Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Laktat Dehydrogenase Sequestration Assay — En simpel og pålidelig metode til at bestemme Bulk Autophagic beslaglæggelse aktivitet i pattedyrceller

doi: 10.3791/57971 Published: July 27, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Her beskrives et simpelt og godt valideret protokol til måling af bulk autophagic beslaglæggelse aktivitet i pattedyrsceller. Metoden er baseret på kvantificere andelen af laktat dehydrogenase (LDH) i sedimentable celle fraktioner i forhold til samlede cellulære LDH niveauer.

Abstract

Bulk autophagy er karakteriseret ved binding af store dele af cytoplasma i dobbelt/multi-membrane strukturer kaldes autophagosomes. Her beskrives en simpel protokol til at overvåge denne proces. Desuden tilbydes typiske resultater og eksperimenterende validering af metoden på autophagy-inducerende betingelser i forskellige typer af kulturperler pattedyrsceller. Under bulk autophagy udskille autophagosomes cytosol, og dermed også opløselige cytosole proteiner, sammen med andre autophagic last. LDH er en stabil og meget rigelige, opløselige cytosole enzym, der er ikke selektivt afsondret i autophagosomes. Mængden af LDH sequestration derfor afspejler mængden af bulk autophagic binding. For at bestemme LDH binding i celler, effektivt og præcist, ansætter vi en electrodisruption-baseret fraktionering protokol, der effektivt adskiller sedimentable fra cytosole LDH, efterfulgt af måling af enzymatisk aktivitet i sedimentable brøker versus hele-celle prøver. Autophagic binding bestemmes ved at fratrække del af sedimentable LDH i ubehandlet celler fra at i behandlede celler. Fordelen ved LDH sequestration assay er at det giver en kvantitativ måling af den autophagic binding af endogene last, i modsætning til andre metoder, enten indebærer Ektopisk udtryk for binding sonder eller semi-kvantitative protease beskyttelse analyser af autophagy markører eller receptorer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Autophagy (græsk for "selv spise") er en evolutionær bevarede proces for vakuolære/lysosomale nedbrydning af intracellulære materiale. Efter opdagelsen af autophagy-relaterede ("ATG") gener, som er vigtige for autophagy gær og mennesker, og erkendelsen af at autophagy spiller en væsentlig rolle i menneskers sundhed og sygdom (anerkendt af Nobelprisen i medicin eller fysiologi til i 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagy er hurtigt blevet en af de mest intenst undersøgt processer i celle biologi1,2.

Macroautophagy (i det følgende benævnt "autophagy") er præget af ekspansion og foldning af intracellulære membran cisternae ("phagophores") i hermetisk lukkede og dobbelt eller multi membrane strukturer ("autophagosomes"), der effektivt udskille den enwrapped materiale fra resten af cytoplasma. Ved fusion af autophagosomes med lysosomer, er indre autophagosomal membran og afsondret lasten nedbrudt og genanvendt. Autophagosomes kan udskille cytoplasmatisk materiale i både tilfældige (non-selektive autophagy) og selektiv (selektiv autophagy) manerer. Bulk autophagy sandsynligvis repræsenterer en blanding af non-selektive og selektive autophagy.

I 1960-erne og 70 's ("morfologiske æra" autophagy forskning), blev autophagic binding primært vurderet gennem ultrastrukturelle analyser. I 1980-erne og begyndelsen af 1990 ("den biokemiske æra") pr. Seglen og kollegaer – der studerede autophagy i primære rotte hepatocytter — udviklet de første metoder til at måle kvantitativt autophagic beslaglæggelse aktivitet3. Bruger disse assays, Seglen defineret og karakteriseret forskellige trin af autophagic-lysosomale vejen4,5, opdaget, opfundet amphisome6 (product af endosome-autophagosome fusion) og var først til at beskrive rollen af protein fosforylering i autophagy regel7. Men efter opdagelsen af ATGs i 1990erne ("den molekylære æra") og den første karakterisering af et protein af pattedyr ATG8, mikrotubulus-forbundet protein 1A/1B-lys kæde 3 (LC3) i 20008, brug af ATG proteiner som markører for den autophagic proces hurtigt vundet popularitet, og de ældre og mere besværlig biokemiske metoder blev efterladt. I virkeligheden, i de sidste 18 år, vestlige skamplet og Fluorescens mikroskopi analyser af LC3 er blevet den langt mest populære (og i mange tilfælde den eneste) måde at studere autophagy i pattedyrceller. Fordelen er den relative lethed, hvormed disse metoder kan gennemføres. Ulempen er, at man studerer en vogn komponent (LC3) i stedet for faktiske autophagic last. Dette er en temmelig alvorlig ulempe, fordi forholdet mellem de stater og/eller flux af LC3 gennem vej versus binding og flux af lasten er meget uklart. Faktisk har vi vist, bulk last flux kan bevares på et højt niveau under forhold hvor der ikke er nogen LC3 flux, trods tilstedeværelsen af konjugeret LC3 i celler9. Vi viste desuden, at bulk autophagy er upåvirket af effektiv LC3 udtynding, og sandsynligvis er således LC3-uafhængig9. Denne konstatering er senere blevet bekræftet af LC3 knock-out undersøgelser10,11, som også viser, Parkin-afhængige mitophagy (den selektive autophagy af mitochondrier) er uafhængig af LC310,11 .

I sammendrag, der er et klart behov for fragt-baserede assays til at overvåge autophagic aktivitet. Optimalt bør sådanne assays være bredt gældende, velafgrænset og let at udføre. I de sidste par år har vi taget en særlig interesse i LDH sequestration assay, som blev udviklet af Per Seglen i 1980 's12, og er baseret på måling af overførsel af cytosole LDH til sedimentable, autophagic vakuole-holdige celle fraktioner. LDH er en stabil, opløselige cytosole protein, der er let Co afsondret når phagophores enwrap cytoplasmatisk last. Binding af LDH er derfor en generel foranstaltning af autophagic binding. LDH er udelukkende nedbrudt af autophagic-lysosomale vej12. Således, i overværelse af lysosomale nedbrydning hæmmere, fx, bafilomycin A1 (Baf)13, eksperimentel behandling effekter direkte afspejler ændringer i autophagic forvaring aktivitet. I mangel af nedbrydning hæmmere, kan nettoeffekten af ændringer i LDH binding og nedbrydning måles.

LDH sequestration assay er generelt gældende, da LDH er stærkt og allestedsnærværende udtrykt i alle celletyper, og LDH niveauer kan kvantificeres præcist ved en enzymatisk assay14,15. Men oprindelige protokol12 — etableret i primære rotte hepatocytter — var temmelig tidskrævende og krævede en stor mængde af starter materiale samt en custom-made elektrisk udladning kondensator. I en trinvis måde, har vi gradvist omdannet analysen til en nem og alsidig metode. Først, den originale protokol blev tilpasset til brug i pattedyr celle linjer16. For det andet var metoden væsentligt nedskaleret3,9. Tredje, flere trin i protokollen blev elimineret, herunder en møjsommelig tæthed pude trin17. Dette aktiveret samtidigt en yderligere nedskalering af metoden, fra det oprindelige startpunkt for at bruge en 10 cm plade pr. sample16 til ved hjælp af et enkelt godt fra en 12-godt plade pr. sample (dvs.ca 15-fold mindre starter materiale)17. For det fjerde, vi identificeret en kommerciel elektroporation apparat, der kunne erstatte de skræddersyede elektriske udladning kondensator17.

Her præsenteres vores nyeste protokol af LDH sequestration assay, som omfatter nogle yderligere forenklinger af metoden i forhold til den tidligere udgivne17 . Desuden et sæt af typiske resultater opnået i en række forskellige celletyper er vist, og vigtigere, flere linjer af eksperimentelle valideringer af metoden ved hjælp af farmakologiske samt genetiske knockdown og knockout tilgange leveres. For en overordnet flow ordning af den hele protokol, se figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. celle såning og behandling

  1. Kultur vedhængende celler i 75 cm2 vævskultur flasker i en fugtig kuvøse med 5% CO2 ved 37 ° C, ved hjælp af foretrukne næringssubstratet for den pågældende celle. Tillad cellerne til at vokse, indtil de når en nær sammenflydende cellelag.
    Bemærk: Brug RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) for LNCaP, HEK293, mus embryonale fibroblaster (MEFs), BJ, MCF-7 og RPE-1 celler.
    1. Cellerne vaskes med 3 mL 37 ° C fosfatbufferet saltopløsning (PBS), pH 7,4. Erstatte PBS med 3 mL 0,25% (w/v) Trypsin-ethylendiamintetraacetat (EDTA), og Inkuber i kolben i et befugtet kuvøse med 5% CO2 ved 37 ° C, indtil cellerne frigøre (2-5 min).
    2. Resuspend de fritliggende celler med 7 mL næringssubstratet indeholdende 10% FBS. Bland en 10 µL celle suspension alikvot med 10 µL 0,4% Trypan blå i et microcentrifuge rør, ved hjælp af en 0,5 – 20 µL pipette tip. Bruge samme pipette spidsen umiddelbart udfylde en optælling kammer dias, og tælle cellerne i en automatiseret celle counter.
  2. Forberede en passende fortynding (se note nedenfor) af cellesuspension fra trin 1.1.2 bruger kultur medium indeholdende 10% FBS, og frø 1 mL af den fortyndet cellesuspension i hvert hul i en 12-godt vævskultur plade (areal ~3.8 cm2) ved hjælp af aseptisk teknik. Tillad vækst i en fugtig kuvøse med 5% CO2 ved 37 ° C, indtil den ønskede celle tæthed er nået, fx 60 – 90% sammenløbet ved høst.
    Bemærk: Den passende fortynding af cellesuspension, der vil give den ønskede celle confluency på høst vil variere fra celletype, celletype, samt varighed og typen af eksperimentelle behandlinger. Således, dette skal empirisk vurderes i hvert enkelt tilfælde.
    1. For eksperimenter, der skal være både behandlet og høstet 2 dage efter såning, frø 2,5 x 105 LNCaP, HEK293, eller MCF-7 celler, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ eller 1.5 x 105 ÅV-1 celler i hvert hul i den 12-godt plade.
    2. For celler, der overholder løst, pels pladerne med typen af belægning anbefales for den pågældende celle. LNCaP (og HEK293) bruge celler plader overtrukket med poly-D-lysin (PDL).
    3. Med henblik herpå, tilsættes 500 µL PDL på 2,5 µg/mL i sterilt H2O til hver brønd og Inkuber plader i et sterilt miljø i 30 min. ved stuetemperatur (20-25 ° C). Fjerne PDL med suge, og vaskes hver godt kort med 1 mL sterilt H2O.
      Bemærk: Generelt, trin 1.2.1 er gjort uden nogen eksperimentelle behandlinger. Dog hvis udfører RNAi, kan det være praktisk at starte et omvendt Transfektion med seeding9.
  3. Udføre eksperimentelle behandlinger i dobbelt eller tredobbelt wells pr. betingelse.
    1. For eksempel, behandling af celler med 50 nM af mTOR-hæmmer Torin1, der generelt er en effektiv inducer af autophagic binding, eller underkaste cellerne akut serum- og aminosyre sult ved at vaske cellerne med 1 mL af aminosyre-fri Earle er afbalanceret Salt løsning (EBSS) medium, og efterfølgende Inkuber celler i 1 mL EBSS i en fugtig kuvøse med 5% CO2 ved 37 ° C.
    2. Efterlad et sæt brønde ubehandlet for at definere baggrundsværdier for sedimentable LDH.
    3. Tilføje en mætte mængde efter binding hæmmer bafilomycin A1 (Baf)3,13,16,18 i fravær eller tilstedeværelse af de eksperimentelle behandlinger, 3-4 timer før celle høst. Inkuber celler i en fugtig kuvøse med 5% CO2 ved 37 ° C.
      1. Brug 100 nM Baf LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 og RPE-1 celler, og 10 nM Baf for MEFs.
      2. For eksperimentelle behandlinger, der har en varighed på kun 3 – 4 h (som disse eksemplificeret i trin 1.3.1 har typisk), tilføje Baf samtidig med behandlingerne. For længere eksperimentelle behandlinger, vente 3-4 timer før høst og tilføje 2 µL af en 500 x koncentreret Baf stock direkte i mediet.
      3. Mix af agiterer pladen umiddelbart efter tilsætning af Baf. Det er på dette tidspunkt også anbefalelsesværdigt at tilføje macroautophagic binding hæmmere som kontrol, fx 10 mM af pan-phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-hæmmer 3-methyl adenin (3MA)19, eller 10 µM af selektiv PI3K klasse III hæmmer SAR-40520.

2. celle høst og forberedelse til Electrodisruption

  1. For enden af behandlingsperioden Aspirér medium med suge og tilføje 200 µL celle detachement løsning (forvarmet til 37 ° C) til hver brønd. Der inkuberes ved 37 ° C, indtil cellerne frigøre (typisk omkring 5 min).
    Bemærk: 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA kan anvendes i stedet for celle detachement løsning, sidstnævnte indeholder DNase, som hjælper med at reducere viskositeten af de fritliggende celler. Så længe mediet er grundigt indsugning, er det ikke nødvendigt at vaske cellerne før tilsætning af Trypsin-EDTA eller celle detachement løsning.
  2. Tilføje 500 µL stuetemperatur (20-25 ° C) PBS, pH 7,4, der indeholder 2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) til hvert hul, og pelleten med en pipette, indtil ingen celle klumper er synlige. Straks overføre cellesuspension til 1,5 mL microcentrifuge rør på is.
    Bemærk: Medmindre andet er angivet, udføre alle efterfølgende trin på is.
  3. Sediment celler ved centrifugering ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C.
  4. Grundigt Aspirér supernatanten (med suge) for at forlade cellen pellets så tør som muligt.
  5. Tilføj 400 µL 10% (w/v) saccharose (i ultrarent H2O) til hver tube.

3. Plasma membran Electrodisruption og adskillelse af Sedimentable og Total celle fraktioner

  1. Resuspenderes celle med en pipette til at opnå en i nærheden af encellede suspension, og overføre det til en 4 mm elektroporation kuvette.
    Bemærk: Pipettering up-and-down ~ 10-15 gange, ved hjælp af en 100-1.000 µL pipette tip, er normalt tilstrækkeligt.
  2. Placere kuvette i en eksponentiel henfald bølge electroporator, og varetage en enkelt elektrisk puls på 800 V, 25 µF, og 400 Ω; disse indstillinger producere en puls af ~ 8 ms varighed.
  3. Brug en ny pipette tip til at overføre celle disruptate til en 1,5 mL microcentrifuge tube indeholder 400 µL iskold fosfatbufferet saccharose løsning (100 mM natrium monophosphate, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA og 1,75% saccharose, pH 7,5), og bland kortvarigt ved pipettering.
    1. Valgfrit: Hvis du vil kontrollere effektivt plasma membran electrodisruption17, mix 10 µL af de fortyndede celle disruptate fra trin 3.3 med 10 µL 0,4% Trypan blå i 1,5 mL microcentrifuge rør. Overførsel til en optælling kammer og kontrollere, at procentdelen af Trypan blå positive celler > 99%.
      1. Lad prøven i tælle salen i 30 min. ved stuetemperatur (20-25 ° C), og kontroller, at procentdelen af Trypan blå positive celler er forblevet > 99%.
    2. Valgfrit: For at kontrollere, at electrodisruption ikke er for barsk, det vil sige, det har ikke afbrudt intracellulære organeller, udføre trin 1.1 – 3.3 som beskrevet ovenfor, men bruger en større råvare (et godt fra en 6-godt plade med en ~ 80% sammenflydende cellelag), og bruge 150 µL 10% saccharose i trin 2,5 og 150 µL fosfatbufferet saccharose løsning uden DTT i trin 3.3.
      1. Bruge en pipette til omhyggeligt lag 200 µL af de fortyndede celle disruptate løsning på toppen af en 1,2 mL tæthed pude af fosfatbufferet 8% (w/v) tæthed gradient medium (fx, 8% Nycodenz, 50 mM natriumfosfat, 2,2% saccharose, 1 mM EDTA) i et 2 mL centrifugeres rør. Der centrifugeres ved 20.000 x g i 45 min. ved 4 ° C i et microcentrifuge med soft-funktion (til blid acceleration og deceleration), og forsigtigt sætte rørene på is.
      2. Fjern forsigtigt 60 µL af ~ 200 µL top fraktion, og sørg for ikke at afhente nogen tæthed gradient medium løsning, og overføre til en frisk microcentrifuge tube.
        Bemærk: Bør indeholde cytosol af ekstraordinære renhed, kaldes "celle sap"21.
      3. Test renheden af brøkdel fremstillet i ovenstående trin, ved at udføre vestlige skamplet analyser af organelle-indeholdt proteiner, ved hjælp af standard teknikker og 4-20% gradient gels16.
      4. Udføre for eksempel immunoblotting for cathepsin B21, cytokrom c, og protein disulphide isomerase, at kontrollere, at elektrisk stød i trin 3.2 ikke har forstyrres lysosomer, mitokondrier eller endoplasmatiske reticulum, henholdsvis, og immunblot for LDH at kontrollere tilstedeværelsen af en cytosole protein i cellen sap.
      5. Samtidig skal du udføre immunoblotting på protein ekstrakter fremstillet af cellen total disruptate løsning16 at bekræfte, at antistofferne anvendes kan registrere organelle-indeholdt proteiner, der bliver vurderet.
  4. Gentag trin 3.1-3.3 for hver prøve.
  5. Ophæve 550 µL af hver fortyndet celle disruptate løsning (fås ved trin 3.3) til 2 mL microcentrifuge rør indeholdende 900 µL iskold resuspension buffer (50 mM natrium monophosphate, 1 mM DTT, 1 mM EDTA og 5,9% saccharose, pH 7,5) suppleret med 0,5% BSA og 0,01% Tween-20 og bland kortvarigt ved pipettering.
  6. Der centrifugeres ved 18.000 x g i 45 min. ved 4 ° C til at producere pellets, der indeholder "aflejret LDH". Grundigt Aspirér supernatanten (med suge) for at forlade piller så tør som muligt. Prøveemner i et-80 ° C fryser.
  7. Overføre 150 µL fra hver fortyndet celle disruptate løsning (fås ved trin 3.3) til nye rør, og placere prøverne i et-80 ° C fryser. Brug disse prøver for at bestemme "samlet LDH" niveauerne i cellerne.
    Bemærk: På dette tidspunkt forsøget kan afbrydes midlertidigt så længe ønskede.

4. LDH udvinding og måling af LDH enzymaktivitet

  1. Tø "aflejret LDH" (fra trin 3.6) og "samlet LDH" prøver (fra trin 3.7) på is.
  2. Tilsæt 300 µL af iskold resuspension buffer indeholdende 1,5% Triton X-405 til den "samlede LDH" prøver (giver en endelig Triton X-405 koncentration på 1%). Rotere prøver på en valse i et koldt værelse (4-8 ° C) i 30 min.
  3. Tilføje 750 µL af iskold resuspension buffer med 1% Triton X-405 til "Aflejret LDH" prøver, og pelleten pellets med en pipette, indtil en homogen løsning er nået.
  4. Der centrifugeres prøver fra trin 4.2 og 4.3 på 18.000 x g i 5 min. ved 4 ° C til sediment uopløst celleaffald.
  5. Mix 4 dele af kolde 65 mM imidazol (pH 7.5)/0.75 mM pyruvat med en del af kolde 65 mM imidazol (pH 7,5) / 1,8 mM NADH til at få en fungerende løsning, der er holdbar i mindst tre uger ved 4 ° C.
  6. Bland 3 – 30 µL af supernatanter fra trin 4.4 med 200 µL af trin 4.5 brugsopløsning.
  7. Bestemme mængden af LDH ved at måle LDH enzymatisk aktivitet som nedgangen i nicotinamid-adenin-dinucleotid (reduceret form) (NADH) absorbans ved 340 nm ved 37 ° C i forhold til en standard med en kendt LDH koncentration. Udføre absorbans målinger, indtil reaktionen har nærmede sig afslutningen, dvs. indtil absorbans ved 340 nm ikke længere ændres med tiden.
    Bemærk: Dette er den klassiske biokemiske metode til at måle LDH aktivitet. Selv om den nuværende protokol udfører reaktion ved 37 ° C, kan det også udføres ved stuetemperatur (20-25 ° C), som er tilrådeligt hvis gør manuel spektrofotometri. Den nuværende protokol bruger en robot multianalyzer instrument, som i en automatiseret måde blander prøver med brugsopløsning i en 96-brønd plade, og måler absorbansen ved 340 nm ved 37 ° C hvert 20 s i 3 min. Derefter instrument software beregnes koncentrationen af LDH, udtrykt som enheder (U) / L, ved at sammenligne hældningen af absorbans målinger over tid i forhold til en standardkurve opnået gennem kalibrering med en standard af kendte LDH koncentration. Det lineære område af påvisning af denne tilgang er 30-1.500 U/L. Som et alternativ findes en bred vifte af kommercielt tilgængelige kits til at måle LDH. Nogle af dem er baseret på kobling generation af kolorimetriske eller fluorescerende produkter, aktivering af andre midler end UV spektrofotometri og med andre lineære intervaller af påvisning enzymatisk reaktion.

5. beregning af LDH binding

  1. Beregne procentdelen af aflejret LDH til samlede LDH for hver prøve, tager Fortyndingerne og prøveudtagning i betragtning:
    Aflejret LDH (%) =Equation 1
    Bemærk: Under trin 3.1-3.3 ca 50 µL er tabt på grund af overførsel til og fra elektroporation kuvette. Således beregne fra at have en i alt 750 µL (i stedet for 800 µL) af fortyndede celle disruptate i trin 3.3.
  2. Fratrække den procentdel af aflejret LDH fremstillet i prøver fra ubehandlede celler (trin 1.3.2) fra den procentdel af aflejret LDH fremstillet i prøver fra eksperimentelt behandlede celler og kløft ved behandlingstiden med Baf at få procent af afsondret LDH i timen i stikprøveperioden:
    Afsondret LDH (% / h) =Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved hjælp af protokollen beskrevet her, bulk autophagic beslaglæggelse aktivitet i en række forskellige pattedyr cellelinjer, herunder LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, mus embryonale fibroblaster (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ og LNCaP celler blev målt. Binding blev vurderet under basale forhold (i komplet, næringsrige medium) eller i celler akut sultet for serum og aminosyrer (en Bonafide autophagy-inducerende tilstand22). Resultaterne viste, at LDH beslaglæggelse aktivitet sult betingelser varierer meget på tværs af forskellige cellelinjer, lige fra knap påviselig niveauer i LAPC4, DU145, Huh7 og PNT2 celler (data ikke vist) til ~1.6%/h i LNCaP celler (figur 2 A). Observeret i sultet primære rotte hepatocytter er højere end i cellelinjer, der er nævnt ovenfor, og typisk spænder fra 2.5–4%/h23. Basal betingelser, LDH binding blev næsten ikke målbart i halvdelen af cellelinjer testet, og varierede fra ~0.2%/h til ~0.5%/h i anden halvdelen (data ikke vist). I de cellelinjer, der viser påviselige basal autophagic beslaglæggelse aktivitet, inducerer akut serum og aminosyre sult typisk en 3 – 4 fold stigning i LDH sequestration sats (Se for eksempel LNCaP forsøget vist i figur 2A). I de testede cellelinjer (nævnt ovenfor), er baggrunden procentdel af aflejret LDH fremstillet i prøver fra ubehandlede celler (trin 1.3.2) typisk omkring 2-3%. Fra 22 uafhængige eksperimenter udført i forskellige cellelinier, den intra eksperimentelle variationskoefficient (CV) mellem aflejret LDH værdier (% aflejret LDH) af behandling replikater var 5,8% ± 1,7% (gennemsnit % CV ± standardafvigelse), lige fra 3.0 – 9,0%. Sammen, give disse numre en indikation af hvad de kan forvente når du udfører LDH sequestration assay i pattedyrsceller.

Brugen af kemiske hæmmere som godt som genetiske knockdown og knockout tilgange, udstrakt grad kontrollerer at LDH sequestration assay pålideligt måler autophagic beslaglæggelse aktivitet. Autophagosome dannelse kræver aktiv PI3K klasse III (PIK3C3) og Unc-51 som autophagy aktivering kinase (ULK)24, såvel som balance i intracellulære Ca2 + homøostase16. Som vist i figur 2A, både basal og sult-induceret LDH binding er helt afskaffet af pan-PI3K hæmmer 3MA, selektiv PIK3C3 hæmmer SAR-40520, eller ER Ca2 + pumpe hæmmer thapsigargin (TG) 25 i LNCaP celler. LDH sequestration sult betingelser (Skift til aminosyre-fri Earle's Balanced Salt løsning (EBSS) medium) er også kraftigt reduceret ved TG eller ULK-hæmmer MRT67307 i HEK293 celler (figur 2B). Derudover sult-induceret LDH binding er konsekvent hæmmes af 3MA i MEFs (figur 2C), BJ (figur 2D), MCF-7 (figur 2E) og RPE-1 (figur 2F) celler. Generelt, inkubation af celler i EBSS medium alene (dvs. i mangel af Baf eller andre efter binding hæmmere) fører ikke til nogen målbar ophobning af afsondret LDH (Se for eksempel LNCaP forsøget vist i figur 2 A). Dette er sandsynligvis fordi akut aminosyre sult fører til accelereret autophagic-lysosomale flux, hvilket resulterer i hurtige og vedvarende forringelse af den afsondret LDH.

Næste, forskellige ATG gen knockout (KO) MEFs blev ansat til at teste, om LDH binding kræver autophagy-relaterede gener rapporteret til at være afgørende for autophagosome dannelse. Faktisk er sult-induceret LDH binding afskaffet i ATG5 KO MEFs26 (fig. 3A), bekræfter vores tidligere resultater9. Desuden, som vist i figur 3B og 3 C, sult-induceret LDH binding er afrundede også i ATG7 KO MEFs27 og ATG9A KO MEFs28.

Endelig, LDH sequestration assay blev testet i forhold til om RNAi-medieret hæmning af centrale ATG gen udskrifter ville hæmme sult-induceret beslaglæggelse aktivitet. Faktisk Transfektion med en ATG9A-targeting siRNA eller kombinerede målretning af ULK1 og ULK2, stærkt reduceret LDH sequestration betingelser sult i LNCaP celler (figur 3D). Desuden vi bekræftet vores tidligere resultater3,9 , målretning af fokale vedhæftning kinase familie interagere protein af 200 kDa (FIP200) eller kombineret målretning af γ-aminobutyric syre type A (GABAA) receptor-forbundet protein ( GABARAP) familiemedlemmer hæmmer sult-induceret LDH sequestration (figur 3D).

Figure 1
Figur 1 : Samlede flow ordning af LDH sequestration protokol. Protokollen er baseret på en 12-godt vævskultur plade format, ved hjælp af de angivne mængder pr. sample (fra en brønd). Assay-protokollen kan bekvemt inddeles i to separate arbejdsdage, som angivet. Det er dog også muligt at udføre hele proceduren på én dag. Forkortelser: ABB, efter blast buffer (Se trin 3.3 i protokollen for ingredienser); RSB, ophvirvling buffer (Se trin 3.5 i protokollen for ingredienser). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Validering af LDH sequestration analysen ved hjælp af autophagy-hæmmende forbindelser. (A) LNCaP celler blev enten efterladt ubehandlet (med henblik på baggrund subtraktion: Se trin 1.3.2) i komplet vækstmediet (CM; RPMI 1640 + 10% føtal bovint serum (FBS)), eller de blev behandlet med DMSO køretøj (0,1%) eller 100 nM Baf i CM eller i serum- og aminosyre gratis medium (EBSS). Desuden, nogle af cellerne blev behandlet med 3MA (10 mM), SAR-405 (10 µM), eller Thapsigargin (300 nM), som angivet. Efter 3 h af behandling, cellerne er høstet, og LDH sequestration priser blev fastsat som beskrevet i den nuværende protokol. (B) HEK293 celler blev behandlet med DMSO køretøj (0,1%) i CM eller 100 nM Baf i EBSS, som angivet. Desuden, nogle af cellerne modtaget 10 µM MRT67307 (en ULK hæmmer) eller 300 nM Thapsigargin. LDH sequestration priser blev fastsat efter 3 h af behandling. (C-F) MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) eller ÅV-1 (F) celler blev behandlet med DMSO køretøj (0,1%) i CM eller Baf (10 nM i C, 100 nM i D-F) i EBSS med eller uden 10 mM 3MA, som angivet. LDH sequestration priser blev fastsat efter 3 h af behandling. A, B, D, E og F viser middelværdier fra tre biologiske flergangsbestemmelser (tredobbelt wells) fra et eksperiment (n = 1), med fejllinjer repræsenterer standardafvigelse. C viser middelværdier fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3), med fejllinjer repræsenterer standard fejl af middelværdien. p < 0,05, ***p < 0,001, gentagne prøver en-vejs ANOVA.

Figure 3
Figur 3 : Validering af LDH sequestration analysen af knockout (A-C) eller knockdown (D) tilgange. (A-C) ATG5 vildtype (WT) eller knockout (KO) MEFs (A), ATG7 WT eller KO MEFs (B), eller ATG9A WT eller KO MEFs (C) blev behandlet med DMSO køretøj (0,01%) i CM, eller med 10 nM Baf i EBSS, som angivet. LDH sequestration priser blev fastsat efter 3 h af behandling. Betyde værdier fra fire (A; n = 4) eller tre (B og C; n = 3) uafhængige forsøg med fejllinjer repræsenterer standard fejl af middelværdien. p < 0,05, gentagne prøver to-vejs ANOVA. N.S., ikke betydelig. (D) LNCaP celler var omvendt transfekteret med 5 nM af en nontargeting kontrol siRNA (siCtrl), eller med 5 nM ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- eller GABARAPL2-targeting siRNA oligoes, som angivet. Efter 48 h, cellerne enten blev behandlet med DMSO køretøj (0,1%) i CM eller 100 nM Baf i EBSS, som angivet. LDH sequestration priser blev fastsat efter 3 h af behandling. Vist er gennemsnitsværdier fra tre biologiske flergangsbestemmelser (tredobbelt wells) fra et eksperiment (n = 1), med fejllinjer repræsenterer standardafvigelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sammenfattende repræsenterer protokol beskrevet her en pålidelig og bredt anvendelig metode til at overvåge bulk autophagic beslaglæggelse aktivitet i pattedyrsceller. I forhold til den oprindelige metode12,16, har vi fjernet en række unødvendige skridt, forenklet flere af de resterende trin og indført en betydelig nedtrapning. Som et resultat af protokollen er væsentligt forbedret i forhold til pris - og tid-effektivitet, og det samme antal prøver kan nu håndteres i mindre end halvdelen af tiden i forhold til den originale protokol. For 24 prøver, trin 2 – 3 (dag 1) kræver ca ½ h af forberedelse plus 3 h af effektive arbejde, mens trin 4 (dag 2) kan udføres i ~ 2 h (tid skøn at alle de nødvendige buffere er forberedt på forhånd). Siden assay på dag 1 normalt er foranstillet celle behandlinger, herunder en 3 – 4 h inkubation med Baf eller andre hæmmere af autolysosomal LDH nedbrydning, er det praktisk at opdele analysen i to på hinanden følgende dage. Det er dog også muligt at udføre hele analysen i én og samme dag. I så fald ville det spare tid til snap-freeze prøver i flydende kvælstof i trin 3.6 og 3.7. Men er ikke testet med den nuværende protokol, er det sandsynligt at fryse-tø skridt kan hoppet helt, da mere uddybe version af analysen i primære rotte hepatocytter er sket uden dette trin23.

Protokollen præsenteres her kan udføres med relativ lethed. Af note er det vigtigt at være præcise i pipettering, da analysen indeholder flere prøveudtagning og fortynding trin. Derudover skal supernatanten forhåbninger gøres grundigt, så minimale mængder af ioner er til stede i saccharose cellesuspension taktfast 2,5 og som lille cytosole LDH som muligt forurener det aflejret materiale i trin 3.6. Analysen som beskrevet her er fleksible for en bred vifte af starter materiale. For eksempel i LNCaP celler, har vi med held brugt analysen med en vifte af forskellige mængder af celler ved høst, der spænder over op til en 10-fold forskel (fra 2,5 x 105 celler til 2,5 x 106 celler). Minimum begyndende materiale behov er defineret af hvor følsom den opdagelse metode af LDH enzymatisk aktivitet er. Protokollen kan meget sandsynligt blive skaleret væsentligt længere nede, ved at skalere ned de mængder, der anvendes på trin 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 og 4.3.

Den mest kritiske faktor og tekniske udfordring assay er electrodisruption trin. Den stærke, men korte, elektrisk stød af celler i ion-fri, isotonisk opløsning resulterer i en ensartet og Selektiv afbrydelse af plasma membran, mens intracellulære struktur og organeller (herunder autophagic vacuoles) intakt12, 29. Når du bruger vedhængende celler, er det vigtigt at de tolerere de enzymatiske og mekaniske behandlinger i trin 2.1-3.1 (celle detachement, centrifugering og resuspension). For trin 3,1 er det ikke afgørende at opnå en perfekt encellede suspension. For eksempel, er det meget svært at opnå med LNCaP celler. Ikke desto mindre opnås vellykkede electrodisruption i nærheden af 100% af cellerne altid, selv inden for celle klumper der indeholder flere snesevis af fysisk tilknyttede celler. Når du tester en ny celletype, det er tilrådeligt at kontrollere effektiviteten af electrodisruption (Se trin 3.3.1)17. Tæt på 100% af celler skal være permanent Trypan blå positiv efter electrodisruption trin17. Hvis dette ikke er tilfældet, skal indstillingerne for electroporator sandsynligvis blive ændret. Ved hjælp af analysen i 20 forskellige pattedyr celletyper, har vi aldrig haft til at ændre indstillingerne for electroporator. Derfor, når de rigtige indstillinger er blevet fundet for et pattedyr cellelinie, er det sandsynligvis til at arbejde for alle andre typer af pattedyrsceller. For at kontrollere, at electrodisruption ikke er for barsk, Følg dvs,at har været forstyrret kun plasma membranen, og ikke membranerne af intracellulære organeller, trin 3.3.2.

Bulk autophagy er udført af autophagosomes, der co udskille betydelige mængder af cytosol sammen med andre fragt. Dette kan ske via rent ikke-selektive autophagy portioner af cytoplasma, eller på en måde, der repræsenterer en blanding af selektiv og ikke-selektive autophagy. Til dato det er ikke klart, hvorvidt eller i hvilken grad selektiv og ikke-selektive autophagy eksistere som to forskellige former for autophagy, eller om autophagosomes som regel samtidig udskille lasten i både selektiv og ikke-selektive manerer. Vigtigere, men rapporteret en nylig undersøgelse at aktivatorer af selektiv autophagy fremkalde en lignende stigning i bulk cytosole cargo binding som binding af den særlige last30. Resultater fra vores eget laboratorium er indforstået med dette (vores ikke-offentliggjorte resultater). Analysere binding af opløselige cytosole proteiner (fx LDH) derfor sandsynligvis har potentiale til at registrere ændringer i macroautophagic forvaring aktivitet under mange, hvis ikke alle betingelser. Men selv om det stadig at være bevist, ikke kan udelukkes, at visse typer af betingelser entydigt fremkalde en form for selektiv-eksklusiv autophagy hvor ladningen er så tæt pakket af phagophore at selv cytosol er udelukket fra at være afsondret i autophagosome. For at sende forespørgsler om hvorvidt denne betingelse kan eksistere, bør bulk autophagy assays ligesom LDH sequestration assay køres parallelt med selektive autophagy assays.

En af de vigtigste fordele ved LDH sequestration assay er, at den måler binding af endogene fragt, hvilket gør det en generelt gældende metode. Desuden måler analysen beslaglæggelse aktivitet i en yderst kvantitative måde. LDH sequestration assay er et vigtigt redskab til at studere de mekanismer og regulering af autophagosome dannelse, siden open phagophores ikke kan udskille LDH. Det er meget besværligt og vanskeligt, hvis ikke umuligt, at vurdere, om autophagosome-lignende strukturer er forseglet enheder eller ikke ved elektronmikroskopi. En anden metode, der anvendes til at analysere, om autophagosomes er lukket er at teste følsomhed af autophagy markører (fx LC3) eller receptorer (f.eks. sequestosome 1 (p62/SQSTM1) eller nukleare dot protein 52 (NDP52)) til proteaser10 ,31,32. Ulempen ved denne analyse er, at man studerer protease beskyttelse af vogn komponenter i stedet for autophagic last. Desuden, da analysen er baseret på western blotting, det er kun semi-kvantitative.

Evnen til at analysere autophagy af endogene cargo er en fordel, er en iboende begrænsning med LDH sequestration assay, og eventuelle andre assays, der vurderer binding af endogene last, at en nedbrydning hæmmer skal medtages for at skelne specifikke effekter på autophagic binding og ikke nettovirkningerne af binding og nedbrydning. Effektiv hæmmere af LDH nedbrydning omfatter protonpumpehæmmere ligesom Baf eller concanamycin en3,16,18, og lysosomotropic agenter som Klorokin og ammoniumklorid33. Protease hæmmer leupeptin fungerer godt i primære rotte hepatocytter23, men er generelt ineffektive i de pattedyr cellelinjer, vi har testet. Vi bruger rutinemæssigt Baf13, der fungerer hurtigt og er meget effektiv i både nonmalignant og maligne celler. Det er dog vigtigt at huske på at ingen af LDH nedbrydning hæmmere er helt særlige og formodede virkninger af hæmmere på autophagy ikke kan udelukkes. For at minimere risikoen for ikke-specifikke indflydelse, er det anbefalelsesværdigt at bruge koncentrationer af inhibitoren, der er bare på mætte niveauer og omfatter hæmmer kun for de sidste par timer (3-4 h) af eksperimentet. Mætte koncentrationen af Baf bør fastlægges for hver celle. Som en vejledning, 50 – 100 nM mætte for de fleste af de kultiverede pattedyr cellelinjer vi har testet, mens nogle celle typer såsom MEFs kræver kun 10 nM Baf for en fuld blok i LDH nedbrydning.

En indlysende begrænsning LDH sequestration assay er, at det kan kun udføres på levende celler, således udelukke dets anvendelse til analyse af autophagy i fast celler og væv. På den anden side er der i øjeblikket ingen assays etableret, der kan måle funktionelle autophagic aktivitet i faste celler. Men er ikke testet med den nuværende protokol, bør det være fuldt ud muligt at bruge LDH sequestration analysen for at vurdere i vivo autophagic beslaglæggelse aktivitet i eksperimentel organismer. Begrænsning ville være at organismen skal tåler behandling med en hæmmer af lysosomale LDH nedbrydning, og at tidsrummet mellem sådanne behandling og udførelse af analysen bør være relativt korte, at minimere potentielle ikke-specifikke effekter af hæmmer. Interessant nok, angivet en tidlig undersøgelse af Kominami et al., 3-6 h behandling af rotter med leupeptin (intraperitoneal injektion af 2 mg/100 g kropsvægt) er passende at observere effektiv ophobning af autophagically afsondret LDH i leveren subcellulært fraktioner beriget til autophagic vacuoles34.

Ektopisk udtryk for pH-følsom fluorescerende sequestration sonder som Rosella35 eller Keima36 kan bruges til at visualisere autophagic binding uden brug af herunder nedbrydning hæmmere. Desuden, i modsætning til LDH sequestration assay, sådanne metoder kan bruges til at visualisere autophagic binding i enkelte celler. Derudover kan fusion af sonde til målretning af organelle sekvenser udnyttes til at overvåge binding af specifikke organeller. Kraftfuld mikroskopiske platforme kan også give mulighed for høj overførselshastighed screening analyser. Ulemperne er, at ektopisk sonde udtryk, samt ophobning af sonden i den lysosomale system, kan påvirke den autophagic vej. Desuden, i modsætning til LDH sequestration assay, en er afhængige af celler, der kan være effektivt transfekteret. Endelig, mens LDH sequestration analysen giver et straight-forward kvantitative output af procentdel afsondret cytosol, de image-baserede metoder generelt give ikke denne type absolut kvantitative output. Det ville være tilrådeligt at gøre brug af begge typer af tilgange komplementært med hinanden. En anden fremragende metode til at studere autophagic binding uden behov for nedbrydning hæmmere er at indføre radiolabeled raffinose i cellerne af reversibel electro-permeabilization3,23,37, 38. Raffinose er en membran-impermeant og metabolisk inaktive sukker, der er resistente over for lysosomale enzymer. Derfor, sine autophagic binding kan følges ved adskillelse af cytosole fra sedimentable celle fraktioner3,23,37,38. Denne tilgang er imidlertid, mere tidskrævende end LDH sequestration assay, og kræver yderligere sikkerhedsforanstaltninger på grund af brugen af radioaktivitet. Endelig kan slutresultatet af bulk autophagic binding og uhindret autophagic last flux, nedbrydningen af langlivede proteiner, præcist måles ved en veletableret protein mærkning-baseret metode39,40 ,41,42,43. Men, i modsætning til LDH sequestration assay, denne metode giver ikke en specifik udlæsning for autophagic aktivitet, da langlivede proteiner er nedbrudt også af andre mekanismer end autophagy, især af proteasomal systemet (mens LDH binding kun opstår som følge af autophagy). Derfor en række kontrol behandlinger skal være rutinemæssigt medtaget, fx, kemiske hæmmere af autophagic-lysosomale eller proteasomal nedbrydning og genetiske interferens med autophagy3,16.

LDH sequestration assay kan sammenlignes med de almindeligt anvendte LC3 flux assays, som måler LC3-II niveauer af western blotting eller LC3 puncta dannelsen af fluorescens imaging i fravær eller tilstedeværelse af hæmmere af lysosomale LC3 nedbrydning (Baf er de fleste ofte anvendes), eller overgang af fluorescently mærket LC3 varianter til sure miljøer22. Selv om disse LC3-baserede assays kan give nyttige oplysninger, kan de være vanskelige at fortolke, navnlig fordi relationen mellem graden af LC3 flux og mængden og typen af lasten flux er ukendt. Som nævnt i indledningen, kræver bulk autophagy og Parkin-afhængige mitophagy ikke LC3 familie proteiner9,10,11,44. Desuden i sultet rotte hepatocytter, LDH binding og nedbrydning fortsætter uafbrudt tid perioder hvor der er ingen autophagic-lysosomale LC3 flux9. Således, i dette tilfælde cargo flux kan være helt adskilt fra LC3 flux. Er behov for mere forskning sammenligne LC3 flux med forskellige former for last flux til bedre fortolke resultaterne med LC3 flux assays.

I sin nuværende form er LDH sequestration assay sammenlignelig med western blotting kræves hands-on tid og omkostninger. Målingen af bulk autophagy, det er mindst lige så effektivt som raffinose-baserede sequestration assay eller langlivede protein nedbrydning assay beskrevet ovenfor. For specifikke måling af bulk autophagic beslaglæggelse aktivitet og dannelsen af lukkede autophagosomes er det langt mere effektiv og ligetil end LC3 flux assays eller protease beskyttelse assays af LC3 eller autophagy receptorer, siden de sidstnævnte assays foranstaltning vogn komponenter snarere end faktiske fragt. Selvom vi har væsentligt forbedret gennemløb af LDH sequestration assay, det er langt fra en høj overførselshastighed assay, og det kan ikke konkurrere med effektiviteten af billed-baserede assays beskrevet ovenfor. Men både de image-baserede assays og LDH sequestration assay har deres fordele og ulemper, og begge typer af assays har således deres egne værdier. Det er sandsynligvis muligt via fremtidige justeringer at gøre LDH sequestration assay semi high-overførselshastighed. For eksempel, det bør være muligt at udføre electrodisruption i en 96-brønds format, og det er tænkeligt at cytosole LDH kunne adskilles fra afsondret LDH ved filtrering i stedet for centrifugering, eller at centrifugering trin kan udføres i en 96- godt format. Derudover assays til at måle LDH aktivitet, der er meget mere følsom end der bruges i den nuværende protokol er blevet udviklet, og er kommercielt tilgængelige. Andre interessante fremtidige potentialer i analysen er dens formodede anvendelse i andre celletyper end mammale celler, fx i gær eller andre encellede organismer, eller endog plante celler, og dets anvendelse i vivo målinger af autophagic binding aktiviteter i væv af eksperimentelle organismer.

Afslutningsvis, mener vi, at LDH sequestration assay i sin forbedrede og genoplivet form vil være et vigtigt redskab i fremtidige autophagy-relateret forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev økonomisk støttet af Norges forskning Rådet, universitetet i Oslo, Anders Jahre Foundation, Nansen Foundation og arv i mindet om Henrik Homan. Vi takker Dr. Noboru Mizushima for ATG5 +/ + MEFs og ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu for ATG7 +/ + MEFs og ATG7/MEFs, og Dr. Shizuo Akira for ATG9A +/ + MEFs og ATG9A/MEFs. Vi takker Frank Sætre for teknisk bistand, og Dr. Per O. Seglen for konstruktiv metodologiske diskussioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46, (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591, (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166, (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264, (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151, (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19, (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333, (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111, (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19, (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9, (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510, (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10, (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282, (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432, (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169, (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142, (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20, (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281, (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23, (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7, (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258, (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18, (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270, (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162, (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8, (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123, (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95, (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85, (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12, (2), 1-3 (2016).
Laktat Dehydrogenase Sequestration Assay — En simpel og pålidelig metode til at bestemme Bulk Autophagic beslaglæggelse aktivitet i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter