Summary
Hier is een eenvoudig en goed gevalideerde protocol voor het meten van de bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen wordt beschreven. De methode is gebaseerd op het kwantificeren van het aandeel van lactaat dehydrogenase (LDH) in sedimentable cel breuken in vergelijking met de totale cellulaire LDH niveaus.
Abstract
Bulk autophagy wordt gekenmerkt door de inbeslagneming van grote delen van het cytoplasma in dubbele/multi-membrane structuren genoemd autophagosomes. Hier is een eenvoudig protocol volgen van dit proces beschreven. Bovendien, de typische resultaten en experimentele validatie van de methode onder autophagy-inducerende omstandigheden in verschillende soorten gekweekte zoogdiercellen worden geleverd. Tijdens bulk autophagy sekwestreren autophagosomes cytosol, en daarmee ook oplosbare cytosolische eiwitten, naast andere autophagic lading. LDH is een stabiel en zeer overvloedig, oplosbaar cytosolische enzym dat is non-selectief afgezonderd in autophagosomes. De hoeveelheid LDH sekwester weerspiegelt dan ook de hoeveelheid bulk autophagic sekwester. Efficiënt en nauwkeurig bepalen van LDH sekwester in cellen, hanteren wij een electrodisruption gebaseerde fractionering protocol dat effectief sedimentable van cytosolische LDH scheidt, gevolgd door meting van enzymatische activiteit in sedimentable breuken versus geheel-celsteekproeven. Autophagic sekwester wordt bepaald door het aantal sedimentable LDH in onbehandelde cellen uit dat in behandelde cellen af te trekken. Het voordeel van de bepaling van de sekwestratie LDH is dat het geeft een kwantitatieve meting van de autophagic sekwestratie van endogene lading, in tegenstelling tot andere methoden dat ofwel ectopische uitdrukking van sekwester sondes of semi-kwantitatieve protease betrekken de analyses van de bescherming van autophagy markeringen of receptoren.
Introduction
Autophagy (Grieks voor "zelf eten") is een evolutionaire geconserveerde proces voor vacuolar/lysosomale afbraak van intracellulaire materiaal. Bij ontdekking van de genen autophagy-gerelateerde ("ATG"), die belangrijk voor autophagy in gist en mensen zijn, en het besef dat autophagy speelt een belangrijke rol in de menselijke gezondheid en ziekte (erkend door 2016 de Nobelprijs voor geneeskunde of fysiologie aan Yoshinori Ohsumi), autophagy snel uitgegroeid tot een van de meest intensief bestudeerde processen in1,2van de biologie van de cel.
Macroautophagy (hierna te noemen "autophagy") wordt gekenmerkt door de expansie en vouwen van intracellulaire membraan cisternae ("phagophores") in hermetisch gesloten, dubbel - of multi - membrane structuren ("autophagosomes") die effectief sekwestreren de enwrapped materiaal van de rest van het cytoplasma. Na de fusie van autophagosomes met lysosomen, is de innerlijke autophagosomal membraan de afgezonderd lading gedegradeerd en gerecycleerd. Autophagosomes kan sekwestreren cytoplasmatische materiaal in zowel willekeurige (niet-selectieve autophagy) en selectieve (selectieve autophagy) manieren. Bulk autophagy waarschijnlijk vertegenwoordigt een mix van niet-selectieve en selectieve autophagy.
In de jaren 1960 en 70 ("de morfologische tijdperk" van autophagy onderzoek), was autophagic sekwester vooral beoordeeld via ultrastructurele analyses. In de jaren 1980 en begin van de jaren 1990 ("de biochemische tijdperk") Per Seglen en medewerkers — die studeerde autophagy in primaire rat hepatocyten — de eerste methodes voor het kwantitatief meten van autophagic sekwester activiteit3ontwikkeld. Met behulp van deze tests, Seglen gedefinieerd en gekenmerkt van de verschillende stappen van de autophagic-lysosomale traject4,5, ontdekt en bedacht de amphisome6 (het product van endosome-autophagosome fusion) en was de eerste die beschrijven de rol voor Proteïne Fosforylatie in autophagy verordening7. Echter, na de ontdekking van de ATGs in de jaren 1990 ("de moleculaire tijdperk") en de eerste karakterisering van een zoogdieren ATG8 eiwit, microtubulus-geassocieerde proteïne 1A/1B-licht ketting 3 (LC3) in 20008, het gebruik van eiwitten van de ATG als markers voor de autophagic proces snel aan populariteit gewonnen en de oudere en meer moeizaam biochemische methoden werden achtergelaten. In feite, in de laatste 18 jaren, westelijke vlek en fluorescentie microscopie analyses van LC3 de veruit het meest populair zijn geworden (en in veel gevallen de enige) vervoermiddel studeren autophagy in de cellen van zoogdieren. Het voordeel is het relatieve gemak waarmee deze methoden kunnen worden uitgevoerd. Het nadeel is dat men bestudeert een kar component (LC3) in plaats van de werkelijke autophagic lading. Dit is een vrij ernstige nadeel, omdat de relatie tussen de Staten en/of flux van LC3 via het traject ten opzichte van de sekwestratie en flux van lading zeer onduidelijk is. In feite, we hebben aangetoond dat bulk cargo flux kan worden gehandhaafd op een hoog niveau in omstandigheden waar er geen LC3 flux, ondanks de aanwezigheid van geconjugeerd LC3 in de cellen9. Bovendien, we laten zien dat bulk autophagy niet wordt beïnvloed door efficiënte LC3 uitputting, en is dus waarschijnlijk LC3-onafhankelijke9. Deze bevinding is later bevestigd door LC3 knock-out studies10,11, waaruit ook blijkt dat Parkin-afhankelijke mitophagy (de selectieve autophagy mitochondria) onafhankelijk is van LC310,11 .
Kortom, er is duidelijk behoefte aan lading gebaseerde testen om autophagic activiteit te controleren. Optimaal moet deze gehaltebepalingen in grote lijnen die van toepassing zijn, duidelijk omschreven en gemakkelijk uit te voeren. De afgelopen jaren hebben wij een bijzonder belang bij het LDH sekwester assay, die werd ontwikkeld door Per Seglen in de jaren 1980-12, en is gebaseerd op de meting van de overdracht van cytosolische LDH aan sedimentable, autophagic vacuole-bevattende cel genomen breuken. LDH is een stabiele, oplosbare cytosolische eiwit dat is gemakkelijk samen afgezonderd wanneer phagophores wrap cytoplasmatische lading. Sekwestratie van LDH is daarom een algemene maatregel autophagic sekwester. LDH is uitsluitend afgebroken door de autophagic-lysosomale traject12. Dus, in het bijzijn van de lysosomale afbraak-remmers, bijvoorbeeld bafilomycin A1 (Baf)13, experimentele behandeling effecten direct bijgewerkt met de wijzigingen in autophagic sekwester activiteit. Bij gebrek aan degradatie remmers, kan het netto-effect van wijzigingen in het LDH sekwestratie en afbraak worden gemeten.
De bepaling van de sekwestratie LDH is breed toepasbare, aangezien LDH zeer en overal in alle celtypes uitgedrukt is, en LDH niveaus kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd met een enzymatische assay14,15. Echter, de oorspronkelijke protocol12 — vastgesteld in primaire rat hepatocyten — was nogal tijdrovend en vereist een hoge hoeveelheid materiaal, evenals een op maat gemaakte elektrische kwijting condensator beginnen. Op een stapsgewijze manier, hebben wij de bepaling geleidelijk omgevormd tot een gemakkelijke en veelzijdige methode. Ten eerste, was het oorspronkelijke protocol aangepast voor gebruik in zoogdiercellen lijnen16. Ten tweede, de methode was aanzienlijk radiolink3,9. Derde, verschillende stappen in het protocol werden geëlimineerd, met inbegrip van een moeizame dichtheid kussen stap17. Hierdoor tegelijkertijd een nog verdere inkrimping van de methode van het oorspronkelijke beginpunt van het gebruik van een 10 cm plaat per monster16 naar het gebruik van een enkele goed uit een plaat van de 12-well per monster (dat wil zeggen, ongeveer 15-fold minder beginnen materiaal)17. Ten vierde, we een commerciële electroporation apparaat dat zou kunnen van de op maat gemaakte elektrische kwijting condensator17 vervangenvastgesteld.
Hier wordt onze meest recente protocol van het LDH sekwester assay, waarin sommige verdere vereenvoudigingen van de methode in vergelijking met de eerder gepubliceerde17 gepresenteerd. Bovendien, een typische resultaten die zijn verkregen in een aantal verschillende soorten cellen worden weergegeven, en belangrijker, meerdere tekstregels experimentele validaties van de methode met behulp van zowel farmacologische als genetische knockdown en knock-out benaderingen worden meegeleverd. Voor een algehele regeling van de stroom van het hele protocol, Zie Figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cel zaaien en behandeling
-
Cultuur Adherente cellen in 75 cm2 weefselkweek kolven in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C, met behulp van het medium van de cultuur voor het celtype in kwestie. De cellen groeien totdat ze een in de buurt van-heuvels cellaag bereiken toestaan.
Opmerking: Gebruik RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) voor LNCaP, HEK293, muis embryonale fibroblasten (MEFs), BJ, MCF-7 en RPE-1 cellen.- Wassen van de cellen met 3 mL 37 ° C-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4. De PBS vervangen door 3 mL 0,25% (m/v) trypsine-ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA) en Incubeer de kolf in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C, totdat de cellen los (2-5 min).
- Resuspendeer de vrijstaande cellen met 7 mL gestolde voedingsbodem met 10% FBS. Meng een hoeveelheid van 10 µL cel schorsing met 10 µL 0,4% blauw van de Trypan in een microcentrifuge buis, met behulp van een 0,5 – 20 µL pipette uiteinde. Gebruik het dezelfde pipette uiteinde te vullen onmiddellijk een dia kamer tellen en tellen van de cellen in een geautomatiseerde cel teller.
-
Bereiden een geschikte verdunning (zie hieronder nota) van de celsuspensie van stap 1.1.2 met cultuur gemiddeld met 10% FBS, en zaad 1 mL van de verdunde celsuspensie in ieder putje van een 12-well weefselkweek plaat (oppervlakte ~3.8 cm2) met behulp van aseptische techniek. Groei in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C toestaan, totdat de gewenste celdichtheid is bereikt, bijvoorbeeld 60 – 90% samenvloeiing bij de oogst.
Opmerking: De aangewezen verdunning van de celsuspensie krijgt de gewenste cel confluentie bij de oogst zal variëren van celtype celtype, en volgens de duur en de soort experimentele behandelingen. Dus, dit moet worden empirisch beoordeeld in elk geval.- Voor experimenten die moeten worden beide behandeld en geoogst van 2 dagen na het zaaien, zaad 2.5 x 10,5 LNCaP, HEK293, of MCF-7 cellen, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ of 1.5 x 10-5 RPE-1 cellen in elk putje van de plaat 12-well.
- Voor cellen die losjes houden, jas u de platen met het type coating aanbevolen voor het celtype in kwestie. Gebruik platen bedekt met poly-D-lysine (PDL) voor LNCaP (en HEK293) cellen.
- Te dien einde 500 µL PDL op 2,5 µg Mo/mL in steriel H2O toevoegen aan elk putje en Incubeer de platen in een steriele omgeving gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C). Verwijder de PDL afzuigen en wassen elk goed kort met 1 mL steriele H2O.
Opmerking: In het algemeen, stap 1.2.1 gebeurt zonder enige experimentele behandelingen. Het uitvoeren van RNAi, kan het wel handig om te beginnen een omgekeerde transfectie met de seeding9.
-
Het uitvoeren van experimentele behandelingen in dubbele of drievoudige wells per voorwaarde.
- Bijvoorbeeld, het behandelen van de cellen met 50 nM van de mTOR-remmer Torin1, die over het algemeen is een efficiënte inductor autophagic sekwester, of onder de cellen zijn acute honger van de serum- en aminozuur door het wassen van de cellen met 1 mL aminozuur-vrije Earle is evenwichtig Zout oplossing (EBSS) medium, en vervolgens Incubeer de cellen in EBSS 1 mL in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C.
- Een set van putten ter vastlegging van de achtergrondniveaus van sedimentable LDH onbehandeld verlaten.
- Voeg een saturating hoeveelheid de post sekwester remmer bafilomycin A1 (Baf)3,13,16,18 in de afwezigheid of de aanwezigheid van de experimentele behandelingen, 3-4 h voor cel oogst. Incubeer de cellen in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 ° C.
- Gebruik 100 nM Baf voor LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 en RPE-1 de cellen, en 10 nM Baf voor MEFs.
- Voor experimentele behandelingen hebben een duur van slechts 3-4 h (zoals deze blijkt in stap 1.3.1 hebben meestal), tegelijk met de behandelingen Baf toevoegen. Wachten tot 3-4 uur vóór de oogst voor meer experimentele behandelingen, en voeg 2 µL van een 500 x geconcentreerd Baf voorraad direct in het medium.
- Meng door schudden van de plaat onmiddellijk na de toevoeging van Baf. Op dit punt is het ook aan te bevelen om toe te voegen macroautophagic sekwester remmers als besturingselementen, bijvoorbeeld 10 mM van de pan-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) remmer 3-methyl adenine (3MA)19of 10 µM van de selectieve PI3K klasse III remmer SAR-40520.
2. cel oogst en voorbereiding voor Electrodisruption
- Aan het eind van de behandelingsperiode, gecombineerd het medium afzuigen en 200 µL cell detachement oplossing (pre-water verwarmd tot 37 ° C) toe te voegen aan elk putje. Incubeer bij 37 ° C, totdat de cellen los (meestal ongeveer 5 min).
Opmerking: Overwegende dat 0,25% (m/v) trypsine-EDTA mogen worden gebruikt in plaats van de mobiele-detachement oplossing, deze laatste bevat DNase, die helpt het verminderen van de viscositeit van de vrijstaande cellen. Zo lang als het medium is grondig aanzuiging, is het niet nodig om te wassen van de cellen vóór toevoeging van trypsine-EDTA of cel detachement oplossing. - Voeg 500 µL kamertemperatuur (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, met 2% (g/v) bovien serumalbumine (BSA) aan elk putje, en resuspendeer met de pipet zolang geen klontjes cel niet zichtbaar zijn. Onmiddellijk overdracht de celsuspensie 1,5 mL microcentrifuge buizen op ijs.
Opmerking: Tenzij anders vermeld, uitvoeren van alle volgende stappen op het ijs. - Sediment de cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
- Grondig gecombineerd het supernatant (afzuigen) te laten de cel pellets zo droog mogelijk.
- Voeg 400 µL 10% (m/v) sacharose (in ultrazuiver H2O) aan elke buis.
3. plasmamembraan Electrodisruption en scheiding van Sedimentable - en totaal-cel breuken
- Resuspendeer de pellet van de cel met een pipet te verkrijgen van een in de omgeving van eencellige schorsing en overbrengen naar een 4 mm electroporation cuvette.
Opmerking: Pipetting en neergaande ~ 10-15 keer, met behulp van een 100-1000 µL Pipetteer tip, is meestal voldoende. - Plaats de cuvette in een exponentiële afname Golf electroporator en kwijting een enkele elektrische puls op 800 V, 25 µF en 400 Ω; deze instellingen produceren een puls van ~ 8 ms duur.
-
Gebruik een nieuwe tip van de pipet om de cel disruptate overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met 400 µL ijskoude fosfaatgebufferde sacharoseoplossing (100 mM natrium monofosfaat, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA en 1,75% sucrose, pH 7.5) en meng kort door pipetteren.
- Optioneel: Controleer of efficiënte plasmamembraan electrodisruption17, meng 10 µL van de disruptate van de verdunde cel uit stap 3.3 met 10 µL 0,4% Trypan blauw in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Overbrengen naar een tellen kamer en controleer of het percentage Trypan blauw positieve cellen > 99%.
- Laat het monster in het tellen kamer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (20-25 ° C), en controleer dat het percentage Trypan blauw positieve cellen gebleven > 99%.
- Optioneel: Om te controleren dat de electrodisruption niet te hard is geweest, dat wil zeggen, het heeft niet verstoord intracellulaire organellen, voert u stappen 1.1 – 3.3 zoals hierboven beschreven, maar gebruiken een grotere grondstof (een goed uit een 6-well-plaat met een confluente cellaag van ~ 80%), en gebruik 150 µL 10 gewichtspercenten sacharose in stap 2.5 en 150 µL fosfaatgebufferde sacharoseoplossing zonder DTT in stap 3.3.
- Gebruik een pipet aan zorgvuldig laag 200 µL van de verdunde cel disruptate oplossing op de top van een 1.2 mL dichtheid-kussen van fosfaatgebufferde 8% (m/v) dichtheid kleurovergang medium (bijvoorbeeld8% Nycodenz, 50 mM natriumfosfaat, 2,2% sucrose, 1 mM EDTA) in een centrifuge 2 mL buis. Centrifugeer bij 20.000 x g voor 45 min bij 4 ° C in een microcentrifuge met zachte-mode functie (voor zachte versnelling en vertraging), en zorgvuldig zet de buizen op ijs.
- Verwijder voorzichtig 60 µL van de ~ 200 µL top breuk, om ervoor te zorgen niet te halen een kleurovergang middellange oplossing dichtheid, en overbrengen naar een verse microcentrifuge buis.
Opmerking: Dit moet bevatten cytosol van uitzonderlijke zuiverheid, genoemd "cel sap"21. - Test de zuiverheid van de breuk in de bovenstaande stap, verkregen door het uitvoeren van analyses van de westelijke vlek van organel-bevat eiwitten, met behulp van standaard technieken en 4 – 20% kleurovergang gels16.
- Uitvoeren bijvoorbeeld immunoblotting voor cathepsin B21, cytochroom c, en eiwit dissulfide isomerase, om te verifiëren dat de elektrische schok in stap 3.2 heeft niet verstoord lysosomen en mitochondriën, endoplasmatisch reticulum, respectievelijk, en immunoblot voor LDH om te controleren of de aanwezigheid van een cytosolische eiwit in het sap van de cel.
- Uitvoeren in parallel, immunoblotting op eiwithoudende extracten gemaakt van de cel Totaal disruptate oplossing16 om te bevestigen dat de antilichamen die gebruikt het organel-bevat eiwitten die zijn onderzocht kunnen detecteren.
- Optioneel: Controleer of efficiënte plasmamembraan electrodisruption17, meng 10 µL van de disruptate van de verdunde cel uit stap 3.3 met 10 µL 0,4% Trypan blauw in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Overbrengen naar een tellen kamer en controleer of het percentage Trypan blauw positieve cellen > 99%.
- Herhaal stap 3.1-3.3 voor elk monster.
- Verwijderen van 550 µL van elke oplossing van verdunde cel disruptate (verkregen bij stap 3.3) 2 mL microcentrifuge buizen met 900 µL ijskoude resuspensie buffer (50 mM natrium monofosfaat, 1 mM DTT, 1 mM EDTA en 5,9% sucrose, pH 7.5) aangevuld met 0,5% BSA en 0,01% Tween-20 en mix kort door pipetteren.
- Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 45 min bij 4 ° C tot pellets die bevat "gesedimenteerd LDH". Grondig gecombineerd het supernatant (afzuigen) te laten de korrels zo droog mogelijk. Leg de monsters in een vriezer-80 ° C.
- 150 µL van elke oplossing van verdunde cel disruptate (verkregen bij stap 3.3) overbrengen naar nieuwe buizen, en plaats de monsters in een vriezer-80 ° C. Gebruik deze voorbeelden om de "totale LDH" niveaus in de cellen.
Opmerking: Op dit punt het experiment kan worden onderbroken voor zo lang als gewenst.
4. LDH extractie en meting van LDH enzymatische activiteit
- Ontdooi de "gesedimenteerd LDH" (uit stap 3.6) en de "total LDH" monsters (uit stap 3.7) op ijs.
- Voeg 300 µL van ijskoude resuspensie buffer met 1,5% Triton X-405 tot de "totale LDH" monsters (opbrengst een eindconcentratie van de Triton X-405 van 1%). De monsters op een roller in een koude kamer (4-8 ° C) gedurende 30 minuten draaien.
- Voeg 750 µL van ijskoude resuspensie buffer met 1% Triton X-405 tot de "gesedimenteerd LDH" monsters en resuspendeer de pellets met een pipet totdat een homogene oplossing is gevonden.
- Centrifugeer de monsters uit stap 4.2 en 4.3 bij 18.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C naar sediment onopgeloste cellulaire puin.
- Mix 4 delen van koude 65 mM imidazool (pH 7.5)/0.75 mM pyruvaat met een deel van koude 65 mM imidazool (pH 7.5) / 1,8 mM NADH te verkrijgen van een werkoplossing die is stabiel gedurende ten minste drie weken bij 4 ° C.
- Meng 3 – 30 µL van het supernatant uit stap 4.4 met 200 µL van de werkoplossing stap 4.5.
- De hoeveelheid LDH bepalen door het meten van LDH enzymatische activiteit als de daling in nicotinamide adenine dinucleotide (gereduceerde vorm) (NADH) absorptie bij 340 nm bij 37 ° C in vergelijking met een standaard met een bekende concentratie van LDH. Extinctie metingen uit te voeren tot de reactie heeft benaderd voltooiing, d.w.z. tot de absorptie bij 340 nm niet langer verandert met de tijd.
Opmerking: Dit is de klassieke biochemische methode voor het meten van LDH activiteit. Hoewel het huidige protocol de reactie bij 37 ° C voert, kan het ook worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25 ° C), die is aan te raden als het doen van handmatige spectrofotometrie. Het huidige protocol gebruikt een robotachtige multianalyzer instrument, die op een geautomatiseerde wijze mengt monsters met werkoplossing in een 96-wells-plaat, maatregelen de absorptie bij 340 nm bij 37 ° C elke 20 s gedurende 3 minuten. Daarna de instrument software berekent de concentratie van LDH, uitgedrukt als Units (U) / L, door het vergelijken van de helling van de extinctie metingen na verloop van tijd in vergelijking met een standaard curve verkregen door kalibratie met een norm van bekende LDH concentratie. Het lineaire bereik van detectie door deze aanpak is 30 – 1.500 U/L. Als alternatief, een breed scala aan commercieel beschikbare kits voor het meten van LDH bestaan. Sommigen van hen zijn gebaseerd op de koppeling van de enzymatische reactie op de generatie van colorimetrische of TL producten, detectie inschakelen door andere middelen dan UV-spectrofotometrie, en met andere lineaire bereiken van detectie.
5. berekening van LDH Sequestration
- Bereken het percentage van gesedimenteerd LDH aan totale LDH voor elk monster, nemen de verdunningen en bemonstering rekening:
Gesedimenteerd LDH (%) =
Opmerking: Tijdens stappen 3.1-3.3 ongeveer 50 µL is verloren als gevolg van overdracht naar en vanuit de electroporation cuvette. Dus, uit een totaal van 750 µL (in plaats van 800 µL) berekenen van verdunde cel disruptate in stap 3.3. - Het percentage van de gesedimenteerd LDH verkregen in de monsters van onbehandelde cellen (stap 1.3.2) uit het percentage van de gesedimenteerd LDH verkregen in monsters van experimenteel behandelde cellen en kloof door de behandeltijd met Baf te verkrijgen van het percentage aftrekken afgezonderd LDH per uur gedurende de bemonstering:
Afgezonderd LDH (% / h) =
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van het protocol beschreven hier, bulk autophagic sekwester activiteit in een aantal verschillende zoogdieren cellijnen, met inbegrip van LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, muis embryonale fibroblasten (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ en LNCaP cellen werd gemeten. Sekwester was beoordeeld onder basale omstandigheden (in volledige voedselrijke medium), of in cellen acuut uitgehongerd voor serum en aminozuren (een bona fide autophagy-inducerende voorwaarde22). De resultaten aangegeven dat LDH sekwester activiteit onder honger voorwaarden uitgebreid verschilt voor verschillende cellijnen, variërend van nauwelijks detecteerbare niveaus in LAPC4, DU145, Huh7 en PNT2 ~1.6%/h in LNCaP cellen (Figuur 2 cellen (gegevens niet worden weergegeven) A). Het percentage waargenomen in uitgehongerd primaire rat hepatocyten is hoger dan in de cellijnen hierboven vermeld, en meestal varieert van 2.5–4%/h23. Onder basale omstandigheden, LDH sekwester was vrijwel niet aantoonbaar in de helft van de cellijnen getest, en varieerden van ~0.2%/h tot ~0.5%/h in de andere helft (gegevens niet worden weergegeven). In de cellijnen die detecteerbare basale autophagic sekwester activiteit tonen, induceert acute serum en aminozuur honger meestal een 3 – 4-voudige toename in LDH sekwester tarief (zie bijvoorbeeld het experiment van de LNCaP getoond in Figuur 2). In de geteste cellijnen (hierboven genoemde), is het percentage van de achtergrond van de gesedimenteerd LDH verkregen in monsters van onbehandelde cellen (stap 1.3.2) meestal ongeveer 2 – 3%. Van 22 onafhankelijke experimenten in verschillende cellijnen, de intra experimentele variatiecoëfficiënt (CV) tussen gesedimenteerd LDH waarden (% gesedimenteerd LDH) behandeling wordt gerepliceerd was 5,8% ± 1,7% (gemiddeld % CV ± standaardafwijking), variërend van 3.0- 9,0%. Deze nummers geven samen een indicatie van wat u kunt verwachten bij het uitvoeren van de bepaling van de sekwestratie LDH in zoogdiercellen.
Gebruik van chemische inhibitoren als goed als genetische knockdown en knock-out benaderingen, uitvoerig wordt gecontroleerd of dat de bepaling van de sekwestratie LDH betrouwbaar meet autophagic sekwester activiteit. Autophagosome vorming vereist actieve PI3K klasse III (PIK3C3) en Unc-51 zoals autophagy activeren kinase (Grzbietoluski)24, evenals het evenwicht in de intracellulaire Ca2 + homeostase16. Zoals afgebeeld in Figuur 2A, zowel de basale als de honger-geïnduceerde LDH sekwestratie is afgeschaft door de pan-PI3K remmer 3MA, de selectieve PIK3C3 remmer SAR-40520, of het ER Ca2 + pomp remmer thapsigargin (TG) 25 in LNCaP cellen. LDH sekwester onder honger voorwaarden (schakelaar aan aminozuur-vrije Earle's Balanced Salt oplossing (EBSS) medium) is ook sterk gereduceerd door TG, of door de MRT67307 van de Grzbietoluski-remmer in HEK293 cellen (Figuur 2B). Bovendien, honger geïnduceerde LDH sekwester consequent wordt geremd door 3MA in MEFs (Figuur 2C), BJ (Figuur 2D), MCF-7(Figuur 2)en RPE-1 (Figuur 2F) cellen. In het algemeen, incubatie van cellen in EBSS medium alleen (dat wil zeggen, in de afwezigheid van Baf of andere post sekwester remmers) leidt niet tot enige meetbare accumulatie van afgezonderd LDH (zie bijvoorbeeld het experiment van de LNCaP afgebeeld in Figuur 2 A). Dit is waarschijnlijk omdat acute aminozuur hongerdood tot versnelde autophagic-lysosomale flux leidt, wat resulteert in snelle en voortdurende afbraak van het afgezonderd LDH.
Volgende, verschillende ATG gene knock-out (KO) MEFs werden ingezet om te testen of LDH sekwester autophagy-gerelateerde genen gemeld vereist dat essentieel is voor de vorming van de autophagosome. Inderdaad, honger geïnduceerde LDH koolstofvastlegging in ATG5 KO MEFs26 (Figuur 3,A), bevestigen onze eerdere bevindingen9is afgeschaft. Bovendien, zoals blijkt uit Figuur 3B en 3 C, honger geïnduceerde LDH sekwestratie is afgerond ook in ATG7 KO MEFs27 en ATG9A KO MEFs28.
Tot slot, de LDH sekwester assay werd getest met betrekking tot of honger geïnduceerde sekwester activiteit met belangrijke ATG gene afschriften van RNAi-gemedieerde silencing zou remmen. Inderdaad, transfectie met een ATG9A-targeting siRNA of gecombineerde doelgerichtheid van ULK1 en ULK2, sterk verlaagde LDH koolstofvastlegging in LNCaP cellen (Figuur 3D) voorwaarden honger. Bovendien, we onze eerdere bevindingen3,9 bevestigd dat doelgerichtheid van focal hechting kinase familie interactie eiwit van 200 kDa (FIP200) of gecombineerd doelgerichtheid van de γ-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor-geassocieerde proteïne ( De leden van de familie van de GABARAP) remt honger geïnduceerde LDH sekwester (Figuur 3D).
Figuur 1 : Algemene regeling van het LDH sekwester protocol stromen. Het protocol is gebaseerd op een 12-well weefselkweek plaat formaat, met behulp van de aangegeven volumes per monster (van één putje). Het test-protocol kan gemakshalve worden onderverdeeld in twee afzonderlijke werkdagen, zoals aangegeven. Het is echter ook mogelijk om de hele procedure uitvoeren in één dag. Afkortingen: ABB, na ontploffing buffer (zie stap 3.3 in het protocol voor ingrediënten); RSB, resuspensie buffer (zie stap 3.5 in het protocol voor ingrediënten). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Validatie van de LDH sequestration Test waarbij autophagy-remmende stoffen. (A) LNCaP cellen werden ofwel verlaten onbehandeld (met het oog op de achtergrond aftrekken: Zie stap 1.3.2) in volledige groeimedium (CM; RPMI 1640 + 10% foetale runderserum (FBS)), of ze werden behandeld met DMSO voertuig (0,1%) of 100 nM Baf in CM of in serum- en aminozuur gratis medium (EBSS). Bovendien, sommige van de cellen werden behandeld met 3MA (10 mM), SAR-405 (10 µM), of Thapsigargin (300 nM), zoals aangegeven. Na 3U van behandeling, de cellen zijn geoogst en LDH sekwester tarieven werden bepaald als beschreven in het huidige protocol. (B) HEK293 cellen werden behandeld met DMSO voertuig (0,1%) in CM of 100 nM Baf in EBSS, zoals aangegeven. Bovendien ontvangen sommige van de cellen 10 µM MRT67307 (een Grzbietoluski-remmer) of 300 nM Thapsigargin. LDH sekwester tarieven waren vastbesloten na 3U van behandeling. (C-F) MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) of RPE-1 (F) cellen werden behandeld met DMSO voertuig (0,1%) in CM of met Baf (10 nM in C, 100 nM in D-F) in EBSS met of zonder 10 mM 3MA, zoals aangegeven. LDH sekwester tarieven waren vastbesloten na 3U van behandeling. A, B, D, E en F Toon gemiddelde waarden uit drie biologische wordt gerepliceerd (drievoudige wells) van een experiment (n = 1), met de foutbalken die vertegenwoordigen de standaarddeviatie. C toont de gemiddelde waarden uit drie onafhankelijke experimenten (n = 3), met de foutbalken die vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. p < 0,05, ***p < 0.001, herhaald monsters one-way ANOVA.
Figuur 3 : Validatie van de bepaling van de sekwestratie LDH door knock-out (A-C) of (D) knockdown benaderingen. (A-C) ATG5 wild type (WT) of knock-out (KO) MEFs (A), ATG7 WT of KO MEFs (B), of ATG9A WT of KO MEFs (C) werden behandeld met DMSO voertuig (0.01%) in CM of 10 nM Baf in EBSS, zoals aangegeven. LDH sekwester tarieven waren vastbesloten na 3U van behandeling. Gemiddelde waarden van vier (A; n = 4) of drie (B en C; n = 3) onafhankelijke experimenten, met foutbalken die vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. p < 0,05, herhaald monsters two-way ANOVA. N.S., niet significant. (D) LNCaP cellen omgekeerde transfected met 5 werden nM van een nontargeting controle siRNA (siCtrl), of met 5 nM elke van ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- of GABARAPL2-targeting siRNA oligoes, zoals aangegeven. Na 48u, de cellen werden ofwel getrakteerd met DMSO voertuig (0,1%) in CM of 100 nM Baf in EBSS, zoals aangegeven. LDH sekwester tarieven waren vastbesloten na 3U van behandeling. Weergegeven zijn gemiddelde waarden uit drie biologische wordt gerepliceerd (drievoudige wells) van een experiment (n = 1), met de foutbalken die vertegenwoordigen de standaarddeviatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kortom vertegenwoordigt het protocol beschreven hier een betrouwbare en breed toepasbaar methode om bulk autophagic sekwester activiteit in zoogdiercellen te controleren. Vergeleken met de oorspronkelijke methode12,16, hebben we een aantal onnodige stappen verwijderd, vereenvoudigd verscheidene van de resterende stappen en introduceerde een aanzienlijke inkrimping. Dientengevolge, het protocol is sterk verbeterd ten opzichte van kosten - en tijd-efficiëntie, en dezelfde hoeveelheid monsters kan nu worden behandeld in minder dan de helft van de tijd in vergelijking met het oorspronkelijke protocol. Voor 24 monsters, stappen 2-3 (dag 1) vereist ongeveer ½ h van voorbereiding plus 3 h efficiënte werk, overwegende dat stap 4 (dag 2) kan worden uitgevoerd in ~ 2 h (tijd schat gezien het feit dat alle de nodige buffers vooraf zijn voorbereid). Sinds de bepaling op dag 1 wordt meestal voorafgegaan door cel behandelingen, waaronder een 3-4 uur incubatie met Baf of andere remmers van de aantasting van het LDH van de autolysosomal, is het handig om het verdelen van de bepaling in twee opeenvolgende dagen. Het is echter ook mogelijk om uit te voeren van de gehele test in één en dezelfde dag. In dat geval zou het tijd om de module-freeze de monsters in vloeibare stikstof in stap 3.6 en 3.7 besparen. Hoewel niet getest met het huidige protocol, is het waarschijnlijk dat de vries-dooi stap helemaal kan worden overgeslagen, omdat het meer werken versie van de bepaling in primaire rat hepatocyten heeft gedaan zonder deze stap23.
Het protocol hier gepresenteerd kan worden uitgevoerd met relatief gemak. Van de nota is het belangrijk om nauwkeurig in de pipetteren, aangezien de bepaling verschillende stappen van de bemonsterings- en verdunning omvat. Bovendien, het supernatant aspiraties moet worden grondig, zodat de minimale hoeveelheden ionen in de celsuspensie van sacharose in stap 2.5 aanwezig zijn, en zodat als weinig cytosolische LDH mogelijk is de verontreiniging van de gesedimenteerd materiaal in stap 3.6. De bepaling zoals hier beschreven is flexibel voor een breed scala van grondstof. Bijvoorbeeld, in LNCaP cellen, we hebben met succes gebruikt de bepaling met een scala aan verschillende hoeveelheden cellen bij de oogst, spanning tot een 10-fold verschil (van 2,5 x 105 cellen naar 2.5 x 106 cellen). Het minimum grondstof die nodig is wordt bepaald door hoe gevoelig de detectie methode van LDH enzymatische activiteit is. Het protocol kan zeer waarschijnlijk worden geschaald aanzienlijk verder naar beneden, door de schaalvergroting van welke volumes zijn opgebruikt stappen 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 en 4.3.
De meest kritieke factor en technische uitdaging met de test is de stap van de electrodisruption. De sterke, maar kort, elektrische schok van cellen in ion-vrije, isotone oplossing resulteert in een verstoring van het uniform en selectief van het plasma-membraan, terwijl het verlaten van de intracellulaire structuur en organellen (met inbegrip van autophagic vacuolen) intact12, 29. Wanneer aanhangend cuvetten, is het essentieel dat ze de enzymatische en mechanische behandelingen in stappen 2.1-3.1 (mobiele-detachement, centrifugeren en resuspensie) tolereren. Voor stap 3.1 is het niet essentieel zijn voor het verkrijgen van een perfect eencellige schorsing. Bijvoorbeeld, is dit zeer moeilijk te bereiken met de LNCaP cellen. Succesvolle electrodisruption in in de omgeving van 100% van de cellen wordt echter altijd verkregen, zelfs binnen de cel bosjes met tientallen fysiek gekoppelde cellen. Bij het testen van een nieuw celtype, is het raadzaam om te controleren of de efficiëntie van de electrodisruption (zie stap 3.3.1)17. Bijna 100% van de cellen moet permanent Trypan blauw positieve nadat de electrodisruption stap17. Als dit niet het geval, moeten de electroporator-instellingen waarschijnlijk worden gewijzigd. Met behulp van de bepaling in 20 verschillende zoogdieren celtypen, hebben wij nooit moest de electroporator-instellingen wijzigen. Dus, zodra de juiste instellingen voor één zoogdiercellen regel zijn bevonden, is het waarschijnlijk om te werken voor alle overige voertuigtypen van zoogdiercellen. Om te controleren dat de voorwaarden van de electrodisruption niet te hard zijn, volg dat wil zeggen,dat alleen het plasma-membraan, en niet de membranen van intracellulaire organellen hebben verstoord, stap 3.3.2.
Bulk autophagy wordt uitgevoerd door autophagosomes die mede aanzienlijke hoeveelheden cytosol samen met andere lading sekwestreren. Dit kan gebeuren via puur niet-selectieve autophagy van gedeelten van het cytoplasma, of op een wijze die een mix van selectieve en niet-selectieve autophagy vertegenwoordigt. Tot op heden is niet duidelijk of of naar welke graad selectieve en niet-selectieve autophagy samenleven als twee verschillende modi voor autophagy of of autophagosomes als een regel tegelijk sekwestreren cargo in zowel de selectieve en de niet-selectieve manieren. Nog belangrijker is, echter, een recente studie gemeld dat activators van selectieve autophagy een vergelijkbare toename van de bulk cytosolische lading sekwester zoals de inbeslagneming van de specifieke lading30 induceren. Resultaten van onze eigen laboratorium zijn het eens met dit (onze niet-gepubliceerde resultaten). Analyseren van de inbeslagneming van oplosbare cytosolische eiwitten (bijvoorbeeld LDH) dus waarschijnlijk heeft het potentieel voor de opsporing van wijzigingen in macroautophagic sekwester activiteit onder velen, als niet alle voorwaarden. Echter, hoewel het nog moet worden bewezen, kan niet worden uitgesloten dat bepaalde soorten voorwaarden uniek veroorzaken een soort selectieve-exclusieve autophagy waar de lading zo strak door het phagophore dat zelfs cytosol verpakt wordt is uitgesloten afgezonderd worden in de autophagosome. Om te zoeken naar of dergelijke situatie kan bestaan, moeten de bulk autophagy testen zoals de bepaling van de sekwestratie LDH parallel met selectieve autophagy testen worden uitgevoerd.
Een van de belangrijkste voordelen van de bepaling van de sekwestratie LDH is dat het de inbeslagneming van endogene lading, waardoor het een breed toepasbare methode meet. Bovendien meet de assay sekwester activiteit in een zeer kwantitatieve manier. De bepaling van de sekwestratie LDH is een belangrijk instrument voor de studie van de mechanismen en de regulering van de vorming van de autophagosome, sinds de open phagophores niet kan sekwestreren LDH. Het is erg lastig en moeilijk, zo niet onmogelijk, om te beoordelen of autophagosome-achtige structuren verzegeld entiteiten zijn of niet door elektronenmicroscopie. Een andere methode die wordt gebruikt om te analyseren of autophagosomes zijn gesloten is voor het testen van de gevoeligheid van autophagy markers (bijv LC3) of receptoren (b.v., sequestosome 1 (p62/SQSTM1) of nucleaire dot eiwit 52 (NDP52)) aan proteasen10 ,31,32. Het nadeel van deze test is dat men bestudeert protease bescherming van kar componenten in plaats van autophagic lading. Bovendien, aangezien de bepaling is gebaseerd op het westelijke bevlekken, het is alleen semi-kwantitatieve.
Overwegende dat de mogelijkheid om het analyseren van autophagy van endogene lading een voordeel is, is een inherente beperking met de bepaling van de sekwestratie LDH en eventuele andere tests die sekwestratie van endogene lading beoordelen, dat een afbraak-remmer moet worden opgenomen met het oog op onderscheiden van specifieke effecten op de autophagic van de sekwestratie dan netto effecten van de sekwestratie en afbraak. Efficiënte remmers van de aantasting van het LDH omvatten protonpompinhibitoren als agenten van de Baf of concanamycin een3,16,18, en lysosomotropic als chloroquine en ammoniumchloride33. De protease inhibitor leupeptin werkt goed in primaire rat hepatocyten23, maar is over het algemeen inefficiënte in de zoogdieren cellijnen die we hebben getest. We gebruiken routinematig Baf13, dat werkt snel en is zeer efficiënt in zowel de nonmalignant als de kwaadaardige cellen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat geen van de LDH-afbraak-remmers volledig specifieke zijn en vermeende gevolgen van de remmers autophagy kunnen niet worden uitgesloten. Om het risico van niet-specifieke invloed, is het aan te bevelen te gebruiken van de concentraties van de Inhibitor van de omwenteling die gewoon op het verzadigen van de niveaus en op te nemen van de Inhibitor van de omwenteling alleen voor de laatste paar uur (3-4 h) van het experiment. De saturating concentratie van Baf moet worden bepaald voor elk celtype. Als een gids, 50 – 100 nM is verzadigen voor de meeste van de gekweekte zoogdiercellen cellijnen die we getest hebben, terwijl sommige cel typen zoals MEFs vereisen slechts 10 nM Baf voor een volledige blok LDH degradatie.
Een duidelijke beperking met de bepaling van de sekwestratie LDH is dat het kan alleen worden uitgevoerd op levende cellen, dus met uitzondering van het gebruik ervan voor analyse van autophagy in vaste cellen en weefsels. Aan de andere kant, er zijn momenteel geen tests vastgesteld die functionele autophagic activiteit in vaste cellen kunnen meten. Hoewel niet getest met het huidige protocol, moet het heel goed mogelijk met de bepaling van de sekwestratie LDH te beoordelen van in vivo autophagic sekwester activiteit in experimentele organismen. De beperking zou dat het organisme behandeling met een inhibitor van de omwenteling van lysosomale LDH degradatie moet tolereren, en dat de periode tussen deze behandeling en de prestaties van de test moet relatief kort, tot een minimum beperken van mogelijke niet-specifieke gevolgen van de Inhibitor van de omwenteling. Interessant, een vroege studie door Kominami et al., aangegeven dat 3 – 6 h behandeling van ratten met leupeptin (intraperitoneale injectie van 2 mg/100 g lichaamsgewicht) wenselijk is te observeren van efficiënte accumulatie van autophagically afgezonderd LDH in lever subcellular breuken verrijkt voor autophagic vacuolen34.
Ectopische expressie fluorescerende sekwester pH-gevoelige sondes zoals Rosella35 of Keima36 kan worden gebruikt voor het visualiseren van autophagic sekwester zonder de noodzaak van het opnemen van afbraak-remmers. Bovendien, in tegenstelling tot het LDH sekwester assay, kunnen dergelijke benaderingen te visualiseren autophagic sekwester in afzonderlijke cellen worden gebruikt. Bovendien kan fusion van de sonde naar organel-targeting sequenties worden gebruikt voor het controleren van de sekwestratie van specifieke organellen. Krachtige microscopische platformen kunnen ook toestaan voor high-throughput screening analyses. De nadelen zijn dat ectopische sonde expressie, evenals de accumulatie van de sonde in de lysosomale systeem, het autophagic traject kan beïnvloeden. Bovendien, in tegenstelling tot het LDH sekwester assay is een afhankelijk van cellen die efficiënt kunnen zijn transfected. Ten slotte, dat de bepaling van de sekwestratie LDH een rechttoe-rechtaan kwantitatieve output van percentage afgezonderd cytosol voorziet, de beeld-gebaseerde methoden kunnen niet in het algemeen bieden dit soort absolute kwantitatieve uitvoer. Het zou wenselijk zijn om gebruik van beide soorten benaderingen in een complementaire wijze. Een andere uitstekende methode om te studeren van autophagic sekwester zonder de noodzaak voor afbraak remmers is radiolabeled raffinose ingevoerd in cellen door omkeerbare electro-permeabilization3,23,37, 38. Raffinose is een membraan-impermeant en metabolisch inert suiker dat resistent is tegen lysosomale enzymen. Daarom kan zijn autophagic sekwester worden gevolgd door scheiding van cytosolische van sedimentable cel breuken3,23,37,38. Deze aanpak is, echter, meer tijd in beslag dan het LDH sekwester assay, en vereist extra veiligheidsmaatregelen ten gevolge van het gebruik van radioactiviteit. Tot slot, het eindresultaat van de bulk autophagic sekwestratie en onbelemmerde autophagic lading flux, de afbraak van langlevende eiwitten, nauwkeurig kan worden gemeten door een gevestigde eiwit etikettering gebaseerde methode39,40 ,41,42,43. Echter, in tegenstelling tot het LDH sekwester assay, deze methode voorziet niet een specifieke uitlezing autophagic activiteit, aangezien langlevende eiwitten ook door andere mechanismen dan autophagy, vooral door het systeem van de remmen afgebroken zijn (overwegende dat LDH sekwester treedt alleen op als gevolg van autophagy). Daarom een aantal controle behandelingen moeten regelmatig worden opgenomen, bijvoorbeeld chemische inhibitoren van autophagic-lysosomale of aantasting van de remmen en genetische interferentie met autophagy3,16.
De bepaling van de sekwestratie LDH kan worden vergeleken met de veelgebruikte LC3 flux testen, die LC3-II door het westelijke bevlekken of de vorming van de puncta van de LC3 door fluorescentie imaging in de afwezigheid of de aanwezigheid van inhibitors van lysosomale LC3 afbraak meten (Baf is het meest vaak gebruikt), of de overgang van fluorescently tagged LC3 varianten aan zure omgevingen22. Hoewel deze LC3 gebaseerde testen nuttige informatie bieden kunnen, kunnen ze moeilijk te interpreteren, met name omdat de relatie tussen de mate van LC3 flux en de hoeveelheid en het soort lading flux onbekend is. Zoals vermeld in de inleiding, vereisen bulk autophagy en Parkin-afhankelijke mitophagy geen LC3 familie eiwitten9,10,11,44. Bovendien, in hepatocyten uitgehongerd rat, LDH sekwestratie en afbraak opbrengst ononderbroken tijdens perioden wanneer er geen autophagic-lysosomale LC3 flux9. Dus, in dit geval lading flux kan worden volledig gescheiden blijft van LC3 flux. Meer onderzoek vergelijken LC3 flux met verschillende soorten lading flux is nodig om de resultaten verkregen met LC3 flux tests beter te interpreteren.
In zijn huidige vorm is de LDH sequestration Test vergelijkbaar met het westelijke bevlekken in termen van hands-on tijd en kosten. In termen van bulk autophagy te meten, het is minstens zo efficiënt als de sekwestratie raffinose gebaseerde bepaling of de bepaling van de afbraak langlevende eiwitten zoals hierboven beschreven. Voor specifieke meting van bulk autophagic sekwester activiteit en vorming van gesloten autophagosomes is veel efficiënter en rechttoe-rechtaan dan LC3 flux testen of protease bescherming testen van LC3 of autophagy receptoren, sinds de laatste testen maatregel kar componenten in plaats van werkelijke lading. Hoewel we hebben aanzienlijk verbeterd de doorvoer van de LDH sequestration Test, het is verre van een high-throughput assay, en het kan niet concurreren met de efficiëntie van de hierboven beschreven tests die op basis van installatiekopieën. Echter zowel de beeld-gebaseerde testen en de bepaling van de sekwestratie LDH hebben hun voor- en nadelen, en beide soorten testen hebben dus hun eigen waarden. Het is waarschijnlijk mogelijk via toekomstige aanpassingen om het LDH sekwester assay halve hoge gegevensdoorvoer. Bijvoorbeeld, het moet mogelijk zijn voor het uitvoeren van electrodisruption in een 96-Wells-formaat, en het is denkbaar dat cytosolische LDH van afgezonderd LDH door filtratie in plaats van centrifugeren kan worden gescheiden, of dat de stap van centrifugeren kan worden uitgevoerd in een 96- goed formaat. Bovendien testen voor het meten van LDH activiteit die veel gevoeliger dan die is gebruikt in het huidige protocol zijn hebben ontwikkeld, en zijn commercieel verkrijgbaar. Andere interessante toekomstige potentieel van de bepaling zijn het vermeende gebruik ervan in andere celtypes dan zoogdiercellen, bijvoorbeeld in gist of andere eencellige organismen, of zelfs plantaardige cellen, alsmede het gebruik ervan voor in vivo metingen van autophagic de activiteiten van de sekwestratie in weefsels van experimentele organismen.
Kortom, wij zijn van mening dat de bepaling van de sekwestratie LDH in zijn verbeterde en vernieuwde vorm een belangrijk instrument in toekomstige autophagy-onderzoek zijn zal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflict van belang.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door de Raad onderzoek van Noorwegen, de Universiteit van Oslo, de Anders Jahre Foundation, de Nansen-Stichting en de erfenis in het geheugen van Henrik Homan. Wij danken Dr. Noboru Mizushima voor de ATG5 +/ + MEFs en ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu voor de ATG7 +/ + MEFs en ATG7-/-MEFs en Dr. Shizuo Akira voor het ATG9A +/ + MEFs en ATG9A-/-MEFs. Wij bedanken Frank Sætre voor technische bijstand, en Dr. Per O. Seglen voor constructieve methodologische discussies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µL) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µL) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1,000 µL) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
References
- Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
- Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
- Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
- Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
- Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
- Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
- Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
- Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
- Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
- Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
- Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
- Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
- Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
- Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
- Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
- Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
- Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
- Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
- Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
- Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
- Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
- An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
- Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
- Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
- Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
- Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
- Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
- Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
- Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
- Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
- Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
- Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).
