Summary
Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.
Abstract
Bevoegdheid van de vector is gedefinieerd als het potentieel van een mug soort te zenden een muggen overgebrachte virus (mobovirus) naar een gewervelde host. Levensvatbare virusdeeltjes worden verzonden tijdens een maaltijd van bloed via het speeksel van een besmette mug. Gedwongen speekselvloed testen laten bepalen de vectorpotentiaal op basis van één muggen, het vermijden van het gebruik van dierproeven. De methode is geschikt voor het analyseren van een groot aantal muggen in één experiment binnen een korte periode van tijd. Gedwongen speekselvloed assays werden gebruikt voor het analyseren van 856 individuele muggen gevangen in Duitsland, waaronder twee verschillende Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium evenals Aedes albopictus, die experimenteel besmet waren met Zika-virus (ZIKV) en bebroede bij 18 ° C of 27 ° C gedurende twee tot drie weken. De resultaten aangegeven vector bevoegdheid van de verschillende Culex taxa voor ZIKV. Aedes albopictus werd daarentegen gevoelig voor ZIKV, maar alleen bij 27 ° C, met transmissiesnelheden vergelijkbaar met een kolonie van Aedes aegypti laboratorium getest in parallel.
Introduction
In 2015, Zika-virus (ZIKV), een muggen overgebrachte virus (mobovirus) behoort tot de familie Flavivirus, ontstaan in Columbia en Brazilië en snel verspreid over Amerika en het Caribisch gebied, waardoor er een epidemie met bekende nummers van geassocieerde klinische gevallen van microcefalie en Guillain-Barré syndroom1. Muggen van de soort Aedes aegypti en Aedes albopictus worden beschouwd als de primaire en secundaire vectoren van ZIKV2, maar andere soorten van het geslacht Aedes hebben ook bewezen experimentele vector bevoegd3 . In tegenstelling tot de Aedes -soorten zijn de meeste van de Culex soorten getest tot nu toe niet kundig voor zenden de virus4. De gegevens voor Culex quinquefasciatus verstrekt slechts, twijfelachtige resultaten3. Op dit moment ontbreekt informatie over mosquito vector bevoegdheid voor ZIKV onder gematigde temperatuursomstandigheden (< 20 ° C). Deze informatie is echter aanzienlijk voor de risico-evaluatie van mogelijke uitspreidt aan regio's met een gematigd klimaat zoals Midden-Europa.
Een bevoegde vector voor de ZIKV staat te verwerven, te handhaven, te versterken en ten slotte het doorgeven van het virus. Daarom, het testen van de mosquito kadavers of delen van de organen, met inbegrip van de benen, middendarm, head of speekselklieren, voor ZIKV is niet volstaat het te bepalen van de bevoegdheid van de vector. Het is verplicht om te testen voor besmettelijke virusdeeltjes binnen vrijgegeven speeksel. Om te beoordelen vector bevoegdheid, zowel besmettingstarief (IR, aantal ZIKV-positieve mug instanties per aantal overvuld muggen) en transmissiesnelheid (TR), aantal muggen met ZIKV-positieve speeksel per aantal ZIKV-positieve mug organen, moet worden bepaald. IRs van muggen kan gemakkelijk worden geanalyseerd door gewoon homogenisator muggen, gevolgd door een reverse-transcriptase real-time polymerasekettingreactie (RT-qPCR) gericht op ZIKV. Bovendien kan de infectie verder worden gekarakteriseerd door het bepalen van de aantallen van de virale kopie per mug. In tegenstelling, berust de analyse van transmissiesnelheden op de detectie van levensvatbare virusdeeltjes in het speeksel van individuele muggen. Dit kan worden bereikt door het eten van besmette muggen op gastheer voor de ziekte vatbare dieren, gevolgd door de analyse van de voorjaarsviremie in de host-5. Echter deze methode berust op geschikt modelorganismen, en is duur en beperkt door dierenwelzijn verordeningen. Om te voorkomen dat het gebruik van proefdieren voor het analyseren van transmissiesnelheden en kosten te verlagen, met behulp van druppels zijn bloed op kunstmatige opnieuw voedersystemen6zijn beschreven. Testen op individuele schaal gecombineerd met een groot aantal personen is echter moeilijk en tijdrovend. De eerste beschrijving van een bepaling van de speekselvloed op individuele schaal werd gepubliceerd in 19667 en tijdens de afgelopen jaren gedwongen speekselvloed experimenten zijn geworden de methode van keuze voor de evaluatie van de bevoegdheid van de vector van muggen3,8 .
Gebaseerd op onze vector bevoegdheid studie van Centraal-Europese muggen onlangs gepubliceerd9, zoals gerapporteerd door Anderson et al.beschrijven we gedwongen speekselvloed. 8 met enkele wijzigingen. Met deze methode kunt hoge doorvoer gestandaardiseerd experimenten onder hoge bioveiligheid niveau voorwaarden (BSL-3) en omvat de identificatie van actieve virus door cel cultuur gebaseerd testen. De hier beschreven experimenten omvatten 856 muggen. Ze waren geïnfecteerd met ZIKV door kunstmatige bloedmeel en vervolgens geanalyseerd voor de aanwezigheid van besmettelijke virusdeeltjes in het speeksel. De muggen die de experimenten bestond uit twee reeds lang bestaande laboratorium populaties van Ae. aegypti en Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus), evenals veld binnengebracht gevangen Culex pipiens pipiens pipiens biotype (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) en twee Ae. albopictus populaties. Met uitzondering van één van de twee Ae. albopictus populaties, die werd verzameld in Italië, waren alle muggen verzamelde in Duitsland.
Protocol
1. Prepareer vrouwelijke muggen
- Verzamelen muggen uit een grote kooi met behulp van een aspirator (ongeveer 400 muggen per grote kooi).
- Anesthetize de muggen met kooldioxide (CO2) voor 7 s.
- Sorteren van 20 vrouwen per plastic flesje (Ø 50 mm × 100 mm).
Opmerking: Als de muggen wakker worden, gebruik een andere 3 s van CO2. - Verhongeren de muggen 's nachts.
2. kunstmatige bloedmeel
Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd onder BSL-3-omstandigheden.
-
De besmettelijke bloed-maaltijd te bereiden.
- Verdun de virus voorraad de concentratie van 1 x 108 plaque vorming van eenheden (PFU) / mL.
Opmerking: De voorraad concentratie werd bepaald door het uitvoeren van weefselkweek infectiemethode dosis 50 (TCID50) en berekend door de Spearman & Kärber algoritme10,11. - Mix verlopen menselijk bloed (bloed behoud) van de bloedbank (niet geschikt voor menselijke meer, maar nuttig voor muggen) met fructose (8%-oplossing), gefiltreerd runderserum (FBS) en werkende oplossing voor het virus voorraad (menselijk bloed: fructose: FBS verlopen: werkoplossing = 5:3:1:1).
Opmerking: We kozen voor van menselijk bloed, omdat dit de bekende natuurlijke zoogdier gastheer van ZIKV is.
- Verdun de virus voorraad de concentratie van 1 x 108 plaque vorming van eenheden (PFU) / mL.
- 140 µL van bloedmeel mix voor verdere analyse via TCID50 bevriezen.
-
Uitvoeren van kunstmatige voeding met behulp van verschillende voeding methoden, afhankelijk van de soort:
- Aedes aegypti: gebruik van een membraan voersysteem voor 30 min (1 mL per feeder).
- Culex spp.: bieden het besmettelijke bloed via een katoen stick's nachts en doen niet opwarmen van het bloed (300 µL per flacon).
-
Aedes albopictus: Zet twee druppels (van elk 50 µL) van de mix van bloedmeel in het plastic flesje en laten de muggen feed voor 2 h. Niet het bloed opwarmen.
Opmerking: Muggen worden meegenomen in de eerste 15 min. De verlengde incubatietijd is nodig vanwege veiligheidsredenen. De druppels bloed worden bevloeid na 2 h, dat dus de kans op besmetting is verminderd tijdens het sorteren van gevoed muggen.
- Anesthetize de muggen met CO2 voor 7 s.
Opmerking: Als de muggen wakker worden, gebruik een andere 3 s van CO2. - Sorteren en tellen volledig overvuld muggen in een nieuwe flacon.
- Voeg een wattenschijfje, verzadigd met fructose (8%-oplossing) tussen de flacon en een stekker.
- Houden de muggen op de aangewezen temperatuur van 18 ° C of 27 ° C in de vochtigheid van 80% voor 14 of 21 dagen.
- Feed de muggen met fructose-verzadigd katoen kussentjes. Vullen elke 72 h met 1,5 mL fructose (8%-oplossing) per flacon (tot 20 muggen, afhankelijk van de voeding tarief, zie stap 2.5).
3. gedwongen speekselvloed Assay op dag 14 of 21
Opmerking: Alle stappen zijn uitgevoerd onder BSL-3-omstandigheden.
- Zaad van 2 x 104 Vero-cellen / per putje in een 96 goed plaat met 200 µL van groeimedium (Dulbecco´s bewerkt eagle medium (DMEM), aangevuld met 3% FBS 100 U/mL penicilline, 100 mg/mL streptomycine, 5 µg/mL amfotericine B, 2 mM L-glutamine 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% natrium pyruvaat).
-
Bereiden de speekselvloed apparaat:
- Plaats een kwadraat glasplaat (20 × 20 cm) op de Bank in een hoek van 30°.
Opmerking: Dit is nodig vanwege de onderdruk in het lab van de veiligheid. Als de plaat horizontaal of verticaal is, zal de vloeistof lekken. - Dubbele dubbelzijdig plakband op de top van de glasplaat te plaatsen.
- Rol de klei van de modellering totdat hij bereikt een diameter van 0,5 cm en voeg het horizontaal 1 cm afstand van de dubbelzijdige plakband.
- De eerste 0.3 cm van het puntje van een 10 µL filter tip afgesneden.
Opmerking: Het is aangeraden om dit voor te bereiden voordat het experiment buiten het biosafety-laboratorium. - Vul de filter tips met 10 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4).
- Plaats de filter tips op de modellering klei met de tip naar de plakband.
- Beveilig de filter tips met zachte druk.
- Plaats een kwadraat glasplaat (20 × 20 cm) op de Bank in een hoek van 30°.
-
De muggen te bereiden:
- Anesthetize de muggen met CO2.
- Verwijder de poten en vleugels te immobiliseren van de muggen.
- Fix de mug levende lichamen op de plakband boven een filter tip.
- Plaats de snuit voorzichtig in de filter-tip.
- Voer de speekselvloed assay voor 30 min.
- Verwijder de filter tips en negeren de klei en tape.
4. verwerking van speeksel
Opmerking: De stappen 4.1-4.6.2 zijn uitgevoerd onder BSL-3 voorwaarden.
- Het verdrijven van de inhoud in de buizen van de reactie met 10 µL van PBS.
- Meng voorzichtig en breng de inhoud in de putjes van de bereid 96 goed plaat met behulp van een goed per monster.
- Incubeer de plaat gedurende 7 dagen bij 37 ° C met 5% CO2.
- Gebruik de verrekijker om te controleren de cellen voor de aanwezigheid van cytopathogeen effect (CPE).
- Als het goed positief voor CPE is, oogst het supernatant door pipetting 140 µL in een reactiebuis voor RNA extractie.
-
Het RNA zuiveren met behulp van een RNA extractie kit.
- Mix-140 µL van het supernatans dat met 560 µL van AVL buffer (virale lysis-buffermengsel) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 560 µL van ethanol (96%) en vortex het monster.
Opmerking: De monsters zijn geïnactiveerd na deze stap en kunnen worden afgevoerd uit het laboratorium van BSL-3. - Pipetteer 630 µL van het monster op een kolom en centrifuge met 6.000 x g voor 1 min.
- Negeren van het filtraat, Pipetteer de resterende 630 µL op de kolom en herhaal het centrifugeren.
- Wassen van RNA, gebonden aan het membraan van de kolom, door toevoeging van 500 µL van het wassen van de buffer 1 aan de kolom en de centrifuge bij 6.000 x g gedurende 1 minuut.
- Negeren van de collectie buis en de plaats van de kolom in een nieuwe collectie buis. Voeg 500 µL wassen buffer 2 en centrifuge op 12.500 x g gedurende 3 minuten.
- Negeren van de collectie buis en plaats van de kolom in een 1,5 mL reactiebuis.
- Voeg 50 µL van elutie buffer en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer bij 6.000 x g voor 1 min en vervolgens negeren van de kolom.
- Analyseer de monsters voor ZIKV RNA via RT-qPCR.
5. de verwerking van Mosquito organen
Opmerking: De stappen 5.1-5.5 worden uitgevoerd onder BSL-3-omstandigheden.
- Verwijderen van de organen van de mug en leg elk orgaan in een reactiebuis.
Opmerking: Het is mogelijk om het experiment op dit punt onderbreken en opslaan van de monsters bij-80 ° C. - Voeg 500 µL van homogenisering media (DMEM zonder enige supplementals) in de reactiebuis.
- Meng het lichaam met behulp van motor handmixer en een nieuwe stamper gebruiken voor elk monster.
- Voeg 200 µL van het homogenaat in een 96-well-plate voor zuivering.
Opmerking: Het is mogelijk om het experiment op dit punt onderbreken en opslaan van de monsters bij-80 ° C. - Inactivering van de plaat door incubatie gedurende 60 minuten op 60 ° C.
- Het zuiveren van het RNA door geautomatiseerde nucleïnezuur zuivering.
Opmerking: Het is mogelijk om het experiment op dit punt onderbreken en opslaan van de monsters bij-80 ° C.
6. analyse
- Kwantificeren van de virale RNA exemplaren met behulp van RT-qPCR.
Opmerking: De RNA-kopieën werden gemiddeld over alle ZIKV-positieve mug lichaam en exclusief de muggen ZIKV-negatief. - Bereken de IR, gedefinieerd als het aantal ZIKV-positieve mug instanties per aantal gevoed vrouwtjes.
- Bereken de TR, gedefinieerd als het aantal muggen met ZIKV-positieve speeksel per aantal ZIKV-positieve mug organen. De transmissiesnelheid kon niet worden berekend voor soorten-temperatuur combinaties met geen ZIKV-positieve lichamen.
Representative Results
Aedes aegypti staat bekend als een bevoegde vector voor ZIKV ten minste onder tropische weersomstandigheden12. Dus, we gebruikten aegypti Ae. als positieve controle om de bepaling en voor het analyseren van de IRs evenals TRs bij een incubatietemperatuur van 27 ° C en een vochtigheid van 80%. IR en TR werden gedefinieerd zoals eerder beschreven door Fortuna et al. 13. Challenged Ae. aegypti toonde IR van 50 tot 72% en TR van 42% en 31% 14 tot 21 dagen na de infectie (dpi), respectievelijk (figuur 1A en 1B). Vervolgens werden Europese muggen getest ZIKV infectie en transmissie met behulp van tropische en gematigde klimatologische omstandigheden.
Bij 27 ° C incubatietemperatuur, alle soorten van de mug toonde ZIKV infectie op 14 dpi, alsmede 21 dpi, behalve Cx. p. pipiens en Cx. torrentium mensen, die positief op 14 dpi alleen waren. Alle soorten van Aedes bleek hoger IRs (tussen 50% en 72%) en hogere virale RNA-concentratie (106 tot 109 RNA kopieën/mug exemplaren) in vergelijking met de verschillende Culex taxa, geopenbaard die IRs variërend tussen 0 % en 32% en virale ladingen van 103 tot 104 RNA kopieën/mug specimens. Alle soorten van Aedes weergegeven ZIKV-positieve speeksel (TR 13 – 42%), dat geen van de speeksel monsters uit de Culex taxa ZIKV (figuur 1A en 1B opgenomen). Interessant, transmissiesnelheden op 21 dpi waren qua Ae. aegypti en Ae. albopictus uit Duitsland (30%), maar waren aanzienlijk lager in Ae. albopictus uit Italië (13%).
Incubatie van uitgedaagd muggen bij een gematigde temperatuur van 18 ° C bleek over het algemeen lagere virus ladingen in de Aedes -soorten (104–106 RNA kopieën/mug) alsook in de verschillende Culex taxa (102-104 RNA kopieën/mug). Echter op 18 ° C incubatietemperatuur, werd transmissie van ZIKV niet waargenomen voor elk van de soorten van de mug onderzocht.
Figuur 1: transmissiesnelheden van muggen experimenteel geïnfecteerd met ZIKV. Resultaten van vector bevoegdheid onderzoeken met ZIKV bij verschillende mug diersoorten. Zes verschillende mug taxa waren besmet met ZIKV en geïncubeerd bij 27 ° C of 18 ° C gedurende 14 (A) of (B) de laatste 21 dagen. TR wordt gedefinieerd als het aantal muggen met ZIKV-positieve speeksel per aantal ZIKV-positieve mug organen. Het totale aantal muggen onderzocht was 856, met een minimum van 30 personen voor elke tijd punt/temperatuur/mug taxa. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Het is eerder aangetoond dat de resultaten verkregen met gedwongen speekselvloed klassieke opnieuw voeding experimenten6stroken. Voor opnieuw het voederen van experimenten zowel in onze voorgestelde methode van gedwongen speekselvloed, is het echter onmogelijk om direct bewijs speekselvloed activiteit of controleren de release van speeksel. Om te bewijzen speekselvloed activiteit, monsters kunnen worden getest, andere onderdelen aanwezig in het speeksel (bv., eiwitten, koolhydraten, enz.). Bovendien zou de extra qPCRs detectie van virale RNA exemplaren. Dit vereist echter splitsing van speeksel monsters voor diverse analyses, die gevoeligheid in de cel cultuur bepaling in geval van zeer lage deeltje nummers kunnen beperken. Beurtelings, kan dit leiden tot een onderschatting van de vastberaden transmissiesnelheden.
Reproduceerbare resultaten is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat alle muggen leven tot het einde van het experiment blijven. Dit wordt geregeld door visueel bewakingsactiviteit het lichaam beweging van de muggen. Bovendien heeft het gebruik van het beginsel van de speekselvloed assay voor een bepaalde mug soort te worden getest door het voeren van bestrijding virussen, waarvan bekend is dat door deze specifieke mug soort toegezonden. Omgekeerd, moet elke virus binnengebracht van een experiment worden getest in een gevoelig mug.
Gedwongen speekselvloed testen hebben veel voordelen. Groot aantal muggen kan gelijktijdig worden getest op een enkel exemplaar basis onder gecontroleerde gestandaardiseerde omstandigheden zonder conflict met het welzijn van dieren verordeningen9.
De methode wordt gebruikt door verschillende laboratoria. Exacte opstellingen kunnen echter verschillen, die kan leiden tot verschillen in resultaten tussen laboratoria. Een kritische component is het capillair te verzamelen van het speeksel, die kan worden gemaakt van glas14 of kunststof15. Om te voldoen aan de hoge veiligheidsnormen van een bioveiligheid niveau 3 insectary, gebruikten we plastic filter tips in plaats van glas haarvaten, waardoor het risico van letsel. Filter tips hebben bovendien het voordeel dat de verzamelde vloeistof gemakkelijk kan worden overgedragen met behulp van een precisiepipet.
De installatie van de bepaling van de gedwongen speekselvloed hier gepresenteerd is gebaseerd op twee onderzoekers samenwerken en het delen van taken. Demobilisatie van de mug wordt uitgevoerd door één persoon, terwijl anderzijds tegelijkertijd de gedwongen speekselvloed setup bereidt. Dit aanzienlijk vermindert de verwerkingstijd en minimaliseert het risico van monster schakelen als het veranderen tussen de demobilisatie-werkplek en de speekselvloed-plaat is niet nodig. Bovendien kan het plaatsen van de muggen op het gedwongen speekselvloed apparaat onmiddellijk na demobilisatie. Dit vrij kort mug verwerkingstijd is essentieel voor succesvolle gedwongen speekselvloed. Tot slot, de muggen kunnen rechtstreeks worden gecontroleerd voor motiliteit gedurende het hele experiment.
De bepaling van de speekselvloed gepresenteerde wordt inzichten te krijgen in de vectorpotentiaal mug soorten gebruikt. Echter sommige andere specifieke vragen te beantwoorden (bv., de nummers van muggenbeten die nodig zijn om te besmetten gewervelden), dierlijke experimenten kunnen nog steeds worden vereist.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Ella Weinert, Michelle Helms en Marlis Badusche voor uitstekende technische bijstand, Jessica Börstler voor analyse van muggen Culex , Norbert Becker en Björn Pluskota voor het verstrekken van Aedes albopictus eieren en Olli Vapalahti voor het verstrekken van de voorraad van het virus. ML werd ondersteund door de vereniging van Leibniz; verlenen nummer SAW-2014-SGN-3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
| Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
| Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
| Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
| Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
| Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
| Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
| Vero cells | BNITM | ||
| Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
| double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
| Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
| RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
| MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
| Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
| filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
| hand motor mixer | carl roth | sold out | |
| micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
| DMEM | P0403550 | ||
| L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
| Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
| Fructose | carl roth | 4981.5 | |
| Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
| FBS | PAN | ||
| Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
| MEM NAA | PAN | P0832100 | |
| Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
| Light Cycler | Roche | 480 II | |
| Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
| Modeling clay | no specific provider | ||
| King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
| Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
| Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
| Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
| CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |
References
- Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).
- World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from: http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region (2016).
- Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933 (2017).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus. Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).
- Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus. Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).
- Cornel, A. J., Jupp, P. G. Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses. Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).
- Hurlbut, H. S. Mosquito salivation and virus transmission. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).
- Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes. Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).
- Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe. Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).
- Hierholzer, J. C., Killington, R. A. Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. , (1996).
- Horzinek, R. W., Marian, C. Kompendium der allgemeinen Virologie. Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480 (2010).
- Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).
- Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus. Parasites & Vectors. 8, 463 (2015).
- Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. Turell, M. J. 10 (10), (2016).
- Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection. PLOS ONE. 4 (6), e5895 (2009).
