Summary
Para el eficiente control de mosquito transmitidas por transmisión del virus, el conocimiento del potencial vector de mosquitos respectivos es de particular interés. Describimos la salivación forzada como un método para analizar la competencia vectorial de Aedes albopictus y tres taxones diferentes de Culex para la transmisión del virus Zika.
Abstract
Competencia de vectores se define como el potencial de una especie de mosquito de transmitir un virus transmitido por mosquitos (mobovirus) a un hospedador vertebrado. Las partículas del virus viable son transmitidas durante una comida de sangre a través de la saliva de un mosquito infectado. Ensayos de salivación forzada permiten determinar el potencial del vector sobre la base de los mosquitos solo, evitando el uso de experimentos con animales. El método es adecuado para analizar un gran número de mosquitos en un experimento en un período corto de tiempo. Salivación forzada ensayos fueron usados para analizar mosquitos individuales 856 atrapados en Alemania, incluyendo dos diferentes biotipos de Culex pipiens pipiens , Culex torrentium como Aedes albopictus, que fueron experimentalmente infectados con el virus Zika (ZIKV) y se incubó a 18 ° C o a 27 ° C durante dos o tres semanas. Los resultados indicaron la falta de competencia de vectores de los diferentes taxa de Culex por ZIKV. Por el contrario, Aedes albopictus era susceptible a ZIKV, pero sólo en el 27 ° C, con velocidades de transmisión similares a una colonia de laboratorio de Aedes aegypti en paralelo.
Introduction
En el año 2015, el virus Zika (ZIKV), un virus transmitido por el mosquito (mobovirus) perteneciente a la familia Flaviviridae, surgido en Colombia y Brasil y se propagó rápidamente a través de las Américas y el Caribe, causando una epidemia con un notable número de asociados casos clínicos de microcefalia y síndrome de Guillain-Barré síndrome1. Los mosquitos de la especie Aedes aegypti y Aedes albopictus se consideran los vectores primarios y secundarios de ZIKV2, pero otras especies del género Aedes han demostrado competencia experimental vector3 . En contraste con especies de Aedes , la mayoría de las especies de Culex probadas hasta ahora no es capaces de transmitir el virus4. Simplemente, los datos de Culex quinquefasciatus proporcionan resultados no concluyentes3. En la actualidad, información falta en competencia de vector mosquito por ZIKV bajo condiciones de temperatura moderadas (< 20 ° C). Sin embargo, esta información es importante para las evaluaciones de riesgo de posibles extensiones a regiones con clima templado como Europa Central.
Un vector competente por ZIKV es capaces de adquirir, mantener, ampliar y finalmente transmitir el virus. Por lo tanto, prueba el mosquito cuerpos o partes de los cuerpos, incluyendo las piernas, intestino medio, cabeza o glándulas salivales, por ZIKV no es suficiente para determinar la competencia del vector. Es obligatorio para las partículas de virus infecciosos dentro de saliva lanzada. Para valorar la competencia vectorial, índice de infección (IR, el número de cuerpos de mosquito ZIKV positivos por el número de mosquitos engorged) y tarifa de la transmisión (TR, número de mosquitos con saliva ZIKV positivo por varios cuerpos de mosquito ZIKV-positivo), debe ser determinado. IRs de mosquitos pueden ser analizadas fácilmente por los mosquitos simplemente homogeneización seguidos de una reacción en cadena reversa-transcriptase de polimerasa en tiempo real (RT-qPCR) dirigidos a ZIKV. Por otra parte, la infección puede caracterizarse aún más mediante la determinación de los números de copia viral por mosquitos. En contraste, el análisis de las tasas de transmisión se basa en la detección de partículas del virus viable en la saliva de los mosquitos. Esto puede lograrse por la alimentación de los mosquitos infectados en animales susceptibles host, seguidos por el análisis de la viremia en el host5. Sin embargo, este método se basa en organismos modelo adecuado y es costosa y restringida por las normas de bienestar animal. Para evitar el uso de animales de laboratorio para el análisis de las tasas de transmisión y para reducir los costos, volver a sistemas de alimentación artificial con sangre gotas han sido descritos6. Sin embargo, la prueba a escala individual combinada con un alto número de individuos es difícil y desperdiciador de tiempo. La primera descripción de un ensayo de salivación a escala individual se publicó en 19667 y durante los últimos años, experimentos de salivación forzada se han convertido en el método de elección para evaluar la competencia de vectores de mosquitos3,8 .
Basado en nuestro estudio de competencia del vector de Europa Central los mosquitos publicaron recientemente9, describimos la salivación forzada según Anderson et al. 8 con algunas modificaciones. Este método permite alto rendimiento estandarizado experimentos bajo condiciones de nivel de alta bioseguridad (BSL-3) e incluye la identificación de virus activo por análisis de cultura de célula. Los experimentos descritos aquí incluyen los 856 mosquitos. Estaban infectados por ZIKV por harina de sangre artificial y posteriormente analizados para la presencia de las partículas infecciosas del virus en la saliva. Los mosquitos en las poblaciones de laboratorio larga dos experimentos consta de Ae. aegypti y Culex pipiens pipiens biotipo molestus (Cx. p. molestus), así como campo atrapado Culex pipiens pipiens pipiens de biotipo (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) y dos poblaciones de Ae. albopictus . Con la excepción de una de las dos poblaciones de Ae. albopictus , que recogió en Italia, todos los mosquitos fueron colectados en Alemania.
Protocol
1. prepare los mosquitos hembras
- Recopilar los mosquitos de una gran jaula mediante un aspirador (aproximadamente 400 mosquitos por jaula grande).
- Anestesiar los mosquitos con dióxido de carbono (CO2) para 7 s.
- Ordenar 20 hembras por frasco de plástico (Ø 50 x 100 mm).
Nota: Si los mosquitos despiertan, utilice otros 3 s de CO2. - Hambre durante la noche los mosquitos.
2. artificial harina de sangre
Nota: Todas las medidas se realizan bajo condiciones BSL-3.
-
Preparar la harina de sangre infecciosa.
- Diluir la acción del virus a la concentración de 1 x 108 placa formando unidades (PFU) / mL.
Nota: La concentración stock se determina realizando el método de dosis 50 de infección cultivo de tejido (DICT50) y calcula por Spearman y Kärber algoritmo10,11. - Mezcla caducado sangre humana (conservación de la sangre) del Banco de sangre (no apto para humanos, pero útil para los mosquitos) con fructosa (solución al 8%), filtrado de suero bovino (FBS) y la solución de trabajo de la acción de virus (caducado humana sangre: fructosa: FBS: solución de trabajo = 5:3:1:1).
Nota: Elegimos sangre humana, porque esto es el anfitrión mamífero natural conocido de ZIKV.
- Diluir la acción del virus a la concentración de 1 x 108 placa formando unidades (PFU) / mL.
- Congelar 140 μl de mezcla de harina de sangre para su posterior análisis mediante TCID50.
-
Realizar la alimentación artificial mediante el uso de diferentes métodos de alimentación, dependiendo de la especie:
- Aedes aegypti: utilice una alimentación de 30 min (1 mL por cada alimentador) de la membrana.
- Culex spp.: proporcionar la sangre infecciosa mediante un bastoncillo de algodón durante la noche y no calentar la sangre (300 μL por vial).
-
Aedes albopictus: poner dos gotas (50 μL) de la mezcla de harina de sangre en el frasco de plástico y deje que los mosquitos de alimentación para 2 h. No calentar la sangre.
Nota: Los mosquitos se alimentan en los primeros 15 minutos. El tiempo de incubación prolongado es necesario por razones de seguridad. Las gotas de sangre están agotadas después de 2 h, por lo tanto se reduce el riesgo de contaminación durante la clasificación de alimentación los mosquitos.
- Anestesiar los mosquitos con CO2 para 7 s.
Nota: Si los mosquitos despiertan, utilice otros 3 s de CO2. - Suerte y cuenta completamente engorged los mosquitos en un frasco nuevo.
- Añadir un disco de algodón, saturado con fructosa (solución al 8%) entre el frasco y un enchufe.
- Mantener los mosquitos a la temperatura designada de 18 ° C o a 27 ° C en la humedad del 80% durante 14 o 21 días.
- Los mosquitos se alimentan con cojines de algodón saturado de fructosa. Reponer cada 72 h con 1,5 mL de fructosa (solución al 8%) por vial (hasta 20 mosquitos, dependiendo de la alimentación la tarifa, ver paso 2.5).
3. forzoso ensayo de salivación en el día 14 o 21
Nota: Todas las medidas se realizan bajo condiciones BSL-3.
- 2 x 104 células de Vero de la semilla / por pozo en una 96 well placa con 200 μL de medio de cultivo (Dulbecco´s modificado medio de águila (DMEM) suplementado con 3% FBS, 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 5 μg/mL de anfotericina B, 2 mM L-glutamina el 1% no aminoácidos esenciales (AANE), piruvato de sodio 1%).
-
Prepare el dispositivo de la salivación:
- Coloque una placa de vidrio cuadrado (20 x 20 cm) en el Banco en un ángulo de 30°.
Nota: Esto es necesario debido a la depresión en el laboratorio de seguridad. Si la placa es horizontal o vertical, el líquido se derramará. - Coloque cinta adhesiva de doble cara encima de la placa de vidrio.
- Papel la arcilla de modelado hasta que alcanza un diámetro de 0,5 cm y fije horizontalmente 1 cm de distancia de la cinta adhesiva de doble cara.
- Corte los primeros 0,3 cm de la punta de una punta de filtro de 10 μl.
Nota: Se aconseja preparar esta antes de iniciar el experimento fuera del laboratorio de bioseguridad. - Llene el filtro consejos con 10 μl de tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4).
- Coloque las puntas de filtro en la arcilla de modelado con la punta hacia la cinta adhesiva.
- Fijar las puntas de filtro con una ligera presión.
- Coloque una placa de vidrio cuadrado (20 x 20 cm) en el Banco en un ángulo de 30°.
-
Preparar los mosquitos:
- Anestesiar los mosquitos con CO2.
- Quitar las patas y alas para inmovilizar a los mosquitos.
- Arreglar la vida del mosquito cuerpos en la cinta adhesiva sobre una punta del filtro.
- Coloque suavemente la probóscide en la punta del filtro.
- Ejecutar el ensayo de salivación durante 30 minutos.
- Quitar las puntas de filtro y deseche la arcilla y la cinta.
4. proceso de Saliva
Nota: Los pasos 4.1 – 4.6.2 son realizados bajo condiciones BSL-3.
- Vierta el contenido en los tubos de reacción con 10 μl de PBS.
- Mezclar suavemente y transferir el contenido en los pocillos de la placa bien 96 preparado mediante un pozo por muestra.
- Incube la placa durante 7 días a 37 ° C con 5% CO2.
- Usar los binoculares para ver las células por la presencia de efecto citopático (CPE).
- Si bien es positivo para el CPE, recoger el sobrenadante por pipeteo 140 μL en un tubo de reacción para la extracción de RNA.
-
Purificar el RNA mediante el uso de un kit de extracción de RNA.
- Mezcla 140 μl del sobrenadante con 560 μl de AVL tampón (tampón de lisis viral) e incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Añadir 560 μl de etanol (96%) y agitar la muestra.
Nota: Las muestras son inactivadas después de este paso y pueden ser descargadas del laboratorio BSL-3. - Pipeta de 630 μl de la muestra en una columna y centrifugadora con 6.000 x g durante 1 minuto.
- Deseche el filtrado, pipetee el μl 630 restantes en la columna y repita la centrifugación.
- Lave el ARN, enlazado a la membrana de la columna, Añadir 500 μl de buffer 1 a la columna y la centrífuga de lavado a 6.000 x g durante 1 min.
- Deseche el tubo de la colección y coloque la columna en un tubo nuevo de colección. Añadir 500 μl de tampón de lavado 2 y centrifugue a 12.500 x g durante 3 minutos.
- Deseche el tubo de la colección y coloque la columna en un tubo de reacción de 1,5 mL.
- Añadir 50 μl de tampón de elución e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar a 6.000 x g durante 1 min y luego desechar la columna.
- Analizar las muestras de RNA ZIKV mediante RT-qPCR.
5. proceso de Mosquito cuerpos
Nota: Los pasos 5.1 – 5.5 son realizados bajo condiciones BSL-3.
- Quite los órganos del mosquito y coloque cada cuerpo en un tubo de reacción.
Nota: Es posible hacer una pausa en este punto el experimento y almacenar las muestras a-80 ° C. - Añadir 500 μl de medio de homogeneización (DMEM sin cualquier suplementos) en el tubo de reacción.
- Homogeneizar la carrocería motor batidora y utilice un pistilo nueva para cada muestra.
- Añadir 200 μL del homogeneizado en una placa de 96 pozos para la purificación.
Nota: Es posible hacer una pausa en este punto el experimento y almacenar las muestras a-80 ° C. - Desactivar la placa por la incubación durante 60 min a 60 ° C.
- Purificar el RNA purificación de ácidos nucleicos automatizada.
Nota: Es posible hacer una pausa en este punto el experimento y almacenar las muestras a-80 ° C.
6. Análisis
- Cuantificar las copias de ARN Viral mediante RT-qPCR.
Nota: Las copias de RNA fueron hechas un promedio sobre todos los cuerpos mosquito ZIKV-positivo y sin incluir los mosquitos ZIKV negativo. - Calcular el IR, definido como el número de cuerpos de mosquito ZIKV positivos por el número de hembras alimentadas.
- Calcular la TR, definida como el número de mosquitos con saliva ZIKV positivo por varios cuerpos de mosquito ZIKV positivo. La tasa de transmisión no podría calcularse para combinaciones de temperatura y especies con ningunos cuerpos ZIKV positivo.
Representative Results
Aedes aegypti es conocido como un vector competente por ZIKV al menos bajo condiciones climáticas tropicales12. Por lo tanto, usamos Ae. aegypti como control positivo para establecer el análisis y analizar IRs como TRs en una temperatura de incubación de 27 ° C y una humedad del 80%. IR y TR se definieron como se describió anteriormente por Fortuna et al. 13. Challenged Ae. aegypti mostraron IR del 50% y 72% y TR de 42% y 31% a los 14 y 21 días post infección (dpi), respectivamente (figura 1A y 1B). Posteriormente, los mosquitos europeos fueron probados por ZIKV infección y transmisión con condiciones climáticas tropicales y templadas.
En la temperatura de incubación de 27 ° C, todas las especies de mosquito demostraron la infección ZIKV en dpi 14 y 21 dpi, excepto Cx. pipiens p. y Cx. torrentium individuos, que eran positivos en 14 dpi sólo. Todas las especies de Aedes demostraron mayor IRs (entre 50% y 72%) así como mayor concentración viral de RNA (106 a 10 muestras de9 RNA copias/mosquito) en comparación con los diferentes taxa de Culex , que reveló la IRs que oscilan entre 0 % y 32% y cargas virales de 103 a 10 ejemplares de copias mosquito4 RNA. Todas las especies de Aedes muestran saliva ZIKV positivo (TR 13 – 42%), mientras que ninguna de las muestras de saliva de los taxa de Culex contuvieron ZIKV (figura 1A y 1B). Curiosamente, las tasas de transmisión en 21 dpi eran similares en Ae. aegypti y Ae. albopictus de Alemania (30%), pero fueron sustancialmente inferiores en Ae. albopictus de Italia (13%).
Incubación de mosquitos desafiados en una temperatura moderada de 18 ° C reveló generalmente virus menor carga en las especies de Aedes (104– 106 RNA copias/mosquito) así como en los diferentes taxa de Culex (102-104 RNA copias/mosquito). Sin embargo, a 18 ° C temperatura de incubación, transmisión de ZIKV no fue observada por cualquiera de las especies de mosquitos investigadas.
Figura 1: tasas de transmisión de los mosquitos infectados experimentalmente por ZIKV. Resultados de estudios de la competencia del vector con ZIKV en diferentes especies de mosquitos. Seis taxa diferentes mosquitos fueron infectados por ZIKV y se incubaron a 27 ° C o 18 ° C 14 (A) o 21 días (B). TR se define como el número de mosquitos con saliva ZIKV positivo por varios cuerpos de mosquito ZIKV positivo. El número total de mosquitos investigado fue 856, con un mínimo de 30 personas para cada taxa de mosquito de temperatura de punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Se ha demostrado previamente que los resultados obtenidos con salivación forzada son conforme clásico re-alimentación experimentos6. Sin embargo, realimentación experimentos tanto en nuestro método presentado de salivación forzada, es imposible directamente la prueba de actividad de salivación o supervisar la liberación de la saliva. Para probar la actividad de la salivación, podrían ser muestras para otros componentes presentan en la saliva (por ej., proteínas, hidratos de carbono, etc..). Además, qPCRs adicional permitiría la detección de copias de RNA virales. Esto, sin embargo, requiere partir de muestras de saliva para análisis distintos, que pueden limitar la sensibilidad en el ensayo de cultivo celular en caso de números muy bajos de partículas. A su vez, esto podría llevar a una subestimación de las tasas de transmisión determinado.
Para obtener resultados reproducibles, es necesario asegurar que todos los mosquitos sobrevivir hasta el final del experimento. Esto se controla mediante el control visual de la actividad de movimiento del cuerpo de los mosquitos. Además, el uso del principio de la prueba de salivación para una especie determinada de mosquito tiene que ser probado por virus control, que se saben para ser transmitidos por esta especie de mosquito específico de alimentación. Viceversa, cada virus introducido en un experimento tiene que ser probado en un mosquito susceptible.
Ensayos de salivación forzada tienen muchas ventajas. Un número elevado de mosquitos puede analizarse simultáneamente en una sola muestra base en condiciones estandarizadas controladas sin entrar en conflicto con las normas de bienestar animal9.
El método es utilizado por varios laboratorios. Sin embargo, pueden diferir las configuraciones exactas que pueden conducir a diferencias en los resultados entre laboratorios. Un componente crítico es el capilar para recoger la saliva, que puede ser de vidrio14 o plástico15. Para cumplir con las normas de alta seguridad de un insectario de nivel 3 de bioseguridad, se utilizó para el filtro de plástico en lugar de tubos capilares de vidrio, reduciendo así el riesgo de lesiones. Además, extremidades de filtro tiene la ventaja de que el líquido recogido puede ser fácilmente transferido mediante una pipeta.
La configuración de la prueba de salivación forzada presentada aquí se basa en dos investigadores trabajando juntos y compartiendo tareas. Desmovilización del mosquito se realiza por una sola persona, mientras que la otra simultáneamente prepara la configuración salivación forzada. Esto considerablemente reduce el tiempo de manipulación y reduce el riesgo de muestra el cambio como cambiar entre el trabajo de desmovilización y en la placa de la salivación no es necesario. Además, permite colocar los mosquitos en el dispositivo de salivación forzada inmediatamente después de la desmovilización. Este mosquito bastante corto tiempo de manipulación es esencial para el éxito salivación forzada. Por último, los mosquitos pueden controlarse directamente para la motilidad a lo largo del experimento todo.
El ensayo de salivación presentado aquí se utiliza para hacerse una idea del potencial vector de especies de mosquitos. Sin embargo, para responder algunas preguntas específicas (por ej., los números de las picaduras de mosquitos que son necesarios para infectar vertebrados), animal experimentos todavía pueden ser necesarios.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Ella Weinert, Michelle Helms y Marlis Badusche excelente asistencia técnica, Jessica Börstler para el análisis de los mosquitos Culex , Norbert Becker y Björn Pluskota huevos de Aedes albopictus y Olli Vapalahti para que la acción de virus. ML fue apoyado por la Asociación de Leibniz; concesión número Sierra-2014-SGN-3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inject+matic Sleeper | Inject+matic | ||
| Bugdorm-1 Insect Rearing Cage | BugDorm Store | ||
| Drosophila cultivation tubes | carl roth | PK11.2 | plastic vial for mosquitoes |
| Plug for drosophila cultivation tubes | carl roth | PK15.1 | |
| Constant climate chamber | Binder | KBF-240 | |
| Blood | banked human blood, expired, not usable for medical application | ||
| Dumont-Pincette Electronic SS | Dumont | B40c | |
| Vero cells | BNITM | ||
| Flash light aspirator | Bioquip | 2809 | |
| double-sided adhesive tape | no specific provider | ||
| Gammex Powder-free gloves with AMT | Ansell | for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory | |
| RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit | altona diagnostics | 591013 | |
| MagMax Pathogen RNA/DNA Kit | Thermo fisher scientific | 4462359 | RNA isolation of mosquito bodies |
| Qiamp viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52906 | RNA-Isolation of supernatant |
| filter tips (20 µL) | Sarstedt | 701,116,210 | Cut the first 3 mm of the tip |
| hand motor mixer | carl roth | sold out | |
| micro pestles for hand motor mixer | carl roth | CXH8.1 | |
| DMEM | P0403550 | ||
| L Glutamine Penicilin/Streptomycin | PAN | P0819100 | |
| Amphotericin B | PAN | P06-0110 | |
| Fructose | carl roth | 4981.5 | |
| Phosphate buffered saline | PAN | P04-36500 | |
| FBS | PAN | ||
| Sodium Pyruvat | PAN | P0443100 | |
| MEM NAA | PAN | P0832100 | |
| Hemotek Feeder | Hemotek | PS6 | |
| Light Cycler | Roche | 480 II | |
| Light Cycler Software | Roche | 480 SW 1.5.1 | |
| Modeling clay | no specific provider | ||
| King Fisher Flex Purification System | ThermoFisher scientific | ||
| Aedes albopictus | eggs were collected in Freiburg, Germany | ||
| Binocular | MOTIC | SMZ-168 | |
| Binocular light | MOTIC | MLC-150C | |
| CO2-Incubator | Thermo scientific | MIDI 40 |
References
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