Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

doi: 10.3791/57971 Published: July 27, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Abstract

Toplu autophagy sitoplazma büyük bölümlerini haciz autophagosomes olarak adlandırdığı çift/multi-membrane yapılar ile karakterizedir. Bu işlem izlemek için basit bir protokol burada açıklanmıştır. Ayrıca, tipik sonuçları ve deneysel doğrulama yönteminin çeşitli kültürlü memeli hücreleri autophagy indükleyici koşullarda temin edilmektedir. Toplu autophagy sırasında sitozol ve böylece aynı zamanda diğer autophagic kargo yanında çözünen sitozolik protein autophagosomes çekilmek. Karaciğer bir istikrarlı ve son derece seçici olarak sigara autophagosomes gizlediği bol, çözünür sitozolik enzim var. Karaciğer haciz miktarını bu nedenle toplu autophagic haciz miktarını yansıtır. Verimli bir şekilde ve doğru bir şekilde karaciğer haciz hücreleri belirlemek için çalışan sayımız sitozolik karaciğer, ölçüm enzimatik sedimentable faaliyete ardından etkili sedimentable ayıran bir electrodisruption tabanlı ayırma iletişim kuralı Bütün hücre örnekleri karşı kesirler. Autophagic haciz sedimentable karaciğer içinde bu işlem görmüş hücreleri tedavi edilmezse hücrelerdeki oranı çıkarılarak belirlenir. Karaciğer haciz tahlil bu ya haciz probları veya yarı kantitatif proteaz ektopik ifade dahil diğer yöntemleri karşı endojen kargo autophagic haciz nicel bir ölçü verir avantajdır koruma analizleri autophagy işaretleri veya reseptörleri.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Autophagy (Yunanca "kendi kendine yemek" için) hücre içi malzeme katmaninin/lizozomal bozulması için evrimsel korunmuş bir süreçtir. Autophagy Maya ve insanlar için önemli olan autophagy ile ilgili ("ATG") genlerin keşfi üzerine ve gerçekleşme bu autophagy insan sağlığı ve hastalıkları (2016 yılında Nobel Tıp veya Fizyoloji için tarafından kabul önemli bir rol oynar Yoshinori Ohsumi), autophagy hızla hücre biyoloji1,2en yoğun okudu işlemlerden biri haline gelmiştir.

(Bundan sonra "autophagy" anılacaktır) Macroautophagy genişleme karakterize ve katlama hücre içi membran cisternae ("phagophores"), etkili bir şekilde çekilmek en kapalı, çift veya çoklu membrane yapılar ("autophagosomes") sitoplazma geri enwrapped malzemesi. Organellerin ile autophagosomes füzyonu, iç autophagosomal membran ve münzevi kargo bozulmuş ve geri dönüşümlü. Autophagosomes rasgele (non-selektif autophagy) ve seçici (seçici autophagy) görgü sitoplazmik malzeme çekilmek olabilir. Toplu autophagy büyük olasılıkla a karıştırmak-in non-selektif ve seçici autophagy temsil eder.

1960 ve 70 's ("morfolojik dönemi" autophagy araştırma) autophagic haciz ultrastructural analizler esas olarak değerlendirildi. 1980 yılında ve başında 1990 ("biyokimyasal dönemi") başına Seglen ve iş arkadaşları — kim okudu birincil fare tetkikine autophagy — kantitatif autophagic haciz aktivitesi3ölçmek için ilk yöntemleri geliştirilmiştir. Bu deneyleri kullanarak, Seglen tanımlanan ve lizozomal autophagic yolu4,5farklı adımları ile karakterize, keşfetti ve amphisome6 (endosome-autophagosome füzyon ürün) icat ve ilk için protein fosforilasyon autophagy yönetmelik7rolünü açıklar. Ancak, ATGs ("moleküler dönemi") 1990'ın keşfi ve bir memeli ATG8 protein ilk karakterizasyonu sonra Mikrotubul ilişkili protein 1A/1B-hafif zincir 3 (LC3) 20008, ATG proteinler için işaretleyici olarak kullanımı autophagic süreci hızla popülerlik kazandı ve büyük ve daha zahmetli biyokimyasal Yöntemler geride. Aslında, son 18 yıldır, Batı leke ve floresan mikroskopi analizleri LC3 farkla en popüler hale gelmiştir (ve birçok sadece durumda) autophagy memeli hücrelerinde okuyan anlamına gelir. Bu yöntemler tarafından gerçekleştirilebilecek göreceli kolaylığı avantajdır. Bunu bir sepeti bileşeni (LC3) yerine gerçek autophagic kargo okuyor dezavantajdır. Devletler ve/veya LC3 akı karşı haciz yolu ile ve akı kargo arasındaki ilişki son derece belirsiz olduğundan oldukça ciddi bir dezavantaj, budur. Aslında, biz toplu kargo akı koşullar altında yüksek düzeyde muhafaza edilmesi göstermiştir hücreleri9konjuge LC3 varlığı rağmen hiçbir LC3 akı olduğu. Ayrıca, bu toplu autophagy verimli LC3 tükenmesi tarafından etkilenmez ve bu nedenle büyük olasılıkla LC3 bağımsız9gösterdi. Bu bulgu da Parkin bağlı mitophagy (mitokondri seçici autophagy) LC310,11 bağımsız olduğunu belirtmek LC3 knock-out çalışmalar10,11tarafından daha sonra doğrulanmıştır .

Özet olarak, açık bir işte deneyleri için kargo tabanlı autophagic etkinliğini izlemek gerekir. En iyi şekilde bu tür deneyleri geniş uygulanabilir, iyi tanımlanmış ve gerçekleştirmek kolay olmalıdır. Son birkaç yıl içinde biz 1980 's12' başına Seglen tarafından geliştirilmiş ve sitozolik karaciğer aktarmak sedimentable, autophagic çarpıtması içeren hücreye ölçme üzerinde dayanır karaciğer haciz tahlil özel bir ilgi almış kesirler. Karaciğer phagophores sitoplazmik kargo enwrap yükleyen kolayca ortak münzevi bir istikrarlı, çözünür sitozolik protein var. Haciz karaciğer, bu nedenle autophagic haciz genel bir ölçüsüdür. Karaciğer lizozomal autophagic yolu12tarafından özel olarak düşer. Böylece, huzurunda lizozomal bozulması inhibitörleri, Örneğin, bafilomycin A1 (Baf)13, deneysel tedavi etkileri doğrudan autophagic haciz etkinliğinde değişiklikleri yansıtmak. Bozulma inhibitörleri yokluğunda, karaciğer tutma ve yıkımı net etkisi ölçülebilir.

Karaciğer haciz tahlil geniş uygulanabilir, çünkü karaciğer son derece ve ubiquitously tüm hücre tiplerinde ifade edilir ve karaciğer düzeyleri doğru bir enzimatik tahlil14,15tarafından sayısal. Ancak, orijinal protokol12 — birincil fare tetkikine kurulan — oldukça zaman alıcı ve malzeme gibi bir ısmarlama elektrik deşarj kapasitör başlayan yüksek bir miktar gerekli. Step-wise bir şekilde yavaş yavaş kolay ve çok yönlü bir yöntem tahlil dönüştürdü. İlk olarak, özgün iletişim kuralını kullanmak üzere memeli hücre hatları16uyarlanmıştır. İkinci olarak, Yöntem önemli ölçüde downscaled3,9yaşındaydım. Üçüncü, zahmetli yoğunluğu hava yastığı da dahil olmak üzere17adım, protokol birkaç adımda elendi. Bu aynı anda bir daha da bir 10 cm tabak örnek16 başına 12-şey plaka (yaklaşık 15-fold daha az başlangıçyani, örnek başına tek bir kuyu kullanmaya kullanarak özgün başlangıç noktasından Yöntem downscaling etkin malzeme)17. Dördüncü olarak, özel yapım elektrik deşarj kapasitör17yerini alabilir bir ticari Elektroporasyon aparatı tespit edilmiştir.

Burada bizim en güncel iletişim kuralı ile karşılaştırıldığında daha önce yayımlanmış17 yönteminin bazı daha fazla basitleştirme içerir karaciğer haciz testin sunulur. Ayrıca, farklı hücre türleri bir dizi elde edilen tipik sonuçlar kümesi gösterilir ve önemlisi, farmakolojik hem de genetik nakavt ve nakavt yaklaşımları kullanarak yöntemi deneysel doğrulamaları birkaç satırlık sağlanmaktadır. İçin genel bir akış düzeni tüm iletişim kuralı bkz: Şekil 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. hücre tohum ve tedavi

  1. Kültür 75 cm2 doku kültürü şişe oksijen kuluçka söz konusu hücre türü için tercih edilen kültür ortamı kullanarak 37 ° C'de % 5 CO2 yapışık hücreleri. Hücreleri bir birleşmesi yakınındaki hücre katmanı ulaşana kadar büyümeye izin.
    Not etmek Kullanma ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) LNCaP, HEK293, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), BJ, takıma RPMI 1640 orta MCF-7 ve RPE-1 hücreleri.
    1. 3 mL 37 ° C fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), pH 7.4 hücrelerle yıkayın. PBS yerine 3 mL %0.25 (w/v) tripsin-ethylenediaminetetraacetate (EDTA) ve hücreleri (2-5 dk) ayırmak kadar oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 şişeye kuluçkaya.
    2. Müstakil hücreleri ile 7 mL kültür % 10 içeren orta resuspend FBS. 10 µL hücre süspansiyon aliquot ile 10 µL % 0,4 mix Trypan mavi bir microcentrifuge tüp 0,5-20 µL pipet ucu kullanarak. Hemen bir sayım odası slayt doldurmak için aynı pipet ucu kullanın ve bir otomatik hücre Counter hücreleri saymak.
  2. Uygun bir hazırlamak seyreltme (aşağıdaki nota bakın) adım 1.1.2 kullanarak hücre süspansiyon kültür orta içeren %10 FBS ve tohum seyreltilmiş hücre süspansiyon 12-iyi doku kültürü plaka (yüzey alanı ~3.8 cm2) kullanarak her şey aseptik 1 mL tekniği. İstenen hücre yoğunluğu ulaşana kadar Örneğin, 60-%90 izdiham hasat, 37 ° C'de % 5 CO2 ile oksijen bir kuluçka büyüme sağlar.
    Not: Uygun seyreltme istenen hücre confluency hasat verecek hücre süspansiyon hücre tipi hücre tipi yanı sıra süresi ve deneysel tedaviler türüne göre değişiklik gösterir. Böylece, bu ampirik olarak her durumda değerlendirildi gerekir.
    1. Yapılacak deneyler için hem tedavi ve tohum, tohum 2.5 x 105 LNCaP, HEK293, veya MCF-7 hücreleri, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ veya 1.5 x 10 sonra 2 gün her şey 12-şey plaka5 RPE-1 hücrelerde hasat.
    2. Gevşek bağlı hücreler için söz konusu hücre tipi için önerilen kaplama türü ile tabakalar kat. LNCaP (ve HEK293) hücreler için poli-D-lisin ile (PDL) kaplamalı plakalar kullanın.
    3. Bu amaçla, her şey için 2,5 µg/mL steril H2O 500 µL PDL ekleyin ve plakaları, oda sıcaklığında (20-25 ° C) 30 dk için steril bir ortamda kuluçkaya. PDL emme kaldırmak ve her biri de kısaca 1 mL steril H2o yıkayın
      Not: Genel olarak, herhangi bir deneysel tedaviler adım 1.2.1 yapılıyor. Ancak, RNAi gerçekleştirmek, bu ters bir transfection ile tohum9başlatmak uygun olabilir.
  3. Koşul başına yinelenen veya onaylatılacak Wells deneysel tedaviler gerçekleştirmek.
    1. Örneğin, 50 hücrelerle tedavi genellikle autophagic haciz verimli bir uyarıcı olduğunu veya hücreleri 1 mL Earle amino asit içermeyen hücrelerle yıkayarak akut serum ve amino asit açlıktan ölecek konu mTOR inhibitörü Torin1 nM'ın dengeli Çözüm (EBSS) orta tuz ve daha sonra EBSS 1 mL oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 hücrelerinde kuluçkaya
    2. Sedimentable karaciğer arka plan düzeyleri tanımlamak için tedavi edilmezse Wells bir set bırakın.
    3. Sonrası haciz inhibitörü bafilomycin A1 (Baf) doyurarak bir miktar eklemek3,13,16,18 yokluğu veya varlığı deneysel tedaviler, hücre önce 3-4 h hasat. Hücreleri oksijen kuluçka 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçkaya
      1. Kullanım 100 nM LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 ve 1 RPE hücrelerinin, Baf ve 10 nM Baf MEFs için.
      2. Sadece 3-4 h, (genellikle bu örneği içinde adım 1.3.1 varmış gibi) süresi olan deneysel tedaviler için ekleme Baf aynı anda tedaviler ile. Artık bu deneysel tedaviler için 3-4 h önce hasat beklemek ve bir 500 x 2 µL Baf stok doğrudan orta konsantre ekleyin.
      3. Hemen Baf eklenmesinden sonra plaka Tantanacı tarafından karıştırın. Bu noktada da macroautophagic haciz inhibitörleri denetimleri, Örneğin, pan-fosfoinositid 3-kinaz (PI3K) inhibitörü 3-Metil adenin (3MA)1910 mM ve seçici PI3K Sınıf III 10 µM eklemek için tavsiye inhibitörü SAR-40520.

2. hücre hasat ve Electrodisruption için hazırlık

  1. Tedavi süresi sonunda, orta emme Aspire edin ve her şey için 200 µL hücre dekolmanı çözümü (37 ° C-önceden ısıtılmış) ekleyin. Hücreleri (genellikle yaklaşık 5 dk) ayırmak kadar 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: %0,25 (w/v) tripsin-EDTA hücre dekolmanı çözümü yerine kullanılabilir ise, ikinci DNaz, viskozite müstakil hücre azaltmaya yardım eder içerir. Orta iyice emişli sürece tripsin-EDTA veya hücre dekolmanı çözüm eklenmesi önce hücreleri yıkamak gerekli değildir.
  2. Her şey için %2 (w/v) Sığır serum albumin (BSA) içeren 500 µL oda sıcaklığında (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, eklemek ve pipet ile hiçbir hücre kümeleri görünür hale gelene kadar resuspend. Hemen hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüpler için buza aktarın.
    Not: Aksi belirtilmedikçe, buz üstünde tüm sonraki adımları uygulayın.
  3. Tortu hücreleri tarafından Santrifüjü 400 x g 4 ° C'de 5 min için de
  4. İyice süpernatant (ile emme) hücre topakları kadar mümkün olduğunca kuru bırakmak Aspire edin.
  5. 400 µL % 10 (w/v) sukroz (içinde ultrasaf H2O) her tüp için ekleyin.

3. plazma zarı Electrodisruption ve Sedimentable ve toplam hücre kesirler ayrılması

  1. Hücre Pelet çevre bir tek hücre süspansiyon elde etmek için bir pipet ile resuspend ve 4 mm Elektroporasyon küvet aktarın.
    Not: alçalarak ~ 10-15 Pipetting zamanlarda, 100 – 1000 µL pipet ucu kullanarak genellikle yeterlidir.
  2. Küvet bir üstel çürüme dalga electroporator yerleştirin ve tek elektrik nabzı 800 deşarj V, 25 µF ve 400 Ω; Bu ayarları ~ 8 ms süresi bir darbe üretmek.
  3. Hücre disruptate 400 µL buz gibi fosfat tamponlu sükroz solüsyon (100 mM sodyum monofosfattır, 2 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM EDTA ve %1.75 sukroz, pH 7.5) içeren 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak için yeni bir pipet ucu kullanın ve tarafından kısa bir süre karıştırın Pipetting.
    1. İsteğe bağlı: verimli plazma zarı electrodisruption17doğrulamak için seyreltilmiş hücre disruptate adım 3.3 10 µL ile 10 µL % 0,4 mix Trypan mavi bir 1.5 mL microcentrifuge tüp. Aktarım sayım odasına ve Trypan mavi pozitif hücrelerinin yüzdesi olduğundan emin olun > % 99.
      1. Oda sıcaklığında (20-25 ° C) 30 dk için sayım odasında örnek bırakın ve Trypan mavi pozitif hücrelerinin yüzdesi kalmıştır doğrulayın > % 99.
    2. İsteğe bağlı: electrodisruption değil çok sert oldu, diğer bir deyişle, bu hücre içi organellerin bozulduğu, değil doğrulamak için adımları 1.1-3.3 yukarıda açıklandığı gibi ama daha büyük bir başlangıç materyali (6-şey plaka bir ~ %80 konfluent hücre katmanı ile bir kuyudan), kullanın ve 150 µL % 10 sükroz adım 2.5 ve 150 µL fosfat tamponlu sükroz çözüm DTT olmadan adım 3.3 kullanın.
      1. Bir pipet seyreltilmiş hücre disruptate çözümü fosfat tamponlu % 8 (w/v) yoğunluk gradient Orta (Örneğin, %8 Nycodenz, 50 mM sodyum fosfat, % 2.2 sukroz, 1 mM EDTA) 1.2 mL yoğunluğu yastık üstüne dikkatle µL katman 200 için bir 2 mL santrifüje kullanın Tüp. 20.000 x g için bir microcentrifuge 4 ° C'de 45 dk ile yumuşak modu görev (için nazik hızlanma ve yavaşlama), santrifüj kapasitesi ve dikkatle tüpler buza koy.
      2. 60 µL ~ 200 µL üst fraksiyonunun değil herhangi bir yoğunluk gradient orta çözüm kadar almak ve aktarmak için bir taze microcentrifuge tüp emin dikkatli bir şekilde çıkarın.
        Not: Bu olağanüstü saflık, "hücre sap"21olarak adlandırdığı sitozol içermelidir.
      3. Kesir saflığı proteinlerin standart teknikleri ve % 4-20 degrade jelleri16kullanarak organel yer alan, Batı leke analizleri gerçekleştirerek Yukarıdaki adımda elde test.
      4. Örneğin cathepsin B21, sitokrom c ve protein disülfür izomeraz, elektrik çarpması adım 3.2 organellerin, mitokondri veya endoplazmik retikulum, sırasıyla, kesintiye değil olduğunu doğrulamak için ve immunoblot için immunoblotting gerçekleştirmek Karaciğer hücre sap bir sitozolik protein varlığını doğrulamak için.
      5. Buna paralel olarak, immunoblotting kullanılan antikor değerlendirilir organel bulunan proteinler algılayabilir onaylamak için Toplam hücresini disruptate çözüm16 yapılan proteini özleri üzerinde gerçekleştirin.
  4. 3.1-3.3 her örnek için yineleyin.
  5. % 0.5 BSA ve % 0,01 ile 900 µL buz gibi resuspension arabellek (50 mM sodyum monofosfattır, 1 mM DTT, 1 mM EDTA ve % 5,9 sukroz, pH 7.5) içeren 2 mL microcentrifuge tüpler için her seyreltilmiş hücre disruptate çözümü (3.3 adımda elde edilen) 550 µL kaldırmak Ara-20 ve kısa bir süre ile pipetting karışımı.
  6. 4 ° C'de üretmek için 45 dk için 18.000 x g , santrifüj "posalı karaciğer" içeren unsurlardandır. İyice süpernatant (ile emme) granül mümkün olduğu kadar kuru bırakmak Aspire edin. Örnekleri-80 ° C dondurucuya koyun.
  7. 150 µL (3.3 adımda elde edilen) her seyreltilmiş hücre disruptate çözümü için yeni tüpler aktarmak ve örnekleri-80 ° C dondurucuya yerleştirin. Bu örnekler hücrelerdeki "Karaciğer toplam" düzeylerini belirlemek için kullanın.
    Not: Bu noktada deneme için istenen sürece duraklatılmış.

4. karaciğer ayıklama ve karaciğer enzim aktivitesi ölçümü

  1. Tezcan (Kimden adım 3.6) "posalı karaciğer" ve "Karaciğer toplam" örnekleri (adım 3.7) buz üzerinde.
  2. Buz gibi resuspension arabelleği %1,5 "Toplam karaciğer" Triton X-405 örnekleri (verimli bir son Triton X-405 konsantrasyonu % 1) içeren 300 µL ekleyin. 30 dk soğuk oda (4-8 ° C) bir rulo üzerinde örnekleri döndürün.
  3. Buz gibi resuspension arabelleği %1 "Posalı karaciğer" Triton X-405 örnekleri ile 750 µL ekleyin ve homojen bir çözüm ulaşılana kadar granül bir pipet ile resuspend.
  4. Adım 4.2 ve 4.3 18.000 x g 4 ° C'de 5 min için de örnekleri undissolved tortu hücresel enkaz için santrifüj kapasitesi.
  5. Soğuk 65 mM imidazole parçalarını mix 4 (pH 7.5)/0.75 mM pyruvate soğuk 65 mM imidazole (pH 7.5) bir parçası ile / 1.8 mM NADH 4 ° C'de en az üç hafta boyunca stabil çalışan bir çözüm elde etmek için
  6. 3 – 30 µL adım 4.4 200 µL ile adım 4.5 çalışma çözüm supernatants, karıştırın.
  7. Karaciğer enzim aktivitesi Nikotinamid adenin dinükleotit (azaltılmış form) düşüş olarak ölçerek karaciğer miktarını (NADH) absorbans 340 nm bir standart olarak bilinen bir karaciğer konsantrasyon ile karşılaştırıldığında 37 ° C'de. Tepki tamamlama, yani 340 absorbans kadar yaklaştı kadar absorbans ölçümleri gerçekleştirmek nm artık zamanla değişir.
    Not: Bu karaciğer etkinliği ölçmek için klasik biyokimyasal yöntemdir. Her ne kadar reaksiyon 37 ° C'de geçerli iletişim kuralı gerçekleştirdiği, bu da oda sıcaklığında (20-25 ° C), hangi el ile spectrophotometry yapıyor tavsiye edilir gerçekleştirilebilir. Geçerli iletişim kuralını kullanan otomatikleştirilmiş bir yolla örnekleri çalışan çözüm bir 96-şey plaka ile karışımları ve 340 absorbans ölçer bir robot multianalyzer enstrüman, 37 ° C nm'de her 20 s 3 dk için. Bundan sonra karaciğer, birimleri (U) olarak ifade edilen konsantrasyon enstrüman yazılım hesaplar / L, bilinen karaciğer bir standart ile kalibrasyon ile elde edilen bir standart eğrisine göre zaman içinde absorbans ölçümleri eğimi karşılaştırarak konsantrasyon. Bu yaklaşım tarafından algılamayı doğrusal dizi 30-1500 U/l. Alternatif olarak, çok çeşitli karaciğer ölçmek için piyasada kitleri adlı biri yok. Bazıları başka bir yöntemle UV spectrophotometry daha ve algılama doğrusal diğer aralıklar ile algılama etkinleştirme Renkölçer veya floresan ürünlerin üretimi için enzimatik reaksiyon kaplin temel alır.

5. karaciğer haciz hesaplanması

  1. Her örnek için dilutions almak ve dikkate örnekleme toplam karaciğer için posalı karaciğer yüzdesini hesaplamak:
    Posalı karaciğer (%) =Equation 1
    Not: adımları sırasında 3.1-3.3 yaklaşık 50 µL aktarımı içine ve dışına Elektroporasyon küvet nedeniyle kaybolur. Böylece, toplam 750 µL (yerine 800 µL) sahip olmaktan seyreltilmiş hücre disruptate adım 3.3'in hesaplayın.
  2. Posalı karaciğer tedavi edilmezse hücrelerden (adım 1.3.2) posalı karaciğer tarafından Baf yüzdesini elde etmek için tedavi zamanla deneysel tedavi hücreleri ve bölmek örnekleri elde yüzdesi örneklerinden elde yüzdesi çıkarma münzevi karaciğer örnekleme döneminden saatte:
    Münzevi karaciğer (% / h) =Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

İletişim kuralını kullanarak açıklanan burada, birkaç farklı memeli hücre satır, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, dahil olmak üzere toplu autophagic haciz etkinliğinde MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, fare embriyonik fibroblastlar (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ ve LNCaP hücreleri ölçülür. Haciz (tam, besin açısından zengin ortamda) Bazal koşullar altında değerlendirilen veya hücrelerin içinde akut serum ve amino asitler (bir bona fide autophagy indükleyici koşulu22) için aç. Karaciğer tutma etkinliği açlık koşullar altında kapsamlı bir şekilde LAPC4, DU145, Huh7 ancak algılanabilir düzeyleri arasında değişen farklı hücre hatları üzerinden değişir ve PNT2 hücreleri (veri gösterilmez) için ~1.6%/h (Şekil 2 LNCaP hücrelerdeki sonuçları gösterilir A). Yıldız birincil fare tetkikine gözlenen yukarıda belirtilen hücre satırları ve genellikle 2.5–4%/h23aralığından daha yüksek oranıdır. Bazal koşullar altında karaciğer haciz test ve ~0.2%/h ~0.5%/h diğer yarısında değişmekteydi cep çizgilerinden oluşan yarısında hemen hemen görünmez (veri gösterilmez). Algılanabilir bazal autophagic haciz etkinliğini gösteren hücre hatlarında akut serum ve amino asit açlık genellikle karaciğer tutma oranı 3-4 kat artış (örneğin bkz: Şekil 2içindeAgösterilen LNCaP deney) neden olmaktadır. (Yukarıda belirtilen) test hücre hatlarında posalı karaciğer örneklerinde (adım 1.3.2) tedavi edilmezse hücrelerden elde edilen arka plan yüzdesi genellikle % 2-3 civarındadır. Çeşitli hücre hatlarında, posalı karaciğer değerleri arasında varyasyon (CV) intra deneysel katsayısı gerçekleştirilen 22 bağımsız deneyler üzerinden (% posalı karaciğer) tedavi çoğaltır % 5.8 ± % 1.7 (ortalama % CV ± standart sapma), 3.0-değişen yapıldı. %9.0. Birlikte, bu numaraları bir karaciğer haciz tahlil memeli hücrelerinde gerçekleştirirken beklemek ne göstergesidir.

De genetik nakavt ve nakavt olarak kimyasal inhibitörleri kullanımı yaklaşımlar, kapsamlı bir şekilde karaciğer haciz tahlil güvenilir autophagic haciz etkinliğini ölçer doğrular. Autophagosome oluşumu gerektirir etkin PI3K kinaz (ULK)24aktive autophagy gibi Sınıf III (PIK3C3) ve Unc-51 yanı sıra denge intrasellüler Ca2 + homeostazı16. Şekil 2'A, hem bazal hem de açlık kaynaklı karaciğer haciz tamamen pan-PI3K inhibitörü 3MA tarafından kaldırıldı gösterildiği, seçici PIK3C3 inhibitörü SAR-40520veya acil servis Ca2 + pompa inhibitörü thapsigargin (TG) 25 LNCaP hücrelerdeki. Karaciğer haciz açlık koşulları (amino asit içermeyen Earle ün dengeli tuz çözüm (EBSS) Orta geçiş) altında da güçlü TG veya ULK inhibitörü MRT67307 HEK293 hücrelerinde (Şekil 2B) azalır. Ayrıca, açlık kaynaklı karaciğer haciz sürekli 3MA MEFs (Şekil 2C), BJ (Şekil 2D), içinde tarafından engellenir MCF-7 (Şekil 2E) ve RPE-1 (Şekil 2F) hücreleri. Genel olarak, kuluçka hücrelerinin EBSS orta tek başına (Yani, Baf veya diğer sonrası haciz inhibitörleri yokluğu) münzevi karaciğer herhangi bir ölçülebilir birikimi (örneğin Şekil 2 ' de gösterilen LNCaP deneyi bakınız yol açmaz A). bu olası nedeni akut amino asit açlık münzevi karaciğer hızlı ve sürekli bozulma sonuçlanan hızlandırılmış lizozomal autophagic akı yol açar.

Daha sonra çeşitli ATG gen nakavt (KO) MEFs karaciğer haciz autophagy ile ilgili genleri autophagosome oluşumu için gerekli olduğu bildirilen sağlanıp sağlanmadığını test etmek için istihdam edildi. Gerçekten de, açlık kaynaklı karaciğer tutma bizim önceki bulgular9teyit ATG5 KO MEFs26 (Şekil 3A), kaldırıldı. Ayrıca, Şekil 3B ve 3 C' de gösterildiği açlık kaynaklı karaciğer haciz de ATG7 KO MEFs27 ve ATG9A KO MEFs28kör.

Son olarak, karaciğer haciz tahlil olup RNAi aracılı anahtar ATG gen transkript susturmak açlık kaynaklı tutma etkinliği inhibe ile ilgili olarak test edildi. Gerçekten de, transfection bir ATG9A hedefleme siRNA, ya da ULK1 ve ULK2, şiddetle azaltılmış karaciğer haciz LNCaP hücrelerinde (Şekil 3D) açlık koşullarda kombine hedefleme. Ayrıca, bizim önceki bulgular3,9 200 kDa (FIP200) protein etkileşim odak yapışma kinaz ailesinin hedefleme teyit veya γ-aminobütirik asit türü A (GABAA) reseptör ilişkili protein (hedefleme kombine GABARAP) aile üyeleri açlık kaynaklı karaciğer tutma (Şekil 3D) engeller.

Figure 1
Resim 1 : Genel olarak akış düzeni karaciğer haciz Protokolü'nün. Protokol örnek başına belirtilen birimleri (bir kuyudan) kullanarak bir 12-iyi doku kültürü plaka biçimi temel alır. Tahlil Protokolü elverişli bir konuma sahip iki ayrı çalışma gün, belirtildiği şekilde ayrılabilir. Ancak, bir gün içinde tüm prosedürü gerçekleştirmek mümkündür. Kısaltmalar: Sonra patlama arabellek ABB (bkz. Adım 3.3 malzemeler için protokolündeki); RSB, resuspension arabellek (bkz. Adım 3.5 malzemeler için iletişim kuralı). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Doğrulama autophagy inhibe bileşikleri kullanarak karaciğer haciz testin. (A)LNCaP hücreleri kalmıştı ya tedavi edilmezse (arka plan çıkarma amacıyla: bkz. Adım 1.3.2) tam büyüme orta (CM; RPMI 1640 + %10 fetal Sığır serum (FBS)), veya DMSO araç (%0.1) veya 100 ile tedavi edildi nM Baf CM veya serum ve amino asit ücretsiz Orta (EBSS). Ayrıca, bazı hücreleri 3MA ile tedavi edildi (10 mM), SAR-405 (10 µM), veya Thapsigargin (300 nM), belirtildiği gibi. 3 h tedavi sonra hücreleri hasat edildi ve karaciğer tutma oranları olarak belirlenmiştir geçerli iletişim kuralında ayrıntılı. (B) HEK293 hücreleri tedavi DMSO CM (% 0,1) araca ya da 100 nM Baf belirtildiği gibi EBSS içinde. Ayrıca, bazı hücreleri 10 µM alınan MRT67307 (bir ULK inhibitörü) veya 300 nM Thapsigargin. Karaciğer tutma oranları tedavi 3 h sonra belirlenmiştir. (C-F) MEF (C), BJ (D), MCF-7 (E) veya RPE-1 (F) hücre tedavi DMSO CM (% 0,1) araca ya da Baf (10 nM c, 100 nM D-f) içinde EBSS da belirtildiği gibi 10 mM 3MA, olmasa da. Karaciğer tutma oranları tedavi 3 h sonra belirlenmiştir. A, B, D, E ve F göstermek üç biyolojik çoğaltır (onaylatılacak wells) bir deneme ortalama değerleri (n = 1), standart sapma temsil eden hata çubukları ile. C üç bağımsız deneyler ortalama değerleri gösterir (n = 3), standart hata ortalamaya temsil eden hata çubukları ile. p < 0,05, ***p < 0,001 tekrarlanan, tek yönlü ANOVA örnekleri.

Figure 3
Şekil 3 : Karaciğer haciz tahlil nakavt (A-C) veya nakavt (D) yaklaşımlar tarafından doğrulanmasını. (A-C) ATG5 vahşi türü (WT) veya nakavt (KO) MEFs(a)ATG7 WT veya KO MEFs (B), veya ATG9A WT veya KO MEFs (C) tedavi DMSO CM (% 0.01) araca ya da 10 nM Baf belirtildiği gibi EBSS içinde. Karaciğer tutma oranları tedavi 3 h sonra belirlenmiştir. Dört değerleri yani (A; n = 4) veya üç (B ve C; n = 3) standart hata ortalamaya temsil eden hata çubukları ile bağımsız deneyler. p < tekrarlanan 0,05, iki yönlü ANOVA örnekleri. Tutarak, önemli değil. (D) LNCaP hücreleri ters 5 ile transfected nM nontargeting denetim siRNA (siCtrl) veya 5 her belirtildiği gibi ATG9A - FIP200-, ULK1-, ULK2-, GABARAP-, GABARAPL1- da GABARAPL2 hedefleme siRNA oligoes, nM. 48 saat sonra hücreleri de DMSO araca CM (% 0,1), veya 100 ile tedavi edildi nM Baf belirtildiği gibi EBSS içinde. Karaciğer tutma oranları tedavi 3 h sonra belirlenmiştir. Üç biyolojik çoğaltır (onaylatılacak wells) bir deneme ortalama değerleri gösterilmiştir (n = 1), standart sapma temsil eden hata çubukları ile.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Özetle, burada açıklanan protokol memeli hücreleri toplu autophagic haciz etkinliğini izlemek için güvenilir ve yaygın olarak uygulanabilir bir yöntem temsil eder. Orijinal yöntemi12,16için karşılaştırıldığında, biz gereksiz adımları bir dizi kaldırıldı, kalan adımları birkaç Basitleştirilmiş ve önemli downscaling tanıttı. Sonuç olarak, protokol maliyet ve zaman-verimliliği ile ilgili olarak, büyük ölçüde artırıldı ve örnekleri aynı miktarda şimdi özgün protokolü ile karşılaştırıldığında daha az yarısından zamanında ele alınabilir. Adım 4 (2 gün)-ebilmek var olmak kılınmak ~ 2 h ise 24 örnekleri için 2-3 arasındaki adımları (gün 1) ½ h hazırlık artı yaklaşık 3 h verimli çalışmanın gerektirir (tüm gerekli arabellekleri önceden hazırlanır verilen bu tahmin eder zaman). Günde 1 genellikle Baf ile 3-4 h kuluçka veya diğer inhibitörleri autolysosomal karaciğer bozulması, dahil olmak üzere hücre tedavileri tarafından öncesinde tahlil beri iki gün üst üste tahlil bölmek uygundur. Ancak, bir ve aynı gün içinde tüm tahlil yapmak mümkündür. Bu durumda, ek-örnekleri dondurma sıvı azot içinde adım 3,6 ve 3,7 için zaman kazandırır. Her ne kadar geçerli protokolü ile test değil, donma-çözülme adım tamamen atlanabilir, daha ayrıntılı bu yana birincil fare tetkikine tahlil sürümü bu adım23yapılmıştır olasıdır.

Burada sunulan Protokolü göreli kolaylıkla gerçekleştirilebilir. Not, tahlil çeşitli örnekleme ve seyreltme adımları içerir bu yana, pipetting içinde doğru olmak önemlidir. Ayrıca, süpernatant umutları iyice, böylece en az miktarda iyonları sükroz hücre süspansiyon adım 2.5 mevcut ve böylece adım 3.6 posalı malzeme olarak mümkün olduğunca küçük sitozolik karaciğer kirletici yapılmalıdır. Burada açıklandığı şekilde tahlil malzeme başlayarak geniş bir aralığı için esnektir. Örneğin, LNCaP hücrelerde, biz başarılı bir şekilde tahlil hücreleri, hasat, farklı miktarda bir dizi ile bir 10 kat farkı (2. 5 x 2. 5 x 106 hücre 105 hücrelere) kadar yayılan kullandık. Gerekli malzemeleri başlayarak en az tarafından ne kadar hassas algılama karaciğer enzim aktivitesinin yöntemdir tanımlanır. Protokol ölçeklenebilir çok büyük olasılıkla önemli ölçüde daha fazla aşağı, aşağı adımları 2.5, 3.3, 3.5, 3.7, 4.2 ve 4.3 kullanılan birimleri ölçekleme tarafından.

En kritik faktör ve teknik meydan okuma tahlil ile electrodisruption adım var. Güçlü, ama kısa, elektrik çarpması hücrelerinin hücre içi yapısı ve organelleri (autophagic boşluklar da dahil olmak üzere) olduğu gibi12bırakarak bir üniforma ve seçici bozulma plazma zarı sonuçlarında iyon-free, izotonik çözüm 29. Yapışık hücreleri kullanırken, enzimatik ve mekanik bakımları adımda 2.1-3.1 (hücre dekolmanı, aralıklarla ve resuspension) tahammül esastır. Adım 3.1 için mükemmel tek hücreli süspansiyon elde etmek için kritik değildir. Örneğin, bu LNCaP hücreleri ile ulaşmak çok zor oluyor. Yine de, çevre hücrelerin % 100 başarılı electrodisruption her zaman, hatta birkaç düzine-in fiziksel olarak bağlı hücreler içeren hücre kümeleri içinde elde edilir. Yeni bir hücre tipi sınarken, electrodisruption etkinliğini doğrulamak için tavsiye edilir (bkz. Adım 3.3.1)17. Electrodisruption adım sonra17hücrelerin % 100 yakın kalıcı olarak Trypan mavi pozitif olmalıdır. Yoksa, electroporator ayarları büyük olasılıkla değiştirilmesi gerekir. Tahlil 20 farklı memeli hücre türleri kullanarak, biz hiç electroporator ayarlarını değiştirmek zorunda kalmışlardır. Böylece, doğru ayarları için bir memeli hücre satır bulduktan sonra tüm diğer tür memeli hücreleri için işe muhtemeldir. Electrodisruption koşulları çok sert olmadığını doğrulamak için sadece plazma zarı ve hücre içi organellerin değil zarı bozulur olduğunu, Yani,adım 3.3.2 izleyin.

Toplu autophagy sitozol diğer kargo ile birlikte önemli miktarda Co çekilmek autophagosomes tarafından gerçekleştirilir. Bu sitoplazma bölümlerini tamamen seçici autophagy yolu ile ortaya çıkabilir veya bir şekilde bu seçici ve non-selektif autophagy karışımı temsil eder. Bu bugüne kadar olup olmadığını veya hangi dereceye kadar seçici ve non-selektif autophagy işbirliği var autophagy iki farklı mod veya olup olmadığını autophagosomes bir kural olarak aynı anda seçici ve non-selektif görgü kargo çekilmek açık değildir. Önemlisi, ancak, yeni yapılan bir çalışmada seçici autophagy aktivatörler toplu sitozolik kargo haciz belirli kargo30haciz olduğu gibi benzer bir artış neden bildirdi. Kendi laboratuvar sonuçlarından bu ile anlaşma vardır (yayınlanmamış sonuçlarımız). Haciz çözünür sitozolik protein analizi (Örneğin, karaciğer) bu nedenle büyük olasılıkla macroautophagic tutma etkinliği çok altında değilse tüm koşulları değişiklikleri algılamak için potansiyel vardır. Her ne kadar hala kanıtlanmış için olasılık koşulları belirli türleri benzersiz bir tür Seçici özel autophagy nerede kargo sıkıca bile o sitozol phagophore tarafından sarılır neden dışarıda bırakılamaz kalır ancak, üzerinden edilmemektedir autophagosome tecrit. Böyle durum var olabilir için soruşturma için toplu autophagy deneyleri karaciğer haciz tahlil gibi seçici autophagy deneyleri ile paralel olarak çalıştırılması gerekir.

Karaciğer haciz tahlil ana avantajlarından biri bu endojen kargo, böylece genel olarak uygulanabilir bir yöntem yapmak haciz ölçer var. Ayrıca, tahlil son derece nicel bir şekilde tutma etkinliğini ölçer. Karaciğer haciz tahlil mekanizmaları ve autophagosome oluşumu, açık beri düzenlenmesi için önemli bir araçtır phagophores karaciğer çekilmek olamaz. Bu imkansız değil, autophagosome benzeri yapıları kapalı varlıklardır olup olmadığını veya elektron mikroskobu tarafından değil değerlendirmek çok hantal ve zor, tek. Autophagosomes kapalı olup olmadığını çözümlemek için kullanılan başka bir yöntem hassasiyeti autophagy işaretleri (Örneğin, LC3) veya reseptörleri test etmektir (Örneğin, sequestosome 1 (p62/SQSTM1) veya nükleer nokta protein 52 (NDP52)) için proteaz10 ,31,32. Bu testin bir proteaz koruma autophagic kargo yerine sepeti bileşenleri okuyor dezavantajdır. Tahlil western Blot dayalı olduğundan, Ayrıca, bu yarı nicel bir durum.

Endojen kargo Autophagy analiz yeteneği bir avantajdır, karaciğer haciz tahlil ve haciz endojen kargonun değerlendirmek diğer deneyleri ile doğal bir sınırlama bir bozulma inhibitörü amacıyla dahil edilmelidir ise autophagic tutma belirli etkileri yerine haciz ve yıkımı net etkileri ayırt. Karaciğer bozulması verimli inhibitörleri proton pompa inhibitörleri gibi klorokin ve amonyum klorür33gibi Baf veya concanamycin3,16,18ve lysosomotropic ajanlar içerir. Proteaz inhibitörü leupeptin de birincil fare tetkikine23' inşaat ama test ettik memeli hücre hatlarında genelde verimsiz. Biz düzenli olarak hızla geçecek olan ve, nonmalignant ve malign hücrelerde yüksek verimli Baf13, kullanın. Ancak, karaciğer bozulması inhibitörleri hiçbiri tamamen özeldir ve autophagy inhibitörlerinin sözde etkileri dışarıda bırakılamaz göz önünde tutmak önemlidir. Non-spesifik etkisi riskini en aza indirmek için sadece düzeyleri doyurarak çoğu engelleyici konsantrasyonları kullanın ve engelleyici sadece son birkaç saat deneme için (3-4 h) eklemek için tavsiye ediyoruz. Baf doyurarak konsantrasyonu her hücre türü için tespit edilmelidir. Bir kılavuz olarak, biz-si olmak sınav, kültürlü memeli hücre satırlarını çoğu için 50-100 nM doyurarak MEFs sadece 10 gerektirir gibi bazı hücre türleri ise nM Baf tam bir blok içinde karaciğer bozulması için.

Bir belirgin karaciğer haciz tahlil ile o sadece canlı hücreler üzerinde böylece autophagy sabit hücre ve doku analizi için kullanımı hariç gerçekleştirilebileceğini kısıtlamadır. Öte yandan, şu anda hiçbir deneyleri kurulan sabit hücrelerinde fonksiyonel autophagic etkinliği ölçmek. Geçerli protokol ile test değil rağmen in vivo autophagic tutma etkinliği deneysel organizmalarda değerlendirmek için karaciğer haciz tahlil kullanmak tamamen mümkün olmalıdır. Belgili tanımlık sınırlama-cekti var olmak organizma bir inhibitörü ile tedavisinde lizozomal karaciğer bozulması tolere gerekir ve dönemin böyle tedavi ve testin performans arasındaki olası belirsiz etkilerini en aza indirmek için nispeten kısa olması gerekir engelleyici. İlginçtir, Kominami vd., erken bir çalışmayla belirtilen 3-6 h tedavi sıçan leupeptin (mayi enjeksiyon, 2 mg/100 g vücut ağırlığının) ile verimli autophagically münzevi karaciğer karaciğer birikimi gözlemlemek uygundur hücre altı fraksiyonları autophagic boşluklar34için zenginleştirilmiş.

PH-duyarlı floresan haciz ektopik ifade Rosella35 gibi probes veya Keima36 bozulması inhibitörleri dahil olmak üzere gerek kalmadan autophagic haciz görselleştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, karaciğer haciz tahlil bu tür yaklaşımlar tek kişilik hücrelerde autophagic haciz görselleştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, organel hedefleme sıralarını sonda füzyonu özel organelleri haciz izlemek için yararlı olabilir. Güçlü mikroskobik platformları da yüksek üretilen iş tarama analizleri için izin verebilir. Ektopik sonda ifade, aynı zamanda lizozomal sisteminde sonda birikimi autophagic yolu etkileyebilir dezavantajları vardır. Ayrıca, karaciğer haciz tahlil farklı olarak verimli bir şekilde transfected hücrelere bağlı biri. Son olarak, karaciğer haciz tahlil münzevi yüzde sitozol düz ileri nicel bir çıktısını sağlar ise, yansıma tabanlı yöntemler genellikle bu tür mutlak nicel çıkış sağlayamaz. Tavsiye yaklaşımlar her iki tür tamamlayıcı bir şekilde kullanın. Autophagic tutma bozulması inhibitörleri gerek olmadan çalışmak için başka bir mükemmel Yöntem radiolabeled raffinose hücrelere tersinir electro-permeabilization3,23,37tarafındantanıtmak için hazırlanmıştır, 38. Raffinose lizozomal enzimler için dayanıklı membran-impermeant ve metabolik olarak inert bir şeker var. Bu nedenle, onun autophagic haciz sedimentable hücre kesirler3,23,37,38sitozolik ayrılması tarafından takip edilebilir. Bu yaklaşım ise, karaciğer haciz tahlil daha fazla zaman ve radyoaktivite kullanımı nedeniyle ek güvenlik önlemleri gerektirir. Son olarak, toplu autophagic tutma ve engelsiz autophagic kargo akı, uzun ömürlü proteinlerin bozulması ait sonuç doğru bir iyi kurulmuş protein etiketleme tabanlı yöntemi39tarafından,40 ölçülebilir ,41,42,43. Uzun ömürlü proteinlerin Ayrıca en önemlisi proteasomal sistem tarafından autophagy, daha diğer mekanizmaları tarafından bozulmuş beri Ancak, karaciğer haciz tahlil farklı olarak, bu yöntem belirli bir okuma autophagic etkinliği için sağlamaz (ise karaciğer haciz yalnızca autophagy sonucunda oluşur). Bu nedenle, bakımları düzenli olarak olması gerekli denetim sayısı dahil, Örneğin, kimyasal inhibitörleri lizozomal autophagic veya proteasomal bozulması ve genetik müdahale autophagy3,16.

Karaciğer haciz tahlil yokluğu veya inhibitörleri (Baf çoğu lizozomal LC3 bozulması varlığı western Blot ya da LC3 puncta oluşumu tarafından floresans görüntüleme tarafından LC3-II düzeyleri ölçmek yaygın olarak kullanılan LC3 akı deneyleri ile karşılaştırıldığında sık kullanılan), veya asidik ortamlarda22fluorescently etiketli LC3 versiyonlarının geçiş. Ne kadar bu LC3 tabanlı deneyleri yararlı bilgiler sağlayabilir, onlar yorumlamak, özellikle çünkü LC3 akı derecesini ve miktarı ve türü kargo akı arasındaki ilişki bilinmiyor zor olabilir. Giriş bölümünde de belirtildiği gibi toplu autophagy ve Parkin bağımlı mitophagy LC3 aile proteinler9,10,11,44gerekmez. Ayrıca, yıldız sıçan hepatosit karaciğer tutma ve yıkımı gelirleri kesintisiz zaman dilimlerinde olduğu yerde Hayır autophagic lizozomal LC3 akı9. Böylece, bu durumda, kargo akı tamamen LC3 akı ayrılmış olabilir. Daha fazla araştırma LC3 akı kargo akı farklı tür karşılaştırma daha iyi LC3 akı deneyleri ile elde edilen sonuçlar yorumlamak için gereklidir.

Mevcut haliyle, karaciğer haciz tahlil gerekli uygulamalı zaman ve maliyet açısından Batı kurutma için karşılaştırılabilir olduğunu. Toplu autophagy ölçme, açısından en az raffinose tabanlı haciz tahlil olarak verimli veya uzun ömürlü protein yıkımı tahlil yukarıda açıklanan. Toplu autophagic haciz faaliyet belirli ölçüm ve kapalı autophagosomes oluşumu için bu ikinci deneyleri çok daha verimli ve düz ileri LC3 akı deneyleri veya proteaz koruma deneyleri reseptörlerinin, LC3 veya autophagy daha gerçek kargo yerine sepeti bileşenleri ölçmek. Biz önemli ölçüde karaciğer haciz tahlil throughput geliştirilmiş olsa bile, bir yüksek-den geçerek tahlil çok uzak olduğunu ve yukarıda açıklanan resim tabanlı deneyleri verimlilik ile rekabet edemez. Ancak, görüntü tabanlı deneyleri ve karaciğer haciz tahlil avantaj ve dezavantajları var ve böylece her iki tip deneyleri kendi değerlerine sahip. Karaciğer haciz tahlil yarı yüksek-geçiş yapmak için gelecek ayarlamaları ile büyük olasılıkla mümkündür. Örneğin, electrodisruption bir 96-iyi biçimde gerçekleştirmek mümkün olmalıdır ve bu sitozolik karaciğer münzevi karaciğer Santrifüjü yerine filtrasyon sayesinde ayrilmis veya Santrifüjü adım 96 - gerçekleştirilebileceğini akla yatkın iyi biçim. Ayrıca, geçerli protokol kullanılandan çok daha duyarlı olan karaciğer etkinliği ölçmek için deneyleri geliştirilmiştir ve ticari olarak kullanılabilir. Diğer ilginç gelecek potansiyelleri testin diğer hücre tipleri memeli hücrelerinde, örneğin Maya veya diğer tek hücreli organizmalar daha onun sözde kullanılmaktadır veya kullanımı için in vivo ölçümleri autophagic yanı sıra hatta bitki hücreleri Deneysel organizmalar dokuların haciz faaliyetleri.

Sonuç olarak, karaciğer haciz tahlil canlandı ve gelişmiş haliyle gelecekteki autophagy ilgili araştırmada önemli bir araç olacağına inanıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Bu eser mali Araştırma Konseyi Norveç, Oslo Üniversitesi, Anders Jahre Vakfı, Nansen Vakfı ve Henrik Homan anısına mirası tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Noboru Mizushima ATG5 için teşekkür ederim +/ + MEFs ve ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu ATG7 için +/ + MEFs ve ATG7/MEFs ve Dr. Shizuo Akira ATG9A için +/ + MEFs ve ATG9A/MEFs. Biz Frank Sætre teknik yardım ve Dr başına O. Seglen için yapıcı metodolojik tartışmalar için teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL and 2 mL microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µL, 13.3 cm x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 min, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µL) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µL) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1,000 µL) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/mL stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46, (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591, (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166, (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264, (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151, (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19, (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333, (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111, (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19, (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9, (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510, (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10, (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282, (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432, (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169, (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142, (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20, (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281, (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23, (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7, (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258, (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18, (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270, (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162, (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8, (9), e2836 (2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123, (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95, (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85, (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12, (2), 1-3 (2016).
Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).More

Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter