Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

أجبر اللعاب كأسلوب لتحليل اختصاص البعوض ناقل

doi: 10.3791/57980 Published: August 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

لكفاءة السيطرة على البعوض يوضع انتقال الفيروس، المعرفة بإمكانيات مكافحة ناقلات البعوض الحامل لكل منها أهمية خاصة. يصف لنا اللعاب القسري كوسيلة لتحليل المتجهات اختصاص Aedes albopictus وثلاثة من الأصناف Culex مختلفة لانتقال الفيروس Zika.

Abstract

ويعرف اختصاص ناقلات إمكانات الأنواع البعوض أحيل فيروسات المنقولة بالبعوض (موبوفيروس) إلى مضيف فقاريات. وتحال جزيئات الفيروس قابلة للتطبيق خلال وجبة الدم عن طريق اللعاب من بعوضة مصابة. فحوصات اللعاب القسري السماح بتحديد الإمكانات ناقلات الأمراض على أساس واحد البعوض، تجنب استخدام التجارب على الحيوانات. الأسلوب مناسبة لتحليل عدد كبير من البعوض في تجربة واحدة ضمن فترة قصيرة من الوقت. واستخدمت فحوصات اللعاب القسري لتحليل البعوض الفردية 856 محاصرين في ألمانيا، بما في ذلك اثنان مختلفة المتعايشة Culex pipiens pipiens ، Culex تورينتيوم ، فضلا عن Aedes albopictus، التي كانت مصابة تجريبيا فيروس زكى (زيكف) والمحتضنة في 18 درجة مئوية أو 27 درجة مئوية لاثنين وثلاثة أسابيع. وبينت النتائج عدم وجود اختصاص متجه للأصناف Culex مختلفة زيكف. وفي المقابل، Aedes albopictus كان عرضه زيكف، ولكن فقط في 27 درجة مئوية، مع معدلات انتقال مماثلة إلى مستعمرة مختبر بعوض الزاعجة المصرية اختبارها في نفس الوقت.

Introduction

في عام 2015، Zika الفيروسات (زيكف)، ترتبط فيروسات المنقولة بالبعوض (موبوفيروس) لعائلة فيروسات مصفرة، ظهرت في كولومبيا، والبرازيل، وانتشر بسرعة عبر الأمريكتين ومنطقة البحر الكاريبي، مما تسبب في حدوث وباء مع عدد ملحوظ الحالات السريرية لصغر الرأس و متلازمة غيان – باريه1. تعتبر البعوض هذه الأنواع بعوض الزاعجة المصرية Aedes albopictus ناقلات الابتدائية والثانوية من زيكف2، ولكن الأنواع الأخرى من جنس بعوض ثبت أيضا أن يكون ناقل التجريبية اختصاص3 . على عكس الأنواع بعوضة ، ومعظم الأنواع Culex اختبارها حتى الآن ليست قادرة على نقل الفيروس4. مجرد، قدمت بيانات Culex quinquefasciatus 3من النتائج غير حاسمة. وفي الوقت الحاضر، هناك نقص في المعلومات اختصاص البعوض ناقل زيكف تحت ظروف الحرارة المعتدلة (< 20 درجة مئوية). ومع ذلك، هذه المعلومات جوهرية لتقييمات المخاطر الحيزات الممكنة إلى المناطق ذات المناخ المعتدل مثل أوروبا الوسطى.

ناقل مختصة زيكف غير قادرة على الحصول على والحفاظ على، وتضخيم وأخيراً نقل الفيروس. ولذلك، اختبار هيئات البعوض أو أجزاء من الجثث، بما في ذلك الساقين، أو الأمامي أو الرأس أو الغدد اللعابية، زيكف لا يكفي لتحديد اختصاص متجه. وملزمة لاختبار لجزيئات الفيروسات المعدية داخل اللعاب المفرج عنهم. لتقييم كفاءة ناقل، معدل الإصابة (الأشعة تحت الحمراء، وعدد من الهيئات البعوض زيكف الإيجابية الواحدة عدد من البعوض محتقن) ومعدل انتقال (TR، عدد من البعوض مع اللعاب زيكف الإيجابية الواحدة وعدد من الهيئات البعوض زيكف الإيجابية)، يجب أن تكون العزم. يمكن تحليل IRs للبعوض بسهولة عن طريق البعوض ببساطة المتجانس متبوعاً عكس المنتسخة في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-qPCR) استهداف زيكف. وعلاوة على ذلك، يمكن وصف العدوى كذلك بتحديد أرقام نسخ الفيروسية كل البعوض. وفي المقابل، تحليل معدلات انتقال يعتمد على الكشف عن جزيئات الفيروس قابلة للتطبيق في لعاب البعوض الفردية. يمكن تحقيق هذا عن طريق تغذية البعوض المصابة في الحيوانات المضيفة عرضه، يليها تحليل فريميا في المضيف5. ومع ذلك، هذا الأسلوب يعتمد على الكائنات نموذج مناسب، ومكلف ومقيد باللوائح الرفق بالحيوان. لتجنب استخدام الحيوانات المختبرية لتحليل معدلات انتقال العدوى وتخفيض التكاليف، مصطنعة إعادة تغذية نظم استخدام الدم قطرات قد وصف6. ومع ذلك، اختبار مقياس الفردية جنبا إلى جنب مع عدد كبير من الأفراد صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً. وصف أولاً فحص اللعاب على مقياس فردية ونشر في عام 19667 وخلال السنوات الأخيرة، أصبحت تجارب اللعاب القسري الأسلوب المفضل تقييم كفاءة ناقل من البعوض3،8 .

بناء على دراستنا اختصاص متجهة من "أوروبا الوسطى" البعوض نشرت مؤخرا9، ويصف لنا اللعاب القسري كما أفاد أندرسون وآخرون. 8 مع بعض التعديلات. يسمح هذا الأسلوب ارتفاع إنتاجية موحدة التجارب تحت شروط السلامة العالية المستوى (BSL-3)، ويتضمن تحديد الفيروس النشط بخلية الثقافة على أساس فحوصات. وتشمل التجارب الموضحة هنا 856 البعوض. وكانوا مصابين زيكف في وجبة الدم الاصطناعي وتحليلها في وقت لاحق لوجود جزيئات الفيروسات المعدية في اللعاب. اشتعلت البعوض أدخلت الشعبين تجارب شملت المختبرات عريقة Ae. مصرية و Culex pipiens بيبينس بيوتيبي موليستوس (Cx. ص موليستوس)، فضلا عن ميدان Culex بيبينس بيبينس بيوتيبي بيبينس (Cx. pipiens ص) و Culex تورينتيوم (Cx. تورينتيوم) وهما عبد اللطيف-البوبيكتوس السكان. استثناء واحد للسكان Ae. البوبيكتوس اثنين، والتي تم جمعها في إيطاليا، جمعت جميع البعوض في ألمانيا.

Protocol

1. إعداد البعوض الإناث

  1. جمع البعوض من قفص كبير باستخدام المضخة (حوالي 400 البعوض في قفص كبير).
  2. تخدير البعوض مع ثاني أكسيد الكربون (CO2) 7 s.
  3. فرز الإناث 20 كل قنينة بلاستيكية (Ø 50 مم × 100 مم).
    ملاحظة: إذا استيقظ البعوض، تستخدم آخر 3 s شركة2-
  4. تجويع البعوض بين عشية وضحاها.

2-الاصطناعية الدم وجبة

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في ظروف BSL-3.

  1. إعداد وجبة الدم المعدية.
    1. تمييع مخزون الفيروس بتركيز 1 × 108 البلاك تشكيل وحدات (بفو)/مل.
      ملاحظة: تحدد عن طريق إجراء زراعة الأنسجة طريقة الجرعة 50 العدوى (TCID50) تركيز المخزون وحساب بواسطة سبيرمان & Kärber10،خوارزمية11.
    2. انتهت مزيج الدم البشري (الحفاظ على الدم) من بنك الدم (غير مناسب للبشرية بعد الآن، لكن من المفيد للبعوض) مع سكر (الحل 8%)، فيلتراتيد المصل البقري (FBS) وحل عملي من مخزون فيروس (انتهت البشرية الدم: الفركتوز: FBS: حل العامل = 5:3:1:1).
      ملاحظة: لقد اخترنا الدم البشري، لأن هذا هو المضيف الثدييات الطبيعية المعروفة من زيكف.
  2. تجميد ميليلتر 140 من مزيج وجبة الدم لمزيد من التحليل عن طريق TCID50.
  3. تؤدي التغذية الاصطناعية باستخدام أساليب التغذية المختلفة، اعتماداً على هذه الأنواع:
    1. بعوض الزاعجة المصرية: استخدم غشاء تغذية النظام لمدة 30 دقيقة (1 مل في علبة التغذية بالورق).
    2. Culex spp.: توفير الدم المعدية عن طريق عصا القطن بين عشية وضحاها ولا الاحماء في الدم (300 ميليلتر للقنينة الواحدة).
    3. Aedes albopictus: وضع قطرات اثنين (50 ميليلتر في كل) من هذا المزيج وجبة الدم إلى القنينة البلاستيكية وترك البعوض تغذية ح 2. لا الاحماء في الدم.
      ملاحظة: سيتم تغذية البعوض في 15 دقيقة الأولى. فترة الحضانة طويلة ضروري نظراً لأسباب تتعلق بالسلامة. هي ينضب قطرات الدم بعد 2 ح، وبذلك يتم تقليل خطر التلوث أثناء الفرز من تغذية البعوض.
  4. تخدير البعوض مع CO2 7 s.
    ملاحظة: إذا استيقظ البعوض، استخدم 3 آخر ق من أول أكسيد الكربون2.
  5. الفرز والعد الكامل محتقن البعوض في قنينة جديدة.
  6. إضافة وسادة القطن، مشبعة بسكر (8% الحل) بين القنينة والمكونات.
  7. تبقى البعوض في مكان مخصص درجة حرارة 18 درجة مئوية أو 27 درجة مئوية في درجة الرطوبة % 80 لمدة 14 أو 21 يوما.
  8. تغذية البعوض مع منصات القطن المشبعة سكر. تجديد كل ح 72 مع 1.5 مل سكر (8% حل) كل قنينة (ما يصل إلى 20 من البعوض، اعتماداً على تغذية معدل، راجع الخطوة رقم 2، 5).

3-فرض فحص اللعاب في يوم 14 أو 21

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات في ظروف BSL-3.

  1. البذور 2 × 104 خلايا فيرو/كل بئر في 96 حسنا لوحة مع 200 ميليلتر من متوسط النمو (Dulbecco´s تعديل النسر المتوسطة (دميم) وتستكمل مع 3% FBS، 100 يو/مليلتر البنسلين، ستربتوميسين 100 ملغ/مل، 5 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب، 2 مم L-الجلوتامين ، 1% الأحماض الأمينية غير الأساسية (نيا)، بيروفات صوديوم 1%).
  2. تحضير جهاز اللعاب:
    1. ضع لوحة زجاج التربيعية (20 × 20 سم) على مقاعد البدلاء في زاوية 30 درجة.
      ملاحظة: وهذا ضروري نظراً أونديربريسوري في مختبر السلامة. إذا كانت اللوحة الأفقي أو الرأسي، وسوف تسرب السائل.
    2. وضع شريط لاصق الوجهين مزدوجة على رأس اللوحة الزجاجية.
    3. دور الطين النمذجة حتى يبلغ قطره 0.5 سم ونعلق عليه أفقياً 1 سم بعيداً عن الشريط اللاصق على الوجهين.
    4. قطع سم 0.3 أول من غيض من تلميح تصفية 10 ميليلتر.
      ملاحظة: ينصح بتحضير هذا قبل البدء بالتجربة خارج المختبر السلامة الأحيائية.
    5. ملء نصائح تصفية مع 10 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4).
    6. نصائح مكان عامل التصفية في الطين النمذجة مع التلميح نحو الأشرطة اللاصقة.
    7. تأمين النصائح عامل التصفية مع ضغط لطيف.
  3. إعداد البعوض:
    1. تخدير البعوض مع CO2.
    2. إزالة الساقين وأجنحة لشل البعوض.
    3. إصلاح الهيئات البعوض الحية على الشريط مثبت أعلاه معلومات عامل تصفية.
    4. مكان ململه بلطف إلى الفلتر.
    5. قم بتشغيل فحص اللعاب لمدة 30 دقيقة.
    6. إزالة نصائح التصفية وتجاهل الطين والشريط.

4-تجهيز اللعاب

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات 4.1 – 4.6.2 تحت ظروف BSL-3.

  1. طرد المحتويات في رد فعل أنابيب تحتوي على 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
  2. المزيج بلطف ونقل المحتوى إلى الآبار التي بليت جيدا 96 استعداد استخدام بئر واحدة كل عينة.
  3. احتضان اللوحة لمدة 7 أيام في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
  4. استخدام مجهر لفحص الخلايا لوجود تأثير سيتوباثيك (CPE).
  5. إذا كان البئر إيجابية بالنسبة للتعليم المهني المستمر، حصاد المادة طافية ميليلتر 140 بيبيتينج في أنبوب رد فعل لاستخراج الحمض النووي الريبي.
  6. تنقية الجيش الملكي النيبالي باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي.
    1. المخزن المؤقت (تحلل الفيروسية العازلة) ميليلتر 140 مزيج من المادة طافية مع ميليلتر 560 من التتبع الآلي واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة ميليلتر 560 من الإيثانول (96 في المائة) ودوامه العينة.
      ملاحظة: يتم إلغاء تنشيطه بعد هذه الخطوة العينات ويمكن تفريغها من المختبر BSL-3.
    3. بيبيت 630 ميليلتر العينة على العمود، وأجهزة الطرد المركزي مع 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
    4. تجاهل فيلتراتي، بيبيت ميليلتر 630 المتبقية على العمود وكرر الطرد المركزي.
    5. أغسل الجيش الملكي النيبالي، ملزمة للغشاء للعمود، بإضافة 500 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت 1 إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في س 6,000 ز لمدة 1 دقيقة.
    6. تجاهل أنبوب جمع ووضع العمود في أنبوب مجموعة جديدة. إضافة 500 ميليلتر الغسيل العازلة 2 وأجهزة الطرد المركزي في س 12,500 ز لمدة 3 دقائق.
    7. تجاهل أنبوب جمع ووضع العمود في أنبوب رد فعل 1.5 مل.
    8. إضافة 50 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    9. الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 1 دقيقة وثم تجاهل العمود.
  7. تحليل العينات "الحمض النووي الريبي زيكف" عبر RT-قبكر.

5-تجهيز هيئات البعوض

ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات 5.1 – 5.5 تحت ظروف BSL-3.

  1. إزالة جثث البعوض ووضع كل هيئة في أنبوب رد فعل.
    ملاحظة: من الممكن إيقاف التجربة في هذه المرحلة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية.
  2. إضافة 500 ميليلتر من تجانس وسائل الإعلام (دميم دون أي سوبليمينتالس) في أنبوب رد فعل.
  3. مجانسة نص باستخدام خلاط المحرك واستخدام المدقة جديدة لكل عينة.
  4. إضافة 200 ميليلتر من هوموجيناتي إلى 96-جيدا--لوحة لتنقية.
    ملاحظة: من الممكن إيقاف التجربة في هذه المرحلة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية.
  5. إلغاء تنشيط اللوحة بالحضانة لمدة 60 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
  6. تنقية الجيش الملكي النيبالي بتنقية الحمض النووي الآلي.
    ملاحظة: من الممكن إيقاف التجربة في هذه المرحلة وتخزين العينات في-80 درجة مئوية.

6-تحليل

  1. التحديد الكمي "نسخ الرنا الفيروسي" استخدام الرايت qPCR.
    ملاحظة: قد بلغ نسخ الحمض النووي الريبي عبر جميع الهيئات البعوض زيكف-إيجابية ودون بما في ذلك البعوض زيكف السلبية.
  2. حساب الأشعة تحت الحمراء، يعرف بأنه عدد الهيئات البعوض زيكف الإيجابية الواحدة وعدد الإناث بنك الاحتياطي الفيدرالي.
  3. حساب TR، يعرف بأنه عدد البعوض مع اللعاب زيكف الإيجابية الواحدة وعدد من الهيئات البعوض زيكف إيجابية. لا يمكن أن يكون حساب معدل انتقال لمجموعات الأنواع ذات درجة الحرارة مع أي هيئات زيكف إيجابية.

Representative Results

بعوض الزاعجة المصرية هو معروف كناقل مختصة زيكف على الأقل تحت الظروف المناخية المدارية12. ولذلك، استخدمنا Ae. مصرية كعنصر إيجابي لإنشاء الفحص وتحليل مصلحة الضرائب وكذلك TRs في درجة حرارة حضانة من 27 درجة مئوية ورطوبة 80%. تم تعريف الأشعة تحت الحمراء وار كما سبق وصف فورتونا وآخرون. 13-التحديات Ae. مصرية أظهرت الأشعة تحت الحمراء من 50% و 72% و TR من 42 في المائة و 31 في المائة في 14 و 21 يوما بعد العدوى (نقطة في البوصة)، على التوالي (الشكل 1A و 1B). وفي وقت لاحق، تم اختبار البعوض الأوروبية للإصابة زيكف ونقلها باستخدام الظروف المناخية المدارية، فضلا عن المناطق المعتدلة.

في درجة حرارة الحضانة 27 درجة مئوية، أظهرت جميع البعوض أنواع العدوى زيكف على 14 نقطة في البوصة، فضلا عن 21 نقطة في البوصة، باستثناء الأفراد Cx. pipiens ص و Cx. تورينتيوم ، التي كانت إيجابية على 14 نقطة في البوصة فقط. أظهرت جميع الأنواع بعوضة IRs أعلى (بين 50 في المائة و 72 في المائة) فضلا عن تركيز الجيش الملكي النيبالي الفيروسية أعلى (106 حتى 10 عينات البعوض نسخ/9 الجيش الملكي النيبالي) بالمقارنة مع الأصناف Culex المختلفة، التي كشفت عن مصلحة الضرائب التي تتراوح بين 0 % ونسبة 32 في المائة والأحمال الفيروسية من 103 إلى 10 عينات البعوض نسخ/4 الجيش الملكي النيبالي. عرض جميع أنواع بعوض اللعاب زيكف-إيجابية (TR 13-42%)، بينما لم يتضمن أي من عينات اللعاب من الأصناف Culex زيكف (الشكل 1A و 1B). من المثير للاهتمام، معدلات انتقال ب 21 نقطة في البوصة متشابهة في Ae. مصرية و عبد اللطيف. البوبيكتوس من ألمانيا (30 في المائة)، ولكن كانت أقل بكثير في Ae. البوبيكتوس من إيطاليا (13%).

حضانة البعوض المطعون في درجة حرارة معتدلة من 18 درجة مئوية وكشف عموما يحمل الفيروس أقل في الأنواع بعوضة (4–10 10،6 الحمض النووي الريبي نسخ/البعوض) وكذلك في الأصناف Culex مختلفة (102 –104 نسخ الحمض النووي الريبي/البعوضة). ومع ذلك، حرارة الحضانة 18 درجة مئوية، لم يلاحظ انتقال زيكف لأي من أنواع البعوض بالتحقيق.

Figure 1
رقم 1: معدلات انتقال العدوى من البعوض المصابة تجريبيا مع زيكف- نتائج الدراسات اختصاص ناقلات مع زيكف في أنواع مختلفة من البعوض. ستة البعوض مختلفة الأنواع كانت مصابة زيكف والمحتضنة في 27 درجة مئوية أو 18 درجة مئوية 14 (أ) أو 21 (ب) أيام. ويعرف عدد البعوض مع اللعاب زيكف الإيجابية الواحدة وعدد من الهيئات البعوض زيكف إيجابية TR. وكان العدد الإجمالي للبعوض التحقيق 856، مع حد أدنى من 30 فردا لكل الأصناف نقطة/درجة الحرارة/البعوض في الوقت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

لقد ثبت سابقا أن النتائج التي تم الحصول عليها بالإكراه اللعاب تتماشى مع التجارب الكلاسيكية إعادة التغذية6. ومع ذلك، سواء في إعادة تغذية التجارب أو في طريقة عرض من اللعاب القسري، من المستحيل مباشرة دليل على نشاط اللعاب أو رصد إطلاق سراح اللعاب. لإثبات النشاط اللعاب، يمكن أن تختبر عينات لمكونات أخرى موجودة في اللعاب (على سبيل المثال-، البروتينات، الكربوهيدرات، إلخ.). وعلاوة على ذلك، سيسمح قبكرس إضافية الكشف عن نسخ الرنا الفيروسي. ومع ذلك، وهذا يتطلب تقسيم عينات اللعاب لتحليلات مختلفة، مما قد يحد من حساسية في مقايسة ثقافة الخلية في حالة إعداد الجسيمات منخفضة جداً. بدوره، وهذا قد يؤدي إلى التقليل من معدلات انتقال العزم.

للنتائج استنساخه، من الضروري ضمان أن جميع البعوض البقاء على قيد الحياة حتى نهاية التجربة. ويسيطر هذا بصريا رصد نشاط حركة الجسم من البعوض. وعلاوة على ذلك، قد استخدام مبدأ المقايسة اللعاب لنوع معين من البعوض لفحصها عن طريق تغذية مراقبة الفيروسات والتي هي معروفة لإرسالها عن طريق هذه الأنواع من البعوض محددة. العكس بالعكس، قد كل الفيروسات التي أدخلت في تجربة اختبار في البعوض عرضه.

فحوصات اللعاب القسري لها العديد من المزايا. يمكن اختبار إعداد كبيرة من البعوض في وقت واحد على عينة واحدة قاعدة تحت ظروف خاضعة للرقابة الموحدة دون المتعارضة مع أنظمة رعاية الحيوان9.

الأسلوب الذي يستخدمه عدة مختبرات. ومع ذلك، قد تختلف الأجهزة الدقيقة، التي يمكن أن تؤدي إلى اختلافات في النتائج بين المختبرات. هو أحد المكونات الهامة الشعرية لجمع اللعاب، التي يمكن أن تكون مصنوعة من الزجاج14 أو15من البلاستيك. للامتثال للوائح السلامة العالية من إينسيكتاري المستوى 3 السلامة الأحيائية، استخدمنا البلاستيك تصفية نصائح بدلاً من الزجاج الشعيرات الدموية، وبالتالي تقليل مخاطر الإصابات. وعلاوة على ذلك، نصائح تصفية لها ميزة أن السائل التي تم جمعها يمكن بسهولة نقلها باستخدام ماصة.

ويستند الإعداد لفحص اللعاب القسري المقدمة هنا اثنين من المحققين العمل معا وتقاسم الواجبات. يتم تسريح من البعوض بشخص واحد، بينما الآخر في نفس الوقت تستعد الإعداد اللعاب القسري. هذا يقلل من الوقت المناولة إلى حد كبير، ويقلل من الخطر من عينة التبديل كتغيير بين التسريح-أماكن العمل واللعاب-اللوحة ليست ضرورية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح وضع البعوض على جهاز اللعاب القسري فورا بعد التسريح. هذا البعوض قصيرة بدلاً من التعامل مع الوقت أمر ضروري لنجاح اللعاب القسري. وأخيراً، يمكن رصد البعوض مباشرة للحركة في جميع أنحاء التجربة كلها.

فحص اللعاب المقدمة هنا تستخدم لاكتساب نظرة ثاقبة إمكانات متجه من أنواع البعوض. بيد للإجابة على بعض الأسئلة المحددة الأخرى (على سبيل المثال.، عدد لدغات البعوض التي هي بحاجة لتصيب الفقاريات)، والحيوانات التجارب قد تكون مطلوبة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر إيلا وينيرت، هيلمز ميشيل وبادوش مارليس للمساعدة التقنية الممتازة، جيسيكا Börstler لإجراء تحليلات للبعوض Culex ، نوربرت بيكر وبيورن بلوسكوتا لتوفير البيض Aedes albopictus وفابالاهتي قوللي توفير مخزون الفيروس. مل تدعمها "الرابطة لايبنتز"؛ منح رقم شهد-2014-SGN-3.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inject+matic Sleeper Inject+matic
Bugdorm-1 Insect Rearing Cage BugDorm Store
Drosophila cultivation tubes carl roth PK11.2 plastic vial for mosquitoes
Plug for drosophila cultivation tubes carl roth PK15.1
Constant climate chamber Binder KBF-240
Blood banked human blood, expired, not usable for medical application
Dumont-Pincette Electronic SS Dumont B40c
Vero cells BNITM
Flash light aspirator Bioquip 2809
double-sided adhesive tape no specific provider
Gammex Powder-free gloves with AMT Ansell for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory
RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit altona diagnostics 591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit Thermo fisher scientific 4462359 RNA isolation of mosquito bodies
Qiamp viral RNA Mini Kit Qiagen 52906 RNA-Isolation of supernatant
filter tips (20 µL) Sarstedt 701,116,210 Cut the first 3 mm of the tip
hand motor mixer carl roth sold out
micro pestles for hand motor mixer carl roth CXH8.1
DMEM P0403550
L Glutamine Penicilin/Streptomycin PAN P0819100
Amphotericin B PAN P06-0110
Fructose carl roth 4981.5
Phosphate buffered saline PAN P04-36500
FBS PAN
Sodium Pyruvat PAN P0443100
MEM NAA PAN P0832100
Hemotek Feeder Hemotek PS6
Light Cycler Roche 480 II
Light Cycler Software Roche 480 SW 1.5.1
Modeling clay no specific provider
King Fisher Flex Purification System ThermoFisher scientific
Aedes albopictus eggs were collected in Freiburg, Germany
Binocular MOTIC SMZ-168
Binocular light MOTIC MLC-150C
CO2-Incubator Thermo scientific MIDI 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Musso, D., Gubler, D. J. Zika Virus. Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).
  2. World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. Available from: http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region (2016).
  3. Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, (11), e0005933 (2017).
  4. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus. Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).
  5. Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus. Journal of Medical Entomology. 45, (1), 102-108 (2008).
  6. Cornel, A. J., Jupp, P. G. Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses. Journal of the American Mosquito Control Association. 5, (1), 70-72 (1989).
  7. Hurlbut, H. S. Mosquito salivation and virus transmission. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, (6), 989-993 (1966).
  8. Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes. Journal of the American Mosquito Control Association. 26, (1), 108-111 (2010).
  9. Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe. Eurovsurveillance. 22, (2), (2017).
  10. Hierholzer, J. C., Killington, R. A. Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual. (1996).
  11. Horzinek, R. W., Marian, C. Kompendium der allgemeinen Virologie. Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32, (1-10), 480 (2010).
  12. Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10, (9), (2016).
  13. Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus. Parasites & Vectors. 8, 463 (2015).
  14. Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. Turell, M. J. 10, (10), (2016).
  15. Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection. PLOS ONE. 4, (6), e5895 (2009).
أجبر اللعاب كأسلوب لتحليل اختصاص البعوض ناقل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Schmidt-Chanasit, J., Tannich, E. Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. J. Vis. Exp. (138), e57980, doi:10.3791/57980 (2018).More

Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Schmidt-Chanasit, J., Tannich, E. Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes. J. Vis. Exp. (138), e57980, doi:10.3791/57980 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter