Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères

doi: 10.3791/57971 Published: July 27, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Un protocole simple et bien validé pour mesurer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères est décrit ici. La méthode est basée sur la quantification de la proportion de la lactate déshydrogénase (LDH) dans les fractions de cellules sédimentables par rapport aux niveaux LDH cellulaires totales.

Abstract

En vrac autophagie est caractérisée par la séquestration de larges portions du cytoplasme en double/multi-membrane structures appelées autophagosomes. Un protocole simple de contrôler ce processus est décrit ici. En outre, les résultats typiques et validation expérimentale de la méthode dans des conditions inductrices d’autophagie dans divers types de cellules mammifères cultivées sont fournis. Au cours de l’autophagie en vrac, autophagosomes séquestrer le cytosol et aussi des protéines cytosoliques solubles, aux côtés d’autres cargaisons autophagie. LDH est stable et très abondant, soluble enzyme cytosolique qui est non sélective séquestré dans autophagosomes. Le montant de la séquestration du LDH reflète donc la quantité de séquestration autophagique en vrac. Pour efficacement et précisément déterminer la séquestration de LDH dans les cellules, nous utilisons un protocole basé sur electrodisruption de fractionnement qui sépare efficacement sédimentables LDH cytosolique, suivie de la mesure de l’activité enzymatique dans sédimentables fractions par rapport à des échantillons de cellules entières. Séquestration de l’autophagie est déterminée en soustrayant la proportion de sédimentables LDH dans les cellules non traitées que dans les cellules traitées. L’avantage de l’essai de séquestration de LDH est qu’il donne une mesure quantitative de la séquestration autophagique du fret endogène, par opposition à d’autres méthodes que soit impliquent l’expression ectopique de sondes de séquestration ou semi-quantitatifs protéase analyses de la protection des récepteurs ou des marqueurs de l’autophagie.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Autophagie (du grec « se manger ») est un processus évolutif et conservé pour dégradation lysosomale/vacuolaire du matériel intracellulaire. Lors de la découverte des gènes liés autophagie (« ATG »), qui sont importants pour l’autophagie chez les levures et les humains, et la réalisation que l’autophagie joue un rôle important dans la santé humaine et de la maladie (reconnu par le prix Nobel de médecine ou de physiologie à 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagie est rapidement devenu un des procédés plus intensément étudiés en cellule biologie1,2.

Macroautophagy (ci-après dénommé « autophagie ») est caractérisée par l’expansion et pliage de saccules membranaires intracellulaire (« phagophores ») dans des structures scellées, double - ou multi - membrane (« autophagosomes ») séquestrent efficacement le enveloppé de matériel du reste du cytoplasme. Lors de la fusion des autophagosomes avec les lysosomes, la membrane intérieure autophagosomal et la cargaison séquestrée est dégradée et recyclés. Autophagosomes peut piéger le matériel cytoplasmique en aléatoire (autophagie non sélectif) et manières sélectives (autophagie sélective). En vrac autophagie probablement représente un mélange de l’autophagie non-sélective et sélective.

Dans les années 60 et 70 (« l’ère morphologique » de la recherche de l’autophagie), séquestration autophagique a été principalement évaluée au moyen d’analyses ultrastructurales. Dans les années 1980 et au début des années 1990 (« l’ère biochimique ») par Seglen et collègues de travail — qui a étudié l’autophagie dans les hépatocytes primaires de rat — mis au point les premières méthodes pour mesurer quantitativement la séquestration autophagique activité3. À l’aide de ces tests, Seglen défini et caractérise les différentes étapes de la voie autophagique lysosomal4,5, découvert et a inventé l’amphisome6 (le produit de la fusion de l’endosome-autophagosome) et fut le premier à décrire le rôle de la phosphorylation des protéines l’autophagie règlement7. Cependant, après la découverte des ATGs dans les années 1990 (« l’ère moléculaire ») et la première caractérisation d’une protéine ATG8 chez les mammifères, les protéines associées aux microtubules 1 a/1 b-light chain 3 (LC3) 20008, l’utilisation de protéines ATG comme marqueurs pour la processus autophagique rapidement gagné en popularité, et les plus âgés et plus laborieux des méthodes biochimiques ont été laissés. En fait, sur les 18 dernières années, les tache occidentale et les analyses de microscopie de fluorescence de LC3 sont devenues de loin la plus populaire (et dans bien des cas la seule) moyens d’étudier l’autophagie des cellules de mammifères. L’avantage est la facilité par laquelle ces méthodes peuvent être effectuées. L’inconvénient est que l'on étudie un composant du panier (LC3) plutôt que de réel autophagique fret. Il s’agit d’un inconvénient plutôt sérieux, parce que la relation entre les Etats et/ou les flux de LC3 par la voie contre la séquestration et de la cargaison n’est pas très claire. En fait, nous avons montré que le flux de cargaison en vrac peut être maintenue à des niveaux élevés dans des conditions où il n’y a aucun flux LC3, malgré la présence de LC3 conjugués dans les cellules9. En outre, nous avons démontré que l’autophagie en vrac n’est pas affectée par l’appauvrissement LC3 efficace et donc probablement est indépendant du LC39. Cette constatation est confirmée plus tard par LC3 études knock out10,11, qui indiquent également que mitophagy Parkin-dépendante (l’autophagie sélective des mitochondries) est indépendant de LC310,11 .

En résumé, il n’y a absolument besoin pour analyses fret surveiller l’activité de l’autophagie. Façon optimale ces tests devraient être largement applicable, bien définie et facile à exécuter. Au cours de ces dernières années, nous avons pris un intérêt particulier pour le test de fixation du LDH, qui a été développé par Seglen dans les années 198012et repose sur la mesure de la cession de LDH cytosolique à sédimentables, cellule de contenant des vacuoles autophagique fractions. LDH est une protéine cytosolique stable, soluble qui est séquestrée facilement conjointement au moment où phagophores enwrap fret cytoplasmique. Séquestration de LDH est donc une mesure générale de séquestration de l’autophagie. LDH est exclusivement dégradée par la voie autophagique lysosomal12. Ainsi, en présence d’inhibiteurs de dégradation lysosomale, par exemple, bafilomycine A1 (Baf)13, directement les effets du traitement expérimental reflètent altérations dans l’activité de séquestration autophagie. En l’absence d’inhibiteurs de la dégradation, l’effet net des altérations dans la séquestration de la LDH et de la dégradation peut être mesurée.

Le test de fixation du LDH est largement applicable, puisque la LDH s’exprime fortement et de façon ubiquitaire dans tous les types de cellules, et des niveaux LDH peuvent être quantifiées avec précision par un dosage enzymatique14,15. Toutefois, l’original du protocole12 — établi dans les hépatocytes primaires de rat — est plutôt fastidieux et requiert une grande quantité d’à partir de matériel comme un condensateur de décharge électrique sur mesure. De manière progressive, nous avons progressivement transformé l’essai dans une méthode simple et versatile. Tout d’abord, le protocole original a été adapté pour une utilisation dans des cellules de mammifères lignes16. Deuxièmement, la méthode a été substantiellement à échelle réduite de3,9. Troisièmement, plusieurs étapes dans le protocole ont été éliminés, y compris un coussin de densité laborieuse étape17. En même temps, cela a permis une réduction encore plus loin de la méthode, dans le point de départ original d’utiliser une plaque de 10 cm par exemple16 pour utiliser un seul puits d’une plaque de 12 puits par échantillon (soitenviron 15 fois moins à partir le matériel)17. Quatrièmement, nous avons identifié un appareil commercial électroporation qui pourrait remplacer le condensateur de décharge électrique sur mesure17.

Notre protocole à jour de l’essai de fixation du LDH, qui comprend quelques simplifications supplémentaires de la méthode par rapport à la publiées antérieurement17 est présenté ici. En outre, un ensemble de résultats typiques obtenus dans un certain nombre de différents types de cellules s’affiche, et important, plusieurs lignes de validations expérimentales de la méthode à l’aide de knockdown pharmacologique mais aussi génétique et approches knockout sont fournis. Pour un projet global de flux du protocole entier, voir la Figure 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. cellule ensemencement et traitement

  1. Cellules adhérentes de la culture dans des flacons de culture de tissu de2 cm 75 dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C, en utilisant le milieu de culture privilégié pour le type de cellule en question. Laissez les cellules jusqu'à ce qu’ils atteignent une couche de cellules de proximité-anastomosé.
    Remarque : Utiliser un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) pour LNCaP, HEK293, fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs), BJ, MCF-7 et cellules pre-1.
    1. Laver les cellules avec 3 mL 37 ° C tampon phosphate salin (PBS), pH 7,4. Remplacez les PBS avec 3 mL de 0,25 % (p/v), la trypsine-éthylènediaminetétraacétate (EDTA) et incuber la fiole dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules détachement (2 à 5 min).
    2. Remettre en suspension les cellules individuelles avec 7 mL de milieu de culture contenant 10 % FBS. Mélanger une quantité de suspension de cellules de 10 µL à 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan dans un tube de microcentrifuge, à l’aide d’une pointe de pipette 0,5 – 20 µL. Utiliser la même pipette pour pourvoir immédiatement une diapositive comptage de la chambre et compter les cellules dans un compteur de cellules automatisées.
  2. Préparer une dilution (voir note ci-dessous) de la suspension cellulaire en faisant étape 1.1.2 culture moyenne contenant 10 % FBS et semences 1 mL de la suspension cellulaire dilué dans chaque puits d’une plaque (superficie ~3.8 cm2) en culture de tissu de 12 puits utilisant aseptique technique. Permettre la croissance dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C jusqu'à ce que la densité de la cellule souhaitée est atteinte, par exemple, de 60 à 90 % confluence à la récolte.
    Remarque : La dilution appropriée de la suspension cellulaire qui donnera à la confluence de la cellule souhaitée à la récolte varie de type cellulaire de type cellulaire, ainsi que selon la durée et le type de traitements expérimentaux. Par conséquent, cela doit être évaluée empiriquement dans chaque cas.
    1. Pour des expériences qui doivent être tous deux traitement et récolté 2 jours après le semis, semences 2,5 x 105 LNCaP, HEK293, ou MCF-7 cellules, MEFs4 5 x 10, 4 x 105 BJ ou 1,5 x 105 pre-1 éléments dans chaque puits de la plaque de 12 puits.
    2. Pour les cellules qui adhèrent librement, enduire les plaques avec le type de revêtement recommandé pour le type de cellule en question. Pour les cellules LNCaP (et HEK293) utiliser plaques recouvertes de poly-D-lysine (PDL).
    3. À cette fin, ajouter 500 µL PDL à 2,5 µg/mL stérile H2O dans chaque puits et incuber les boîtes dans un environnement stérile pendant 30 min à température ambiante (20 à 25 ° C). Retirer le PDL avec aspiration et laver chaque bien brièvement avec 1 mL stérile H2O.
      Remarque : En général, l’étape 1.2.1 est faite sans traitement expérimental. Toutefois, si vous effectuez l’ARNi, il peut être pratique démarrer une transfection inverse avec le semis9.
  3. Effectuer des traitements expérimentaux dans les puits en doubles ou en triple par État.
    1. Par exemple, traiter les cellules avec 50 nM de la Torin1 inhibiteur de mTOR, qui généralement est un inducteur efficace de séquestration autophagique, ou sous réserve des cellules à la famine aiguë de sérum et d’acides aminés par laver les cellules avec 1 mL d’Earle exempte d’acides aminés est équilibré Support de la Solution (EBSS) de sel et ensuite Incuber les cellules dans 1 mL de EBSS dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C.
    2. Laisser un jeu de puits non traitée afin de définir des niveaux de fond des sédimentables LDH.
    3. Ajouter une quantité saturante de l’inhibiteur de la fixation du post bafilomycines A1 (Baf)3,13,16,18 en l’absence ou la présence des traitements expérimentaux, 3 – 4 h avant cellule la récolte. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2 à 37 ° C.
      1. Utilisez les 100 nM Baf pour LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 et cellules pre-1 et 10 nM Baf pour MEFs.
      2. Pour les traitements expérimentaux qui ont une durée de seulement 3 à 4 h (comme ces étape illustré en 1.3.1 ont généralement), ajouter Baf simultanément avec les traitements. Pour plus de traitements expérimentaux, attendre 3-4 h avant la récolte et ajouter 2 µL d’une 500 x concentré Baf stock directement dans le milieu.
      3. Mélanger en agitant la plaque immédiatement après l’ajout de la Baf. À ce stade, il est également recommandé d’ajouter macroautophagic inhibiteurs de la séquestration des contrôles, par exemple, 10 mM de la pan-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) inhibiteur de la 3-méthyl adénine (3MA)19ou 10 µM de la classe sélective du PI3K III inhibiteur de la SAR-40520.

2. récolte et préparation pour Electrodisruption des cellules

  1. À la fin de la période de traitement, aspirer d’aspiration au milieu et ajouter 200 µL de solution détachement de cellules (préchauffé à 37 ° C) dans chaque puits. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules détachement (généralement autour de 5 min).
    NOTE : Considérant que 0,25 % (p/v), la trypsine-EDTA peuvent servir au lieu de la solution de détachement cellulaire, ce dernier contient DNase, qui permet de réduire la viscosité des cellules individuelles. Aussi longtemps que le milieu est complètement aspiré, il n’est pas nécessaire de laver les cellules avant l’addition de trypsine-EDTA ou cellule solution de détachement.
  2. Ajouter 500 µL température ambiante (20-25 ° C) PBS, pH 7,4, contenant 2 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) dans chaque puits et remettre en suspension à l’aide de la pipette jusqu'à ce qu’aucun amas de cellules ne sont visibles. Transférer immédiatement la suspension cellulaire aux tubes de microcentrifuge de 1,5 mL sur la glace.
    Remarque : Sauf indication contraire, effectuez toutes les étapes subséquentes sur la glace.
  3. Sédiments les cellules par centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Bien aspirer le surnageant (par aspiration) pour laisser les granules cellulaires aussi sèches que possible.
  5. Ajouter 400 µL 10 % (p/v) de sucrose (dans ultrapure H2O) dans chaque tube.

3. Membrane plasmique Electrodisruption et séparation des Fractions de cellules sédimentables et Total

  1. Resuspendre le culot cellulaire avec une pipette pour obtenir une suspension de cellules individuelles proche et de le transférer à une cuvette d’électroporation de 4 mm.
    NOTE : Pipetage va-et-vient ~ 10 à 15 fois, à l’aide d’une pointe de pipette 100 – 1 000 µL, est généralement suffisant.
  2. Placez la cuve dans une électroporateur vague de décroissance exponentielle et acquitter une seule impulsion électrique à 800 V, 25 µF et 400 Ω ; ces paramètres de produisent une impulsion de durée ~ 8 ms.
  3. Un nouvel embout de la pipette permet de transférer le disruptate de cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL contenant 400 µL de solution de saccharose glacée de tampon phosphate (monophosphate de sodium 100 mM, 2 mM le dithiothréitol (DTT), EDTA de 2 mM et 1,75 % de sucrose, pH 7,5) et mélanger brièvement en pipetage.
    1. Facultatif : Pour vérifier la membrane plasmique efficace electrodisruption17, mélanger 10 µL de la disruptate cellulaire dilués à l’étape 3.3 avec 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Transférer vers une chambre de comptage et de vérifier que le pourcentage de cellules positives le bleu Trypan est > 99 %.
      1. Laisser l’échantillon dans la chambre de comptage pendant 30 min à température ambiante (20 à 25 ° C) et vérifiez que le pourcentage de cellules positives le bleu Trypan est resté > 99 %.
    2. Facultatif : Pour vérifier que l’electrodisruption n’a pas été trop sévère, autrement dit, il n’a pas perturbé organites intracellulaires, effectuez les étapes 1.1 – 3.3 comme décrit ci-dessus, mais utilisez un plus grand produit de départ (un puits d’une plaque de 6 puits avec une couche de cellules confluentes de ~ 80 %), et utiliser 150 µL 10 % de saccharose en étape 2.5 et 150 µL tampon phosphate une solution de saccharose sans TNT à l’étape 3.3.
      1. Utiliser une pipette à soigneusement couche 200 µL de la solution de disruptate cellule dilué sur un coussin de densité 1,2 mL de milieu dégradé densité de 8 % (p/v) tamponnée au phosphate (par exemple, 8 % Nycodenz, phosphate de sodium de 50 mM, 2,2 % de sucrose, EDTA 1 mM) dans une centrifugeuse de 2 mL tube. Centrifuger à 20 000 x g pendant 45 min à 4 ° C dans une micro-centrifugeuse avec fonction soft-mode (pour légère accélération et de décélération) et rangez soigneusement les tubes sur la glace.
      2. Retirez soigneusement les 60 µL de la fraction supérieure ~ 200 µL, en veillant pas à ramasser toute solution moyenne gradient de densité et transférer dans un tube de microcentrifuge fraîches.
        Remarque : Cela devrait contenir cytosol d’une pureté exceptionnelle, appelée « suc cellulaire »21.
      3. Test de la pureté de la fraction obtenue dans l’étape précédente, en effectuant des analyses par transfert western des protéines contenus organite, utilisant des techniques standards et de gels dégradé de 4 à 20 %16.
      4. Exécuter par exemple immunoblotting pour cathepsine B21, le cytochrome c et isomérase de bisulfure de protéine, pour vérifier que l’électrocution à l’étape 3.2 n'a pas perturbé les lysosomes, mitochondries ou réticulum endoplasmique, respectivement et immunoblot pour LDH pour vérifier la présence d’une protéine cytosolique dans le suc cellulaire.
      5. En parallèle, effectuer l’immunotransfert sur extraits protéiques issus de la cellule total disruptate solution16 pour confirmer que les anticorps utilisés peuvent détecter les protéines organelle autonomes qui sont évaluées.
  4. Répétez les étapes 3.1 – 3.3 pour chaque échantillon.
  5. Séparer la 550 µL de chaque solution de disruptate cellule dilué (obtenue à l’étape 3.3) tubes de microcentrifuge de 2 mL contenant 900 µL glacee tampon de resuspension (monophosphate de sodium de 50 mM, 1 mM DTT, EDTA 1 mM et 5,9 % de sucrose, pH 7,5) additionné de 0,5 % de BSA et 0,01 % Tween-20 et mélanger brièvement par pipetage.
  6. Centrifuger à 18 000 x g pendant 45 min à 4 ° C pour produire des granulés contenant « sédimentée LDH ». Bien aspirer le surnageant (par aspiration) pour laisser les granules aussi sèches que possible. Placer les échantillons dans un congélateur à-80 ° C.
  7. Transférer 150 µL de chaque solution de disruptate cellule dilué (obtenue à l’étape 3.3) dans de nouveaux tubes et placer les échantillons dans un congélateur à-80 ° C. Utiliser ces échantillons pour déterminer les niveaux de « total des LDH » dans les cellules.
    Remarque : À ce stade, l’expérience peut être suspendue pour aussi longtemps que vous le souhaitez.

4. LDH Extraction et mesure de l’activité enzymatique de la LDH

  1. Décongeler la LDH « sédimentée » (de l’étape 3.6) et échantillons « total LDH » (de l’étape 3,7) sur la glace.
  2. Ajouter 300 µL de tampon de resuspension glacée contenant 1,5 % X-405 Triton à la LDH « totale » des échantillons (ce qui donnerait une concentration finale de Triton X-405 de 1 %). Faire pivoter les échantillons sur un rouleau dans une chambre froide (4 – 8 ° C) pendant 30 min.
  3. Ajouter 750 µL de tampon de resuspension glacée avec 1 % X-405 Triton à la LDH « sédimentée » échantillons et remettre en suspension les boulettes avec une pipette jusqu'à obtenir une solution homogène.
  4. Centrifuger les échantillons à l’étape 4.2 et 4.3 à 18 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour les sédiments non dissous les débris cellulaires.
  5. Mix 4 pièces de l’imidazole froid 65 mM (pH 7.5)/0.75 mM pyruvate avec une part de l’imidazole froid 65 mM (pH 7.5) / 1,8 mM NADH pour obtenir une solution de travail qui est stable pendant au moins trois semaines à 4 ° C.
  6. Mélanger 3 – 30 µL de surnageants de l’étape 4.4 avec 200 µL de la solution de travail étape 4.5.
  7. Déterminer le montant de la LDH en mesurant l’activité enzymatique LDH comme la baisse de la nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite) absorbance (NADH) à 340 nm à 37 ° C par rapport à un étalon avec une concentration connue de la LDH. Effectuer des mesures d’absorbance jusqu'à ce que la réaction a approché l’achèvement, c'est-à-dire jusqu'à l’absorbance à 340 nm ne change avec le temps.
    NOTE : Ceci est la méthode biochimique classique pour mesurer l’activité de la LDH. Bien que le protocole actuel effectue la réaction à 37 ° C, elle peut également être réalisée à température ambiante (20 à 25 ° C), qui est conseillé si spectrophotométrie manuelle à faire. Le protocole actuel utilise un instrument robotique multianalyzer, qui, de manière automatisée, mélange d’échantillons avec la solution de travail dans une plaque à 96 puits et mesure l’absorbance à 340 nm à 37 ° C toutes les 20 s pendant 3 min. Par la suite, le logiciel de l’instrument calcule la concentration de la LDH, exprimée en unités (U) / L, en comparant la pente de la mesure d’absorbance dans le temps par rapport à une courbe d’étalonnage obtenue par étalonnage avec une norme de LDH connu concentration. La gamme linéaire de détection de cette approche est 30 – 1 500 U/L. Comme alternative, il existe une grande variété de kits disponibles dans le commerce pour mesurer la LDH. Certains d'entre eux sont basés sur la réaction enzymatique à la génération de produits colorimétriques ou fluorescentes, permettant la détection par d’autres moyens que la spectrophotométrie UV et avec les autres cuisinières linéaires de détection de couplage.

5. calcul de la séquestration du LDH

  1. Calculer le pourcentage de LDH sédimenté de LDH totale pour chaque échantillon, prenant les dilutions et d’échantillonnage en compte :
    LDH sédimentée (%) =Equation 1
    Remarque : Au cours des étapes 3.1 – 3.3 environ 50 µL est perdue en raison du transfert dans et hors de la cuvette d’électroporation. Ainsi, calculer d’avoir un total de 750 µL (au lieu de 800 µL) de disruptate cellule dilués à l’étape 3.3.
  2. Soustraire le pourcentage de LDH sédimenté acquis dans les échantillons de cellules non traitées (étape 1.3.2) du pourcentage de LDH sédimenté acquis dans des échantillons de cellules traitées expérimentalement et diviser par la durée du traitement avec la Baf pour obtenir le pourcentage de LDH séquestré par heure pendant la période d’échantillonnage :
    Séquestré LDH (% / h) =Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En utilisant le protocole décrit ici, activité autophagique séquestration en vrac dans un certain nombre de lignées cellulaires chez les mammifères, y compris LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, T47D, U2OS, PC3, MCF-7, G361, (MEFs) les fibroblastes embryonnaires de souris, pre-1, On a mesuré les cellules HEK293, BJ et LNCaP. Sequestration a été évaluée dans les conditions basales (dans un milieu complet, riche en nutriments), ou dans les cellules aiguë affamée de sérum et d’acides aminés (un bona fide induisant autophagie condition22). Les résultats indiquent que l’activité de la LDH séquestration dans des conditions de famine varie largement différentes lignées cellulaires, allant à peine détectables dans LAPC4, DU145, Huh7 et PNT2 cellules (données non présentées) à ~1.6%/h dans les cellules LNCaP (Figure 2 A). Le taux observé dans les hépatocytes primaires de rats affamés est plus élevé que dans les lignées cellulaires mentionnées ci-dessus et en général varie de 2.5–4%/h23. Dans des conditions basales, séquestration de la LDH a été pratiquement indétectable dans la moitié des lignées cellulaires testées et variait entre ~0.2%/h et ~0.5%/h dans l’autre moitié (données non présentées). Dans les lignées de cellules qui présentent une activité de séquestration autophagique basale détectable, famine aiguë de sérum et d’acides aminés induit généralement une augmentation de 3 à 4 fois taux de séquestration de LDH (voir, par exemple, l’expérience de LNCaP illustré à la Figure 2A). Dans les lignées de cellules testées (mentionnées ci-dessus), le pourcentage de fond de LDH sédimenté acquis dans des échantillons de cellules non traitées (étape 1.3.2) est généralement environ 2 à 3 %. De 22 expériences indépendantes réalisées dans diverses lignées cellulaires, le coefficient intra-laboratoire de variation (CV) entre les valeurs LDH sédimentées (% sédimentée LDH) des répliques de traitement était de ± 5,8 % 1,7 % (CV % en moyenne ± écart-type), allant de 3.0 – 9,0 %. Ensemble, ces chiffres donnent une indication de ce qu’il faut s’attendre lorsque vous effectuez le test de fixation du LDH dans les cellules de mammifères.

Utilisation d’inhibiteurs chimiques comme bien que génétique knockout et choc s’approche, largement vérifie que le test de fixation du LDH mesure fiable l’activité autophagique séquestration. Formation de l’autophagosome nécessite active PI3K de classe III (PIK3C3) et Unc-51 comme l’autophagie, activation de la kinase (ULK)24, en plus d’équilibrer l’intracellulaire Ca2 + de l’homéostasie du16. Comme le montre la Figure 2A, LDH basale et induite par le jeûne séquestration est complètement abolie par le pan-PI3K inhibiteur 3MA, la SAR-405 d’inhibiteur sélectif PIK3C320ou l’ER Ca2 + pompe thapsigargine inhibiteur (TG) 25 dans les cellules LNCaP. Séquestration de LDH dans des conditions de famine (interrupteur au milieu de Balanced Salt Solution (EBSS) de Earle exempte d’acides aminés) est aussi fortement réduite par TG ou par la MRT67307 de ULK-inhibiteur dans les cellules HEK293 (Figure 2B). En outre, induite par la famine la séquestration de LDH est constamment inhibée par les 3MA en MEFs (Figure 2C), BJ (Figure 2D), MCF-7 (Figure 2A) et pre-1 (Figure 2F) cellules. Généralement, l’incubation des cellules dans un milieu EBSS seul (c'est-à-dire, en l’absence de Baf ou d’autres inhibiteurs de la séquestration du post) ne conduit pas à toute accumulation mesurable de LDH piégé (voir par exemple l’expérience de LNCaP illustré à la Figure 2 A). c’est probablement parce qu’aiguë acides aminés conduit à des flux autophagique lysosomal accélérée, entraînant une dégradation rapide et continue de la LDH séquestrée.

Ensuite, différents gènes ATG MEFs knockout (KO) ont été utilisées pour tester si la fixation du LDH nécessite des gènes liés à l’autophagie semblent essentiels pour la formation de l’autophagosome. En effet, induite par la famine la séquestration de LDH est abolie en ATG5 KO MEFs26 (Figure 3A), qui confirme nos précédentes conclusions9. En outre, comme illustré à la Figure 3B et 3C, séquestration de LDH induite par le jeûne est également affaiblie dans ATG7 KO MEFs27 et28de la ATG9A KO MEFs.

Enfin, le test de fixation du LDH a été testé par rapport à si véhiculée par ARNi silençage de transcription des gènes ATG clée serait inhibent l’activité induite par la famine de séquestration. En effet, la transfection avec le siARN ciblant ATG9A ou ciblage combiné des ULK1 et ULK2, séquestration de LDH fortement réduite dans des conditions de famine dans les cellules LNCaP (Figure 3D). En outre, nous confirme nos précédentes conclusions3,9 ce ciblage de la famille des focal adhesion kinase interaction protéine de 200 kDa (FIP200) ou combinée de ciblage du type acide γ-aminobutyrique (protéine associée au récepteur) A (GABAA) Membres de la famille GABARAP) inhibe la famine induite par la fixation du LDH (Figure 3D).

Figure 1
Figure 1 : Flux globalement schéma du protocole séquestration LDH. Le protocole est basé sur un format de plaque de culture de tissu de 12 puits, en utilisant les volumes indiqués par échantillon (d’un puits). Le protocole d’essai idéalement se divisent en deux jours de travail distincts, comme indiqué. Toutefois, il est également possible d’effectuer l’ensemble de la procédure en une seule journée. Abréviations : ABB, après tampon blast (voir étape 3.3 dans le protocole pour les ingrédients) ; RSB, tampon de resuspension (voir étape 3.5 dans le protocole pour les ingrédients). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Validation de l’essai de séquestration de LDH utilisant des composés inhibant l’autophagie. LNCaP (A) les cellules ont été laissées non plus n’est pas traité (aux fins de la soustraction du fond : Voir l’étape 1.3.2) dans le milieu complet (CM ; RPMI 1640 + 10 % bovine sérum fœtal (SVF)), ou ils ont été traités avec le véhicule de DMSO (0,1 %) ou 100 nM FBA en CM ou dans un milieu sans sérum - et d’acides aminés (EBSS). En outre, certaines des cellules ont été traitées avec 3MA (10 mM), SAR-405 (10 µM), ou thapsigargine (300 nM), comme indiqué. Après 3 h de traitement, les cellules ont été récoltées, et séquestration de LDH taux ont été déterminés comme précisées dans le protocole actuel. (B) HEK293 cellules ont été traitées avec le véhicule de DMSO (0,1 %) en CM ou 100 nM FBA dans EBSS, tel qu’indiqué. En outre, certaines cellules ont reçu 10 µM MRT67307 (un inhibiteur ULK) ou 300 nM thapsigargine. Taux de LDH séquestration ont été déterminées après 3 h de traitement. (C-F) Cellules MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) ou pre-1 (F) ont été traitées avec le véhicule de DMSO (0,1 %) en CM ou Baf (10 nM en C, 100 nM de D-F) en EBSS avec ou sans 3MA 10 mM, comme indiqué. Taux de LDH séquestration ont été déterminées après 3 h de traitement. A, B, D, E et F indiquent des valeurs moyennes de trois répétitions biologiques (puits en triple) d’une expérience (n = 1), avec des barres d’erreur représentant l’écart-type. C indique les valeurs moyennes de trois expériences indépendantes (n = 3), avec des barres d’erreur représentant l’erreur type de la moyenne. p < 0,05, ***p < 0,001, répété ANOVA à des échantillons.

Figure 3
Figure 3 : Validation de l’essai de séquestration de LDH par knockout (A-C) ou des approches de précipitation (D). (A-C) ATG5 type sauvage (WT) ou MEFs knockout (KO) (A), ATG7 WT ou MEFs KO (B), ou ATG9A WT MEFs KO (C) ont été traités avec le véhicule de DMSO (0,01 %) en CM ou 10 nM FBA dans EBSS, tel qu’indiqué. Taux de LDH séquestration ont été déterminées après 3 h de traitement. Les valeurs de quatre moyennes (A ; n = 4) ou trois (B et C ; n = 3) expériences indépendantes, avec des barres d’erreur représentant l’erreur type de la moyenne. p < 0,05, répété échantillons ANOVA bidirectionnelle. N.S., non significatif. (D) LNCaP cellules étaient inversées transfectées avec 5 nM d’un siARN contrôle nontargeting (siCtrl), ou à 5 nM chacun d’oligoes ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- ou GABARAPL2-ciblage de siARN, tel qu’indiqué. Après 48 h, les cellules ont été soit traitées avec véhicule de DMSO (0,1 %) en CM ou 100 nM FBA dans EBSS, tel qu’indiqué. Taux de LDH séquestration ont été déterminées après 3 h de traitement. Sont des valeurs moyennes de trois répétitions biologiques (puits en triple) d’une expérience (n = 1), avec des barres d’erreur représentant l’écart-type.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En résumé, le protocole décrit ici représente une méthode fiable et largement applicable pour surveiller l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères. Par rapport à la méthode originale12,16, nous avons supprimé un certain nombre d’étapes inutiles, simplifié plusieurs des étapes restantes et introduit une substantielle réduction d’échelle. Par conséquent, le protocole est grandement amélioré par rapport aux coût et temps-efficacité, et la même quantité d’échantillons peut maintenant être traitée en moins de la moitié du temps par rapport à l’original du protocole. Pour 24 échantillons, étapes 2 et 3 (jour 1) nécessite environ ½ h de préparation plue 3 h de travail efficace, alors que l’étape 4 (jour 2) peut être réalisée en environ 2 h (estimations de temps étant donné que tous les buffers nécessaires sont préparées au préalable). Depuis le test le jour 1 est habituellement précédée de traitements aux cellules, y compris une incubation de 3 à 4 h avec FBA ou d’autres inhibiteurs de la dégradation des LDH autolysosomal, il est commode de diviser le dosage en deux jours consécutifs. Toutefois, il est également possible d’effectuer le test ensemble dans une même journée. Dans ce cas, cela permettrait d’économiser temps snap-gel les échantillons dans l’azote liquide à l’étape 3.6 et 3.7. Bien que ne pas testé avec le protocole actuel, il est probable que l’étape de gel-dégel peut-être être ignorée au total, étant donné que plus élaborer version du dosage dans les hépatocytes primaires de rat a été faite sans cette étape23.

Le protocole présenté ici peut être effectué avec une relative facilité. À noter, il est important d’être précis dans le pipetage, puisque l’essai comprend plusieurs étapes d’échantillonnage et de la dilution. En outre, les aspirations surnageantes doivent être faites avec soin, afin que des quantités minimes d’ions sont présentes dans la suspension de cellules de saccharose dans l’étape 2.5 et que comme peu LDH cytosolique possible contamine le matériel sédimenté à l’étape 3.6. L’essai tel que décrit ici est flexible pour une large gamme de matériel de départ. Par exemple, dans les cellules LNCaP, nous avons utilisé avec succès le test avec une gamme de différentes quantités de cellules lors de la récolte, s’étendant jusqu'à une différence de 10 fois (à partir de 2. 5 x 105 cellules à 2,5 x 106 cellules). Le minimum à partir de matériel nécessaire est défini par le degré de sensibilité la détection, méthode de l’activité enzymatique de LDH est. Le protocole peut très probablement évoluer sensiblement plus bas, en réduisant les volumes utilisés à pas 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 et 4.3.

Le facteur le plus critique et le défi technique avec le test est l’étape d’electrodisruption. Le choc électrique fort, mais bref, des cellules dans une solution isotonique, exempt d’ion se traduit par une perturbation uniforme et sélective de la membrane plasmique, tout en laissant la structure intracellulaire et organites (y compris les vacuoles autophagiques) intacte12, 29. Lors de l’utilisation de cellules adhérentes, il est essentiel qu’ils tolèrent les traitements enzymatiques et mécaniques en étapes 2.1 – 3,1 (détachement cellulaire, centrifugation et remise en suspension). Pour l’étape 3.1, il n’est pas essentiel pour obtenir une suspension parfaitement unicellulaires. Par exemple, c’est très difficile de parvenir aux cellules LNCaP. Néanmoins, electrodisruption réussie à presque 100 % des cellules est toujours obtenue, même au sein des amas de cellules contenant plusieurs dizaines de cellules attachées physiquement. Lorsque vous testez un nouveau type de cellule, il est conseillé de vérifier l’efficacité de l’electrodisruption (Voir l’étape 3.3.1)17. Près de 100 % des cellules doit être en permanence le bleu Trypan positive après l’electrodisruption étape17. Si ce n’est pas le cas, les paramètres d’électroporateur doivent très probablement être modifiés. Utilisant le test dans 20 types de différentes cellules de mammifères, nous n’avons jamais eu à changer les paramètres d’électroporateur. Ainsi, une fois les bons réglages ont été trouvés pour une ligne de cellules de mammifères, il est susceptible de travailler pour les autres types de cellules de mammifères. Pour vérifier que les conditions d’electrodisruption ne sont pas trop sévères, c'est-à-direque seule la membrane plasmique et pas les membranes des organites intracellulaires ont été perturbés, suivez l’étape 3.3.2.

Autophagie en bloc est effectuée par autophagosomes qui séquestrent conjointement des quantités substantielles de cytosol ainsi que d’autres marchandises. Cela peut se produire par l’intermédiaire d’autophagie purement non sélective des portions du cytoplasme, ou d’une manière qui représente un mélange de l’autophagie sélectif et non sélectifs. A ce jour il n’est pas clair si ou dans quelle mesure autophagie sélective et non-sélective coexister comme deux modes différents de l’autophagie, ou savoir si autophagosomes en règle simultanément séquestrer cargaison de manières sélectifs et non sélectifs. Ce qui est important, cependant, une étude récente a indiqué que les activateurs de l’autophagie sélective induisent une augmentation similaire séquestration cytosolique de cargaison en vrac comme dans la séquestration de la cargaison particulière30. Dans notre propre laboratoire, les résultats sont en accord avec ceci (nos résultats non publiés). Analysant la séquestration des protéines cytosoliques solubles (par exemple, LDH) donc probablement a le potentiel pour détecter des modifications dans l’activité de séquestration du macroautophagic sous beaucoup, si ce n’est ne pas toutes les conditions. Cependant, bien qu’il reste encore à prouver, la possibilité ne peut être exclue que certains types de conditions induisent uniquement un type de l’autophagie sélective exclusive où la cargaison est si étroitement enveloppée par le phagophore cette même cytosol est exclu de être séquestré dans l’autophagosome. Pour sonder pour savoir si telle condition peut-être exister, en vrac autophagie tests comme le test de fixation du LDH doivent être exécutés en parallèle avec des essais de l’autophagie sélective.

Un des avantages principaux de l’essai de séquestration de LDH est qu’il mesure la séquestration du fret endogène, ce qui en fait une méthode largement applicable. En outre, le test mesure l’activité de séquestration de manière très quantitative. Le test de fixation du LDH est un outil important pour étudier les mécanismes et la régulation de la formation de l’autophagosome, depuis ouvert phagophores ne peut séquestrer LDH. Il est très lourd et difficile, sinon impossible, d’évaluer les structures ressemblant à des autophagosome sont des entités scellées ou non par microscopie électronique. Une autre méthode qui est utilisée pour analyser si autophagosomes sont fermés est de tester la sensibilité des marqueurs d’autophagie (p. ex., LC3) ou des récepteurs (p. ex., sequestosome 1 (p62/SQSTM1) ou protéine nucléaire point 52 (NDP52)) aux protéases10 ,31,32. L’inconvénient de ce test est que l'on étudie la protection de protéase de chariot composants plutôt qu’autophagique cargo. En outre, étant donné que l’analyse est basée sur le western blot, il est semi-quantitatif.

Considérant que la capacité d’analyser l’autophagie de cargaison endogène est un avantage, une limitation intrinsèque avec le test de fixation du LDH et tout les autres tests qui évaluent la séquestration du fret endogène, est qu’un inhibiteur de la dégradation doit être inclus afin de discerner les effets spécifiques sur la séquestration de l’autophagie, plutôt que les effets nets de séquestration et de la dégradation. Les inhibiteurs efficaces de la dégradation de la LDH incluent des inhibiteurs de la pompe à protons comme agents Baf ou concanamycin A3,16,18et lysosomotrope comme la chloroquine et chlorure d’ammonium33. La leupeptine d’inhibiteur de protéase fonctionne bien dans les hépatocytes de rat primaire23, mais est généralement inefficace dans les lignées de cellules mammifères, que nous avons testé. Nous utilisons systématiquement Baf13, qui agit rapidement et est très efficace dans les cellules malignes tant non malins. Toutefois, il est important de garder à l’esprit qu’aucun des inhibiteurs de la dégradation de la LDH sont tout à fait spécifique, et les effets présumés des inhibiteurs sur autophagie ne peuvent être exclues. Pour minimiser le risque d’influence non spécifique, il est recommandé d’utiliser des concentrations de l’inhibiteur qui sont juste à saturer les niveaux et d’inclure l’inhibiteur uniquement pour les dernières heures (3 à 4 h) de l’expérience. La concentration saturante de la Baf doit être déterminée pour chaque type de cellule. Comme guide, 50 à 100 nM est saturant pour la plupart des lignées de cellules mammifères cultivées que nous avons testés, alors que certaines cellules types tels que MEFs exigent seulement 10 nM Baf pour un bloc complet dans la dégradation de la LDH.

Une limitation évidente avec le test de fixation du LDH, c’est qu’il ne peut être effectuée sur des cellules vivantes, ce qui exclut son utilisation pour l’analyse de l’autophagie dans les cellules fixes et les tissus. En revanche, il y a actuellement aucun essais mis en place qui peut mesurer l’activité autophagique fonctionnelle dans les cellules fixes. Bien que ne pas testé avec le protocole actuel, il devrait être tout à fait possible d’utiliser le test de fixation du LDH pour évaluer in vivo l’activité autophagique séquestration dans les organismes expérimentaux. La limitation serait que l’organisme doit tolérer de traitement avec un inhibiteur de la dégradation lysosomiale LDH, et que la période de temps entre ce traitement et de la performance du test devrait être relativement courte, afin de minimiser les éventuels effets non spécifiques de l’inhibiteur. Fait intéressant, une étude antérieure par Kominami et al., a indiqué que 3 à 6 h traitement des rats avec leupeptine (injection intrapéritonéale de 2 mg/100 g de poids corporel) est approprié observer l’accumulation efficace de LDH autophagically séquestré dans le foie fractions subcellulaires enrichies de vacuoles autophagiques34.

L’expression ectopique de la séquestration fluorescente sensibles au pH de sondes comme Rosella35 ou Keima36 peut être utilisé pour visualiser les autophages séquestration sans la nécessité d’inclure des inhibiteurs de la dégradation. En outre, contrairement à l’essai de fixation du LDH, ces approches peuvent servir à visualiser la séquestration de l’autophagie dans des cellules individuelles. En outre, fusion de la sonde pour le ciblage de l’organite séquences peut être utilisée pour surveiller la séquestration des organites spécifiques. Puissantes plateformes microscopiques peuvent également permettre des analyses de criblage à haut débit. Les inconvénients sont que l’expression ectopique de sonde, ainsi que l’accumulation de la sonde dans le système lysosomial, peut-être influer sur la voie de l’autophagie. En outre, contrairement à l’essai de séquestration de LDH, une est dépendante de cellules qui peuvent être efficacement transfectées. Enfin, alors que le test de fixation du LDH fournit une sortie directe quantitative de cytosol pourcentage séquestré, les méthodes de base d’image généralement ne peut pas fournir ce type de production quantitative absolue. Il serait souhaitable de faire usage de ces deux types d’approches complémentaires. Une autre excellente façon d’étudier autophagique séquestration sans besoin d’inhibiteurs de la dégradation est d’y introduire des cellules raffinose radiomarquée par electro-perméabilisation réversible3,23,37, 38. Raffinose est un sucre de membrane-imperméants et métaboliquement inerte qui résiste aux enzymes lysosomales. Par conséquent, sa séquestration autophagique peut être suivie par séparation de cytosolique de sédimentables cellule fractions3,23,37,38. Cette approche est, cependant, il y a plus de temps que le test de fixation du LDH et exige des précautions de sécurité supplémentaires dues à l’utilisation de la radioactivité. Enfin, le résultat final de séquestration autophagique en vrac et flux de fret autophagique dégagée, la dégradation des protéines de grande longévités, peut être mesuré avec exactitude par une protéine bien établie méthode basée sur l’étiquetage39,40 ,41,42,43. Cependant, contrairement à l’essai de fixation du LDH, cette méthode ne prévoit pas un affichage spécifique activité autophagique, étant donné que les protéines de longue durées sont dégradés aussi par d’autres mécanismes que l’autophagie, plus particulièrement par le système protéasome (considérant que LDH séquestration se produit uniquement en raison de l’autophagie). Par conséquent, un numéro de contrôle, les traitements doivent être systématiquement inclus, par exemple, des inhibiteurs chimiques d’autophagie lysosomale ou dégradation de protéasome et perturbations génétiques avec autophagie3,16.

Le test de fixation du LDH peut être comparé avec les dosages de flux LC3 couramment utilisés, qui mesurent les niveaux LC3-II par western blot ou LC3 punctums formation par imagerie de fluorescence en absence ou en présence d’inhibiteurs de la dégradation lysosomale LC3 (Baf est le plus fréquemment utilisés), ou le passage de fluorescent étiqueté LC3 variantes aux milieux acides,22. Bien que ces analyses LC3 peuvent fournir des informations utiles, ils peuvent être difficiles à interpréter, en particulier parce que la relation entre le degré de flux LC3 et la quantité et le type de flux de fret est inconnue. Tel que mentionné dans l’introduction, en vrac autophagie et Parkin-dependent mitophagy ne nécessitent pas de LC3 protéines de la famille9,10,11,44. En outre, dans les hépatocytes de rat affamé, séquestration de la LDH et de la dégradation se prolongeait continu pendant les périodes de temps où l'on n’autophagique-lysosomal LC3 flux9. Ainsi, dans ce cas, les flux de fret peut être complètement séparé de flux LC3. Davantage de recherches en comparant les flux de LC3 avec différents types de flux de fret est nécessaire pour mieux interpréter les résultats obtenus avec des analyses de flux LC3.

Dans sa forme actuelle, le test de fixation du LDH est comparable à éponger occidental en ce qui concerne les temps de pratique requis et les coûts. En ce qui concerne la mesure en vrac autophagie, c’est au moins aussi efficace que le dosage de la séquestration du raffinose-basé ou l’analyse de la dégradation de protéine longue durée de vie décrites ci-dessus. Pour mesure spécifique d’activité autophagique séquestration en vrac et formation des autophagosomes fermé, c’est beaucoup plus efficace et directe que LC3 flux analyses ou essais de protéase protection des récepteurs LC3 ou autophagie, depuis les essais de ce dernier composants de chariot de mesure plutôt que fret réelle. Même si nous avons considérablement amélioré le débit de l’essai de fixation du LDH, c’est loin d’être un test haut débit, et il ne peut rivaliser avec l’efficacité des analyses basé sur l’image ci-dessus. Toutefois, tant les essais axés sur l’image et le test de fixation du LDH ont leurs avantages et inconvénients, et donc les deux types d’analyses ont leurs propres valeurs. Il est probablement possible par l’intermédiaire de futurs ajustements à faire la LDH séquestration du dosage semi haut-débit. Par exemple, il devrait être possible d’effectuer des electrodisruption dans un format de 96 puits, et il est concevable que la LDH cytosolique peut être séparée de la LDH séquestré par filtration au lieu de centrifugation, ou que l’étape de centrifugation peut être réalisée dans un 96- Eh bien le format. De plus, les tests pour mesurer l’activité de la LDH qui sont beaucoup plus sensibles que celle utilisée dans le protocole actuel ont été développés et sont disponibles dans le commerce. Autres potentiels futurs intéressants du dosage sont son utilisation putative dans les autres types de cellules que les cellules de mammifères, par exemple dans la levure ou autres organismes unicellulaires, ou même plante des cellules, ainsi que son utilisation pour des mesures in vivo d’autophagie activités de séquestration dans les tissus des organismes expérimentales.

En conclusion, nous croyons que le test de fixation du LDH dans sa forme améliorée et reconstituée sera un outil important dans la future recherche concernant autophagie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu financièrement par le Conseil norvégien de la recherche, l’Université d’Oslo, le Anders Jahre Foundation, la Fondation de Nansen et l’héritage dans la mémoire de Henrik Homan. Nous remercions m. Noboru Mizushima pour le ATG5 + / + MEFs et ATG5-/-MEFs, Dr Masaaki Komatsu pour le ATG7 + / + MEFs et ATG7-/-MEFs et Dr Shizuo Akira pour le ATG9A + / + MEFs et ATG9A-/-MEFs. Nous remercions Frank Sætre pour assistance technique et Dr par O. Seglen pour des débats constructifs méthodologiques.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46, (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591, (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166, (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264, (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151, (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19, (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333, (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111, (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19, (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9, (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510, (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10, (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282, (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432, (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169, (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142, (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20, (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281, (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23, (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7, (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258, (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18, (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270, (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162, (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8, (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123, (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95, (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85, (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12, (2), 1-3 (2016).
Le test de fixation du Lactate déshydrogénase — Une méthode Simple et fiable pour déterminer l’activité de séquestration autophagique en vrac dans des cellules de mammifères
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter