Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Laktat Dehydrogenase lagring analysen-En enkel og pålitelig metode å avgjøre Bulk Autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller

doi: 10.3791/57971 Published: July 27, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Her er en enkel og godt validert protokoll for å måle bulk autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller beskrevet. Metoden er basert på kvantifisere andelen av laktat dehydrogenase (LDH) i sedimentable celle fraksjoner sammenlignet med totale mobilnettet LDH nivåer.

Abstract

Bulk autophagy er preget av lagring av store deler av cytoplasma i dobbel/multi-membrane strukturer kalt autophagosomes. Her er en enkel protokoll for å overvåke denne prosessen beskrevet. Dessuten, typiske resultater og eksperimentelle validering av metoden under autophagy-inducing forhold i ulike typer kulturperler pattedyrceller tilbys. Under bulk autophagy beslaglegge autophagosomes stoffer, og dermed også løselig cytosolic proteiner, sammen med andre autophagic Last. LDH er en stabil og rikelig, løselig cytosolic enzym som er ikke-selektivt sequestered i autophagosomes. Mengden av LDH lagring gjenspeiler mengden bulk autophagic lagring. Å effektivt og nøyaktig bestemme LDH lagring i celler, bruker vi en electrodisruption-baserte fraksjoneres protokoll som effektivt skiller sedimentable fra cytosolic LDH, etterfulgt av måling av enzymatisk aktivitet i sedimentable fraksjoner mot hele celle prøver. Autophagic lagring bestemmes ved å trekke andelen sedimentable LDH i ubehandlet celler fra de i behandlet cellene. Fordelen av LDH lagring analysen er at det gir et kvantitativt mål for autophagic lagring av endogene Last, i motsetning til andre metoder at enten innebære ektopisk uttrykk for lagring sonder eller semi kvantitative protease beskyttelse analyser av autophagy markører eller reseptorer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Autophagy (gresk for «Self-spising») er en bevart evolusjonsprosessen for mer/lysosomale nedbrytning av intracellulær materiale. Etter oppdagelsen av autophagy-relaterte ("ATG") genene, som er viktig for autophagy i gjær og mennesker, og realisering at autophagy spiller en viktig rolle i helse og sykdom (anerkjent av Nobelprisen i medisin eller fysiologi til i 2016 Yoshinori Ohsumi), autophagy har raskt blitt en av de mest intenst studerte prosessene i cellen biologi1,2.

Macroautophagy (heretter kalt "autophagy") er preget av utvidelse og folding av intracellulær membran cisternae ("phagophores") i forseglet, dobbel - eller multi - membrane strukturer ("autophagosomes") som effektivt beslaglegge det enwrapped materiale fra resten av cytoplasma. Ved blanding av autophagosomes med lysosomer, er indre autophagosomal membranen og sequestered lasten degradert og resirkulert. Autophagosomes kan beslaglegge cytoplasmatiske materiale i både tilfeldig (ikke-selektive autophagy) og selektiv (selektiv autophagy) oppførsel. Bulk autophagy mest sannsynlig representerer en blanding av ikke-selektive og selektive autophagy.

I 1960 og 70-tallet («morfologiske æra"av autophagy forskning), ble autophagic lagring hovedsakelig vurdert gjennom ultrastructural analyser. På 1980-tallet og begynnelsen av 1990-tallet («den biokjemiske era") Per Seglen og kolleger, som studerte autophagy i primære rotte hepatocytter-utviklet første metodene kvantitativt mål autophagic lagring aktivitet3. Bruker disse analyser, Seglen definert og preget forskjellige trinnene av autophagic-lysosomale veien4,5, oppdaget skapt amphisome6 (produktet av endosome-autophagosome fusion) og var først Beskriv rollen protein fosforylering i autophagy regulering7. Men etter oppdagelsen av ATGs på 1990-tallet («den molekylære era") og første karakterisering av et pattedyr ATG8 protein, microtubule-assosiert protein 1A/1B-lys kjeden 3 (LC3) i 20008, bruk av ATG proteiner som markører for den autophagic prosessen raskt vunnet popularitet, og de eldre og mer arbeidskrevende biokjemiske metodene ble igjen. Faktisk over de siste 18 år og western blot fluorescens mikroskopi analyser av LC3 har blitt den desidert mest populære (og i mange tilfeller den eneste) måte å studere autophagy i pattedyrceller. Fordelen er det er relative enkelt som disse metodene kan utføres. Ulempen er at man studerer en handlevogn komponent (LC3) i stedet for faktiske autophagic Last. Dette er en ganske alvorlig ulempe, fordi forholdet mellom USA og/eller fluks av LC3 gjennom sti mot lagring og fluks av Last er svært uklart. Faktisk vi har vist at bulk Last flux kan opprettholdes på høye nivåer under forhold der det er ingen LC3 forandring, til tross for tilstedeværelsen av konjugert LC3 i cellene9. Videre viste vi at bulk autophagy påvirkes ikke av effektiv LC3 utarming, og dermed sannsynligvis er uavhengig av LC39. Dette funnet har senere blitt bekreftet av LC3 bank-out studier10,11, som også indikere at Parkin-avhengige mitophagy (den selektive autophagy i mitokondrier) er uavhengig av LC310,11 .

I sammendraget, det er et klart behov for Last-baserte analyser å overvåke autophagic aktivitet. Optimalt bør slike analyser være bredt aktuelt, veldefinerte og lett å utføre. De siste årene har vi tatt en spesiell interesse LDH lagring analysen, som ble utviklet av Per Seglen i 198012, og er basert på måling overføring av cytosolic LDH til sedimentable, autophagic vacuole inneholder cellen brøker. LDH er en stabil, løselig cytosolic protein som er lett co sequestered når phagophores enwrap cytoplasmatiske Last. Lagring av LDH er derfor et generelt mål på autophagic lagring. LDH er utelukkende nedverdiget ved autophagic-lysosomale veien12. Således, i nærvær av lysosomale fornedrelse hemmere, f.eks bafilomycin A1 (Baf)13, eksperimentell behandling effekter direkte gjenspeile endringer i autophagic lagring aktivitet. I fravær av nedbrytning hemmere, kan virkningen endringer i LDH lagring og fornedrelse måles.

LDH lagring analysen er bredt aktuelt, siden LDH er svært og overalt uttrykt i alle celletyper, og LDH nivåer kan kvantifiseres nøyaktig ved en enzymatisk analysen14,15. Men originalen protokoll12 -etablert i primære rotte hepatocytter, var ganske tidkrevende og krevde en høy mengde starter materiale samt en skreddersydd elektrisk utladning kondensator. På en step-wise måte, har vi gradvis forvandlet analysen til en enkel og allsidig metode. Først var den originale protokollen tilpasset for bruk i pattedyr cellen linjer16. Andre var metoden vesentlig downscaled3,9. Tredje, flere trinn i protokollen ble eliminert, inkludert en arbeidskrevende tetthet pute trinn17. Dette aktivert samtidig en ytterligere nedskalering av metoden, fra det opprinnelige startpunktet for å bruke en 10 cm plate per eksempel16 å bruke en enkelt brønn fra en 12-vel plate per prøve (dvs.ca 15-fold mindre starter materiale)17. Fjerde identifisert vi en kommersiell electroporation apparater som kan erstatte de skreddersydde elektriske utladning kondensator17.

Her er vår nyeste protokollen av LDH lagring analysen, som omfatter noen flere forenklinger av metoden i forhold til de tidligere publiserte17 presentert. Videre et sett med typiske resultatene i en rekke ulike celletyper vises, og viktigst, flere linjer med eksperimentelle valideringene av metoden bruker farmakologiske samt genetisk knockdown og knockout innfallsvinkler tilbys. Hvis en samlet flyt plan for hele protokollen, kan du se figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. celle såing og behandling

  1. Kultur tilhenger cellene i 75 cm2 vev kultur flasker i en fuktet inkubator med 5% CO2 på 37 ° C med den foretrukne kultur mediet for den aktuelle cellen. At cellene å vokse til de når en nær confluent celle lag.
    Merk: Bruk RPMI 1640 medium med 10% fosterets bovin serum (FBS) for LNCaP, HEK293, mus embryonale fibroblaster (MEFs), BJ, MCF-7 og RPE-1 celler.
    1. Vask cellene med 3 mL 37 ° C fosfat-bufret saltvann (PBS), pH 7.4. Erstatte PBS med 3 mL 0,25% (w/v) Trypsin-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) og ruge flasken i en fuktet inkubator med 5% CO2 på 37 ° C til cellene koble (2-5 min).
    2. Resuspend frittliggende cellene med 7 mL kultur medium med 10% FBS. Bland en 10 µL celle suspensjon aliquot med 10 µL 0,4% Trypan blå i et microcentrifuge rør, bruke en 0,5-20 µL pipette tips. Bruk samme pipette spissen umiddelbart fylle et telling kammer lysbilde og telle celler i en automatisert celle teller.
  2. Forberede en passende fortynning (se merknaden nedenfor) av cellen suspensjon trinn 1.1.2 bruker kultur medium med 10% FBS, og frø 1 mL av utvannet celle suspensjon i hver brønn av en 12-vel vev kultur plate (areal ~3.8 cm2) med aseptisk teknikk. At veksten i en fuktet inkubator med 5% CO2 på 37 ° C til ønsket celle tetthet er nådd, eksempelvis 60-90% samløpet på harvest.
    Merk: Den aktuelle fortynning av cellen suspensjon som vil gi den ønskede celle confluency i høst vil variere fra celle type til celle type og varighet og type eksperimentelle behandlinger. Dermed må dette empirisk vurderes i hvert tilfelle.
    1. For eksperimenter som skal begge behandlet og høstet 2 dager etter frø, frø 2.5 x 105 LNCaP, HEK293, eller MCF-7 celler, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ eller 1,5 x 105 RPE-1 celler i hver brønn av 12-vel plate.
    2. For celler som følger løst, pels platene med typen belegg anbefales for den aktuelle cellen. LNCaP (og HEK293) bruke celler platene belagt med poly-D-lysine (PDL).
    3. Derfor, legger til 500 µL PDL 2,5 µg/mL i sterilt H2O hver brønn, og ruge plater i et sterilt miljø for 30 min ved romtemperatur (20-25 ° C). Fjerne PDL med suging og vaske godt kort med 1 mL steril H2O.
      Merk: Vanligvis trinn 1.2.1 er gjort uten noen eksperimentelle behandlinger. Men hvis utfører RNAi, kan det være nyttig å starte en omvendt transfection med seeding9.
  3. Utføre eksperimentelle behandlinger i to og tre eksemplarer brønner per betingelse.
    1. For eksempel behandle cellene med 50 nM i mTOR-hemmer Torin1, som vanligvis er en effektiv induser av autophagic lagring, eller underlagt cellene til akutt serum- og aminosyre sult ved å vaske cellene med 1 mL av aminosyre-fri Earle er balansert Salt løsning (EBSS) medium, og senere ruge cellene i 1 mL av EBSS i en fuktet inkubator med 5% CO2 på 37 ° C.
    2. La ett sett av ubehandlet for å definere bakgrunn nivåer av sedimentable LDH.
    3. Legge til en mette mengde etter lagring hemmer bafilomycin A1 (Baf)3,13,16,18 i fravær eller tilstedeværelse av de eksperimentelle behandlingene, 3-4 h før cellen innhøstingen. Inkuber cellene i en fuktet inkubator med 5% CO2 på 37 ° C.
      1. Bruk 100 nM Baf for LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 og RPE-1 celler, og 10 nM Baf for MEFs.
      2. For eksperimentelle behandlinger som har en varighet på bare 3-4 timer (som vanligvis har de eksemplifisert i trinnet 1.3.1), legge Baf samtidig med behandlinger. Vente til 3-4 h før innhøsting lenger eksperimentelle behandlinger, og legge til 2 µL av en 500 x konsentrert Baf lager direkte til medium.
      3. Bland ved agitating plate umiddelbart etter tillegg av Baf. På dette punktet er det også anbefales å legge macroautophagic lagring hemmere som kontroller, f.eks 10 mM av pan-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) hemmer 3-methyl adenine (3MA)19eller 10 µM av selektive PI3K klasse III hemmer SAR-40520.

2. celle Harvest og forberedelse til Electrodisruption

  1. På slutten av behandlingsperioden, Sug opp mediet med suging og legge 200 µL celle avdeling løsning (forvarmet til 37 ° C) i hver brønn. Ruge på 37 ° C til cellene koble (vanligvis rundt 5 min).
    Merk: Mens 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA kan brukes i stedet for celle avdeling løsningen, sistnevnte inneholder DNase, som bidrar til å redusere viskositeten av frittstående cellene. Så lenge mediet er grundig pustende, er det ikke nødvendig å vaske cellene før addisjon av Trypsin-EDTA eller celle avdeling løsning.
  2. Legg til 500 µL romtemperatur (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, som inneholder 2% (w/v) bovin serum albumin (BSA) i hver brønn, og resuspend med Pipetter til ingen celle klumper er synlige. Øyeblikkelig overføre celle suspensjon til 1,5 mL microcentrifuge rør på is.
    Merk: Med mindre annet er oppgitt, utføres alle etterfølgende trinnene på isen.
  3. Sediment cellene med sentrifugering 400 x g i 5 min på 4 ° C.
  4. Grundig Sug opp nedbryting (med suging) for å la celle pellets så tørr som mulig.
  5. Legge til 400 µL 10% (w/v) sukrose (i ultrapure H2O) i hver retning.

3. Plasma membran Electrodisruption og separasjon av Sedimentable - og Total-celle brøker

  1. Resuspend celle pellets med en pipette å få en nær encellede suspensjon, og overføre den til 4 mm electroporation søppel.
    Merk: Pipettering opp ~ 10-15 ganger, bruke en 100-1000 µL pipette tips, er vanligvis tilstrekkelig.
  2. Plasser cuvette i en eksponensiell decay bølge electroporator og utslipp en enkelt elektrisk puls på 800 V, 25 µF og 400 Ω; disse innstillingene gir en puls av ~ 8 ms varighet.
  3. Bruke nye pipette tips for å overføre celle disruptate til en 1,5 mL microcentrifuge tube med 400 µL iskald fosfat-bufret sucrose løsning (100 mM natrium monofosfat, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA og 1,75% sukrose, pH 7.5) og bland kort ved pipettering.
    1. Valgfritt: For å bekrefte effektiv plasma membran electrodisruption17, bland 10 µL av utvannet celle disruptate fra trinn 3.3 med 10 µL 0,4% Trypan blå i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Overføre til en telling kammer og kontroller at andelen Trypan blå positiv celler er > 99%.
      1. La prøven i telling kammeret i 30 min ved romtemperatur (20-25 ° C), og kontroller at andelen Trypan blå positiv celler forble > 99%.
    2. Valgfritt: For å bekrefte at electrodisruption ikke er for harde, at det ikke har forstyrret intracellulær organeller, fremgangsmåten 1.1-3.3 som beskrevet ovenfor, men bruker en større utgangsmaterialet (en brønn fra en 6-vel plate med en ~ 80% confluent celle lag), og bruk 150 µL 10% sukrose i trinn 2.5 og 150 µL fosfat-bufret sucrose løsning uten DTT i trinn 3.3.
      1. Bruke en pipette å nøye lag 200 µL av utvannet celle disruptate løsningen på en 1,2 mL tetthet pute fosfat-bufret 8% (w/v) tetthet gradert middels (f.eks, 8% Nycodenz, 50 mM natrium fosfat, 2,2% sukrose, 1 mM EDTA) i en 2 mL sentrifuge rør. Sentrifuge 20.000 x g for 45 min ved 4 ° C i en microcentrifuge med myke-modus funksjon (for mild akselerasjon og deselerasjon), og nøye satte rørene på is.
      2. Fjern forsiktig 60 µL ~ 200 µL topp brøkdel, og pass på ikke å plukke opp noen tetthet gradert middels løsning, og overføre til en frisk microcentrifuge tube.
        Merk: Denne skal inneholde stoffer eksepsjonelle renhet, kalt "celle sap"21.
      3. Test renheten i brøken innhentet i trinnet ovenfor, ved å utføre western blot analyser av organelle-inneholdt proteiner, bruker standard teknikker og 4-20% gradient gels16.
      4. Utføre for eksempel immunoblotting for katepsin B21, cytochrome c, og protein disulphide isomerase, kontrollere at elektrisk støt i trinn 3.2 ikke har forstyrret lysosomer og mitokondriene, endoplasmatiske retikulum, henholdsvis, og immunoblot for LDH å bekrefte tilstedeværelse av en cytosolic proteiner i cellen sap.
      5. Parallelt, utføre immunoblotting på protein ekstrakter laget av total-celle disruptate løsning16 å bekrefte at antistoffer brukt kan oppdage organelle-inneholdt proteiner som er relevant for stillingen.
  4. Gjenta trinn 3.1-3.3 for hvert utvalg.
  5. Fjerne 550 µL fra hver utvannet celle disruptate løsning (innhentet på trinn 3.3) til 2 mL microcentrifuge rør som inneholder 900 µL iskald rørets buffer (50 mM natrium monofosfat, 1 mM DTT og 1 mM EDTA 5.9% sukrose, pH 7.5) supplert med 0,5% BSA og 0,01% Tween-20, og bland kort av pipettering.
  6. Sentrifuge 18.000 x g for 45 min ved 4 ° C å produsere pellets som inneholder "sedimented LDH". Grundig Sug opp nedbryting (med suging) for å forlate pellets så tørr som mulig. Sett prøvene i-80 ° C fryser.
  7. Overføre 150 µL fra hver utvannet celle disruptate løsning (innhentet på trinn 3.3) til nye rør, og plasser prøvene i-80 ° C fryser. Bruk disse prøvene for å bestemme "totalt LDH" nivåene i cellene.
    Merk: På dette punktet eksperimentet kan pauses som ønsket.

4. LDH utvinning og måling av LDH enzymatisk aktivitet

  1. Tine "sedimented LDH" (fra trinn 3.6) og "totalt LDH" prøver (fra trinn 3.7) på is.
  2. Legge til 300 µL iskald rørets bufferen som inneholder 1,5% Triton X-405 til "Totale LDH" prøver (gir en siste Triton X-405 konsentrasjon av 1%). Rotere eksemplene på en roller i et kaldt rom (4-8 ° C) for 30 min.
  3. Legg 750 µL av iskalde rørets buffer med 1% Triton X-405 til "sedimented LDH" eksempler, og resuspend pellets med en pipette til en homogen løsning er nådd.
  4. Sentrifuge prøvene fra trinn 4.2 og 4.3 18.000 x g i 5 min på 4 ° C til sedimenter fra ikke mobilnettet rusk.
  5. Blanding 4 deler av kaldt 65 mM imidazole (pH 7.5)/0.75 mM pyruvate med en del av kaldt 65 mM imidazole (pH 7.5) / 1,8 mM NADH å få en fungerende løsning som er stabil i minst tre uker på 4 ° C.
  6. Bland 3-30 µL av supernatants fra trinn 4.4 med 200 µL av skritt 4,5 arbeider løsningen.
  7. Bestemme mengden av LDH ved å måle LDH enzymatisk aktivitet som nedgangen i nikotinamid adenine dinucleotide (redusert skjema) (NADH) absorbans ved 340 nm på 37 ° C sammenlignet med en standard med en kjent LDH konsentrasjon. Utføre absorbansen målinger før reaksjonen har nærmet seg ferdigstillelse, dvs før absorbansen på 340 nm lenger endres med tiden.
    Merk: Dette er den klassiske biokjemiske metoden å måle LDH aktivitet. Selv om gjeldende protokollen utfører reaksjonen på 37 ° C, kan også utføres ved romtemperatur (20-25 ° C), som anbefales hvis gjør manuell spectrophotometry. Gjeldende protokollen bruker en robot multianalyzer instrument, som i et automatisert mote blander prøver med fungerende løsning i en 96-brønns plate, og måler absorbansen på 340 nm på 37 ° C hver 20 s 3 min. Deretter instrument programvaren beregner konsentrasjonen av LDH, uttrykt som enheter (U) / L, ved å sammenligne skråningen av absorbansen målinger over tid sammenlignet med en standard kurve innhentet gjennom kalibreringen med en standard av kjente LDH konsentrasjon. Lineær er oppdagelsen av denne tilnærmingen 30-1500 U/L. Som et alternativ, en rekke kommersielt tilgjengelige kits å måle LDH finnes. Noen av dem er basert på koplingen enzymatiske reaksjonen til generasjon av kolorimetrisk eller fluorescerende produkter, som muliggjør gjenkjenning på andre måter enn UV spectrophotometry, og andre lineær verdier gjenkjenning.

5. beregning av LDH lagring

  1. Beregning av sedimented LDH til totalt LDH for hver prøve, tar fortynninger og prøvetaking hensyn:
    Sedimented LDH (%) =Equation 1
    Merk: I trinnene 3.1-3.3 ca 50 µL er tapt på grunn av transport inn og ut av electroporation cuvette. Dermed beregne fra har totalt 750 µL (i stedet for 800 µL) av fortynnet celle disruptate i trinn 3.3.
  2. Trekk prosentandelen av sedimented LDH innhentet i prøvene fra ubehandlet celler (trinn 1.3.2) fra andelen sedimented LDH innhentet i prøver fra eksperimentelt behandlet celler og skillet innen behandling med Baf å få ønsket sequestered LDH per time i prøvetaking perioden:
    Sequestered LDH (% / h) =Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved hjelp av protokollen beskrevet her, bulk autophagic lagring aktivitet i en rekke ulike pattedyr cellelinjer, inkludert LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, jakten, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, mus embryonale fibroblaster (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ og LNCaP ble målt. Lagring ble vurdert under basale forhold (i komplett, næringsrike medium), eller i celler akutt sultet for serum og aminosyrer (et bona fide autophagy-inducing tilstand22). Resultatene indikerte at LDH lagring aktivitet under sult forhold varierer mye over forskjellige linjer, fra knapt Detektbart nivåer i LAPC4, DU145, Huh7 og PNT2 celler (data ikke vist) til ~1.6%/h i LNCaP celler (figur 2 A). Observert i starved primære rotte hepatocytter er høyere enn i linjer ovenfor og vanligvis varierer fra 2.5–4%/h23. Under basale forhold, LDH lagring var praktisk talt uoppdagelig i halvparten av cellen linjene testet og varierte fra ~0.2%/h til ~0.5%/h i den andre halvparten (data ikke vist). Cellen på linjene som viser Detektbart basale autophagic lagring aktivitet induserer akutt serum og aminosyre sult vanligvis en 3-4 ganger økning i LDH lagring rate (se for eksempel LNCaP eksperimentet vist i figur 2A). Testet celle linjene (nevnt ovenfor) er bakgrunn andelen sedimented LDH innhentet i prøver fra ubehandlet celler (trinn 1.3.2) vanligvis rundt 2-3%. Fra 22 uavhengig eksperimenter utført i ulike linjer, den intra eksperimentelle variasjonskoeffisienten (CV) mellom sedimented LDH (% sedimented LDH) av behandling replikat var 5,8% ± 1,7% (gjennomsnittlig % CV ± standardavvik), fra 3.0- 9.0%. Sammen gir disse tallene en indikasjon på hva du kan forvente når du utfører LDH lagring analysen i pattedyrceller.

Bruk av kjemiske hemmere som vel som genetiske knockdown og knockout tilnærminger, bekrefter omfattende at LDH lagring analysen pålitelig måler autophagic lagring aktivitet. Autophagosome formasjon krever aktiv PI3K klasse III (PIK3C3) og Unc-51 som autophagy aktivere kinase (ULK)24, samt balanse i intracellulær Ca2 + homeostase16. Som vist i figur 2A, både basal og sult-indusert LDH lagring er helt avskaffet av pan-PI3K hemmer 3MA, selektiv PIK3C3 hemmer SAR-40520, eller det ER Ca2 + pumpe hemmer thapsigargin (TG) 25 i LNCaP celler. LDH lagring under sult forhold (Bytt til aminosyre-fri Earle balansert Salt løsning (EBSS) middels) er også sterkt redusert ved TG eller ULK-hemmer MRT67307 i HEK293 celler (figur 2B). Videre sult-indusert LDH lagring er konsekvent hemmet av 3MA i MEFs (figur 2C), BJ (figur 2D), MCF-7 (figur 2E) og RPE-1 (figur 2F) celler. Vanligvis fører inkubasjon celler i EBSS medium alene (dvs. i fravær av Baf eller andre etter lagring hemmere) ikke til noen målbare opphopning av sequestered LDH (se for eksempel LNCaP eksperimentet vist i figur 2 A). Dette er sannsynligvis fordi akutt aminosyre sult fører til akselerert autophagic-lysosomale forandring, noe som resulterer i rask og kontinuerlig nedbrytning av sequestered LDH.

Neste, ulike ATG genet knockout (KO) MEFs ble brukt til å teste om LDH lagring krever autophagy-relaterte gener rapportert å være avgjørende for autophagosome formasjon. Faktisk er sult-indusert LDH lagring avskaffet i ATG5 KO MEFs26 (Figur 3A), bekrefter vår tidligere funn9. Videre, som vist i Figur 3B og 3 C, sult-indusert LDH lagring er avstumpet også i ATG7 KO MEFs27 og ATG9A KO MEFs28.

Til slutt, LDH lagring analysen ble testet i forhold til om RNAi-mediert stanse nøkkel ATG genet transkripsjoner ville hemme sult-indusert lagring aktivitet. Faktisk, hva med ATG9A målretting siRNA eller kombinert målretting av ULK1 og ULK2, sterkt redusert LDH lagring under sult forhold i LNCaP celler (Figur 3D). Videre vi bekreftet vår tidligere funn3,9 at målretting av fokal vedheft kinase familie samspill protein av 200 kDa (FIP200) eller kombinert målretting typen γ-aminobutyric acid (reseptor-assosiert protein) A (GABAA) GABARAP) familiemedlemmer hemmer sult-indusert LDH lagring (Figur 3D).

Figure 1
Figur 1 : Samlet flyt av LDH lagring protokollen. Protokollen er basert på en 12-vel vev kultur plate format, med de angitte volumene per prøve (fra en brønn). Analysen protokollen kan enkelt deles inn i to separate arbeidsdager, som angitt. Det er imidlertid også mulig å utføre hele prosedyren i en dag. Forkortelser: ABB, etter blast buffer (se trinn 3.3 i protokollen for ingredienser); RSB, rørets buffer (se trinn 3.5 i protokollen for ingredienser). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Validering av LDH lagring analysen ved hjelp av autophagy-hemmende forbindelser. (A) LNCaP celler var enten venstre ubehandlet (for bakgrunnen subtraksjon: se trinn 1.3.2) i full vekst medium (CM; RPMI 1640 + 10% fosterets bovin serum (FBS)), eller de ble behandlet med DMSO kjøretøy (0,1%) eller 100 nM Baf i CM eller serum- og aminosyre fri medium (EBSS). I tillegg ble noen av cellene behandlet med 3MA (10 mM), SAR-405 (10 µM), eller Thapsigargin (300 nM) som angitt. Cellene ble høstet 3t behandling, og LDH lagring priser var bestemt som beskrevet i gjeldende protokollen. (B) HEK293 celler ble behandlet med DMSO kjøretøy (0,1%) i CM eller 100 nM Baf i EBSS, som angitt. I tillegg fikk noen av cellene 10 µM MRT67307 (en ULK hemmer) eller 300 nM Thapsigargin. LDH lagring priser var bestemt etter 3t behandling. (C-F) MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) eller RPE-1 (F) celler ble behandlet med DMSO kjøretøy (0,1%) i CM eller Baf (10 nM i C, 100 nM i D-F) i EBSS med eller uten 10 mM 3MA, som angitt. LDH lagring priser var bestemt etter 3t behandling. A, B, D, E og F viser mener verdier fra tre biologiske replikat (tre eksemplarer wells) fra et eksperiment (n = 1), med feilfelt representerer standardavvik. Viser mener verdiene fra tre uavhengige eksperimenter (n = 3), med feilfelt som representerer standard feil av gjsnitt. p < 0,05, ***p < 0,001, gjentatt prøver veis VARIANSANALYSE.

Figure 3
Figur 3 : Validering av LDH lagring analysen av knockout (-vekselstrøm) eller knockdown (D) tilnærminger. (A-C) ATG5 wild type (WT) eller knockout (KO) MEFs (A), ATG7 WT eller KO MEFs (B), eller ATG9A WT eller KO MEFs (C) ble behandlet med DMSO kjøretøy (0,01%) i CM eller 10 nM Baf i EBSS, som angitt. LDH lagring priser var bestemt etter 3t behandling. Mener verdier fra fire (A; n = 4) eller tre (B og C, n = 3) uavhengig eksperimenter, med feilfelt som representerer standard feil av gjsnitt. p < 0,05, gjentatt prøver toveis VARIANSANALYSE. Født, ikke signifikant. (D) LNCaP celler var omvendt transfekterte med 5 nM av en nontargeting kontroll siRNA (siCtrl), eller med 5 nM i ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- eller GABARAPL2 målretting siRNA oligoes, som angitt. Etter 48 timer, ble enten cellene behandlet med DMSO kjøretøy (0,1%) i CM eller 100 nM Baf i EBSS, som angitt. LDH lagring priser var bestemt etter 3t behandling. Vises mener verdier fra tre biologiske replikat (tre eksemplarer wells) fra et eksperiment (n = 1), med feilfelt representerer standardavvik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Oppsummert representerer protokollen beskrevet her en pålitelig og allment gjeldende metode å overvåke bulk autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller. Sammenlignet med den opprinnelige metoden12,16, har vi fjernet en rekke unødvendige trinn, forenklet flere av de gjenværende trinnene og introduserte en betydelig avskalling. Resultatet protokollen er kraftig forbedret i forhold til pris - og time-effektivitet, og samme mengde prøver kan nå håndteres på mindre enn halve tiden sammenlignet med den originale protokollen. For 24 prøver, trinn 2-3 (dag 1) krever ca ½ timer med forberedelse pluss 3 h effektivt mens trinn 4 (dag 2) kan utføres i ~ 2 h (tid anslår at alle nødvendige bufferne er forberedt på forhånd). Siden analysen på dag 1 vanligvis innledes med cellen behandlinger, inkludert en 3-4 h inkubasjon med Baf eller andre hemmere av autolysosomal LDH fornedrelse, er det praktisk å dele analysen i to påfølgende dager. Det er imidlertid også mulig å utføre hele analysen i en og samme dag. I så fall ville det spare tid å snapin-fryse prøvene i flytende nitrogen i trinn 3.6 og 3.7. Selv om ikke testet med gjeldende protokollen, er det sannsynlig at det fryse-Tin steget kan hoppet helt, siden mer forseggjort versjon av analysen i primære rotte hepatocytter har blitt gjort uten denne trinn23.

Protokollen presenteres her kan utføres med relativ letthet. Av notatet er det viktig å være nøyaktig i pipettering, siden analysen omfatter flere prøvetaking og fortynning tiltak. Videre gjøres supernatant ambisjoner grundig, slik at minimale mengder ioner finnes i sukrose celle suspensjon i trinn 2.5, og slik at som liten cytosolic LDH som mulig er forurensende sedimented materialet i trinn 3.6. Analysen som beskrevet her er fleksible for et bredt spekter av starter materiale. For eksempel i LNCaP celler, har vi brukt analysen med en rekke ulike mengder cellene på innhøstingen, som strekker seg opp til en 10 ganger forskjell (fra 2,5 x 105 celler til 2,5 x 106 celler). Minimum starter materiale nødvendig defineres av hvor følsom oppdagelsen metoden av LDH enzymatisk aktivitet er. Protokollen kan svært sannsynlig skaleres vesentlig lenger ned, ved å skalere ned volumene på trinn 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 og 4.3.

Den mest kritiske faktoren og teknisk utfordring med analysen er electrodisruption skritt. Sterk, men kortvarig, elektrisk sjokk celleområde i ion-fri, isotonic løsning gir et helhetlig og selektiv avbrudd i plasma membranen, intracellulær struktur og organelles (inkludert autophagic vacuoles) intakt12, 29. Når du bruker tilhenger celler, er det viktig at de tåler enzymatisk og mekanisk behandlinger i trinn 2.1-3.1 (celle avdeling, sentrifugering og rørets). Trinn 3.1 er det ikke nødvendig å få en perfekt encellede suspensjon. For eksempel er dette svært vanskelig å oppnå med LNCaP celler. Likevel er vellykket electrodisruption nær 100% cellene alltid oppnådd, selv innenfor cellen klumper som inneholder dusinvis av fysisk tilkoblede cellene. Når du tester en ny celle type, er det tilrådelig å kontrollere effektiviteten av electrodisruption (se trinn 3.3.1)17. Nær 100% av cellene må være permanent Trypan blå positiv etter electrodisruption trinn17. Hvis dette ikke er tilfelle, må sannsynligvis electroporator innstillingene endres. Bruke analysen i 20 ulike pattedyr celletyper, har vi aldri hatt endre innstillingene for electroporator. Således, når de riktige innstillingene har blitt funnet pattedyr cellen linje, er det trolig vil fungere for alle andre typer pattedyrceller. For å bekrefte at de electrodisruption betingelsene ikke er for hardt, følger dvs.at bare plasma membranen og ikke membraner av intracellulær organeller er avbrutt, du trinn 3.3.2.

Bulk autophagy utføres av autophagosomes som co beslaglegge betydelige mengder av stoffer med andre Last. Dette kan skje via rent ikke-selektive autophagy av deler av cytoplasma, eller på en måte som representerer en blanding av selektive og ikke-selektive autophagy. Dato det er ikke klart om eller i hvilken grad selektive og ikke-selektive autophagy sameksistere som to forskjellige moduser av autophagy, eller om autophagosomes som regel samtidig beslaglegge Last i både selektive og ikke-selektive oppførsel. Viktigere, men rapporterte en fersk studie at aktivator av selektive autophagy induserer en liknende økning i bulk cytosolic Last lagring som lagring av bestemte Last30. Resultatene fra vår egen laboratoriet er med dette (upubliserte resultatene). Analysere lagring av løselig cytosolic proteiner (f.eks LDH) derfor sannsynlig har potensial til å oppdage endringer i macroautophagic lagring aktivitet under mange, om ikke alle forhold. Men selv om det fremdeles gjenstår å bli bevist, muligheten ikke kan utelukkes at visse typer forhold unikt induserer en type selektiv-eksklusiv autophagy der lasten er så tett pakket av phagophore at selv stoffer er utelukket fra blir sequestered i autophagosome. For å undersøke for om slik tilstand eksisterer, bør bulk autophagy analyser som LDH lagring analysen kjøres parallelt med selektiv autophagy analyser.

En av de viktigste fordelene med LDH lagring analysen er at den måler lagring av endogene Last, således gjør den bredt aktuelt metode. Videre måler analysen lagring aktivitet i en svært kvantitative måte. LDH lagring analysen er et viktig verktøy for å studere mekanismer og regulering av autophagosome formasjon, siden åpen phagophores ikke beslaglegge LDH. Det er veldig tungvint og vanskelig, om ikke umulig, å vurdere om autophagosome-lignende strukturer er forseglet enheter eller ikke av elektronmikroskop. En annen metode som brukes til å analysere om autophagosomes er lukket er å teste følsomheten for autophagy (f.eks LC3) eller reseptorer (f.eks sequestosome 1 (p62/SQSTM1) eller kjernefysiske dot protein 52 (NDP52)) til proteaser10 ,31,32. Ulempen med denne analysen er at man studerer protease beskyttelse av handlevognen komponenter i stedet for autophagic Last. Videre siden analysen er basert på vestlige blotting, er det bare semi kvantitative.

Mens muligheten til å analysere autophagy av endogene Last er en fordel, er en iboende begrensning med LDH lagring analysen og andre analyser som vurdere lagring av endogene Last, at en degradering hemmer må tas for å skjelne spesifikke effekter på autophagic lagring i stedet for netto effekt av lagring og fornedrelse. Effektiv hemmere av LDH fornedrelse inkluderer proton pumpe hemmere som Baf eller concanamycin en3,16,18og lysosomotropic agenter som chloroquine og salmiakk33. Protease hemmer leupeptin fungerer godt i primære rotte hepatocytter23, men er vanligvis ineffektivt på pattedyr celle linjene vi har testet. Vi bruk rutinemessig Baf13, som fungerer raskt og er svært effektiv i både nonmalignant og ondartede celler. Det er imidlertid viktig å huske på at ingen av LDH fornedrelse hemmere er helt bestemt, og mulige effekter av hemmere på autophagy kan ikke være utelukket. For å minimere risikoen for ikke-spesifikke innflytelse, anbefales det å bruke konsentrasjoner av inhibitor som bare mette nivåer, og ta inhibitor for de siste timene (3-4 h) av eksperimentet. Mette konsentrasjonen av Baf bør fastsettes for hver celle. Som en guide, 50-100 nM er mette for de fleste av de kulturperler pattedyr cellelinjer vi har testet, mens noen cellen typer som MEFs krever bare 10 nM Baf for en hel blokk i LDH fornedrelse.

En tydelig begrensning med LDH lagring analysen er at det kan bare utføres på levende celler, dermed unntatt bruk for analyse av autophagy i fast celler og vev. På den annen side, det er for øyeblikket ingen analyser etablert som kan måle funksjonelle autophagic aktivitet i fast celler. Selv om ikke testet med gjeldende protokollen, bør det være helt mulig å bruke LDH lagring analysen for å vurdere i vivo autophagic lagring aktivitet i eksperimentell organismer. Begrensningen ville være at organismen tolerere behandling med en inhibitor av lysosomale LDH fornedrelse, og at perioden mellom slik behandling og resultatene av analysen bør være relativt kort, minimere uspesifisert virkning inhibitor. Interessant, indikerte en tidlig studie av Kominami et al., at 3-6t behandling av rotter med leupeptin (intraperitoneal injeksjon av 2 mg/100 g av kroppsvekt) er riktig å observere effektiv opphopning av autophagically sequestered LDH i leveren subcellular fraksjoner beriket for autophagic vacuoles34.

Ektopisk uttrykk for pH-sensitive fluorescerende lagring sonder som Rosella35 eller Keima36 kan brukes å visualisere autophagic lagring uten behovet av inkludert fornedrelse hemmere. Videre, i motsetning til LDH lagring analysen, disse kan brukes til å visualisere autophagic lagring i enkeltceller. I tillegg kan blanding av sonden å organelle målretting sekvenser benyttes for å overvåke lagring av bestemte organeller. Kraftig mikroskopiske plattformer kan også tillate for høy gjennomstrømming screening analyser. Ulempen er at ektopisk sonde uttrykk, i tillegg til opphopning av sonden i lysosomale systemet, kan påvirke autophagic veien. Videre i motsetning LDH lagring analysen er en avhengige av celler som kan være effektivt transfected. Til slutt, mens LDH lagring analysen gir en rett fram kvantitative produksjon på prosent sequestered stoffer, metodene bildebasert generelt ikke gi denne typen absolutt kvantitative utskrift. Det ville være lurt å gjøre bruk av begge tilnærminger i en utfyllende måte. En annen utmerket måte å studere autophagic lagring uten behov for degradering hemmere er å innføre radiolabeled raffinose i cellene av reversibel elektro-permeabilization3,23,37, 38. Raffinose er en membran-impermeant og metabolically inert sukker som er motstandsdyktig mot lysosomale enzymer. Derfor kan sin autophagic lagring bli etterfulgt av separasjon av cytosolic fra sedimentable celle fraksjoner3,23,37,38. Denne tilnærmingen er imidlertid, mer tidkrevende enn LDH lagring analysen, og krever ekstra sikkerhetsforholdsregler skyldes bruk av radioaktivitet. Til slutt kan-resultatet av bulk autophagic lagring og uhindret autophagic Last flux nedbrytning av varige proteiner, måles nøyaktig ved et veletablert protein merking-basert metode39,40 ,41,42,43. Men i motsetning til LDH lagring analysen, denne metoden gir ikke en bestemt lese-out for autophagic aktivitet, siden varige proteiner er degradert også av andre mekanismer enn autophagy, særlig av proteasomal systemet (mens LDH Sequestration bare forekommer derfor av autophagy). Derfor en rekke kontroll behandlinger må være rutinemessig inkludert, f.eks kjemiske hemmere av autophagic-lysosomale eller proteasomal fornedrelse og genetisk interferens med autophagy3,16.

LDH lagring analysen kan sammenlignes med de brukte LC3 flux analyser, som måler LC3-II nivåer av vestlige blotting eller LC3 puncta dannelsen av fluorescens tenkelig i fravær eller tilstedeværelse av hemmere av lysosomale LC3 nedbrytning (Baf er mest ofte brukt), og overgangen fluorescently merket LC3 varianter surt miljøer22. Selv om disse LC3-baserte analyser kan gi nyttig informasjon, kan de være vanskelige å tolke, spesielt fordi forholdet mellom graden av LC3 flux og mengden og typen av Last forandring er ukjent. Som nevnt i innledningen, krever bulk autophagy og Parkin-avhengige mitophagy ikke LC3 familie proteiner9,10,11,44. Videre i starved rotte hepatocytter, LDH lagring og fornedrelse fortsetter uavbrutt tidsperioder der det er ingen autophagic-lysosomale LC3 flux9. Dermed i dette tilfellet kan Last flux være helt adskilt fra LC3 flux. Mer forskning sammenligne LC3 flux med ulike typer Last fluks er nødvendig til beste tolke resultatene med LC3 flux analyser.

I sin nåværende form sammenlignes LDH lagring analysen vestlige blotting nødvendig hands-on tid og kostnader. Når det gjelder måler bulk autophagy, det er minst så effektivt som raffinose-basert lagring analysen eller varige protein fornedrelse analysen beskrevet ovenfor. Bestemt måling bulk autophagic lagring aktivitet og dannelsen av lukkede autophagosomes er det mye mer effektiv og rett fram enn LC3 flux analyser eller protease beskyttelse analyser av LC3 eller autophagy reseptorer, siden de siste analyser måle handlevogn komponenter i stedet for faktiske lasten. Selv om vi har betydelig bedre gjennomstrømningen av LDH lagring analysen, er det langt fra en høy gjennomstrømming analysen, og den kan ikke konkurrere med effektiviteten av bilde-baserte analyser beskrevet ovenfor. Men både bilde-baserte analyser og LDH lagring analysen har sine fordeler og ulemper, og dermed begge typer analyser har sine egne verdier. Det er sikkert mulig via fremtidige justeringer for å gjøre den LDH lagring analysen semi høy gjennomstrømmingen. For eksempel bør det være mulig å utføre electrodisruption i 96-brønnen format, og det er tenkelig at cytosolic LDH kan skilles fra sequestered LDH med filtrering i stedet for sentrifugering, eller at det sentrifugering trinnet kan utføres i en 96- Vel format. Videre analyser måle LDH aktivitet som er mye mer sensitive enn det som brukes i gjeldende protokollen er utviklet, og er kommersielt tilgjengelig. Andre interessante fremtidige muligheter til analysen er dens antatte bruk i andre celletyper enn pattedyrceller, for eksempel i gjær eller andre encellede organismer, eller selv plant celler, og bruk for i vivo målinger av autophagic Sequestration aktiviteter i vev av eksperimentelle organismer.

Avslutningsvis tror vi at LDH lagring analysen i sin forbedret og gjenopplivet form vil være et viktig verktøy i fremtidige autophagy-relaterte forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Norges forskningsråd, Universitetet i Oslo, Anders Jahres Foundation, Nansen grunnlaget og arven i minnet til Henrik Homan. Vi takker Dr. Noboru Mizushima for ATG5 +/ + MEFs og ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu for ATG7 +/ + MEFs og ATG7/MEFs og Dr. Shizuo Akira for ATG9A +/ + MEFs og ATG9A/MEFs. Vi takker Frank Sætre for teknisk assistanse, og Dr. Per O. Seglen for konstruktiv metodologiske diskusjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46, (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591, (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166, (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264, (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151, (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19, (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333, (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111, (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19, (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9, (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510, (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10, (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282, (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432, (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169, (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142, (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20, (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281, (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23, (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7, (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258, (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18, (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270, (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162, (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8, (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123, (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95, (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85, (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12, (2), 1-3 (2016).
Laktat Dehydrogenase lagring analysen-En enkel og pålitelig metode å avgjøre Bulk Autophagic lagring aktivitet i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter