Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Laktatdehydrogenas kvarstad analysen — En enkel och tillförlitlig metod för att bestämma Bulk Autophagic kvarstad aktivitet i däggdjursceller

doi: 10.3791/57971 Published: July 27, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Här beskrivs ett enkelt och väl validerat protokoll för mätning av bulk autophagic kvarstad aktivitet i däggdjursceller. Metoden är baserad på kvantifiera andelen av laktatdehydrogenas (LDH) i sedimentable cell fraktioner jämfört med totala cellular LDH nivåer.

Abstract

Bulk autofagi kännetecknas av beläggs med stora delar av cytoplasman i dubbel/multi-membrane strukturer som kallas autophagosomes. Här beskrivs ett enkelt protokoll att övervaka denna process. Dessutom finns typiska resultat och experimentell validering av metoden autofagi-inducerande villkor i olika typer av odlade däggdjursceller. Under bulk autofagi binda autophagosomes cytosol, och därmed också lösliga cytosoliska proteiner, tillsammans med andra autophagic Last. LDH är en stabil och mycket riklig, lösligt cytosoliska enzym som är icke-selektivt binds till autophagosomes. Beloppet av LDH kvarstad avspeglar därför mängden bulk autophagic kvarstad. För att effektivt och korrekt avgöra LDH kvarstad i cellerna, anställer vi en electrodisruption-baserade fraktionering protokoll som effektivt separerar sedimentable från cytosoliska LDH, följt av mätning av enzymatisk aktivitet i sedimentable fraktioner kontra hela-cell prover. Autophagic kvarstad bestäms genom att subtrahera andelen av sedimentable LDH i obehandlad celler från det i behandlade celler. Fördelen med LDH kvarstad analysen är att det ger ett kvantitativt mått på den autophagic kvarstad av endogena Last, i motsats till andra metoder att antingen innebära ektopisk uttryck för kvarstad sonder eller semikvantitativt proteas skydd analyser av autofagi markörer eller receptorer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Autofagi (grekiska för ”äta själv”) är en evolutionärt bevarade process för vakuolär/lysosomal nedbrytning av intracellulära material. Vid upptäckt av de gener som autofagi-relaterade (”ATG”), som är viktiga för autofagi i jäst och människor, och insikten att autofagi spelar en betydande roll för människors hälsa och sjukdom (erkänt av 2016 Nobelpriset i medicin eller fysiologi till Yoshinori Ohsumi), autofagi har snabbt blivit en av de mest intensivt studerade processerna i cellbiologi1,2.

Macroautophagy (hädanefter benämnd ”autofagi”) är kännetecknas av expansion och vikning av intracellulära membran cisternae (”phagophores”) i förseglade, dubbel - eller multi - membrane strukturer (”autophagosomes”) som effektivt binda den omsluten material från resten av cytoplasman. Vid fusion av autophagosomes med lysosomer, är inre autophagosomal membranet och konfiskerade gods degraderad och återvinnas. Autophagosomes kan binda cytoplasmiska material i både slumpmässiga (icke-selektiva autofagi) och selektiv (selektiv autofagi) seder. Bulk autofagi sannolikt representerar en blandning av icke-selektiva och selektiva autofagi.

1960-och 70-talet (”morfologiska eran” av autofagi forskning) utvärderades främst autophagic kvarstad genom ultrastrukturella analyser. 1980-talet och början av 1990-talet (”den biokemiska eran”) Per Seglen och medarbetare – som studerat autofagi i primära råtta hepatocyter — utvecklade de första metoderna för att kvantitativt mäta autophagic kvarstad aktivitet3. Med dessa analyser, Seglen definieras och kännetecknas olika steg av autophagic-lysosomala väg4,5, upptäckte myntade de amphisome6 (produkten av endosome-autophagosome fusion) och var först att beskriva rollen av protein fosforylering i autofagi förordning7. Dock efter upptäckten av ATGs i 1990-talet (”den molekylära eran”) och den första karakteriseringen av ett däggdjur ATG8 protein, mikrotubuli-associerade protein 1A/1B-light kedja 3 (LC3) i 20008, användning av ATG proteiner som markörer för den autophagic process snabbt vunnit popularitet och de äldsta och mer arbetskrävande biokemiska metoderna var kvar. I själva verket under de senaste 18 åren, western blot och fluorescence mikroskopi analyser av LC3 har blivit den överlägset mest populära (och i många fall den enda) sätt att studera autofagi i däggdjursceller. Fördelen är den relativa lätthet med vilken dessa metoder kan utföras. Nackdelen är att man studerar en vagn komponent (LC3) snarare än faktiska autophagic Last. Detta är en ganska allvarlig nackdel, eftersom förhållandet mellan stater och/eller flux av LC3 via vägen kontra kvarstad och flux Last är mycket oklart. I själva verket har vi visat att merparten Last flux kan upprätthållas på höga nivåer under förhållanden där det finns ingen LC3 flux, trots närvaron av konjugerade LC3 i celler9. Dessutom visade vi att bulk autofagi är opåverkad av effektiv LC3 utarmning, och därmed sannolikt är LC3-oberoende9. Detta konstaterande har senare bekräftats av LC3 knock-out studier10,11, också ange att Parkin-beroende mitophagy (den selektiva autofagi av mitokondrier) är oberoende av LC310,11 .

Sammanfattningsvis, det finns ett klart behov för Last-baserade analyser att övervaka autophagic aktivitet. Optimalt bör sådana analyser vara brett tillämpliga, väldefinierade och enkelt att utföra. De senaste åren har vi tagit ett särskilt intresse för LDH kvarstad analysen, som utvecklades av Per Seglen i 1980-talet12, och bygger på att mäta överföringen av cytosoliska LDH till sedimentable, autophagic vakuol-innehållande cell fraktioner. LDH är en stabil, lösligt cytosoliska protein som är lätt Co binds när phagophores innesluta cytoplasmiska Last. Beslagtagande av LDH är därför en allmän åtgärd autophagic kvarstad. LDH bryts endast av de autophagic-lysosomala väg12. Således, i närvaro av lysosomal nedbrytning-hämmare, t.ex., bafilomycin A1 (Baf)13, experimentell behandlingseffekter direkt återspeglar förändringar i autophagic kvarstad aktivitet. I avsaknad av nedbrytning-hämmare, kan nettoeffekten av förändringar i LDH kvarstad och nedbrytning mätas.

LDH kvarstad analysen är i stort sett tillämplig, eftersom LDH uttrycks mycket och ubiquitously i alla celltyper och LDH nivåer kan kvantifieras korrekt av en enzymatisk analys14,15. Dock ursprungligen protokoll12 — etablerade i primära råtta hepatocyter — var ganska tidskrävande och krävs en stor mängd start material liksom en skräddarsydd elektrisk urladdning kondensator. I en stegvis sätt, har vi gradvis omvandlas analysen till en lätt och mångsidig metod. Första, ursprungliga protokollet var anpassad för användning i däggdjursceller linjerna16. Andra var metoden kraftigt nedskalad3,9. Tredje, flera steg i protokollet eliminerades, inklusive en mödosam densitet kudde steg17. Detta gjorde samtidigt en ytterligare nedskalning av metoden, från ursprungliga startpunkten för att använda en 10 cm platta per prov16 till att använda en enda brunn från en 12-well platta per prov (dvs.ungefär 15-fold mindre startas material)17. För det fjärde har identifierat vi en kommersiell elektroporation apparat som kan ersätta de skräddarsydda elektriska urladdning kondensator17.

Här presenteras våra senaste protokollet av LDH kvarstad analysen, vilket inkluderar vissa ytterligare förenklingar av metoden jämfört med den tidigare publicerade17 . Dessutom visas en uppsättning typiska resultat erhålls i ett antal olika celltyper, och ännu viktigare, flera rader med experimentell validering av metoden som använder farmakologiska samt genetiska knockdown och knockout metoder tillhandahålls. För en övergripande flödesschemat i hela protokollet, se figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. cell sådd och behandling

  1. Kultur vidhäftande celler i 75 cm2 vävnadsodling kolvar i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C, med rekommenderad odlingssubstratet för Celltypen i fråga. Att cellerna att växa tills de når en nära-konfluenta cellager.
    Obs: Använd RPMI 1640 medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) för LNCaP, HEK293, mus embryonala fibroblaster (MEFs), BJ, MCF-7 och RPE-1 celler.
    1. Tvätta cellerna med 3 mL 37 ° C fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4. Ersätt PBS med 3 mL 0,25% (w/v) Trypsin-etylendiamintetraacetat (EDTA) och inkubera kolven i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C tills cellerna lossa (2 – 5 min).
    2. Omsuspendera fristående cellerna med 7 mL odlingsmedium som innehåller 10% FBS. Blanda en 10 µL alikvot cell fjädring med 10 µL 0,4% Trypan blå i en mikrocentrifug rör, med en 0,5 – 20 µL pipettspetsen. Använd samma pipettspetsen att omedelbart fylla en räknande kammare bild och räkna cellerna i en automatiserad cell räknare.
  2. Förbereda en lämplig utspädning (se not nedan) av cellsuspensionen från steg 1.1.2 använda kultur medium innehållande 10% FBS och utsäde 1 mL av den utspädda cellsuspensionen i varje brunn av ett 12-väl vävnadsodling plattan (yta ~3.8 cm2) använder aseptisk teknik. Möjliggöra tillväxt i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C tills önskad cell densiteten har uppnåtts, t.ex., 60 – 90% sammanflödet vid skörd.
    Obs: Den tillämpliga utspädningen av cellsuspensionen som ger den önskade cellen konfluens vid skörd kommer att variera från celltyp celltyp, liksom enligt varaktighet och typ av experimentella behandlingar. Således bedömas detta empiriskt i varje enskilt fall.
    1. För experiment som ska vara både behandlade och skördas 2 dagar efter sådd, utsäde 2,5 x 105 LNCaP, HEK293, eller MCF-7 celler, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ eller 1,5 x 105 RPE-1 celler i varje brunn av 12-väl plattan.
    2. För celler som följer löst, täck plattorna med typ av beläggning som rekommenderas för celltypen som är i fråga. För LNCaP (och HEK293) använder celler plattor belagda med poly-D-lysin (PDL).
    3. Därför, tillsätt 500 µL PDL på 2,5 µg/mL i sterilt H2O i varje brunn och inkubera plattorna i en steril miljö i 30 min i rumstemperatur (20 – 25 ° C). Ta bort PDL med sug och tvätta alla väl kort med 1 mL steril H2O.
      Obs: I allmänhet steg 1.2.1 görs utan någon experimentella behandlingar. Dock om utför RNAi, kan det vara bekvämt att starta en omvänd transfection med sådd9.
  3. Utföra experimentella behandlingar i dubbletter eller tre exemplar brunnar per tillstånd.
    1. Till exempel behandla cellerna med 50 nM den mTOR-hämmare Torin1, som allmänt är en effektiv inducerare av autophagic kvarstad eller akut serum- och aminosyra svält genom att tvätta cellerna med 1 mL av aminosyra-fri Engdahl som omfattas av cellerna är balanserad Salt lösning (EBSS) medium, och därefter Inkubera cellerna i 1 mL EBSS i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C.
    2. Lämna en uppsättning brunnar obehandlade för att definiera bakgrundsnivåer av sedimentable LDH.
    3. Lägga en mättar mängd den efter kvarstad hämmare bafilomycin A1 (Baf)3,13,16,18 i frånvaron eller närvaron av experimentella behandlingar, 3-4 h före cellen skörden. Inkubera cellerna i en fuktad inkubator med 5% CO2 vid 37 ° C.
      1. Använd 100 nM Baf för LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 och RPE-1 celler, och 10 nM Baf för MEFs.
      2. För experimentella behandlingar som har en varaktighet på endast 3 – 4 h (som dessa exemplifieras i steg 1.3.1 normalt har), lägga Baf samtidigt med behandlingarna. För längre experimentella behandlingar, vänta 3-4 h före skörd, och tillsätt 2 µL av en 500 x koncentrerad Baf lager direkt i mediet.
      3. Blanda genom att agitera plattan omedelbart efter tillsats av Baf. På denna punkt är det också rekommenderas att lägga till macroautophagic kvarstad hämmare som kontroller, exempelvis 10 mM av pan-fosfoinositid 3-Kinas (PI3K) hämmare 3-metyl adenin (3MA)19eller 10 µM av selektiv PI3K klass III hämmare SAR-40520.

2. cellen skörd och förberedelse för Electrodisruption

  1. I slutet av behandlingsperioden, aspirera på medellång med sug och tillsätt 200 µL cell avlossning lösning (förvärmts till 37 ° C) till varje brunn. Inkubera vid 37 ° C tills cellerna lossa (vanligen runt 5 min).
    Obs: 0,25% (w/v) Trypsin-EDTA kan användas i stället för cell avlossning lösningen, den senare innehåller DNAS, vilket bidrar till att minska viskositeten hos fristående cellerna. Så länge som medlet är grundligt aspirerade, är det inte nödvändigt att tvätta cellerna före tillsats av Trypsin-EDTA eller cell avlossning lösning.
  2. Tillsätt 500 µL rumstemperatur (20-25 ° C) PBS, pH 7,4, innehållande 2% (w/v) bovint serumalbumin (BSA) till varje brunn, och resuspendera med pipetten tills ingen cell klumpar syns. Omedelbart överföra cellsuspensionen till 1,5 mL mikrocentrifugrör på is.
    Obs: Om inget annat anges, utföra alla efterföljande steg på is.
  3. Sediment cellerna genom centrifugering vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
  4. Grundligt Aspirera supernatanten (med sug) för att lämna cellen pellets så torra som möjligt.
  5. Tillsätt 400 µL 10% (w/v) sackaros (i ultrarena H2O) i varje rör.

3. plasmamembranet Electrodisruption och Separation av Sedimentable - och totalt-cell fraktioner

  1. Återsuspendera cellpelleten med en pipett till en nära encelliga suspension, och överföra det till en 4 mm elektroporation kyvetten.
    Obs: Pipettering up-and-down ~ 10 – 15 gånger, med en 100-1000 µL pipettspetsen, räcker oftast.
  2. Placera kyvetten i en exponentiell förruttnelse våg electroporator, och ur en enda elektrisk puls vid 800 V, 25 µF och 400 Ω; dessa inställningar ger en puls av ~ 8 ms varaktighet.
  3. Använd en ny pipettspetsen överföra de cell-disruptate till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 400 µL iskall fosfatbuffrad sackaroslösning (100 mM natrium monofosfat, 2 mM Ditiotreitol (DTT), 2 mM EDTA och 1,75% sackaros, pH 7.5), och blanda kort av pipettering.
    1. Valfritt: Kontrollera effektiv plasmamembranet electrodisruption17, blanda 10 µL av den utspädda cell disruptate från steg 3.3 med 10 µL 0,4% Trypan blå i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Överföra till en räknande kammare och kontrollera att andelen Trypan blå positiva celler är > 99%.
      1. Lämna provet i räknande kammaren i 30 min i rumstemperatur (20 – 25 ° C) och kontrollera att andelen Trypan blå positiva celler har förblivit > 99%.
    2. Valfritt: Kontrollera att electrodisruption inte har alltför hårda, det vill säga det har inte stört intracellulära organeller, utför steg 1,1 – 3.3 som beskrivs ovan, men använder större utgångsmaterial (en brunn från en 6-well platta med en konfluenta celllagrar ~ 80%), och Använd 150 µL 10% sackaros i steg 2.5 och 150 µL fosfatbuffrad sackaroslösning utan DTT i steg 3.3.
      1. Använd en pipett till noggrant lager 200 µL utspädda cell disruptate lösning ovanpå en 1,2 mL densitet kudde av fosfatbuffrad 8% (w/v) täthet lutning medium (e.g, 8% Nycodenz, 50 mM natriumfosfat, 2,2% sackaros, 1 mM EDTA) i en 2 mL centrifug röret. Centrifugera vid 20 000 x g i 45 minuter vid 4 ° C i en mikrocentrifug med mjuk-lyssningsfunktionen funktion (för skonsam acceleration och retardation), och försiktigt lägga rören på is.
      2. Ta försiktigt bort 60 µL av den ~ 200 µL topp fraktionen, se till att inte plocka upp någon täthet lutning medium lösning och överför till en färsk mikrocentrifug rör.
        Obs: Detta bör innehålla cytosol av exceptionella renhet, kallas ”cellen sav”21.
      3. Test renheten i bråket som erhållits i ovanstående steg, genom western blot analyser av organell-innehöll proteiner, använder standardtekniker och 4 – 20% lutning geler16.
      4. Utföra till exempel immunoblotting för cathepsin B21, cytokrom c, och protein disulphide isomerase, kontrollera att det elektriska stöt i steg 3,2 inte har störs lysosomer, mitokondrier eller endoplasmatiska retikulet, respektive, och immunoblot för LDH att verifiera förekomsten av ett cytosoliskt protein i cellen sav.
      5. Parallellt, utföra immunoblotting på protein extrakt gjort från den totala cell disruptate lösning16 att bekräfta att de antikroppar som används kan upptäcka de organell-innehöll proteiner som bedöms.
  4. Upprepa steg 3.1 – 3.3 för varje prov.
  5. Ta bort 550 µL från varje utspädda cell disruptate lösning (erhålls vid steg 3.3) till 2 mL mikrocentrifugrör som innehåller 900 µL iskall resuspension buffert (50 mM natrium monofosfat, 1 mM DTT, 1 mM EDTA och 5,9% sackaros, pH 7.5) kompletteras med 0,5% BSA och 0,01% Tween-20 och blanda kort genom pipettering.
  6. Centrifugera vid 18.000 x g under 45 minuter vid 4 ° C att producera pellets som innehåller ”sedimenterade LDH”. Grundligt Aspirera supernatanten (med sug) för att lämna pellets så torra som möjligt. Placera proverna i-80 ° C frys.
  7. Överföra 150 µL från varje utspädda cell disruptate lösning (erhålls vid steg 3.3) till nya rör och placera proverna i-80 ° C frys. Använda dessa prover för att avgöra ”Summa LDH” nivåerna i cellerna.
    Obs: Vid denna punkt experimentet kan pausas för så länge som önskas.

4. LDH utvinning och mätning av LDH enzymatisk aktivitet

  1. Tina ”sedimenterade LDH” (från steg 3.6) och ”Summa LDH” prover (från steg 3,7) på is.
  2. Tillsätt 300 µL av iskall resuspension buffert innehållande 1,5% Triton X-405 till ”totala LDH” prover (ger en slutlig Triton X-405 koncentration av 1%). Rotera proverna på en roller i ett kallt rum (4 – 8 ° C) i 30 min.
  3. Lägg 750 µL av iskall resuspension buffert med 1% Triton X-405 till ”sedimenterade LDH” prover och resuspendera pellets med en pipett tills en homogen lösning nås.
  4. Centrifugera proverna från steg 4.2 och 4.3 vid 18.000 x g i 5 minuter vid 4 ° C till sediment oupplöst cellulära skräp.
  5. Blanda 4 delar av kall 65 mM Imidazol (pH 7.5)/0.75 mM pyruvat med en del av kall 65 mM Imidazol (pH 7,5) / 1,8 mM NADH att få en fungerande lösning som är stabil i minst tre veckor vid 4 ° C.
  6. Blanda 3 – 30 µL av supernatanterna från 4.4 steg med 200 µL steg 4,5 arbetslösning.
  7. Bestämma mängden av LDH genom att mäta LDH enzymatisk aktivitet som nedgången i nikotinamid-adenin-dinukleotid (reducerad form) (NADH) absorbans vid 340 nm vid 37 ° C jämfört med en standard med en känd LDH-koncentration. Utföra absorbansen mätningar tills reaktionen har närmat sig slutförandet, dvs tills absorbansen vid 340 nm längre ändras med tiden.
    Obs: Detta är den klassiska biokemiska metoden att mäta LDH aktivitet. Även om det nuvarande protokollet utför reaktionen vid 37 ° C, kan det också utföras vid rumstemperatur (20 – 25 ° C), vilket är lämpligt om gör manuell spektrofotometri. Det nuvarande protokollet använder en robotic multianalyzer instrument, som i ett automatiserat sätt blandar prover med fungerande lösning i en plattan med 96 brunnar och mäter absorbansen vid 340 nm vid 37 ° C varje 20 s för 3 min. Därefter beräknar instrument programvaran koncentrationen av LDH, uttryckt som enheter (U) / L, genom att jämföra lutningen av absorbansen mätningar över tid jämfört med en standardkurva erhålls genom kalibrering med en standard av kända LDH koncentrationen. Det linjära området detektionsgränser genom detta tillvägagångssätt är 30 – 1.500 U/L. Som alternativ finns en mängd olika kommersiellt tillgängliga kit att mäta LDH. Några av dem är baserade på koppling den enzymatiska reaktionen till generation av kolorimetrisk eller fluorescerande produkter, aktivera identifiering av andra medel än UV spektrofotometri, och med andra linjära spänner av upptäckt.

5. beräkning av LDH kvarstad

  1. Beräkna procentandelen av sedimenterade LDH till totala LDH för varje prov, med hänsyn till utspädningarna och provtagning hänsyn:
    Sedimenterade LDH (%) =Equation 1
    Obs: Under steg 3.1 – 3.3 cirka 50 µL är förlorad på grund av överföring in och ut ur den elektroporation kyvetten. Således, beräkna från att ha sammanlagt 750 µL (istället för 800 µL) av utspädda cellen disruptate i steg 3.3.
  2. Subtrahera den procentandel av sedimenterade LDH erhållits i proverna från obehandlade celler (steg 1.3.2) från den procentandel av sedimenterade LDH erhållits i prover från experimentellt behandlade cellerna, och klyftan av behandlingstiden med Baf att få andelen beslagtagna LDH per timme i provtagningsperioden:
    Binds LDH (% / h) =Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollet beskrivs här, bulk autophagic kvarstad aktivitet i ett antal olika däggdjur cellinjer, inklusive LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, T47D, PC3, U2OS, MCF-7, G361, mus embryonala fibroblaster (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ och LNCaP celler mättes. Kvarstad var bedömts under basala förhållanden (i kompletta, näringsrika medium) eller i celler akut svultit för serum och aminosyror (en bona fide autofagi-inducerande skick22). Resultaten indikerade att LDH kvarstad verksamhet på svält villkor varierar i stor utsträckning inom olika cellinjer, alltifrån knappt detekterbara halter i LAPC4, DU145, Huh7 och PNT2 celler (inga data anges) att ~1.6%/h i LNCaP celler (figur 2 A). Observerats i utsvultna primära råtta hepatocyter är högre än i cellinjer som nämns ovan, och vanligtvis spänner från 2.5–4%/h23. Under basala förhållanden, LDH kvarstad var nästan omöjlig att upptäcka under hälften av cellinjer testade och varierade från ~0.2%/h till ~0.5%/h i den andra halvan (inga data anges). I de cellinjer som visar detekterbara basala autophagic kvarstad aktivitet, inducerar akut serum och aminosyra svält vanligtvis en 3 – 4-faldig ökning LDH kvarstad ränta (se till exempel LNCaP experimentet visas i figur 2A). I de testade cellinjer (se ovan), är bakgrunden andelen sedimenterade LDH erhålls i prover från obehandlade celler (steg 1.3.2) normalt cirka 2 – 3%. Från 22 oberoende experiment som utförs i olika cellinjer, inom experimentell variationskoefficienten (CV) mellan sedimenterade LDH värden (% sedimenterade LDH) av behandling replikat var 5,8% ± 1,7% (genomsnitt % CV ± standardavvikelse), alltifrån 3.0 – 9,0%. Tillsammans, ger dessa siffror en indikation på vad som väntar när du utför LDH kvarstad analysen i däggdjursceller.

Användning av kemiska hämmare som väl som genetiska knockdown och knockout närmar sig, i stor utsträckning verifierar att LDH kvarstad analysen på ett tillförlitligt sätt mäter autophagic kvarstad aktivitet. Autophagosome bildande kräver aktiva PI3K klass III (PIK3C3) och Unc-51 som autofagi aktivera kinase (ULK)24, samt balansera i intracellulära Ca2 + homeostas16. Som visas i figur 2A, både basal och svält-inducerad LDH kolupptagning helt avskaffas av den pan-PI3K hämmare 3MA, selektiv PIK3C3 hämmare SAR-40520, eller de ER Ca2 + pump inhibitor thapsigargin (TG) 25 i LNCaP celler. LDH kvarstad svält villkor (växla till aminosyra-fri Earle's Balanced Salt lösning (EBSS) medium) reduceras också starkt av TG eller av den ULK-hämmare MRT67307 i HEK293 celler (figur 2B). Dessutom hämmas konsekvent svält-inducerad LDH kvarstad av 3MA i MEFs (figur 2C), BJ (figur 2D), MCF-7 (figur 2E) och RPE-1 (figur 2F) celler. Allmänhet, inkubation av celler i EBSS medium ensam (dvs. i avsaknad av Baf eller andra efter kvarstad-hämmare) inte leder till några mätbara ansamling av beslagtagna LDH (se till exempel LNCaP experimentet visas i figur 2 A). Detta är sannolikt eftersom akut aminosyra svält leder till snabbare autophagic-lysosomala flux, vilket resulterar i snabb och kontinuerlig nedbrytning av beslagtagna LDH.

Nästa, olika ATG gen knockout (KO) MEFs var anställda för att testa om LDH kvarstad kräver autofagi-relaterade gener rapporterats vara avgörande för autophagosome bildning. Faktiskt, svält-inducerad LDH kvarstad avskaffas i ATG5 KO MEFs26 (figur 3A), bekräftar våra tidigare resultat9. Dessutom som visas i figur 3B och 3 C, är svält-inducerad LDH kvarstad trubbiga också i ATG7 KO MEFs27 och ATG9A KO MEFs28.

Slutligen, LDH kvarstad analysen testades i förhållande till huruvida RNAi-medierad Tystande av viktiga ATG gen avskrifter skulle hämma svält-inducerad kvarstad aktivitet. Faktiskt transfection med ATG9A inriktning siRNA eller kombinerade inriktning av ULK1 och ULK2, starkt reducerade LDH kvarstad svält villkor i LNCaP celler (figur 3D). Dessutom vi bekräftat våra tidigare rön3,9 att inriktningen av fokal vidhäftning kinase familj interagerar protein av 200 kDa (FIP200) eller kombinerat inriktning av γ-aminobutyric syra typ A (GABAA) receptor-associerade protein ( GABARAP) familjemedlemmar hämmar svält-inducerad LDH kvarstad (figur 3D).

Figure 1
Figur 1 : Övergripande flow system av protokollet LDH kolbindning. Protokollet är baserat på en 12-väl vävnadsodling platta format, med de angivna volymerna per prov (från en brunn). Assay protokollet kan delas in i två separata arbetsdagar som anges. Det är dock också möjligt att utföra hela proceduren i en dag. Förkortningar: ABB, efter blast buffert (se steg 3.3 i protokollet för ingredienser); RSB, resuspension buffert (se steg 3.5 i protokollet för ingredienser). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Validering av LDH kvarstad analysen använder autofagi-hämmande föreningar. (A) LNCaP celler lämnades antingen obehandlade (i syfte att bakgrunden subtraktion: se steg 1.3.2) i komplett odlingsmedium (CM; RPMI 1640 + 10% fetalt bovint serum (FBS)), eller de behandlades med DMSO fordon (0,1%) eller 100 nM Baf i CM eller i serum- och aminosyra gratis medium (EBSS). Dessutom några av cellerna behandlades med 3MA (10 mM), SAR-405 (10 µM), eller Thapsigargin (300 nM), som anges. Efter 3 h behandling, celler skördats och LDH kvarstad priser fastställdes som beskrivs i det nuvarande protokollet. (B) HEK293 celler behandlades med DMSO fordon (0,1%) i CM eller 100 nM Baf i EBSS, som anges. Dessutom fick några av cellerna 10 µM MRT67307 (en ULK-hämmare) eller 300 nM Thapsigargin. LDH kvarstad priser fastställdes efter 3 timmars behandling. (C-F) MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) eller RPE-1 (F) celler behandlades med DMSO fordon (0,1%) i CM eller Baf (10 nM i C, 100 nM i D-F) i EBSS med eller utan 10 mM 3MA, som anges. LDH kvarstad priser fastställdes efter 3 timmars behandling. A, B, D, E och F visar medelvärden från tre biologiska replikat (tre exemplar brunnar) från ett experiment (n = 1), med felstaplar representera standardavvikelse. C visar medelvärden från tre oberoende experiment (n = 3), med felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. p < 0,05, ***p < 0,001, upprepade prover one-way ANOVA.

Figure 3
Figur 3 : Validering av LDH kvarstad analysen av knockout (A-C) eller knockdown (D) metoder. (A-C) ATG5 vildtyp (WT) eller knockout (KO) MEFs (A), ATG7 WT eller KO MEFs (B), eller ATG9A WT eller KO MEFs (C) behandlades med DMSO fordon (0,01%) i CM eller med 10 nM Baf i EBSS, som anges. LDH kvarstad priser fastställdes efter 3 timmars behandling. Medelvärden från fyra (A; n = 4) eller tre (B och C; n = 3) oberoende experiment, med felstaplar representera standardavvikelsen för medelvärdet. p < 0,05, upprepade prover tvåvägs ANOVA. N.S., ej signifikant. (D) LNCaP celler var omvänd transfekterade med 5 nM en nontargeting kontroll siRNA (siCtrl), eller med 5 nM varje av ATG9A-, FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- eller GABARAPL2-inriktning siRNA oligoes, som anges. Efter 48 h, cellerna behandlades antingen med DMSO fordon (0,1%) i CM eller 100 nM Baf i EBSS, som anges. LDH kvarstad priser fastställdes efter 3 timmars behandling. Visas är medelvärden från tre biologiska replikat (tre exemplar brunnar) från ett experiment (n = 1), med felstaplar representera standardavvikelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sammanfattningsvis utgör protokollet beskrivs här en tillförlitlig och allmänt tillämplig metod att följa bulk autophagic kvarstad i däggdjursceller. Jämfört med den ursprungliga metod12,16, har vi tagit bort ett antal onödiga steg, förenklad flera av de återstående stegen och introducerade en betydande nedskalning. Som ett resultat, protokollet förbättrad väsentligt i förhållande till kostnader - och tid-effektivitet, och samma mängd prover kan nu hanteras på mindre än halva tiden jämfört med den ursprungliga protokollet. För 24 prov, steg 2 – 3 (dag 1) kräver cirka ½ h av preparatet plus 3 h effektivt arbete, steg 4 (dag 2) kan utföras i ~ 2 h (tid uppskattningar med tanke på att alla nödvändiga buffertar är förberett i förväg). Sedan analysen på dag 1 oftast föregås av cell behandlingar, inklusive en 3 – 4 h inkubation med Baf eller andra hämmare av autolysosomal LDH nedbrytning, är det praktiskt att dela upp analysen i två dagar. Det är dock också möjligt att utföra hela analysen i en och samma dag. Det i så fall skulle spara tid att snapin-frysa proverna i flytande kväve i steg 3.6 och 3.7. Även inte testas med det nuvarande protokollet, är det troligt att frysning-tining steget kan hoppas över helt och hållet, eftersom mer avancerade versionen av analysen i primära råtta hepatocyter har gjorts utan detta steg23.

Det protokoll som presenteras här kan utföras med relativ lätthet. Notera är det viktigt att vara korrekt i den pipettering, eftersom analysen omfattar flera steg för provtagning och utspädning. Dessutom bör de supernatant ambitionerna göras grundligt, så att minimala mängder av joner är närvarande i sackaros cellsuspensionen i steg 2.5, och så att som liten cytosoliska LDH som möjligt kontaminerande sedimenterade materialet i steg 3.6. Analysen som beskrivs här är flexibla för ett brett utbud av utgångsmaterial. Till exempel i LNCaP celler, har vi framgångsrikt använt analysen med en rad olika mängder av celler vid skörd, som sträcker sig upp till en 10-faldig skillnad (från 2,5 x 105 celler till 2,5 x 106 celler). Den minsta utgångsmaterial behövs definieras av hur känslig detektion är metoden av LDH enzymaktivitet. Protokollet kan mycket sannolikt skalas väsentligen längre ner, genom att skala ner de volymer som används vid steg 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 och 4.3.

Den mest kritiska faktorn och teknisk utmaning med analys är electrodisruption steg. Det starka, men kort, elektriska stöt av celler i ion-fri, isoton lösning resulterar i en enhetlig och selektiva störningar av plasmamembranet, medan intracellulära struktur och organeller (inklusive autophagic vakuoler) intakt12, 29. När du använder vidhäftande celler, är det viktigt att de tolererar de enzymatiska och mekaniska behandlingarna i steg 2.1 – 3.1 (cell avlossning, centrifugering och resuspension). För steg 3.1 är det inte avgörande för att erhålla en perfekt encelliga suspension. Detta är till exempel mycket svårt att uppnå med LNCaP celler. Trots erhålls framgångsrika electrodisruption i nära 100% av cellerna alltid, även inom cellen klumpar som innehåller flera dussintals fysiskt kopplade celler. När du testar en ny celltyp, är det tillrådligt att kontrollera effektiviteten hos electrodisruption (se steg 3.3.1)17. Nästan 100% av cellerna ska vara permanent Trypan blå positiva efter electrodisruption steg17. Om detta inte är fallet, måste troligen electroporator inställningarna ändras. Med analys i 20 olika proteintillverkningen, har vi aldrig haft att ändra electroporator inställningar. Således, när rätt inställningar har hittats för en cellinje, är det sannolikt att fungera för alla andra typer av däggdjursceller. För att kontrollera att villkor som electrodisruption inte är för hård, följ dvsatt endast plasmamembranet och inte membranen i intracellulära organeller störts, steg 3.3.2.

Bulk autofagi utförs av autophagosomes som tillsammans binda stora mängder cytosol tillsammans med övrig last. Detta kan ske via rent icke-selektiva autofagi av delar av cytoplasman, eller på ett sätt som representerar en blandning av selektiva och icke-selektiva autofagi. Till dags dato är inte klart huruvida eller i vilken grad selektiva och icke-selektiva autofagi samexistera som två olika lägen av autofagi eller om autophagosomes som regel samtidigt binda Last i både selektiva och icke-selektiva seder. Viktigt, dock rapporterade en färsk studie att aktivatorer av selektiv autofagi inducera en liknande ökning bulk cytosoliska Last kvarstad liksom kvarstad av Last30. Resultat från våra egna laboratorium är införstådda med detta (vår opublicerade resultat). Analysera beslagtagande av lösliga cytosoliska proteiner (t.ex. LDH) därför sannolikt har potential att upptäcka förändringar i macroautophagic kvarstad aktivitet under många, om inte alla villkor. Dock även om det fortfarande återstår för att bevisas, inte det kan uteslutas att vissa typer av villkor unikt inducerar en typ av selektiv-exklusiv autofagi där lasten är så tätt insvept av phagophore som även cytosol är undantagna från som binds till autophagosome. För att undersöka för huruvida sådant tillstånd kan finnas, ska bulk autofagi analyser som LDH kvarstad analysen köras parallellt med selektiv autofagi analyser.

En av de främsta fördelarna med LDH kvarstad analysen är att den mäter beslagtagande av endogena Last, vilket gör det en allmänt tillämplig metod. Analysen mäter dessutom kvarstad aktivitet på ett mycket kvantitativa sätt. LDH kvarstad analysen är ett viktigt verktyg för att studera mekanismer och reglering av autophagosome formation, sedan öppna phagophores kan inte binda LDH. Det är mycket besvärligt och svårt, om inte omöjligt, att bedöma om autophagosome-liknande strukturer är förseglade enheter eller inte genom elektronmikroskopi. En annan metod som används för att analysera om autophagosomes är stängda är att testa känsligheten av autofagi markörer (t.ex. LC3) eller receptorer (t.ex. sequestosome 1 (p62/SQSTM1) eller nuclear dot protein 52 (NDP52)) till proteaser10 ,31,32. Nackdelen med denna analys är att man studerar proteas skydd av vagn komponenter i stället för autophagic Last. Eftersom analysen är baserad på western blotting, är det dessutom bara semikvantitativt.

Förmågan att analysera autofagi av endogena Last är en fördel, är en inneboende begränsning med LDH kvarstad analysen och alla andra analyser som bedöma kvarstad av endogena Last, att en nedbrytning-hämmare måste inkluderas för att urskilja specifika effekter på autophagic kvarstad snarare Nettoeffekter av kvarstad och nedbrytning. Effektiv hämmare av LDH nedbrytning inkluderar protonpumpshämmare som Baf eller concanamycin en3,16,18, och lysosomotropic agenter som klorokin och ammoniumklorid33. Proteas hämmare leupeptin fungerar bra i primära råtta hepatocyter23, men är generellt ineffektiva i däggdjursceller raderna vi har testat. Vi använder rutinmässigt Baf13, som agerar snabbt och är mycket effektiv i både godartad och elakartade celler. Det är dock viktigt att komma ihåg att ingen av de LDH nedbrytning-hämmare är helt specifika, och förmodade effekterna av hämmare på autofagi kan inte uteslutas. För att minimera risken för icke-specifik inflytande, är det rekommendabelt att använda koncentrationer av hämmaren som är bara mättar nivåer, och att inkludera hämmaren endast för de senaste timmarna (3-4 h) av experimentet. Mättar koncentrationen av Baf bör bestämmas för varje celltyp. Som en guide, 50 – 100 nM mättar för de flesta av de odlade däggdjursceller linjerna vi har testat, medan vissa cell typer såsom MEFs kräver endast 10 nM Baf för en full block i LDH nedbrytning.

En uppenbar begränsning med LDH kvarstad analys är att det kan endast utföras på levande celler, alltså exklusive dess användning för analys av autofagi i fasta celler och vävnader. Däremot, för närvarande finns inga analyser etablerade som kan mäta funktionella autophagic aktiviteten i fasta celler. Även om inte provas med det nuvarande protokollet, bör det vara fullt möjligt att använda LDH kvarstad analysen för att bedöma in-vivo autophagic kvarstad aktivitet i experimentell organismer. Begränsningen skulle vara att organismen måste tolererar behandling med hämmare av lysosomala LDH nedbrytning, och att tidsperioden mellan sådan behandling och prestandan för analysen bör vara relativt kort, att minimera potentiella icke-specifika effekter av hämmaren. Intressant, anges en tidig studie av Kominami et al., att 3 – 6 h behandling av råttor med leupeptin (intraperitoneal injektion av 2 mg/100 g kroppsvikt) är lämpligt att iaktta effektiv ackumulering av autophagically beslagtagna LDH i levern subcellulär fraktioner berikad för autophagic vakuoler34.

Ektopisk uttryck för pH-känsliga fluorescerande kvarstad sonder som Rosella35 eller Keima36 kan användas för att visualisera autophagic kvarstad utan behov av inklusive nedbrytning-hämmare. Dessutom till skillnad från LDH kvarstad analysen, kan sådana metoder användas för att visualisera autophagic kvarstad i enstaka celler. Fusion av sonden till organell-targeting sekvenser kan dessutom utnyttjas för att övervaka beslagtagande av särskilda organeller. Kraftfull mikroskopiska plattformar kan också för high-throughput screening analyser. Nackdelarna är att ektopisk sonden uttryck, samt ansamling av sonden i det lysosomala systemet, kan påverka den autophagic vägen. Dessutom, till skillnad från LDH kvarstad analysen är beroende av celler som kan vara effektivt transfekterade. Slutligen LDH kvarstad analysen föreskriver en rättfram kvantitativa utgång av procentandel binds cytosol, de bild-baserade metoderna generellt kan inte tillhandahålla denna typ av absoluta kvantitativa utdata. Det skulle vara lämpligt att göra använda av båda typer av metoder på ett kompletterande sätt. En annan utmärkt metod för att studera autophagic kvarstad utan behov av nedbrytning-hämmare är att införa radiomärkt raffinos i celler genom reversibel electro-permeabilisering3,23,37, 38. Raffinos är en membran-impermeant och metaboliskt inert socker som är resistent mot lysosomala enzymer. Därför, dess autophagic kvarstad kan följas av separation av cytosoliska från sedimentable cell fraktioner3,23,37,38. Detta synsätt är emellertid, mer tidskrävande än LDH kvarstad analysen, och kräver ytterligare säkerhetsåtgärder på grund av användning av radioaktivitet. Slutligen kan slutresultatet av bulk autophagic kvarstad och obehindrad autophagic Last flux, nedbrytningen av långlivade proteiner, mätas exakt genom en väletablerad protein märkning-baserad metod39,40 ,41,42,43. Till skillnad från LDH kvarstad analysen, denna metod inte ger dock en viss avläsningssystem för autophagic verksamhet, eftersom långlivat proteiner bryts också genom andra mekanismer än autofagi, framför allt genom proteasomen systemet (medan LDH kvarstad endast sker till följd av autofagi). Därför ett antal kontroll behandlingar behöver vara rutinmässigt ingår, t.ex. kemiska hämmare av autophagic-lysosomala eller proteasomen nedbrytning och genetiska störningar med autofagi3,16.

LDH kvarstad analysen kan jämföras med de vanliga LC3 flux-analyser, som mäter LC3-II nivåer av western blotting eller LC3 puncta bildandet av fluorescens imaging i frånvaron eller närvaron av hämmare av lysosomala LC3 nedbrytning (Baf är mest ofta används), eller övergången av fluorescently märkta LC3 varianter till sura miljöer22. Även om dessa LC3-baserade analyser kan ge användbar information, kan de vara svåra att tolka, särskilt eftersom förhållandet mellan graden av LC3 flux och mängden och typen av Last flux är okänd. Som nämnts i inledningen, kräver bulk autofagi och Parkin-beroende mitophagy inte LC3 familj proteiner9,10,11,44. Dessutom i utsvultna råtta hepatocyter, LDH kvarstad och nedbrytning fortsätter utan avbrott under perioder där det finns ingen autophagic-lysosomala LC3 flux9. Således i detta fall kan Last flux helt separeras från LC3 flux. Det behövs mer forskning jämföra LC3 flux med olika typer av Last flux att tolka resultaten med LC3 flux-analyser.

I sin nuvarande form är LDH kvarstad analysen jämförbar med western blotting i fråga om krävs praktiska tid och kostnader. När det gäller mätning av bulk autofagi, det är minst lika effektiva som raffinos-baserade kvarstad analysen eller långlivad protein nedbrytning analysen ovan. För viss mätning av bulk autophagic kvarstad aktivitet och bildandet av stängda autophagosomes är det mycket effektivare och mer rakt fram än LC3 flux analyser eller proteashämmare skydd analyser av LC3 eller autofagi receptorer, sedan de senare analyserna mäta vagn komponenter snarare än faktiska Last. Även om vi har väsentligt förbättrat genomströmning av LDH kvarstad analysen, det är långt ifrån en hög genomströmning analysen och det kan inte konkurrera med effektiviteten i image-baserad analyserna ovan. Men både image-baserad analyserna och LDH kvarstad analysen har sina fördelar och nackdelar, och således båda typer av analyser har sina egna värderingar. Det är sannolikt möjligt via framtida justeringar att göra den LDH kvarstad assay semi hög genomströmningen. Exempelvis det bör vara möjligt att utföra electrodisruption i 96 brunnar format, och det är tänkbart att cytosoliska LDH kunde skiljas från beslagtagna LDH genom filtrering i stället för centrifugering eller att centrifugeringssteget kan utföras i en 96- väl format. Dessutom analyser att mäta LDH aktivitet som är mycket känsligare än den som används i det nuvarande protokollet har utvecklats, och är kommersiellt tillgängliga. Andra intressanta framtida potential för analysen är dess förmodade användning i andra celltyper än däggdjursceller, exempelvis i jäst eller andra encelliga organismer, eller ens växt celler, liksom dess användning för i vivo mätningar av autophagic kvarstad aktiviteter i vävnader i experimentell organismer.

Sammanfattningsvis anser vi att LDH kvarstad analysen i sin förbättrade och återupplivade form blir ett viktigt verktyg i framtida autofagi-relaterad forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes ekonomiskt av Norges forskningsråd, Oslo universitet, Anders Jahre Foundation, Stiftelsen Nansen och arvet till minne av Henrik Homan. Vi tackar Dr. Noboru Mizushima för ATG5 +/ + MEFs och ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu för ATG7 +/ + MEFs och ATG7-/-MEFs och Dr Shizuo Akira för ATG9A +/ + MEFs och ATG9A-/-MEFs. Vi tackar Frank Sætre för tekniskt bistånd och Dr Per O. Seglen för konstruktiva metodologiska diskussioner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46, (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591, (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166, (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264, (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151, (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19, (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333, (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111, (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19, (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9, (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510, (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10, (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282, (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432, (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169, (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142, (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20, (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281, (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23, (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7, (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258, (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18, (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270, (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162, (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8, (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123, (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95, (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85, (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12, (2), 1-3 (2016).
Laktatdehydrogenas kvarstad analysen — En enkel och tillförlitlig metod för att bestämma Bulk Autophagic kvarstad aktivitet i däggdjursceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter