Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Published: July 27, 2018 doi: 10.3791/57971
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo
* These authors contributed equally

Summary

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

Abstract

תפזורת autophagy מאופיין על ידי פחמיות של חלקים גדולים של הציטופלסמה למבנים כפול/מולטי-membrane הנקרא autophagosomes. כאן מתואר פרוטוקול פשוט לעקוב אחר תהליך זה. יתר על כן, תוצאות טיפוסי ובדיקת ניסיוני של השיטה בתנאים בתדר autophagy מסוגים שונים בתרבית של תאים בתרבית הינם מסופקים. במהלך autophagy בתפזורת, autophagosomes sequester ציטוזול, ובכך גם חלבונים מסיסים cytosolic, לצד אחרים מטען autophagic. LDH הינה יציב מאוד אנזים cytosolic שופע, מסיסים שאינם סלקטיבי. מבודד לתוך autophagosomes. הכמות של LDH פחמיות ולכן משקף את כמות פחמיות autophagic בתפזורת. ביעילות ובדייקנות לקבוע LDH פחמיות בתאים, אנחנו מעסיקים פרוטוקול מבוסס electrodisruption fractionation המפריד ביעילות sedimentable LDH cytosolic, ואחריו מדידה של פעילות אנזימטי sedimentable שברים לעומת דגימות תאים שלמים. Autophagic פחמיות נקבע על ידי הפחתת שיעור sedimentable LDH בתאים לא מטופל מתאי שטופלו בתוך זה. היתרון של LDH פחמיות וזמינותו היא כי זה נותן מדד כמותי פחמיות autophagic של מטענים אנדוגני, לעומת שיטות אחרות גם לערב ביטוי חוץ רחמי של הגששים פחמיות או פרוטאז הכמותיים למחצה ניתוחים הגנה של סמנים autophagy או קולטנים.

Introduction

Autophagy (מיוונית "עצמי אוכל") היא תהליך ההכפלה אבולוציונית על השפלה vacuolar/lysosomal של חומר תאיים. על גילוי של גנים הקשורים autophagy ("ATG"), אשר חשובים עבור autophagy שמרים ובבני אדם, המימוש autophagy הזה משחק תפקיד משמעותי (הכיר בכך 2016 הנובל ברפואה או פיזיולוגיה כדי מחלה ובריאות האדם Yoshinori Ohsumi), autophagy הפך במהירות אחד מהתהליכים הכי בעוצמה למדה תא ביולוגיה1,2.

Macroautophagy (ןלהל "autophagy") הוא מאופיין על ידי ההרחבה, מתקפלים של קרום תאיים cisternae ("phagophores") לתוך חסומות, membrane כפול או ריבוי במבנים ("autophagosomes") sequester ביעילות חומר enwrapped משאר הציטופלסמה. על היתוך של autophagosomes עם lysosomes, קרום autophagosomal הפנימי ואת המטען מוחרמת מושפל, ממוחזר. Autophagosomes יכולים sequester חומר cytoplasmic אקראי (autophagy לא בררניים) והן נימוסים סלקטיבית (autophagy סלקטיבי). בתפזורת autophagy קרוב לוודאי מייצגת שילוב של autophagy לא בררניים, סלקטיבי.

ב שנות ה-60 וה-70 ("מורפולוגי עידן" autophagy מחקר), autophagic פחמיות הוערכה בעיקר באמצעות ניתוחים ultrastructural. בשנות השמונים ובתחילת שנות התשעים ("התקופה הביוכימי") לכל Seglen ועמיתים — מי למד autophagy בשנת החולדה הראשית hepatocytes — פיתח את השיטות הראשונות למדוד באופן כמותי את פעילות פחמיות autophagic3. באמצעות מבחני אלה, Seglen מוגדרת, מאופיין שלבים שונים של4,autophagic-lysosomal מסלול5גילה, טבע amphisome6 (התוצר של פיוז'ן אנדוזום-autophagosome), היה הראשון תאר את התפקיד של זירחון חלבונים ב autophagy בתקנה7. עם זאת, לאחר גילוי ATGs של 1990 ("התקופה מולקולרי"), אפיון חלבון ATG8 בתרבית של הראשון, חלבונים הקשורים microtubule 1A/1B-אור שרשרת 3 (LC3) ב- 20008, השימוש של חלבונים ATG כסמני עבור תהליך autophagic במהירות לפופולריות, שיטות ביוכימיות יותר מפרך ושנמצאת הושארו מאחור. למעשה, במהלך 18 השנים האחרונות, תספיג וניתוחים פלורסצנטיות מיקרוסקופיה של LC3 הפכו הפופולרי ביותר עד כה (ובמקרים רבים היחידה) פירושו של הלומדים autophagy בתאי יונקים. היתרון הוא הקלות שבה שיטות אלה יכול להתבצע. החיסרון הוא שזה הוא לומד מרכיב עגלה (LC3) במקום מטען autophagic בפועל. זה חיסרון די רציני, כי היחסים בין מדינות ו/או של שטף של LC3 דרך בשביל לעומת פחמיות, שטף של מטענים מאוד לא ברור. למעשה, אנחנו הראו כי שטף מטענים בצובר יכול להישמר ברמה גבוהה בתנאים שבו יש שטף LC3 אין, למרות נוכחותם של LC3 מצומדת ב9תאים. יתר על כן, אנו הפגינו autophagy בצובר הזה הוא לא מושפע על ידי דלדול LC3 יעיל, ולכן סביר שאינו תלוי-LC39. ממצא זה אושר מאוחר יותר על ידי LC3 מעלף מחקרים10,11, אשר גם עולה כי mitophagy תלויי-פרקין (autophagy סלקטיבי של המיטוכונדריה) היא עצמאית של LC310,11 .

לסיכום, יש ברור הצורך מבוסס-מטען מבחני לעקוב אחר פעילות autophagic. בצורה אופטימלית מבחני כזה צריך להיות בהרחבה ישימים, מוגדרים היטב וקל לביצוע. במהלך השנים האחרונות לקחנו את עניין מסוים וזמינותו פחמיות LDH, אשר פותחה על ידי לכל Seglen ב-198012, והיא מבוססת על מדידת ההעברה של cytosolic LDH כדי sedimentable, autophagic המכילים חלולית התא שברים. LDH הוא חלבון cytosolic יציב, מסיסים זה הוא ברצון משותפת מבודד כאשר phagophores שלכדו cytoplasmic מטענים. פחמיות של LDH לכן מדד כללי של פחמיות autophagic. LDH יורד באופן בלעדי על ידי שביל autophagic-lysosomal12. לפיכך, בנוכחות השפלה lysosomal מעכבי, למשל, bafilomycin A1 (Baf)13, טיפול ניסיוני השפעות ישירות לשקף שינויים בפעילות פחמיות autophagic. בהיעדרו של מעכבי השפלה, ניתן למדוד את השפעת שינויים ב- LDH פחמיות והשפלה נטו.

LDH פחמיות וזמינותו ישימה באופן כללי, כיוון LDH מאוד, ubiquitously מתבטא בכל סוגי התאים, LDH רמות ניתן לכמת במדויק על ידי מטוס14,assay אנזימטי15. עם זאת, המקורי פרוטוקול12 – נוסדה בשנת החולדה הראשית hepatocytes — היה במקום זמן רב והוא נדרש כמות גבוהה של החל בחומר, כמו גם קבל פריקה חשמלית בהזמנה אישית. באופן הדרגתיים, לנו יש בהדרגה הפך וזמינותו שיטה קלה ופסיביות. ראשית, הפרוטוקול המקורי הותאם לשימוש בתרבית של תאים שורות16. שנית, שיטת הפעולה היתה באופן משמעותי downscaled3,9. השלישי, מספר שלבים בפרוטוקול חוסלו, כולל כרית צפיפות מפרך בשלב17. זה מופעל בו זמנית של עוד יותר downscaling של השיטה, מנקודת ההתחלה המקורית של שימוש צלחת 10 ס מ לכל דגימה16 באמצעות לבאר בודדת מצלחת 12-טוב עבור דגימה (כלומר, כ 15-fold החל פחות חומר)17. רביעית, זיהינו מנגנון אלקטרופורציה מסחרי שיכול להחליף קבל פריקה חשמלית בהזמנה אישית17.

כאן מוצג שלנו פרוטוקול העדכנית ביותר של LDH פחמיות וזמינותו, הכולל כמה העבודה נוסף של השיטה לעומת ה-17 שפורסמו בעבר. יתר על כן, ערכה של טיפוסי התוצאות המתקבלות מספר סוגי התאים מוצג, חשוב, שורות מרובות של אימותים ניסיוניים של השיטה באמצעות נוקאאוט תרופתי, כמו גם גנטי וגישות נוק אאוט הינם מסופקים. לקבלת לסכימת הזרימה הכללית של פרוטוקול שלם, ראה איור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תא זריעה וטיפול

  1. התרבות תאים חסיד ב- 75 ס מ2 תרביות רקמה מבחנות ב חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס, תוך שימוש באמצעי תרבות מועדפת עבור סוג התא המדובר. מאפשרים לתאים לגדול עד שיגיעו שכבה תא בקרבת מקום ל- confluent.
    הערה: השתמש בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עוברית שור נסיוב (FBS) LNCaP, HEK293, העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs), ג'יי, MCF-7, תאי RPE-1.
    1. לשטוף את התאים עם 3 מ ל 37 ° C באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4. החלף את PBS 3 mL 0.25% (w/v) טריפסין-ethylenediaminetetraacetate (EDTA), דגירה. הבקבוק ב חממה humidified ב 5% CO2 ב 37 ° C עד התאים ניתוק (2-5 דקות).
    2. Resuspend התאים מנותקת 7 mL תרבות בינונית המכיל 10% FBS. מערבבים aliquot השעיה 10 µL תאים עם 10 µL 0.4% Trypan Blue בשפופרת microcentrifuge, באמצעות טיפ פיפטה 0.5 – 20 µL. שימוש בקצה פיפטה אותו למלא מיד שקופית קאמרית ספירה, ולספור התאים מונה הניתן תא אוטומטית.
  2. להכין מתאים דילול (ראה הערה להלן) של התליה תא מלהשתמש שלב 1.1.2 תרבות בינוני המכיל 10% FBS וזרע 1 מ"ל של התא מדולל ההשעיה ב כל טוב של צלחת (שטח ~3.8 ס מ2) 12-ובכן תרביות רקמה באמצעות אספטי טכניקה. מאפשרים צמיחה חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 ° C עד צפיפות התאים הרצויים הגיעה, למשל, 60 – 90% הנהרות-קציר.
    הערה: דילול המתאים של התליה תא שתעניק את confluency התא הרצוי-קציר ישתנו מן סוג התא סוג התא, וכן על פי את משך וסוג ניסיוני טיפולים. לכן, זה חייב להיות מדעית מוערך בכל מקרה ומקרה.
    1. לניסויים שהן שניהם התייחסו וקצרו 2 ימים לאחר זריעה, זרע 2.5 10x5 LNCaP, HEK293, או MCF-7 תאים, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ או 1.5 x 10 תאים5 RPE-1 מכל קידוח של צלחת 12-. טוב.
    2. עבור תאים ולהתבטא באופן רופף, מעיל הצלחות עם הסוג של ציפוי מומלץ עבור סוג התא המדובר. עבור תאים LNCaP (וגם HEK293) השתמש צלחות מצופה פולי-D-ליזין (PDL).
    3. לשם כך, הוסף 500 µL PDL ב 2.5 µg/mL סטרילי H2O מכל קידוח ולאחר דגירה הלוחות בסביבה סטרילית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20 – 25 ° C). להסיר את PDL עם השאיבה, ולשטוף היטב בקצרה עם 1 מ"ל סטרילי H2O.
      הערה: בדרך כלל, שלב 1.2.1 נעשית ללא כל ניסיוני טיפולים. עם זאת, אם מבצע RNAi, יתכן נוח להתחיל של תרביות תאים הפוכה עם זריעה9.
  3. לבצע טיפולים ניסיוניים בבארות כפולים או triplicate לכל תנאי.
    1. לדוגמה, מתייחסים התאים עם 50 nM של Torin1 מעכב mTOR, אשר בדרך כלל משרן יעיל של פחמיות autophagic, או נושא את התאים חריפה לרעב סרום, חומצת אמינו ע י שטיפת התאים עם 1 מ"ל של ארל נטול חומצה אמינית היא מאוזנת מלח בינוני פתרון (EBSS) ולאחר מכן דגירה תאי 1 מ"ל של EBSS ב חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C.
    2. משאיר סט אחד של וולס לא מטופל כדי להגדיר רקע רמות של sedimentable LDH.
    3. להוסיף כמות saturating של bafilomycin פחמיות שלאחר מעכב A1 (Baf)3,13,16,18 היעדרות או נוכחות של טיפולים ניסיוניים, 3-4 שעות לפני תא קציר. דגירה התאים חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C.
      1. שימוש 100 ננומטר Baf LNCaP, HEK293, ג'יי, MCF-7 ותאי RPE-1, ו- 10 ננומטר Baf עבור MEFs.
      2. עבור טיפולים ניסיוניים יש משך של רק 3-4 h (כמו אלה שלב החזרתם ב 1.3.1 יש בדרך כלל), הוסף Baf בו זמנית עם הטיפולים. עבור עוד טיפולים ניסיוניים לחכות עד 3-4 שעות לפני הקטיף, וכן להוסיף 2 µL של סימן x 500 מרוכז Baf המניה ישירות לתוך המדיום.
      3. מערבבים על ידי לזעזע את הצלחת מיד לאחר התוספת של Baf. בשלב זה הוא גם recommendable כדי להוסיף macroautophagic פחמיות מעכבי פקדים, למשל, 10 מ מ של פאן-phosphoinositide 3-קינאז (PI3K) מעכב 3-מתיל אדנין (3MA)19או 10 מיקרומטר של המחלקה PI3K סלקטיבי השלישי מעכב SAR-40520.

2. התא הקציר והכנה Electrodisruption

  1. בסוף תקופת הטיפול, תשאף המדיום עם השאיבה, ולהוסיף את הניתוק פתרון µL תא 200 (שחומם מראש ל- 37 ° C) כל טוב. דגירה ב 37 ° C עד התאים ניתוק (בדרך כלל בסביבות 5 דקות).
    הערה: הואיל 0.25% (w/v) טריפסין-EDTA יכול לשמש במקום הפתרון ניתוק התא, שהשני מכיל DNase, אשר מסייע להפחית את צמיגות של התאים מנותקת. כל עוד המדיום ביסודיות aspirated, אין צורך לשטוף את התאים לפני תוספת של טריפסין-EDTA או תא פתרון ניתוק.
  2. להוסיף 500 µL בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, המכיל 2% (w/v) אלבומין שור (BSA) על כל טוב, וכן resuspend עם פיפטה עד אין גושים תאים גלויים. להעביר מיד התליה תא ל 1.5 mL microcentrifuge צינורות על קרח.
    הערה: אלא אם צויין אחרת, לבצע את כל הצעדים הבאים על קרח.
  3. משקעים התאים על ידי צנטריפוגה ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
  4. ביסודיות וארוקן את תגובת שיקוע (עם השאיבה) לעזוב את כדורי תא יבש ככל האפשר.
  5. להוסיף 400 סוכרוז 10% (w/v) µL (ב- H הנדסה גנטית2O) כל שפופרת.

3. קרום פלזמה Electrodisruption והפרדה של שברים Sedimentable - וסה כתא

  1. Resuspend בגדר תא עם פיפטה כדי לקבל השעיה תא בודד ליד, להעביר אותו cuvette אלקטרופורציה 4 מ מ.
    הערה: Pipetting שיהיה ~ 10-15 פעמים, באמצעות טיפ 100 – 1000 µL פיפטה, מספיקה בדרך כלל.
  2. מניחים את cuvette electroporator גל דעיכה מעריכית, הפרשות דופק חשמלי יחיד-800 V, 25 µF וω 400; הגדרות אלה מייצרים דופק של משך ~ 8 ms.
  3. להשתמש טיפ פיפטה חדש כדי להעביר את disruptate תא צינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל 400 פתרון כקרח סוכרוז באגירה פוספט µL (100 מ מ נתרן monophosphate, dithiothreitol 2 מ מ (DTT), EDTA 2 מ מ ו- 1.75% סוכרוז, pH 7.5), ומערבבים בקצרה על ידי pipetting.
    1. אופציונלי: כדי לוודא קרום פלזמה יעיל electrodisruption17, לערבב 10 µL של disruptate התא מדולל מהשלב 3.3 עם 10 µL 0.4% Trypan Blue צינור microcentrifuge 1.5 mL. העברה לתא הספירה ולוודא כי הוא האחוז של תאים חיוביים Trypan Blue > 99%.
      1. להשאיר את הדגימה בתא ספירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20 – 25 ° C), וודא כי אחוז תאים חיוביים Trypan Blue נותר > 99%.
    2. אופציונלי: כדי לוודא כי electrodisruption לא היה נוקשה מדי, כלומר, זה יש לא הפריע organelles תאיים, בצע את השלבים 1.1 – 3.3 כמתואר לעיל, אך השתמש בחומר המוצא גדול יותר (באר מצלחת 6-ובכן עם שכבת תאים confluent ~ 80%), ולהשתמש 150 µL 10% סוכרוז שלב 2.5 ו- 150 µL תמיסת סוכרוז באגירה פוספט ללא DTT בשלב 3.3.
      1. להשתמש על פיפטה כדי בזהירות שכבה 200 µL של הפתרון disruptate תא מדולל על גבי כרית צפיפות 1.2 מ של באגירה פוספט 8% (w/v) צפיפות בינונית מעבר צבע (למשל, 8% Nycodenz, 50 מ מ סודיום פוספט, 2.2% סוכרוז, 1 מ"מ EDTA) ומפרידה 2 מ שפופרת. צנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 45 דקות ב 4 ° C ב- microcentrifuge עם פונקציית מצב רך (עבור עדין האצה והאטה) והניח בזהירות הצינורות על קרח.
      2. הסר בזהירות µL 60 של השבר ~ 200 µL העליון, מקפיד לא לאסוף כל פתרון הדרגתי בינוני צפיפות ולאחר להעביר צינור microcentrifuge טריים.
        הערה: זה להכיל ציטוזול טוהר יוצאת דופן, כינה "תא sap"21.
      3. מבחן הטוהר של השבר שהושג בשלב מעל, על ידי ביצוע ניתוחים תספיג של חלבונים הכילה-אברון, באמצעות טכניקות רגיל ו- 4 – 20% ג'ל הדרגתיות16.
      4. בצע immunoblotting לדוגמה עבור cathepsin B21, ציטוכרום c, וחלבון disulphide איזומראז, כדי לוודא כי הזרם החשמלי בשלב 3.2 יש לא שיבשו lysosomes, המיטוכונדריה או רשתית תוך-פלזמית, בהתאמה, ו- immunoblot עבור LDH כדי לוודא נוכחות של חלבון הצוף תא cytosolic.
      5. במקביל, מבצע immunoblotting תמציות חלבונים זני ה פתרון disruptate cell סך הכל16 כדי לאשר הנוגדנים בשימוש ניתן לזהות את החלבונים הכיל אברון זה הם המוערך.
  4. חזור על שלבים 3.1 – 3.3 עבור כל דגימה.
  5. להסיר 550 µL כל פתרון disruptate תא מדולל (שהושג בשלב 3.3) כדי microcentrifuge 2 mL צינורות המכיל 900 µL resuspension קר כקרח מאגר (50 מ מ נתרן monophosphate, 1 מ מ DTT, EDTA 1 מ"מ ו- 5.9% סוכרוז, pH 7.5) בתוספת BSA 0.5% ו- 0.01% Tween-20, מערבבים בקצרה על-ידי pipetting.
  6. צנטריפוגה ב 18,000 x g למשך 45 דקות ב 4 ° C כדי לייצר גללים המכיל "sedimented LDH". ביסודיות וארוקן את תגובת שיקוע (עם השאיבה) לעזוב את כדורי יבש ככל האפשר. מקם את הדגימות במקפיא-80 ° C.
  7. להעביר 150 µL כל פתרון disruptate תא מדולל (שהושג בשלב 3.3) צינורות חדשים, ולמקם את הדגימות במקפיא-80 ° C. להשתמש בדוגמאות אלה כדי לקבוע את רמות "סה כ- LDH" בתאים.
    הערה: בשלב זה הניסוי ניתן להשהות עבור כל עוד הרצוי.

4. LDH החילוץ ומדידה של פעילות אנזימטי לקטט דהידרוגנאז

  1. להפשיר את "LDH sedimented" (מתוך שלב 3.6) ודוגמאות "סה כ- LDH" (מתוך שלב 3.7) על קרח.
  2. להוסיף 300 µL resuspension קר כקרח מאגר המכיל 1.5% טריטון X-405 ל- "LDH הכולל" דגימות (מניב ריכוז טריטון X-405 הסופי של 1%). לסובב את הדוגמאות על גלגלת בחדר קר (4 – 8 ° C) במשך 30 דקות.
  3. הוסף µL 750 המאגר הקר resuspension עם 1% טריטון X-405 ל- "sedimented LDH" דגימות, resuspend כדורי עם פיפטה עד פתרון הומוגני.
  4. Centrifuge דגימות מן שלב 4.2 ו- 4.3-x 18,000 g עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי פסולת הסלולר משקעים undissolved.
  5. לערבב 4 חלקים מ מ 65 קר imidazole (pH 7.5)/0.75 פירובט מ מ עם חלק אחד של imidazole מ מ 65 קר (pH 7.5) / 1.8 מ"מ NADH להשגת פתרון עבודה יציב במשך שלושה שבועות לפחות ב 4 º C.
  6. מערבבים 3 – 30 µL של supernatants מ שלב 4.4 עם 200 µL של הפתרון עובד שלב 4.5.
  7. לקבוע את כמות LDH על ידי מדידת LDH פעילות אנזימטי כמו הירידה nicotinamide אדנין dinucleotide (טופס מופחתת) ספיגת (NADH)-340 nm ב 37 מעלות צלזיוס לעומת תקן עם ריכוז LDH ידוע. לבצע מדידות ספיגת עד התגובה פנה השלמה, דהיינו עד ספיגת-340 ננומטר כבר לא משתנה עם הזמן.
    הערה: זוהי שיטת הביוכימי קלאסית כדי למדוד פעילות LDH. למרות בפרוטוקול הנוכחי מבצע את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס, זה ניתן גם לבצע בטמפרטורת החדר (20 – 25 ° C), אשר מומלץ אם עושה ספקטרופוטומטר ידנית. בפרוטוקול הנוכחי משתמש מכשיר multianalyzer רובוטית, אשר באופן אוטומטי מתערבב דגימות עם הפתרון עובד בצלחת 96-ובכן, מודד את ספיגת-340 nm ב 37 ° C כל 20 s למשך 3 דקות. לאחר מכן, כלי התוכנה מחשבת את הריכוז של LDH, הביע כמו יחידות (U) / L, על-ידי השוואת השיפוע של המדידות ספיגת לאורך זמן בהשוואה עיקול רגיל מושגת באמצעות כיול עם תקן של LDH ידוע ריכוז. טווח לינאריות לזיהוי על-ידי גישה זו הוא 30 – 1,500 U/ל' כחלופה, קיים מגוון רחב של ערכות זמינים מסחרית כדי למדוד LDH. חלקם מבוססים על מצומדות אנזימטי לדור של ערכי צבע מוחלטים או פלורסנט מוצרים, המאפשרים זיהוי על ידי אמצעים אחרים מאשר ספקטרופוטומטר UV, ועם שאר הטווחים ליניארי של זיהוי.

5. חישוב של LDH פחמיות

  1. לחשב את אחוז LDH sedimented כדי LDH הכולל עבור כל דגימה, לוקח את דילולים ולדגום בחשבון:
    LDH sedimented (%) =Equation 1
    הערה: במהלך השלבים µL כ-50 3.1 – 3.3 זה איבדו בשל העברת את cuvette אלקטרופורציה וממנה. לפיכך, חישוב מהצורך סך של 750 µL (במקום 800 µL) של התא מדולל disruptate בשלב 3.3.
  2. להפחית את אחוז LDH sedimented להשיג דגימות מתאי לא מטופל (שלב 1.3.2) מן האחוז של LDH sedimented להשיג דגימות תאים שטופלו ניסיוניים, הפער בזמן הטיפול עם Baf כדי לקבל את אחוז LDH מוחרמת לשעה בתקופת הדגימה:
    . מבודד LDH (% / h) =Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, נפח פעילות פחמיות autophagic במספר קווים שונים בתרבית של תאים, כולל LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, הלה, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs), RPE-1. תאים HEK293, בי ג'יי ו LNCaP נמדדה. פחמיות היה מוערך בתנאים הבזליים (ב מלאה, עשירות בינוני), או בתאים בחריפות ברעב עבור סרום וחומצות אמינו ( פיד ה bona בתדר autophagy תנאי22). התוצאות הראו כי פעילות פחמיות LDH בתנאים הרעבה משתנה בהרחבה על פני שורות תאים שונים, הנעים בין רמות לגילוי בקושי LAPC4, DU145, Huh7, PNT2 תאים (נתונים לא מוצג) ~1.6%/h בתאים LNCaP (איור 2 A). שיעור שנצפתה hepatocytes מורעבים החולדה הראשית הוא גבוה יותר מאשר שורות תאים שהוזכרו לעיל, וכן בדרך כלל נע בין 2.5–4%/h23. בתנאים הבזליים, LDH פחמיות היה כמעט בלתי מורגשת במחצית של הקווים תא נבדקים ועוברים נע בין ~0.2%/h ל ~0.5%/h לחצי השני (נתונים לא מוצג). שורות תאים המציגים פחמיות autophagic הבסיס לזיהוי פעילות, חריפה לרעב סרום ושל חומצות אמינו בדרך כלל גורם לעלייה קיפול 3-4 במחיר פחמיות LDH (ראה לדוגמה את הניסוי LNCaP שמוצג באיור 2א). שורות תאים שנבדקו (שהוזכרו לעיל), רקע אחוז LDH sedimented להשיג דגימות מתאי לא מטופל (שלב 1.3.2) הוא בדרך כלל בסביבות 2-3%. מ- 22 ניסויים עצמאית הופיעה שורות תאים שונים, המקדם התוך ניסיוני של וריאציה (CV) בין ערכי LDH sedimented (% sedimented LDH) של טיפול משכפל היה 1.7% (CV % הממוצע ± סטיית תקן), החל מ 3.0 – 5.8% ± 9.0%. יחד, מספרים אלה לתת אינדיקציה למה לצפות בעת ביצוע וזמינותו פחמיות LDH בתאי יונקים.

השימוש של מעכבי כימיים כמו טוב כמו גנטית נוקאאוט, נוקאאוט מתקרבת, בהרחבה מוודאת כי וזמינותו פחמיות LDH מודד באופן אמין פחמיות autophagic פעילות. היווצרות Autophagosome דורש PI3K הפעיל כיתה השלישי (PIK3C3), Unc-51 כמו autophagy מפעיל קינאז (ULK)24, וכן לאיזון תאיים Ca2 + הומאוסטזיס16. כפי שמוצג באיור 2א, LDH הבזליים והן רעב-induced פחמיות לחלוטין פוליטי מאת 3MA מעכב הפאן-PI3K, סלקטיבי PIK3C3 מעכב SAR-40520או ER Ca2 + משאבה מעכב thapsigargin (TG) 25 בתאים LNCaP. LDH פחמיות בתנאים רעב (מתג לבינונית מאוזנת פתרון מלח (EBSS) של ארל נטול חומצה אמינית) מצטמצם גם TG, או על ידי את MRT67307 ULK-מעכב בתאי HEK293 (איור 2B). יתר על כן, רעב-induced פחמיות LDH מעוכבת באופן עקבי על ידי 3MA ב MEFs (איור 2C), בי ג'יי (איור 2D), MCF-7 (איור 2E), ו- RPE-1 (איור 2F) תאים. באופן כללי, דגירה של תאים EBSS בינוני לבד (קרי, בהיעדר Baf או מעכבי פחמיות שלאחר אחרים) לא תוביל כל הצטברות לקטט דהידרוגנאז מוחרמת מדיד (ראה לדוגמה את הניסוי LNCaP באיור 2 A)-זה סביר כי חומצת אמינו חריפה לרעב מוביל שטף autophagic lysosomal מואצת, וכתוצאה מכך השפלה מהירה ומתמשך של LDH מוחרמת.

. הבא בתור, ג'ין ATG שונים נוקאאוט (KO) MEFs הועסקו כדי לבדוק אם LDH פחמיות דורש גנים הקשורים autophagy דיווח כי חיוני היווצרות autophagosome אכן, רעב-induced פחמיות LDH הוא ביטל ATG5 KO MEFs26 (איור 3א), המאשר את הממצאים הקודמים שלנו9. יתר על כן, כפי שמוצג באיור 3B ו- 3 C, רעב-induced פחמיות LDH הוא קהה גם ב ATG7 KO MEFs27 ו ATG9A KO MEFs28.

לבסוף, וזמינותו פחמיות LDH נבחנה ביחס אם מציאה RNAi בתיווך להחרשת מפתח ATG ג'ין תעתיקים לעכב פעילות פחמיות רעב-induced. אכן, תרביות תאים עם siRNA פילוח ATG9A, או פילוח משולב של ULK1, ULK2, חריפה מופחתת פחמיות LDH בתנאים הרעבה בתאי LNCaP (איור 3ד') יתר על כן, אנו אישר שלנו3,הקודם ממצאים9 את המיקוד של המשפחה קינאז אדהזיה מוקד אינטראקציה חלבון של 200 kDa (FIP200) או בשילוב פילוח של סוג חומצה γ-aminobutyric (חלבון קולטן-הקשורים A (GABAA) בני המשפחה GABARAP) מעכב רעב-induced פחמיות LDH (איור 3ד').

Figure 1
איור 1 : זרימה הכולל הערכה של פרוטוקול פחמיות LDH. הפרוטוקול מבוסס על פורמט צלחת תרביות רקמה 12-ובכן, באמצעות אמצעי האחסון שצוין עבור דגימה (מתוך באר אחת). פרוטוקול assay בנוחות ניתן לחלק לשני ימי עבודה נפרד, כמצוין. זאת, בנוסף ניתן לבצע את ההליך כולו ביום אחד. קיצורים: ABB, לאחר הפיצוץ מאגר (ראה שלב 3.3 בפרוטוקול עבור מרכיבים); RSB, מאגר resuspension (ראה שלב 3.5 בפרוטוקול עבור מרכיבים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : אימות של LDH וזמינותו פחמיות באמצעות עיכוב autophagy תרכובות. LNCaP (א) תאים נותרו גם ללא טיפול (לצורך רקע חיסור: ראה שלב 1.3.2) במדיום הגידול מלאה (ס"מ; RPMI 1640 + 10% עוברית שור סרום (FBS)), או הם טופלו עם הרכב דימתיל סולפוקסיד (0.1%) או 100 ננומטר Baf בס מ או בינוני חינם, סרום, חומצת אמינו (EBSS). בנוסף, חלק מהתאים שטופלו 3MA (10 מ מ), SAR-405 (10 מיקרומטר), או Thapsigargin (300 ננומטר), כמצוין. לאחר 3 שעות של טיפול, התאים נקטפו, LDH פחמיות המחירים היו נחושים כמו מפורט בפרוטוקול הנוכחי. HEK293 (B) תאים טופלו עם הרכב דימתיל סולפוקסיד (0.1%) בס מ, או עם 100 ננומטר Baf ב EBSS, כמצוין. בנוסף, חלק מהתאים קיבל 10 מיקרומטר MRT67307 (מעכב ULK) או 300 ננומטר Thapsigargin. LDH פחמיות המחירים נקבעו לאחר 3 שעות של טיפול. (C-F) תאים MEF (C), בי ג'יי (D), MCF-7 (ה) או RPE-1 (נ) טופלו עם הרכב דימתיל סולפוקסיד (0.1%) בס מ, או עם Baf (10 ננומטר c, 100 nM ב D-F) ב- EBSS עם או בלי 3MA 10 מ מ, כמצוין. LDH פחמיות המחירים נקבעו לאחר 3 שעות של טיפול. A, B, D, E ו- F להציג ערכים אומר שלוש ביולוגי משכפל (בארות triplicate) מהניסוי אחד (n = 1), עם קווי שגיאה מייצג סטיית תקן. C מציגה את הערכים רשע מ 3 ניסויים עצמאית (n = 3), עם קווי שגיאה המייצג את שגיאת התקן של הממוצע. p < 0.05, * * *p < 0.001, חזר על דגימות חד-כיווני אנובה.

Figure 3
איור 3 : אימות של LDH פחמיות וזמינותו על-ידי הסתרה (A-C) או גישות נוקאאוט (D). (A-C) ATG5 פראי סוג (WT) או נוקאאוט (KO) MEFs (א), ATG7 WT או KO MEFs (B), או ATG9A WT או KO MEFs (ג) טופלו עם הרכב דימתיל סולפוקסיד (0.01%) בס מ, או עם 10 ננומטר Baf ב EBSS, כמצוין. LDH פחמיות המחירים נקבעו לאחר 3 שעות של טיפול. ערכים 4-מתכוון (A; n = 4) או שלושה (B ו- C; n = 3) ניסויים עצמאית, עם קווי שגיאה המייצג את שגיאת התקן של הממוצע. p < 0.05, חזר על דגימות ANOVA דו-כיווני. . נ. ס, לא משמעותי. LNCaP (ד) התאים היו הפוכה transfected עם 5 nM של siRNA בקרה nontargeting (siCtrl), או עם 5 nM כל של ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- או פילוח GABARAPL2 siRNA oligoes, כמצוין. לאחר 48 שעות, התאים גם טופלו עם הרכב דימתיל סולפוקסיד (0.1%) בס מ, או עם 100 ננומטר Baf ב EBSS, כמצוין. LDH פחמיות המחירים נקבעו לאחר 3 שעות של טיפול. מוצגות ערכים אומר שלוש ביולוגי משכפל (בארות triplicate) מהניסוי אחד (n = 1), עם קווי שגיאה מייצג סטיית תקן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה אמינה החלים נרחב כדי לעקוב אחר פעילות פחמיות autophagic בתפזורת בתאי יונקים. לעומת ה12,המקורי שיטת16, יש להסיר מספר צעדים מיותרים, פשוטה מספר השלבים הנותרים, ואנו הציג downscaling משמעותית. כתוצאה מכך, הפרוטוקול זה השתפר מאוד ביחס עלות-זמן-ויעילות, עכשיו יכול להיות מטופלים כמות זהה של דגימות פחות מחצי מהזמן לעומת הפרוטוקול המקורי. לקבלת דוגמאות 24, שלבים 2 – 3 (יום 1) דורש כ ½ h של הכנה פלוס 3 שעות של עבודה יעילה, בעוד שלב 4 (יום 2) ניתן לבצע גם ~ 2 h (זמן הערכות בהתחשב בכך כל המאגרים הדרושים מוכנים מראש). מאז וזמינותו ביום 1 בדרך כלל לפניו תא טיפולים, כולל של דגירה h 3-4 עם Baf או אחרים מעכבים של השפלה LDH autolysosomal, זה נוח לחלק את הבדיקה בעוד יומיים רצופים. זאת, בנוסף ניתן לבצע את הבדיקה כל יום אותו הדבר. במקרה הזה, זה יחסוך זמן snap-הקפאת הדגימות של חנקן נוזלי בשלב 3.6 ו- 3.7. אף לא נבדק עם פרוטוקול הנוכחי, סביר להניח כי הצעד הפשרת ההקפאה אולי ניתן לדלג לגמרי, מאחר יותר לפרט גירסת וזמינותו של החולדה הראשית hepatocytes נעשתה ללא זה שלב23.

פרוטוקול המובאות כאן ניתן לבצע בקלות יחסית. ראוי לציין, חשוב לדייק ב pipetting, מאז וזמינותו כוללת מספר שלבים דגימה, דילול. יתר על כן, לשאיפות supernatant צריך להיעשות באופן יסודי, כך כמות מינימלית של יונים נמצאים בהתליה תא סוכרוז בשלב 2.5, ועל כך כמו LDH cytosolic קטן ככל האפשר מזהם את החומר sedimented בשלב 3.6. הבדיקה כפי שמתואר כאן הוא גמיש עבור מגוון רחב של הפעלת חומר. לדוגמה, בתאי LNCaP, אנו משתמשים בהצלחה וזמינותו עם מגוון של כמויות שונות של תאים על הקציר, הנמשכים עד הבדל 10-fold (מתוך 2.5 x5 10, לתאים 2.5 x 106 תאים). מינימלי החל החומר שצריך מוגדרת על-ידי כמה רגיש הגילוי הוא שיטה של פעילות אנזימטי LDH. הפרוטוקול סביר מאוד וניתן לשנותם באופן משמעותי בהמשך, על ידי להצטמצם אמצעי האחסון בשימוש ב שלבים 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 ו- 4.3.

הגורם הקריטי ביותר ואתגר טכני עם וזמינותו היא השלב electrodisruption. הזרם החשמלי החזק, אבל קצר, של תאים בפתרון ללא יון, מול התוצאה היא הפרעה אחיד ובלתי סלקטיבית של קרום פלזמה, תוך השארת מבנה תאיים ו- organelles (כולל וקואלות autophagic) שלם12, 29. בעת שימוש תאים חסיד, זה חיוני כי הם סובלים אנזימטי ועל מכניים הטיפולים בשלבים 2.1-3.1 (ניתוק התא, צנטריפוגה, ו- resuspension). עבור שלב 3.1, זה לא קריטי כדי לקבל השעיה תא בודד לחלוטין. לדוגמה, זה מאוד קשה להשיג עם תאים LNCaP. למרות זאת, electrodisruption מוצלחת ליד 100% של התאים תמיד מתקבל, אפילו בתוך גושים תא המכיל עשרות תאים המחוברים פיזית. כאשר בדיקות סוג תא חדש, מומלץ לבדוק את היעילות של electrodisruption (ראה שלב 3.3.1)17. ל 100 אחוז התאים צריך להיות לצמיתות Trypan Blue חיובי לאחר electrodisruption בשלב17. אם זה לא המקרה, חייב ההגדרות electroporator ככל הנראה להשתנות. באמצעות וזמינותו 20 סוגים שונים בתרבית של תאים, מעולם לא היו לנו לשנות את הגדרות electroporator. לכן, ברגע ההגדרות שנמצאו עבור קו בתרבית של תאים אחד, סביר לעבוד עבור כל הסוגים האחרים של תאי יונקים. כדי לוודא כי התנאים electrodisruption אינם קשים מדי, קרי,כי רק קרום פלזמה, לא על הממברנות של organelles תאיים שובשו, בצע צעד 3.3.2.

תפזורת autophagy מתבצע על ידי autophagosomes זה שיתוף sequester כמויות ניכרות של ציטוזול יחד עם מטענים אחרים. זה עלול לקרות דרך autophagy גרידא לא בררניים חלקים של הציטופלסמה, או באופן שמייצג שילוב של autophagy סלקטיבית, לא בררניים. את התאריך אינו ברור או באיזה מידה autophagy סלקטיבית, לא בררניים להתקיים בשני מצבים שונים של autophagy, או אם autophagosomes ככלל sequester בו זמנית מטען נימוסים סלקטיבית וגם לא בררניים. חשוב, עם זאת, מחקר שנערך לאחרונה דיווחו כי מפעילי autophagy סלקטיבי לגרום עלייה דומה בצובר מטענים cytosolic פחמיות כמו פחמיות של מטען מסוים30. תוצאות מעבדה משלנו אתה מסכים עם זה (שלנו שלא פורסמו תוצאות). ניתוח של פחמיות של חלבונים מסיסים cytosolic (למשל, LDH) ולכן סביר יש את היכולת לזהות שינויים macroautophagic פעילות פחמיות תחת רבים, אם לא בכל תנאי. עם זאת, למרות זה עדיין נשאר כדי להוכיח, האפשרות לא ייכללו כי סוגים מסוימים של תנאים זירוז באופן ייחודי מסוג autophagy סלקטיבי-בלעדי איפה המטען הוא כל כך חזק עטוף phagophore ציטוזול אפילו את זה נכללו להיות מופרדת לתוך autophagosome. כדי לחקור אם תנאי כזה יכול להתקיים, מבחני autophagy בכמות גדולה כמו וזמינותו פחמיות LDH צריכה לפעול במקביל מבחני autophagy סלקטיבי.

אחד היתרונות העיקריים של וזמינותו פחמיות LDH הוא זה מודד את פחמיות של מטענים אנדוגני, ובכך שיטה ישימה בהרחבה. יתר על כן, וזמינותו מודד פעילות פחמיות בצורה מאוד כמותית. LDH פחמיות וזמינותו היא כלי חשוב ללמוד את מנגנוני וויסות של היווצרות autophagosome, מאז פתח phagophores לא sequester LDH. זה מאוד מסורבל וקשה, אם לא בלתי אפשרי להעריך אם מבנים דמויי-autophagosome הם ישויות אטום או לא על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה נוספת הנמצאת בשימוש כדי לנתח אם autophagosomes סגורות היא לבחון את הרגישות של סמנים autophagy (למשל, LC3) או קולטנים (למשל, sequestosome 1 (p62/SQSTM1) או חלבון גרעיני נקודה 52 (NDP52)) כדי פרוטאזות10 31, ,32. החיסרון של זה וזמינותו היא שזה הוא לומד פרוטאז הגנה על רכיבים העגלה ולא מטען autophagic. יתר על כן, מאז וזמינותו מבוסס על המערב סופג, זה רק חצי כמותית.

ואילו היכולת לנתח autophagy המטען אנדוגני הוא יתרון, מגבלה הגלום עם LDH פחמיות וזמינותו, כל מבחני אחרים זה להעריך פחמיות של מטענים אנדוגני, הוא כי מעכב השפלה חייב להיות כלול על מנת להבחין השפעות ספציפיות על פחמיות autophagic ולא נטו השפעות פחמיות והשפלה. מעכבי יעיל של LDH השפלה כוללים מעכבי משאבת פרוטונים כמו סוכנים Baf או concanamycin16,3,18, lysosomotropic כמו אמוניום כלוריד כלורוקווין33. Leupeptin מעכב פרוטאז מתאים החולדה הראשית hepatocytes23, אבל בדרך כלל לא יעיל בשורות בתרבית של תאים בדקנו. אנו משתמשים באופן שגרתי Baf13, אשר פועל במהירות והוא יעיל ביותר בתאים ממאירים והן nonmalignant. עם זאת, חשוב לזכור כי אף אחד מעכבי השפלה LDH הספציפיים לחלוטין, בשם השפעות מעכבי על autophagy לא ייכללו. כדי למזער את הסיכון של השפעה לא ספציפית, זה recommendable להשתמש ריכוזי המדכא הנמצאות רק קולח רמות, וכדי לכלול את המדכא רק עבור השעות האחרונות (3-4 h) של הניסוי. ריכוז Baf saturating צריך להיקבע עבור כל סוג התא. כמדריך, 50 – 100 ננומטר הוא קולח עבור רוב הקווים בתרבית של תאים בתרבית בדקנו, ואילו התא כמה סוגי כגון MEFs דורשים רק 10 ננומטר Baf עבור בלוק מלא ב- LDH השפלה.

עם LDH פחמיות וזמינותו הגבלה ברור הוא כי זה ניתן לבצע אך ורק על תאים חיים, ובכך למעט השימוש לניתוח של autophagy ב קבוע תאים ורקמות. מצד שני, יש כיום אין מבחני הוקמה זה יכול למדוד פעילות autophagic תפקודית בתאים קבוע. אף לא נבדק עם פרוטוקול הנוכחי, זה צריך להיות אפשרי להשתמש וזמינותו פחמיות LDH להעריך ויוו autophagic פחמיות פעילות אורגניזמים ניסיוני. המגבלה יהיה האורגניזם חייב לסבול את הטיפול עם מעכב של השפלה LDH lysosomal, כי פרק הזמן בין הביצועים של וזמינותו וטיפול כזה צריך להיות קצר יחסית, כדי למזער את ההשפעות האפשריות שאינם ספציפיים של החומר המדכא. מעניין, מחקר מוקדם על ידי. Kominami et al., ציין כי h 3 – 6. הטיפול של חולדות עם leupeptin (הזרקת בקרום הבטן של 2 מ"ג/100 גרם של משקל הגוף) הוא ראוי להתבונן יעיל הצטברות לקטט דהידרוגנאז autophagically מוחרמת בכבד שברים subcellular מועשר עבור וקואלות autophagic34.

ביטוי חוץ רחמי פחמיות פלורסנט pH רגיש רגשים כגון רוזלה35 או Keima36 יכול לשמש כדי להמחיש פחמיות autophagic ללא צורך כולל מעכבי השפלה. יתר על כן, בניגוד וזמינותו פחמיות LDH, גישות כזה יכול לשמש כדי לדמיין פחמיות autophagic תאים בודדים. בנוסף, פיוז'ן של המכשיר כדי פילוח אברון רצפים יכול להיות מנוצל כדי לפקח פחמיות של organelles ספציפיים. פלטפורמות מיקרוסקופיים חזק עשוי לאפשר גם ניתוחים ההקרנה תפוקה גבוהה. החסרונות הם ביטוי רגש חוץ רחמי, כמו גם הצטברות של המכשיר במערכת lysosomal, עשויים להשפיע מסלול autophagic. יתר על כן, בניגוד וזמינותו פחמיות LDH, אחד הוא תלוי תאים יכולים להיות transfected ביעילות. לבסוף, ואילו וזמינותו פחמיות LDH מספקת של פלט ישר קדימה כמותית של אחוז מבודדות ציטוזול, השיטות מבוססות-תמונה בדרך כלל אינו יכול לספק סוג זה של פלט כמותי מוחלט. זה יהיה מומלץ לעשות שימוש בשני סוגי גישות באופן משלים. שיטה מצוינת נוספת ללמוד פחמיות autophagic ללא צורך מעכבי השפלה היא להציג radiolabeled raffinose לתוך תאים על-ידי הפיכה אלקטרו-permeabilization3,23,37, 38. Raffinose הוא סוכר ממברנה-impermeant ואדישה סמויה אשר עמיד בפני אנזימים lysosomal. לכן, פחמיות autophagic שלה יכולה להיות מלווה הפרדת cytosolic מ- sedimentable תא שברים3,23,37,38. גישה זו היא, עם זאת, זמן רב יותר מאשר וזמינותו פחמיות LDH, ודורש זהירות נוספים עקב השימוש של רדיואקטיביות. בסופו של דבר, התוצאה הסופית של פחמיות autophagic בתפזורת, מטענים autophagic בלא הפרעה שטף, ההשפלה של חלבונים חיים ארוכים, במדויק נמדד על ידי חלבון ומבוססת בשיטה המבוססת labelling39,40 ,41,42,43. עם זאת, בניגוד וזמינותו פחמיות LDH, שיטה זו אינה מספקת read-out ספציפיים לפעילות autophagic, מאז חלבונים חיים ארוכים הם מושפל גם מנגנונים אחרים מאשר autophagy, בייחוד על ידי מערכת proteasomal (ואילו לקטט דהידרוגנאז פחמיות מתרחשת רק כתוצאה autophagy). לכן, מספר של שליטה טיפולים צריך להיות באופן שגרתי כלול, למשל, כימי מעכבים של autophagic-lysosomal או proteasomal השפלה, והפרעות גנטיות עם3,autophagy16.

LDH פחמיות וזמינותו ניתן להשוואה עם מבחני השטף LC3 נפוץ, אשר למדוד רמות LC3-II סופג המערבי או LC3 puncta צורה על-ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה היעדרות או נוכחות של מעכבי של השפלה LC3 lysosomal (Baf הוא רוב לעתים קרובות משמש), או את המעבר של גרסאות LC3 מתויגות fluorescently לסביבות חומצי22. למרות אלה מבחני מבוסס-LC3 עשויים לספק מידע שימושי, הם יכולים להיות שקשה לפרש, בפרט כי הקשר בין מידת השטף LC3 ואת כמות סוג המטען השטף אינו ידוע. כאמור במבוא, בצובר autophagy, mitophagy תלויי-פרקין אינם דורשים LC3 חלבונים משפחה9,10,11,44. יתר על כן, ב hepatocytes עכברוש מורעבים, LDH פחמיות והשפלה ממשיך ללא הפרעה במהלך פרקי זמן איפה שיש לא autophagic lysosomal LC3 שטף9. לכן, במקרה זה, שטף מטענים יכול להיות לחלוטין הופרדו LC3 השטף. דרוש מחקר נוסף השוואת LC3 השטף עם סוגים שונים של מטענים השטף כדאי לפרש תוצאות שהושג עם מבחני השטף LC3.

במתכונתו הנוכחית, וזמינותו פחמיות LDH משולה המערבי סופג הזמן הנדרש על הידיים, עלויות. מבחינת מדידת נפח autophagy, זה לפחות יעיל כמו וזמינותו פחמיות מבוססי raffinose או חלבון מאריכים השפלה וזמינותו שתוארו לעיל. המסוימת של פעילות פחמיות autophagic בתפזורת, היווצרות autophagosomes סגור, זה הרבה יותר יעיל, ישר קדימה מאשר LC3 השטף מבחני או פרוטאז מבחני הגנה של קולטני LC3 או autophagy, מאז מבחני האחרון למדוד את מרכיבי העגלה ולא מטענים בפועל. למרות שאנחנו השתפרו באופן משמעותי את התפוקה של LDH פחמיות וזמינותו, זה רחוק וזמינותו תפוקה גבוהה, להתחרות ביעילות של מבחני מבוססת תמונה שתוארו לעיל. עם זאת, את מבחני מבוססת תמונה והן וזמינותו פחמיות LDH יש יתרונות וחסרונות, ולכן יש שני סוגי מבחני הערכים שלהן. זה אפשרי סביר באמצעות התאמות בעתיד לעשות את LDH פחמיות assay חצי תפוקה גבוהה. לדוגמה, זה צריך להיות אפשרי לבצע electrodisruption בתבנית 96-ובכן, זה מתקבל על הדעת cytosolic LDH יכול ניתן להפריד בין LDH מוחרמת על ידי סינון במקום צנטריפוגה, או כי ניתן לבצע את הצעד צנטריפוגה ב 96- ובכן לעצב. יתר על כן, מבחני למדוד פעילות LDH, כי הם הרבה יותר רגישים יותר בשימוש בפרוטוקול הנוכחי פותחו, והם זמינים מסחרית. אחרים פוטנציאל עתידי מעניין של וזמינותו השימוש בשם בו סוגי תאים אחרים מאשר תאים בתרבית של, למשל שמרים או אורגניזמים חד־תאיות אחרים, או אפילו צמח תאים, כמו גם את השימוש ב- vivo מדידות של autophagic פעילויות פחמיות ברקמות של אורגניזמים ניסיוני.

לסיכום, אנו מאמינים כי וזמינותו פחמיות LDH בצורתו משופרת, לתחייה יהיה כלי חשוב במחקר הקשורות autophagy בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מועצת המחקר של נורבגיה, אוניברסיטת אוסלו, קרן Jahre אנדרס, קרן Nansen, המורשת לזכרו של הנריק Homan. אנו מודים ד ר Mizushima נובורו עבור ATG5 + / + MEFs ו- ATG5-/-MEFs, ד ר מסאקי Komatsu עבור ATG7 + / + MEFs ATG7/MEFs, ואת ד ר אקירה שיזואו עבור ATG9A + / + MEFs ו- ATG9A/MEFs. אנו מודים Sætre פרנק סיוע טכני, ד ר לכל O. Seglen על דיונים מועילים מתודולוגי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 137 LDH לקטט דהידרוגנאז פחמיות autophagy מטענים autophagic phagophore autophagosome Bafilomycin A1 LC3
לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N.… More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter