להשיג הפרדה הניידות הטובה ביותר. הסבר מפורט עם פרוטוקול ניתן למצוא כאן31. המחקרים הרה-נורא, לשימוש מהירות הגל של 40 (m/s), גובה הגל של 550-650 (V).
  14. השתמש פרמטרים אחרים כערכי ברירת המחדל של כלי נגינה.
  15. להכין מדגם ליגנד ללא ניתוח כמו פקד עבור כל הפעלה (איור 1). לניסויים איגוד ליגנד, לבצע לפחות שלוש מדידות עצמאי.
  16. להשתמש בתוכנה Masslynx כדי למדוד את המוני מינים שנוצר ולזהות הכריכה ליגנד, כגון איגוד ATP ו ADP והברית oligomeric (איור 2 ו- 3). תוכנות אחרות זמינים כוללים UniDec32, פולסר33 אמפיטריטה34.
  17. כדי לכמת את השפע היחסי של מינים, השתמש עוצמות יון המתאימים שנצפתה ספקטרום ESI-MS raw (לדוגמה ליגנד מאוגדים, oligomers שונים, וכו '.). לחלופין, לבצע כימות באמצעות תוכנות מיוחדות כמו UniDec ו- Massign35 (איור 1 ו-3 ).

3. רכישת וניתוח IM-MS

הערה: IM-MS מפריד יונים בשלב הגז-בהתבסס על גודל (מסה) שלהם, צורת תשלום. כל תכונה נפתרה בספקטרום מ/z מזוהה עם התפלגות זמן סחיפה. IM-MS מודד את הזמן הסחף של יון בו ניתן להשתמש כדי לחשב את התנגשות חתך (מיליגרם). ערכי שעה להיסחף נמדד מאמצע IM-MS נתונים רכשה באמצעות שצינור להיסחף ניתן מתואמים באופן ליניארי CCS ערכים36. למסעות מדידות IM-MS (TWIMS) גל, חישוב ערכים CCS מצריך עקומת הכיול המתקבל חלבון סטנדרטים עם ערכים ידועים CCS37. מבנה קומפקטי נעים מהר יותר מורחבת או מבנים מאורכים בשל צמצום אינטראקציות עם מאגר גז תא הניידות38. לכן, IM-MS יכול לשמש כדי לזהות אם המבנה מקופל יליד סודרו ב שלב39,של גז40. סעיף זה מתאר כיצד למדוד IM-MS ולחשב את מיליגרם של חלבון באמצעות TWIMS.

  1. לאחר מיטוב לתנאים מכשיר לשידור יציב (שלב 2), להפחית את האנרגיה collisional ואת חרוט הדגימה נמוך ככל האפשר תוך שמירה על איכות טובה ספקטרה.
  2. השתמש גל אופטימליים מהירות גובה הגל לרכוש IM-MS (שלב 2).
  3. למדוד את הסחף יון פעם עם IM-MS במהירויות שונות גל 3 (למשל, 550, 600 ו 650 m/s) תוך שמירה על גובה גל זהה (למשל, 40 V).
  4. כדי לקבוע את היונים חלבון CCS, מדד calibrants חלבון תחת התנאים באותו מכשיר המשמש חלבון תחת חקירה. כיול סחיפה-זמן אופטימלי דורש מידה של חלבונים עם CCS ידוע.
    1. בחר calibrants ארבע, שתיים עם גוש מעל ושתיים עם גוש מתחת לזה של החלבון תחת חקירה37. והכי חשוב, לוודא גובה הגל ואת מהירות גל זהה אלו שנרשמו עבור החלבון תחת חקירה.
  5. לחשב סמ ק ידנית41 או באמצעות תוכנת מיוחדת הפולסר33 ו אמפיטריטה34 (איור 5).
  6. כדי לבדוק אם החלבון מקורי דמוי הגז-בשלב, CCS ניסיוני השווה ל CCS תיאורטי המתקבל מבנים ברזולוציה גבוהה. עבור הרה-נורא, חישוב תיאורטי CCS באמצעות שיטת הקרנה קירוב (PA) המשמשת MOBCAL42. שיטות אחרות כוללות מסלול שיטה (TM)42 המדויק כדור קשה פיזור (EHS)43.

4. בפתרון שיבוש חלבון מתחמי עבור MS מקורי ו- IM-MS הוביל מכשור לקביעת קשיות ומבנה

הערה: מתחמי משנה חלבון במקרים מסוימים ניתן לזהות מתוך אותו פתרון המתחם ללא פגע. עם זאת, מבניים למידע נוסף כגון קישוריות בין יחידת משנה והרכבה מורכבים בר השגה של שיבוש אינטראקציות חלבון בפתרון, מתחמי משנה צורה. זה יכול להיעשות במספר דרכים כגון התוספת של הממס האורגני, הגדלת כוח יונית או תפעול ה-pH. כדי לזכות בתובנה הרה-נורא מורכבת יחידה משנית קישוריות והרכבה מורכבים, מתחמי משנה נוצרו בפתרון על-ידי הוספת ממיסים אשר perturb אינטראקציות יחידה משנית.

  1. להכין חלבון לדוגמה ומאגר ההחלפה לתוך אמוניום אצטט כפי שמתואר בשלב1.
  2. להוסיף 10-40% של הממס בדרגות של 10%. ממיסים משמש בדרך כלל הם מתנול (MeOH), דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או acetonitrile (לחצן מצוקה).
    הערה: זה ניתן לבצע בתוך צינור פוליפרופילן microcentrifuge.
  3. דגירה התערובת בקירור לשעה.
  4. רוכשים של ספקטרום IM-MS עבור כל תנאי (שלבים 2 ו- 3) (איור 4).
  5. השתמש פסגה תוכנה44 כדי להקצות מתחמי משנה חלבון ולהפיק רשתות אינטראקציית חלבון. לחלופין, באופן ידני להפיק רשימה של ההמונים תיאורטי של המין הצפוי.
  6. כדי להבטיח subcomplexes מקופלים, לחשב את ערכי CCS ניסיוני עבור מתחמי משנה, להשוות CCS תיאורטי, כמוסבר בשלב 3 (טבלה 1, איור 5 ו- 6 איור).

5. חוקרים חלבונים מורכבים יציבות באמצעות התנגשות המושרה התגלגלות (ciu לקדם)

הערה: ciu לקדם יכול לשמש בדיקה ביציבות הקונסטרוקטיבית של חלבונים ו שלהם תסביכים על איגוד ליגנד. מומחה חבילות תוכנה כגון הפולסר33, אמפיטריטה34 ו ciu לקדם סוויטה9 ואז ניתן ליצור מודל גז-שלב התפתחות של החלבון תחת חקירה עם ובלי ליגנד. לדוגמה, סעיף זה מתאר הליך לניטור גזים-פאזי התגלגלות מסלולים, חוקר את השפעת ייצוב איגוד ה-DNA ו- ATP על המתחם הרה-נורא.

  1. נתוני IM-MS הרשומה תוך הגדלת המתח האצת מלכודת מ 10 V ל-200 V במרווחים של 2-10 V להתגלות למחמיר החלבון בשלב-הגז.
    הערה: הקלטת תוצאות במרווחים קטנים יותר בקבצי נתונים נוספים כדי לעבד, אולם לגישה זו נפתרה יותר ונמסר ברצף, אשר חשוב לנתח את נקודות המעבר בין המינים מקופל/פרש.
  2. לנתח את הנתונים רכשה באמצעות הפולסר33, אמפיטריטה34 או ciu לקדם סוויטה9 ולהפיק דו מימדי חלקות התגלגלות ביחידות של CCS כפונקציה של האצת מתח (שלב 3). לכל מדינה תשלום, זה נוצר על ידי לערום את עוצמת-מנורמל CCS הפצות במתח כל מאיץ (איור 7 א-Bi).
  3. צור ונמסר תיאורטי באמצעות אחת של חבילות תוכנה. הנתונים להיות מותאם מודל התגלגלות. הדבר מאפשר לכמת את האנרגיה collisional שבו המעברים ייפתחו להתרחש ולקבוע את היציבות של חלבונים עם ובלי ליגנדים מאוגד33. המעבר התגלגלות הוא כאשר מעברים מינים ממצב אחד (מבוסס על ערכיהם CCS ניסיוני) למדינה אחרת עם CCS גדול יותר.
  4. כדי quantitate המעברים, לחשב את midpoint(s) המעבר בין מדינות באמצעות אלגוריתמים ותוכנה כגון הפולסר33. זה נפוץ המדווח CV50, אשר הערך מתח התנגשות (השמנה) שבה תיגמר 50% של מדינה ספציפית.
  5. באמצעות הערך50 קורות חיים, לחשב את האנרגיה פנימי הכולל של יון באמצעות אנרגיה (KECOM) את מרכז-של-המונית התנגשות45. קהCOM מוגדרת על-ידי אנרגיה פנימית הכולל הזמינות עבור המעבר התגלגלות של יון ו מחושבת אנרגיה קינטית, גושים של השותפים התנגשות (חלבון יון וגז נייטרלי) כפי שמתואר משוואה (1)10
    KEcom (eV) = Equation 1 (משוואה 1).
    כאשר Z הוא הטענה יון, MN הוא המסה של הגז נייטרלי והוא זיון המסה של יונים חלבון.
    הערה: זה בגלל ciu לקדם של חלבונים הוא תשלום dependent46, 47. מומלץ לבצע את הניתוח KECOM למצב תשלום אחד או יותר (כל איור 7).

6. מודלינג הליכים דיפרנציאלית סימולציות דינמיקה מולקולרית בשימוש ב'עין MS

הערה: באמצעות מודלים של החלבוניות או קומפלקסים כמו של מבנים קריסטל, MD דיפרנציאלית סימולציות (חלבון מורכב עם ובלי ליגנד) יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של דוגמה ליגנד נוכחות על מבנה החלבון ואת הדינמיקה. סעיף זה מפרט זרימת עבודה וכלים הדרושים עבור דגמי ההליכים הדרושים כדי הגדרת דינמיקה מולקולרית דיפרנציאלית סימולציות.

  1. לזהות את subunits אשר מרכיבות את המתחם (איור 8א, ב שלבים 2 ו- 3). מקור מודלים קיימים של subunits, למשל, קריסטל במבני שהזכרון RCSB (https://www.rcsb.org). UniProt כניסת החלבון מכיל רשימה של יודע לחקר הגבישים/NMR מבנים (http://www.uniprot.org). אם אלה אינם זמינים, ניתן להזין את רצף תיאורטי הפיצוץ כדי לזהות תבניות מתאימים עבור הומולוגיה דוגמנות (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
  2. להרכיב המתחם בטופולוגיית הנכון (איור 8A-ii). ניתן לבצע זאת באמצעות שיטות שונות. Subunits בודדים יכול להיות מצויד לתוך מפות מיקרוסקופ אלקטרונים ניתן למצוא באתר EMDB כדי להרכיב את מתחם שלם (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). ערכת לימוד על השתלבות PDBs EM המפות באמצעות מולקולרית Dynamics גמיש מתאים (MDFF) ניתן למצוא כאן: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.
  3. לזהות אזורים החסרים של המתחם (איור 8א-iii). ביצוע עימוד רצפים מרובים (מס א) בין PDB רצף התיאורטית לזיהוי שאריות אשר עשוי להיות unfitted לתוך מבנים קריסטל או כל מוטציות בירושה ניסויים לחקר הגבישים. למתקן יכול להתבצע באמצעות את webservers כגון T-קפה (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular).
  4. להתחדש שאריות החסר באמצעות הומולוגיה דוגמנות (איור 8א-iv). חסרים שאריות של החלבונים ניתן לבנות באמצעות התוכנית דגמן (https://salilab.org/modeller/). המעצב יכול פלט אנסמבל של דגמי n בתצורות שונות מחדש. דוגמניות טוב יכול להיות מזוהה בהתבסס על הציון שלהם דיסקרטית ממוטב חלבון אנרגיה (סמים). מדריך מקיף מסופק באתר האינטרנט של התוכנה (https://salilab.org/modeller/tutorial/).
  5. ביצוע סימולציות דינמיקה מולקולרית דיפרנציאלית (MD) של החלבונים (איור 8ב') כדי לזהות אזורים של חלבונים אשר מגיבים לשינוי סביבתי מסוים, למשל, המצאות ליגנד. בהדמיות כזה, הפרמטרים התנהגותי סימולציה A (חלבון בלבד) אשר משמש כהפניה, יופחת מ B סימולציה (חלבון + ליגנד). התנודות דיפרנציאלית שורש ממוצע הריבועים (אולי זאבת) מחושב בין סימולציות A ו- B יכול להודיע על אזורים של החלבון אשר להגדיל או להקטין בגמישות באופן תלויות ליגנד.
    1. ביצוע סימולציות MD וניתוח במורד הזרם באמצעות GROMACS (http://www.gromacs.org). ניתן למצוא ערכת לימוד: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. כדי elimate דגם משוא פנים המבנה של המתחם ליגנד מכורך צריך להיווצר קודם. החלבון מועתק אז מזה בלי ליגנד, להניב דגם חלבונים זהים למתחם מאוגד-ליגנד.

Representative Results

תוצאות MS מקורי חשף את המדינה oligomeric, הלחנה ו טופולוגיה של המתחם הרה-נורא (איור 1). כפי אינטראקציות אי-קוולנטיות נשמרים בשלב-הגז, MS מקורית של ATP-γ-S ו- ADP titrations ניסויים קבעו האיגוד נוקלאוטיד pairwise כדי הרה-נורא (איור 2) וזה מגביר הגדלת ריכוז ATP-γ-S היחסית עוצמת hexameric הרה (איור 3). מבני מידע לגבי אינטראקציות יחידה משנית, התקבלו בבית-פתרון הפרעה ואחריו MS יליד והיו גשר עם, בגושים התיאורטיים (איור 4 , טבלה 1).

הערכים CCS ניסיוני של חלבונים ומתחמי שלהם היה נגזר ניסויים IM-MS (איור 5). ערכים אלה הם גז rotationally בממוצע-שלב החישובים חתך הרוחב של הצורה המולקולרית, לתאר את המדינה תלת-ממדי של החלבון. CCS ערכים לעומת מדידות תאורטית מ קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, הסכם טוב יסיק כי הצורה המקורית נשמרים ב- גז-פאזי (טבלה 1). זה מאמת באמצעות ערכים CCS לבניית מודלים ברזולוציה נמוכה של חלבון הרכבה48.

CCSs ניסיוני ניתן לחשב עבור כל יון המדינה תשלום. Conformer חלבון כמו מקורי עלול להביא לחייב את המדינה יונים עם ערכי CCS דומים. עם זאת, יונים המדינה תשלום גבוה יותר גדל repulsions coulombic, דבר שעלול להוביל חלבון גז-פאזי התגלגלות גדול CCS וערכי בהשוואה את CCSs תיאורטיים. הערך מיליגרם של המדינה תשלום הנמוך יונים ולכן הם בדרך כלל בשימוש49. עבור הרה-נורא, ניסויים בפתרון הפרעה על הרה ושל הרה-נורא עם או בלי דנ א תתבקש הדור של מסלול הרכבה החל מונומרים ואז להרכיב את כל hexameric הרה (הרה6)-מתחם נורא (נורא2) dimeric עם ה-DNA (איור 6).

הבדלים בין החלקות התגלגלות ciu לקדם בין ליגנד מאוגד apo (חינם ליגנד) להגדיר את השינוי יציבות מורכבים עם איגוד ליגנד. קורות חיים גבוה50 או KECOM ערך מרמז על יון מיוצב יותר הגז-בשלב. Ciu לקדם וניתוחCOM KE התגלה שהדנ א מכורך הרה-נורא יציב יותר המתחם ללא ה-DNA (איור 7כל). מניתוח ciu לקדם-MS במדינות מחייב ATP, המדינה ארבע-ATP-γ-S המאוגדת יציבות מורכבות מופחתת הגז-השלב, 6 -ATP-γ-S המאוגדת המדינה איפה כל האתרים תפוסים היה הכי יציב (איור 7Bii). יליד MS יכול לחשוף את נוקלאוטיד דיסקרטית איגוד מדינות הרה; עם זאת, זה לא יכול להבחין subunits הרה אשר מחייבות ATP, שם איגוד זה מתקיים. מידע זה יכול להיגזר מפורשת סימולציות MD ממס על hexameric את הרה, את הרה-נורא בעקבות זרימת העבודה summarised (איור 8).

Figure 1
איור 1. חוקר את המדינה oligomeric, הרכב ואת הטופולוגיה של המתחם קשרי ערכיות הרה-נורא. (א) ספקטרה המונית של הרה, הרה-נורא הרה-נורא בנוכחות DNA (15.4 kDa 25 bp כפול גדילי DNA). המתחם תת הרה קיימת של hexamer והן של heptamer. דימר נורא נקשר וכדי hexamer הרה הטלת המרה oligomeric. ה-DNA מאגד המתחם בנוי הרה - נורא (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 201722). (ב) עוצמות יחסי המינים שזוהו מחושבים באמצעות UniDec32. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
באיור 2. ESI-MS מקורי חושף את המנגנון של נוקלאוטיד מחייב הרה-נורא. המוני ספקטרה הרה-נורא (א) ו- (ב) הרה-נורא-DNA עם הגדלת ריכוזי (i) ATP-γ-S ו- (ii) ADP. ההמונים נמדד לעומת בגושים התיאורטיים ואת מידת ATP-γ-S או ADP מאוגד נקבעות. ההמונים נמדד מספר נוקלאוטידים מאוגד מוצגים על הספקטרום. ניסויים titrations ATP-γ-S ו ADP קבעו האיגוד נוקלאוטיד pairwise הרה-נורא לבד, כאשר במתחם עם ה-DNA המציינת את מנגנון התגובה מחזורית (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 201722). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3. מדידת השפעת ריכוז ATP-γ-S על מצב oligomeric הרה. (א) מסת ספקטרום של הרה-הגדלת ריכוזים של ATP-γ-S. (ב) גרף המציג את עוצמות היחסי של מינים שונים של MS יליד מחושב באמצעות תוכנה deconvolution UniDec32. ריכוז ATP-γ-S גודלת, שהבוטות היחסית של hexameric הרה גם מגביר. מספר מולקולות ATP-γ-S מאוגד מוצג על הספקטרום (תוצאות מ Ahdash צ. et al., 201722). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. המוני ספקטרה ומוצרי דיסוציאציה תת מתחם של הרה (א) ו- (ב) הרה-נורא (i) לבד ובפני הבאים (ii) ה-DNA של שיבוש בבית-פתרון. הפרעה בפתרון הניסויים בוצעו באמצעות 10-40% של Acetonitrile, מתנול (MeOH) או דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) וכתוצאה היווצרות של subcomplexes שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5. יון ניידות ההגעה זמן הפצות שמוצג על ציר CCS מתחמי ואת מתחמי משנה שנוצר. סמל עבור כל תת מתחם לתאם עם אלה מוערת על הספקטרום באיור4. ההמונים ניסיוני ומחושב וערכים מיליגרם של מתחמי משנה מפורטים בטבלה 1 אשר הראה הסכם בין ערכים ניסיוני ומחושב (לאחר ששקל הוודאות טיפוסי בהחלטה מטיילים גל יון ניידות ספקטרומטר מסה של ±5 - 8%37). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6. מסלול הרכבה של המתחם הרה-נורא שנוצר מהפרעות בבית-פתרון מקורי עיגולים MS ו- IM-גב' צבעוניים לציין תנאי שבו נצפתה בכל מתחם תת: מקורי (ירוק, לפני כדי הפרעה), מתנול (צהוב), דימתיל סולפוקסיד (סגול) או Acetonitrile (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7. חוקרים את השפעת ייצוב (א) ה-DNA על הרה-נורא ו- ATP (ב) מחייב הרה-נורא-DNA. (i) גז-שלב ciu לקדם-MS חלקות וחישוב אנרגיות (KEcom) (ii) מרכז-של-המונית התנגשות מראים כי הנוכחות של dsDNA מייצבת את מתחם הרה-נורא, ש ATP-γ-S שישה מאוגד המדינה ויש היציב ביותר. מייצב עבור תשלום שונה הברית מוצג. מגרשים נוצרו באמצעות הפולסר 33. תוצאות (א) מ Ahdash צ. et al., 201722. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8. זרימת עבודה עבור נהלי דינמיקה מולקולרית דיפרנציאלית סימולציות הדוגמנות. (א) יצירת הקומפלקס תחת חקירה על ידי בניית הטופולוגיה מן הקיים subunits ובנייה מחדש של שאריות חסרים. (ב) זרימת עבודה עבור הפעלת דינמיקה מולקולרית סימולציות על החלבונים עם ובלי ליגנד. דינמיקה מולקולרית ההדמיות רץ החלבון רק אילו מעשים כהפניה, אשר הוא המופחת סימולציה של חלבון בתוספת ליגנד. זה מלווה חישוב התנודות דיפרנציאלית שורש ממוצע הריבועים (אולי זאבת) בין ההדמיות וקביעת ההשפעה של ליגנד מחייב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מורכבות / תת מורכבים תאורטית מסה (kDa) ניסיוני מסה (kDa) CCS תיאורטי (Å2) CCS ניסיוני (Å2) [תשלום] תנאי, HN
הרה6- נורא2 416.22 417.85 14531 14577 [42 +]
14599 [43 +]
14608 [44 +]
14637 [45 +]		 10-20% לחצן מצוקה, דימתיל סולפוקסיד 10-40%, 10% MeOH
הרה6- נורא2- dsDNA... 431.72 432.27 - 14661 [39 +]
14728 [40 +]
14781 [41 +]
14837 [42 +]		 לחצן מצוקה 10%, 10% MeOH
נורא1 39.12 38.18 3254 2618 [10 +]
2746 [11 +]
2878 [12 +]		 10-40% לחצן מצוקה, 10% MeOH, 20-40% דימתיל סולפוקסיד
נורא2 78.24 78.36 4890 4903 [16 +]
4614 [17 +]
4537 [18 +]
4666 [19 +]		 10-40% MeOH, 20-40% דימתיל סולפוקסיד
הרה1 56.33 56.32 4131 3647 [14 +]
3792 [15 +]
3950 [16 +]		 לחצן מצוקה 10-40%, 40% דימתיל סולפוקסיד
הרה2 112.66 112.95 6475 5648 [20 +]
5747 [21 +]
5842 [22 +]
5996 [23 +]		 40% מתאמפטמין, לחצן מצוקה 10-40%
הרה3 168.99 169.39 8607 7501 [25 +]
7616 [26 +]
7717 [27 +]
7867 [28 +]		 10-40% MeOH, פח 10-40%, 40% דימתיל סולפוקסיד
הרה3 + DNA 183.99 184.976 - 7655 [26 +]
7990 [27 +]
8107 [28 +]		 לחצן מצוקה 10-30%
הרה4 225.32 226.2 10477 9205 [30 +]
9287 [31]
9493 [32 +]
9961 [33 +]		 10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%
הרה4 + DNA 240.82 241.33 - 9637 [31 +]
9756 [32 +]
9830 [33 +]		 לחצן מצוקה 10-30%
הרה5 281.65 282.75 11853 10847 [36 +]
10958 [37 +]
11161 [38 +]		 לחצן מצוקה 30-40%
הרה6 337.98 339.3 12517 12335 [38 +]
12386 [39 +]
12498 [40 +]
12590 [41 +]
12676 [42 +]
13019 [43 +]		 10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%
הרה6 + DNA 353.48 354.626 - 12890 [40 +]
13081 [41 +]
13184 [42 +]
13273 [43 +]
13463 [44 +]
13576 [45 +]		 לחצן מצוקה 30%
הרה7 394.3 395.85 13901 14154 [42 +]
14219 [43 +]
14261 [44 +]
14285 [45 +]
14335 [46 +]		 10-40% MeOH, לחצן מצוקה 10-40%, 10-40% דימתיל סולפוקסיד
הרה7 + DNA 409.8 410.62 - 14414 [41 +]
14510 [42 +]
14558 [43 +]
14598 [44 +]
14630 [45 +]
14641 [46 +]		 לחצן מצוקה 10%

טבלה 1- ההמונים ניסיוני ומחושב וערכים מיליגרם של הרה-נורא, מתחמי משנה שלה שנוצר טופס בפתרון הפרעה מחקרים.

Discussion

MS משחק תפקיד חשוב יותר ויותר באפיון סטויכיומטריה, אינטראקציות ואדריכלות יחידת משנה של מתחמי חלבון. IM-MS נתונים יכול לשמש להגדרת סידורים טופולוגי של subunits בתוך מתחמי. MS, לעומת שיטות אחרות-ביולוגיה מבנית קיים, יש מספר יתרונות. MS מקורית היא טכניקה מהירה, רגישה מאוד והוא יכול לשמש כדי לחקור דגימות חלבון הטרוגנית. כאשר משולב עם הפרעה בפתרון ניסויים, ניתן לנטר דיסוציאציה מסלולים של חלבון הרכבות. יחד עם מבנים קריסטל או מודלים הומולוגיה, המידע המוצעים על ידי MS מבניים מציע כלי עבור חוקרים אינטראקציות חלבון-ליגנד ומספקים הרכבה מסלולים11ומודלים קרובה לשפת אם.

כאן, אנו מתארים נהלי ניסיוני הצורך לנתח את סטויכיומטריה והרכב של אינטראקציות חלבון-ליגנד, עם ליגנדים אחד או יותר, באמצעות MS אינטגרטיבית. זה כולל הכנת הדוגמא MS, חדרי קירור והקפאה, ניתוח נתונים, השילוב של נתונים MS באמצעות כלים חישוביים. כדי לעשות זאת, השתמשנו החלבון הטרו-oligomeric DNA-כריתה הרה-נורא מורכבת, מאוגדים ליגנדים שלוש (דנ א, ATP ו ADP), כמערכת מודל שלנו. הפרוטוקול מראה את השימוש בתוכנה זמין כעת כדי לסייע לניתוח נתונים והצגה.

רכישת ספקטרה באיכות גבוהה חשוב לניתוח איגוד ליגנד, לכן, צעדים הכנה מדגם זהיר הם קריטיים, כולל טיהור חלבון, ליגנד טיטור מאגר exchange. מגבלה אחת של נאסי MS יליד כשלמדתי ליגנד מחייב הוא מחייב שאינם ספציפיים. איגוד שאינו ספציפי מתרחשת במהלך droplet desolvation לאורך כל התהליך ספקטרומטריית electrospray. זה מגביר ריכוז ליגנד ומשנה ולכן יחס חלבון/ליגנד29. הכריכה של נוקלאוטידים יוצרת הבדל מסה קטנה יחסית בין אפו נוקלאוטיד מכורך חלבון אשר אינו משנה את יעילות יינון50,51.

השתמשנו במערכת Synapt G2-סי MS עבור העבודה שלנו, אבל הפרוטוקולים הינם ישימים עבור חקירות שונים של מתחמי חלבון-ליגנד אחרים באמצעות ספקטרומטרים המונים אחרים זמינים מסחרית ננו-ספקטרומטריית electrospray. MS מבניים אינטגרטיבית יותר ויותר משחק תפקיד חשוב בטיפול בעיות ביולוגיות מורכבות גדולה יותר. זרימת העבודה והטכניקות המתוארים כאן הם מתאים היטב להבנת ההשלכות מבנית, בניית מנגנונים של חלבונים מורכבים, היווצרות חלבון-ליגנד אשר אחרת קשה ללמוד באמצעות טכניקות מבניים קונבנציונלי .

Disclosures

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

ברצוננו להודות. פיטר קארל Hopfner, רוברט תומאס ביירן בחביבות לספק הרה הרה-נורא חלבון דגימות, על עזרתם עם עיצוב ניסיוני. אנו מודים גם ד ר איימון הקריאה שלו לבדיקה של כתב היד. אנו בתודה להכיר את גופנו מימון: טרסט [109854/Z 15 Z] והחברה המלכותית [RG150216 על אקולוגיה].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5′-(3-thiotriphosphate) tetralithium salt Merck Millipore 119120-25MG
Adenosine 5′-diphosphate  Sigma-Aldrich 20398-34-9
Ammonium acetate solution Sigma-Aldrich A2706
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad 7326204
Vivaspin concentrator Sartorius Z614041-25EA
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 246964
Water TraceSelect Sigma-Aldrich 95305
Borosilicate Capillaries Harvard Apparatus 300060

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilm, M., Mann, M. Analytical Properties of the Nanoelectrospray Ion Source. Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).
  2. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecule. Science. 246 (4926), 64-71 (1989).
  3. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (3), 715-726 (2007).
  4. Heck, A. J., Van Den Heuvel, R. H. Investigation of intact protein complexes by mass spectrometry. Mass Spectrom Review. 23 (5), 368-389 (2004).
  5. Boeri Erba, E., Petosa, C. The emerging role of native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes. Protein Science. 24 (8), 1176-1192 (2015).
  6. Laganowsky, A., Reading, E., Hopper, J. T. S., Robinson, C. V. Mass spectrometry of intact membrane protein complexes. Nature. 8 (4), 639-651 (2013).
  7. Benesch, J. L. Collisional activation of protein complexes: picking up the pieces. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (3), 341-348 (2009).
  8. Tian, Y., Han, L., Buckner, A. C., Ruotolo, B. T. Collision Induced Unfolding of Intact Antibodies: Rapid Characterization of Disulfide Bonding Patterns, Glycosylation, and Structures. Analytical Chemistry. 87 (22), 11509-11515 (2015).
  9. Eschweiler, J. D., Rabuck-Gibbons, J. N., Tian, Y., Ruotolo, B. T. CIUSuite: A Quantitative Analysis Package for Collision Induced Unfolding Measurements of Gas-Phase Protein Ions. Analytical Chemistry. 87 (22), 11516-11522 (2015).
  10. Hopper, J. T., Oldham, N. J. Collision induced unfolding of protein ions in the gas phase studied by ion mobility-mass spectrometry: the effect of ligand binding on conformational stability. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (10), 1851-1858 (2009).
  11. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chemical Biology. 22 (1), 117-128 (2015).
  12. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Reports. 11 (5), 759-769 (2015).
  13. Lai, Y. T., et al. Structure of a designed protein cage that self-assembles into a highly porous cube. Nature Chemistry. 6 (12), 1065-1071 (2014).
  14. Levy, E. D., Boeri Erba, E., Robinson, C. V., Teichmann, S. A. Assembly reflects evolution of protein complexes. Nature. 453 (7199), 1262-1265 (2008).
  15. Sharon, M., et al. Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality. Structure. 17 (1), 31-40 (2009).
  16. Jurneczko, E., Barran, P. E. How useful is ion mobility mass spectrometry for structural biology? The relationship between protein crystal structures and their collision cross sections in the gas phase. Analyst. 136 (1), 20-28 (2011).
  17. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. Journal of Proteomics. 175, 34-41 (2017).
  18. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  19. Barrera, N. P., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles Protect Membrane Complexes from Solution to Vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  20. Konijnenberg, A., et al. Global structural changes of an ion channel during its gating are followed by ion mobility mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17170-17175 (2014).
  21. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Scientific Reports. 7, 44068 (2017).
  22. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Research. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  23. Pagel, K., Natan, E., Hall, Z., Fersht, A. R., Robinson, C. V. Intrinsically disordered p53 and its complexes populate compact conformations in the gas phase. Angewandte Chemie. 52 (1), 361-365 (2013).
  24. Afonso, J. P., et al. Insights into the structure and assembly of the Bacillus subtilis clamp-loader complex and its interaction with the replicative helicase. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5115-5126 (2013).
  25. van Duijn, E. Current limitations in native mass spectrometry based structural biology. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (6), 971-978 (2010).
  26. Susa, A. C., Xia, Z., Williams, E. R. Native Mass Spectrometry from Common Buffers with Salts That Mimic the Extracellular Environment. Angewandte Chemie. 56 (27), 7912-7915 (2017).
  27. Breukera, K., McLafferty, F. W. Stepwise evolution of protein native structure with electrospray into the gas phase, 10 to 10 s. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18145-18152 (2008).
  28. Robinson, C. V., et al. Probing the Nature of Noncovalent Interactions by Mass Spectrometry. A Study of Protein-CoA Ligand Binding and Assembly. Journal of the American Chemical Society. 118 (36), 8646-8653 (1996).
  29. Shimon, L., Sharon, M., Horovitz, A. A method for removing effects of nonspecific binding on the distribution of binding stoichiometries: application to mass spectroscopy data. Biophysical Journal. 99 (5), 1645-1649 (2010).
  30. Dyachenko, A., Gruber, R., Shimon, L., Horovitz, A., Sharon, M. Allosteric mechanisms can be distinguished using structural mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7235-7239 (2013).
  31. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. 19 (40), (2010).
  32. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Analytical Chemistry. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  33. Allison, T. M., et al. Quantifying the stabilizing effects of protein-ligand interactions in the gas phase. Nature Communications. 6, 8551-8561 (2015).
  34. Sivalingam, G. N., Yan, J., Sahota, H., Thalassinos, K. Amphitrite: A program for processing travelling wave ion mobility mass spectrometry data. International Journal of Mass Spectrometry. 345-347, 54-62 (2013).
  35. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Analytical Chemistry. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  36. Bush, M. F., et al. Collision Cross Sections of Proteins and Their Complexes: A Calibration Framework and Database for Gas-Phase Structural Biology. Analytical Chemistry. 82, 9557-9565 (2010).
  37. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L., Sandercock, A. M., Hyung, S. J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  38. Lanucara, F., Holman, S. W., Gray, C. J., Eyers, C. E. The power of ion mobility-mass spectrometry for structural characterization and the study of conformational dynamics. Nature Chemistry. 6 (4), 281-294 (2014).
  39. Wyttenbach, T., Bowers, M. T. Structural stability from solution to the gas phase: native solution structure of ubiquitin survives analysis in a solvent-free ion mobility-mass spectrometry environment. Journal of Physical Chemistry B. 115 (42), 12266-12275 (2011).
  40. Marcoux, J., Robinson, C. V. Twenty years of gas phase structural biology. Structure. 21 (9), 1541-1550 (2013).
  41. Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  42. Mesleh, M. F., Hunter, J. M., Shvartsburg, A. A., Schatz, G. C., Jarrold, M. F. Structural Information from Ion Mobility Measurements: Effects of the Long-Range Potential. Journal of Physical Chemistry A. 100, 16082-16086 (1996).
  43. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chemical Physics Letters. 261, 86-91 (1996).
  44. Taverner, T., Hernández, H., Sharon, M., Ruotolo, B. T., Matak-Vinković, D., Devos, D., Russell, R. B., Robinson, C. V. Subunit Architecture of Intact Protein Complexes from Mass Spectrometry and Homology Modeling. Accounts of Chemical Research. 41 (5), 617-627 (2008).
  45. Wysocki, V. H., Joyce, K. E., Jones, C. M., Beardsley, R. L. Surface-induced dissociation of small molecules, peptides, and non-covalent protein complexes. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (2), 190-208 (2008).
  46. Hall, Z., Politis, A., Bush, M. F., Smith, L. J., Robinson, C. V. Charge-state dependent compaction and dissociation of protein complexes: insights from ion mobility and molecular dynamics. Journal of the American Chemical Society. 134 (7), 3429-3438 (2012).
  47. Hyung, S. J., Robinsons, C. V., Ruotolo, B. T. Gas-Phase Unfolding and Disassembly Reveals Stability Differences in Ligand-Bound Multiprotein Complexes. Chemistry & Biology. 16, 382-390 (2009).
  48. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  49. Woods, L. A., Radford, S. E., Ashcroft, A. E. Advances in ion mobility spectrometry-mass spectrometry reveal key insights into amyloid assembly. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1257-1268 (2013).
  50. Daubenfeld, T., Bouin, A. P., van der Rest, G. A deconvolution method for the separation of specific versus nonspecific interactions in noncovalent protein-ligand complexes analyzed by ESI-FT-ICR mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 17 (9), 1239-1248 (2006).
  51. Loo, J. A. Studying noncovalent protein complexes by electrospray ionization mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 16, 1-23 (1997).

Tags

כימיה בעיה 140 כחלק ספקטרומטריית (MS) יליד MS יון-ניידות מתחמי חלבון אינטראקציות אי-קוולנטיות נוקלאוטיד איגוד איגוד ה-DNA דינמיקה מולקולרית דוגמנות.
ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahdash, Z., Lau, A. M., Martens, C., … More

Ahdash, Z., Lau, A. M., Martens, C., Politis, A. Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e57966, doi:10.3791/57966 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter