Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ferrichloridopløsning-induceret Canine carotis arterie trombose: En stor dyr Model af vaskulære skade

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57981

Summary

Vi præsenterer her, de ændringer, der er nødvendige til en vel karakteriseret og almindeligt anvendte små ferrichloridopløsning-induceret (FeCl3) halspulsåren skade dyremodel til brug i en stor animalsk vaskulære skade model. Den resulterende model kan udnyttes til prækliniske forsøg vurdering af både forebyggende og trombolytisk farmakologiske og mekaniske interventioner.

Abstract

Okklusiv arteriel trombose fører til cerebral iskæmisk slagtilfælde og myokardieinfarkt bidrager til ~ 13 millioner dødsfald hvert år globalt. Her, har vi oversat vaskulære skade model fra en lille dyr i et stort dyr (hunde), med mindre ændringer, der kan bruges til præklinisk screening af profylaktisk og trombolytisk agenter. Udover de kirurgiske metoder beskriver den ændrede protokol de trinvise metoder til at vurdere halspulsåren kanalisering af angiografi, detaljerede instruktioner til at behandle både hjernen og halspulsåren for histologiske analyse at kontrollere carotis kanalisering og hjerneblødning og specifikke parametre til at gennemføre en vurdering af downstream thromboemboliske hændelser ved at udnytte magnetisk resonans imaging (MR). Derudover behandles bestemte proceduremæssige ændringer fra den tidligere veletableret lille dyr model nødvendigt at oversætte til en stor dyr (hunde) vaskulære skade.

Introduction

Slagtilfælde terapi er i vid udstrækning modelleret efter koronararterie sygdom behandling, hovedsagelig fordi interventioner i hjerte-kar-sygdom har reageret godt på medicin terapi og endovaskulære indgreb1. Disse behandlinger, men oversat ikke korrekt til cerebral infarkt. Vanskeligheder med den nuværende slagtilfælde behandling er at den rekombinante væv plasminogen aktivator (rTPA) ikke kan vendes, og at administrationen indebærer en betydelig 6,4% risiko for hæmoragisk konvertering2,3, 4. den resulterende sygelighed og dødelighed begrænser dets anvendelse til en lille, ofte uopnåeligt vindue5. Også, restenose og okklusion opstår ofte efter indledende trombolyse, tilbageføre oprindelige neurologiske forbedring. I sammendrag er der en smal tidsmæssige vindue til at administrere rTPA, der udelukker det store flertal (~ 90%) af patienter, der lider iskæmisk cerebrovaskulær fornærmelser.

Rollen som intravenøs antitrombotiske behandling har vist lovende i behandling af iskæmisk slagtilfælde med forbedret fartøj recanalization, overlevelse og resultatet2. Desværre, disse stoffer har en forudsigelig bivirkning af intra kraniel og ekstra kraniel blødning, hovedsagelig fordi der er ingen måde at tilstrækkeligt vende eller styre deres aktivitet2. Mens effektiv i forebyggelsen af trombocytaggregation, risikoen for blødning og manglende evne til at vende deres aktivitet har udelukket anvendelsen heraf i rutinemæssige pleje af apopleksi patienter. Behov, findes derfor for potent antitrombotisk narkotika, der fungerer alene eller i kombinationer for at forhindre og lyse blodpropper endnu har en sikkerhedsprofil, der giver mulighed for brug i en lukket, lav volumen plads som hjernen, hvor blødning er dårligt tolereret.

Forstå mekanisme af arteriel trombose og re-stenose, og evaluering af trombolytika og stoffer, der forhindrer re-stenose, kræver både små og store dyr modeller som en del af prækliniske stof udvikling. Ferrichloridopløsning-induceret vaskulære skade er en bredt udnyttede teknik til hurtigt og præcist inducere dannelse af trombi i udsatte blodkar af mus, rotter, marsvin, og kaniner6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. disse mindre arter tilbyder flere fordele, herunder brugervenlighed genmanipulation, billig animalske køb og lav dagpenge boligudgifter. Desværre, små dyreforsøg negere flere blod trækker under operationen til adgang trombocyt reaktivitet, blod gas analyse og inflammatorisk respons. Endnu vigtigere, efterligne store dyr langt mere nøje menneskelige trombocyt fysiologi6,13. FeCl3 halspulsåren skade model har spillet en fremtrædende rolle i studiet af Patofysiologi af trombose, validering af roman anti-trombocyttal og antikoagulerende medicin og opdagelsen af potentielle Trombolytika6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. forrige modeller i mus, rotter, marsvin, og kaniner har givet lethed og fleksibilitet for genmanipulation, men oversætbare prækliniske modeller er afgørende for patient dosering og toksikologiske studier af potentielle therapeutics6 ,13. Selv om flere modeller af trombotiske lidelser er blevet udviklet i mus, store dyremodeller for trombose, der gælder for den Perifer vaskulær sygdom, er slagtilfælde og myokardieinfarkt få og langt. De første trombose modeller i aber, hunde og svin fokuseret på stenose, anvendelsen af hemostats og senere cylindre til fartøjer, ofte resulterer i cykliske flow reduktioner14,15,16. I stedet for en okklusiv blodprop i stedet for i endothelial skader som ferrichloridopløsning model, blodprop i disse modeller resulterede i cykliske trombose, distal embolisering og vende tilbage til normal blodgennemstrømning. I sammenligning, er ferrichloridopløsning model ændret her i et stort dyr, resulterer i en okklusiv blodprop på skaden site og stabiliseret og verificeret af angiografi før trombolytisk behandling. Forudsat at investigator har rigelig midler for per diem og køb af hjørnetænder og passende kirurgisk ekspertise, vi detalje her en stor canine model af vaskulære skade at tillade laboratorier til at studere trombose udnytter kirurgisk, billedbehandling og histologiske teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De undersøgelser, der er beskrevet i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health og blev godkendt af Ohio State University institutionelle Animal Care og brug Udvalget (#2015A00000029). Alle kirurgiske manipulationer blev udført under dyb anæstesi og dyrene oplever ikke smerte på noget tidspunkt under proceduren. Alle forsøg beskrives var manglende inddrivelse.

1. forberedelse

  1. Frisk forberede 50 mL ferrichloridopløsning (FeCl3) på 50% (w/v) opløses i deioniseret vand.
  2. Klippe navlestrengen båndet i 5,5 cm stykker og lægges i blød i opløsningen med frisklavede 50% FeCl3 1 uge før proceduren.
    Bemærk: Umbilical båndet anvendes er tyk og tager lidt tid at absorbere 50% FeCl3 løsning.
  3. Fast hver canine natten før operationen.
  4. Label cryovials for plasma og urin samling, 50 mL sterilt centrifugeglas for alle orgel opbevaring, og 10% formalin beholdere til hjernen og carotis fiksering til H & E farvning med identifikation af dyr, fødselsdato, operation og behandling.
  5. Forberede hver canine procedure 100 mL af hver opløsning: 4% PARAFORMALDEHYD i fosfatbufferet saltopløsning (pH 7,4), 10% neutrale buffered formalin og 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chlorid [TTC i PBS (pH 7,4), opbevares i mørke].
  6. Erhverve rigelig flydende nitrogen for alle cryovials og 50 mL væv rør til flash frysning for dag i proceduren.
  7. Erhverve to ADP/kollagen patroner til PFA-100 (blodplade funktion Analyzer) trombocyt reaktivitet for hver canine for hvert tidspunkt af interesse.
  8. Erhverve en 4,5 mL natriumcitrat blod collection tube, for hver blod tegne før offer, for plasma separation og opbevaring. På offer, tegne 16 blod indsamling rør til plasma opbevaring. Efter hver blod collection tube er fuld, spin på 4.000 x g for 30 s til at isolere trombocyt rige plasma og overførsel klart lag i cryovials. Flash fryse i flydende nitrogen før opbevaring ved-80 ° C.
  9. Erhverve en 4,5 mL lithium heparin blod collection tube, for hver PFA-100 tidspunkt af interesse at optage trombocyt reaktivitet. På hver blod trækning, indføre 800 µL fuldblod fra et lithium heparin blod indsamling rør i hver ADP/kollagen patron uden luftbobler at følge trombocyt reaktivitet.
  10. Erhverve to EDTA K3 blod indsamling rør (1,8 mg af vandfri EDTA per 1 mL af blodet), for komplet blodtælling (CBC) ved baseline og tidspunktet for offer.
    Bemærk: Denne mængde er tilstrækkelig for de fleste core faciliteter til at køre hver to gange i tilfælde af mekaniske fejl. Selv om en CBC blev kørt på begge basislinjen før skade og på tidspunktet for offer, kan efterforskere tilføje mere blod trækker som godkendt i deres dyr protokoller for yderligere analyser. Check med facilitet, mængder og afleveringskrav for deres udstyr.
  11. Forbered en 2 mL heparinized sprøjte ved at udfylde og belægning sprøjten dag i proceduren for blod gas analyse på tidspunktet for offer.
    Bemærk: Check med facilitet, mængder og afleveringskrav for deres udstyr.

2. canine carotis arterieokklusion

  1. Vejer en voksen (> 18 måneder) beagle hunde og pre-medicinerer med intramuskulær Acepromazin (0,025-.2 mg/kg) efterfulgt af en indledende intraperitoneal injektion af ketamin (5-20 mg/kg) og midazolam (0,01-.25 mg/kg). Fremkalde dybere anæstesi med 1-5% isofluran baseret på puls, respirations og kæbe tone.
    Bemærk: Nøjagtige anæstesi er dikteret af vægten og den godkendte animalske protokol. Selvom injektioner kan resultere i smerte for dyr, varigheden af dette ubehag vil være minimal (mindre end 3 s).
  2. Før at tage dyret til tabellen kirurgi, skal du fjerne hår ved klipning. Anvende smørende oftalmologiske salve at de bedøvede dyr øjne til at forhindre tørhed.
  3. Placere dyret i liggende stilling ved hjælp af et positioneringssystem og vedhæfte Elektrokardiografi (EKG) fører til fod pads. Intubate gennem luftrøret med et 6,5 mm håndjern endotrakealtube, mekanisk ventilere 14 vejrtrækninger/min., og vedligeholde hver hund med en kontinuerlig indånding af 1-5% isofluran (afhænger af den godkendte animalske protokol).
  4. For at bestemme omfanget af kanalisering af carotis og længden af den okklusiv blodprop, udføre angiografi før skade, før Mr, og på tidspunktet for offer (se nedenfor for yderligere instruktioner).
  5. Indsætte en femoral arteriel kappe og en plastik kateter og fastgør med en løs 0-silke sutur. Midlertidigt tæt kappe og kateter under transport og billeddiagnostiske undersøgelser. Se canine angiografi nedenfor for yderligere instruktioner).
  6. For blodet trækker, indsætte et 16G x 45 mm intravenøse kateter gennem intakt hud distalt for collum arteriel kappe skære ned site. Rykke kateteret ind i den kirurgiske eksponering og visualisere det som det kommer ind i udsatte femoral vene umiddelbart støder op til den arterielle kappe. Når fuldt indsat i venen, hæve nålen, cap kateter med en 3-vejs hanen og skyl det med 2 mL 0,9% sterilt saltvand. Sikre kateter til huden med en 0-silke sutur.
  7. Gøre en 8-10 cm snit i huden direkte på toppen af højre fælles halspulsåren regionen og dissekere fascia for at isolere fartøj fra det omgivende væv.
  8. Omhyggeligt indføre pincet mellem halspulsåren og vagus nerven til at adskille. Undgå at berøre mere end nødvendigt, da det kan forårsage forsnævring af fartøjet halspulsåren.
  9. Tør det udsatte område af arterien med steril gaze til at undgå FeCl3 løsning fortynding.
  10. Sted Doppler flow sonde omkring carotis giver amble plads til wrap den umbilical tape omkring carotis uden at røre flow sonden og starte optagelsen blod hastighed og fortsætte under hele proceduren (figur 1 Top). Optage baseline flow for ~ 5 min før du anvender umbilical båndet.
    Bemærk: Baseline flow før FeCl3 umbilical tape placering normalt gennemsnit omkring 250 mL/min.
  11. Wrap de forberedte FeCl3 umbilical tape rundt carotis ved hjælp af en hemostat umiddelbart under flow sonden uden at røre det for 15 min, Fjern, og kassér.
    Bemærk: Okklusion er udpeget som nul flow mL/min.
  12. Stabilisere den okklusiv blodprop for 45 min. Tilføj yderligere saltvand til sonden efter behov for at opretholde et signal.
    Bemærk: Afhængigt af alder, køn og type af canine, yderligere placeringer af rede FeCl3 umbilical båndet kan være nødvendige for at tillade 30 min for okklusion at forekomme før fornyet påføring. Ingen forskelle blev observeret i trombose af ferrichloridopløsning program med køn i beagler. Det blev ikke anset for nødvendigt med denne model til at genanvende en frisk FeCl3 umbilical tape mere end én gang og aldrig har afveget fra FeCl3 umbilical tape forberedelse protokol. Hvis laboratoriet er ved hjælp af en anden race eller alder af hunde, FeCl3 umbilical tape bør anvendes på de indledende fag for at sikre at den trombose protokol ikke afviger, eller en gruppe af hjørnetænder kan være nødvendigt at etablere FeCl3 ansøgning tid til at race eller alder i deres specifikke undersøgelse. Okklusion gange, i dette eksperiment, spænder fra 8-30 min efter FeCl3 umbilical tape ansøgning.
  13. For at bestemme streg eller blødning volumen ud over de downstream thromboemboliske hændelser, der kan følge af farmakologiske interventioner, transportere hjørnetænder med yderligere ketamin injektion til en maskine, magnetisk resonans imaging (se nedenfor for yderligere forarbejdning).
  14. Mens stadig under et dybt kirurgisk fly af anæstesi fra en endelige angiogram/MR-scanning (se nedenfor for billedbehandling protocol), angives af en mangel på reaktion på skadelige stimuli, indsamle fuldblod ønskes til senere analyse, så Åbn brystet ved at skære gennem ribbenene starter ved brystbenet og punktafgifter hjertet ved at skære blodkar (exsanguination).
    Bemærk: I dette eksperiment, hele blod (< 10 mL) blev trukket på baseline, 5 min efter agent administration og 60 min. efter infusion fra den femorale kappe og så ingen effekt på processen for trombolyse. På offer, en ubegrænset mængde, kan drages til yderligere plasma opbevaring hvis godkendt i animalsk-protokollen. Analysere, behandle og opbevare alle fuldblod indenfor 30 min offer. Sikre, at blod ikke er trukket over godkendte procentdelen af dyrets legeme last som beskrevet på den godkendte animalske protokol. Alle forsøg beskrives var manglende inddrivelse.
  15. Skyl hjerte med 0,9% saltvand og flash fryse prøver i flydende kvælstof, hvis det ønskes.
  16. Før du fjerner carotiderne, måle blodprop længde ved at placere en lineal ved siden af det og post. Placere væv markør på midten af blodprop og på det samme sted på de kontralaterale carotis for lethed i histologi trimning. Markere de kontralaterale carotis på samme længde.
    Bemærk: Den gennemsnitlige blodprop længde med denne model er 1,75 cm.
  17. Fjerne hele længden af blodprop på begge fartøjer og lave i 10% formalin. Fjern de kontralaterale halspulsåren inden for længden præget af væv markør. Skær de kontralaterale carotis arterie i halve på midten af blodprop. Flash fryse halvdelen de kontralaterale carotis arterie i flydende nitrogen til senere analyse og løse anden halvdelen i 10% formalin til indkapsle ved siden af den skadede carotis for histologiske analyse nedenfor.
  18. Fjerne organer for enhver ønskede analyse, skylles med 0,9% saltvand, og flash fryse i flydende kvælstof.
  19. Fjerne kraniet med en cirkulær knogle så. Langsomt fjerne kraniet uden at beskadige hjernen under.
  20. Når hjernen er fjernet fra kraniet, skyl den i koldt 0,9% saltvand, og skær to 4 mm sektioner fra midten af hjernen, skære lateralt med en skarp skalpel. Placer et af afsnittene 4 mm til 2% TTC for iskæmisk afgrænsning (Se yderligere behandling for brain TTC), mens anden Skive placeret i 10% formalin i 7 dage for H & E farvning (Se yderligere behandling for hjernen H & E).

3. canine angiografi

Bemærk: Dette er vist i figur 2 og sker under operationen på tid interessepunkter.

  1. Føler for en puls i regionen lige lyskebrok og lave en 3-5 cm ventrale sagittal snit.
  2. Udsætte arteria femoralis og adskille det fra det omgivende væv ved hjælp af stump dissektion.
  3. Bruge en retvinklet hemostat for at placere en 0-silke sutur omkring den distale ende af den udsatte arterie.
  4. Binde den distale 0-silke sutur og anvende svag spænding til arterie ved fastspænding løs 0-silke sutur enderne til huden med hemostats.
  5. Placer en anden 0-silke sutur omkring den proksimale ende af den udsatte segment.
  6. Punktere arterie midtvejs mellem de proksimale og distale 0-silke sutur bånd ved hjælp af en 18G introducerende nål til at passere en guidewire i arterien.
  7. Indlæse en samlet 6Fr kappe og dilator på guidewire, fatte wiren, når det kommer ud fra forsamlingen.
  8. Forhånd dilator og kappe over guidewire. Sørg for at opretholde en klar forståelse af wiren, så det stikker ud fra dilatatoren samtidig fremme dilator kappe forsamling.
  9. Efter fuld indsættelse, binde den proksimale 0-silke sutur omkring kappe at opretholde hæmostase på webstedet arteriel punktering.
  10. Samtidig Fjern dilatatoren og guidewire.
  11. Åbn envejs-ventil til at kontrollere tilstedeværelsen af pulsatile blodgennemstrømningen og flugter med 3-5 mL af normale saltvand.
  12. Tilsluttes en væske fyldte forlængelseslinje knyttet til en tryktransduceren at overvåge og registrere invasive blodtryksmålinger adgang kappe envejs-ventil.
  13. Pre-loade en guidewire 0,35" ind i en 4Fr. Angiografisk kateter og tilsluttes kontrast injektion manifold sæt med en Tuohy y-adapter.
  14. Trække spidsen af guidewire lige inden den distale spidsen af kateteret og skylle den hele forsamling med saltvand.
  15. Indsæt Angiografisk kateteret ind i hæmostatisk ventilen af kappe og derefter fremme guidewire ca 5 cm ud over den distale kateter spids.
  16. Under fluoroskopisk vejledning og brug af et retrograd trans-aorta tilgang, langsomt rykke kateteret ind i aortabuen.
  17. Injicere 2-3 mL kontrast agent fortyndet 1:1 med normal saltvand til at identificere take-off af den brachiocephalic stammen.
  18. Bruge guidewire til direkte kateteret ind den brachiocephalic stammen, og derefter selektivt i den højre fælles halspulsåren.
  19. Fjerne guidewire og injicere 2-3 mL fortyndet kontrast til at kontrollere, at kateteret er placeret i carotis.
  20. Injicere 3-4 mL af ufortyndet kontrast mens du optager Angiografisk kører ved hjælp af både digital subtraktion og Angiografisk standardteknikker.
  21. Gentag trin 3,18-3.21 for de gentagne angiografi på ekstra tid point.

4. magnetisk resonans - Diffusion vejede Imaging (DWI) og T2 vægtet imaging (T2WI) af canine hjernen

Bemærk: Dette er vist i figur 3A-3B.

  1. Sikre at hunden er under dyb anæstesi.
  2. Sikre at hundens fysiologiske parametre overvåges hele imaging herunder EKG og puls.
  3. Sikre at hunden er liggende i liggende stilling med hovedet i de bilaterale åbninger af hjernen spolen.
  4. Aktiver 3 Tesla (3T) magnet.
  5. Udføre T2 vægtet imaging (T2WI), en grundlæggende puls sekvenser i Mr.
    Bemærk: Rækkefølgen bruger forskelle i T2 afslapning tid af væv ved forskellige patologiske tilstande.
  6. Udføre localizer imaging for at erhverve pilot billeder af en hund brain før den anatomiske imaging ved hjælp af T2-vægtede gradient ekko imaging sekvens og bestemme synsfelt (FOV), antallet af skiver og skive tykkelse helt dækker hjernen.
  7. Brug følgende T2-parametre: skive tykkelse = 3 mm, TR = 4.000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, erhvervelse matrix = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 pixels, billedopløsning = 2.4615 pixel pr. mm.
  8. Udføre diffusion vægtet imaging (DWI) ved hjælp af echo Afretter DTI sekvens 4 h efter MCA okklusion og umiddelbart før offer.
  9. Brug følgende DWI parametre: b = 1.500 s/mm2, Skive tykkelse = 3 mm, TR = 4.600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, erhvervelse matrix = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, billedopløsning = 0.9333 pixels/mm (tabel 1).

5. hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning af canine hjernen

Bemærk: Dette er vist i figur 3D.

  1. Efter 7 dage i 10% formalin, integrere 4 mm hjernen sektioner i paraffin.
  2. Trim paraffinblokke, indtil de er plan med en mikrotom, at fjerne eventuelle yderligere paraffin fra toppen af hjernevæv, og derefter skære hjernevæv på 4 µm og Placer en hjerne på hver 2 "x 3" tomme dias.
    Bemærk: Før farvning, placere alle løsninger i separate beholdere så slides kan flyttes fra én løsning til en anden uden at udtørre.
  3. De paraffinize hver hjerne dias og hydrat med vand fra hanen.
  4. Placer hvert hjerne dias i hæmatoxylin 560 for 8 min.
  5. Skyl hver hjerne dias i vand fra hanen.
  6. Skelne hver hjerne dias med 1% syre alkohol for 1 s tre gange.
  7. Skyl hver hjerne dias i vand fra hanen.
  8. Blå hver hjerne dias med 1% ammoniumhydroxid for 1 s.
  9. Skyl hver hjerne dias i rindende vand i 2 min.
  10. Dehydrere hver hjerne dias i 70% Ethanol (EtOH) for 1 s 12 gange.
  11. Counterstain hver hjerne dias i eosin for 1 min.
  12. Dehydrere hver hjerne dias i 95% EtOH for 1 s 12 gange.
  13. Dehydrere hver hjerne dias i 100% EtOH.
  14. Ryd hvert hjerne dias i xylen og derefter dækglas 2 "x 3" tommer på toppen af diasset hjerne, at fjerne luftbobler med harpiksholdige montering medier.
    Bemærk: Alle løsninger er genbrugt undtagen vand og ethanol til flere dage af farvning og flere dias. Alle behandling efter hjernen sektioner er placeret på dias er udført i glas farvning krukker, men farvning plastbeholdere er kommercielt tilgængelige også. Erstatte enhver løsning, når det bliver misfarvet og holde dem tæt dækket.

6. hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning af canine carotiderne

Bemærk: Dette er vist i figur 1 (venstre).

  1. Efter 24-72 timer i 10% formalin, halveret den tilskadekomne carotis på midten af blodprop og integrere ~ 1 cm af tilskadekomne carotis og ~ 1 cm af de kontralaterale kontrol i den samme paraffin kassette.
    Bemærk: Blodprop inde carotis er skrøbelige. Vent, indtil skibet har rettet i 10% formalin før opskæring så at størkne ikke forstyrres. Integrere begge de sårede og styre carotis arterierne i samme paraffin blok vil tillade skære på samme tid på samme sted i blodkar.
  2. Trim paraffinblokke indtil niveau med en mikrotom, at fjerne eventuelle yderligere paraffin. Derefter skæres sektioner på 4 µm på 25 mm x 75 mm x 1 mm dias uden at rotere paraffin blok, således at de kontralaterale carotis sektioner er placeret øverst i diaset.
    Bemærk: Tre carotis sektionerne var placeret på hvert dias, men man kan tilføje afhængigt af pletter af interesse.
  3. De paraffinize hver carotis dias og fugte i vand fra hanen.
    Bemærk: I modsætning til hjernen diaset, som skal behandles individuelt, carotis dias kan behandles i bulk ved at placere i krukker, som passer til flere dias på en gang uden at røre hinanden.
  4. Pletten hver carotis dias i hæmatoxylin for 8 min.
  5. Skyl hver carotis dias i vand fra hanen.
  6. Skelne hver carotis dias med 1% syre alkohol for 1 s tre gange.
  7. Skyl hver carotis dias i vand fra hanen.
  8. Blå hver carotis dias med 1% ammoniumhydroxid for 1 s.
  9. Skyl hver carotis dias i rindende vand i 2 min.
  10. Dehydrere hver carotis dias i 70% EtOH for 1 s 12 gange.
  11. Counterstain hver carotis dias i eosin eller 1 min.
  12. Dehydrere hver carotis dias i 95% EtOH for 1 s x 12.
  13. Dehydrere hver carotis dias i 100% EtOH.
  14. Ryd hvert carotis dias i xylen og tilføje en 24 mm x 50 mm coverslip med harpiksholdige montering medier til at fjerne luftboblerne.

7. 2,3,5-trifenyl-2H-tetrazolium chlorid (TTC) farvning af Canine hjernen

Bemærk: Dette er vist i figur 3 c.

  1. Placer afsnittet andre 4 mm fjernet fra midten af den umiddelbart proksimale til afsnittet H & E i hjernen tidligere forberedt 2% TTC (carotis arterieokklusion). Inkuber i mørke ved 37 ° C i mindst 20 min., drejning over afsnittet hjerne til selv farvning hvert 5 min.
    Bemærk: Efter 20 min, afsnittet skal være kirsebær rød på begge sider. Ekstra tid kan være behov for baseret på TTC friskhed og tykkelse af væv sektion.
  2. Fjerne TTC løsningen og erstatte det med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS, pH 7,4 at optimere for farvekontrast.
  3. Når kontrasten mellem hvide og røde pletter er optimal, sted TTC hjernen skiver mellem klar plast plader, tør overskydende væske og scanning i høj opløsning for sporing af iskæmiske områder.
    Bemærk: Sektioner kan gemmes på ubestemt tid i PARAFORMALDEHYD løsning, men farvning vil blegne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter de detaljerede procedurer heri vil resultere i udviklingen af en model, der kan bruges til profylaktisk eller trombolytisk vurdering af okklusiv arteriel interventioner. Figur 1A viser baseline strømningshastighed og den resulterende blod flow hastighed før, under og efter behandling, registreres af en kommerciel software. Data fra denne optagelse kan bruges til at bestemme procentdelen af re perfusion med halspulsåren skade og behandling i denne canine model. Figur 1B viser et eksempel på både de kontralaterale (øverst) og sårede (nederst) canine carotis sektioner plettet med H & E, der kontrollerer re kanalbygning status på tidspunktet for offer. Et væld af software-programmer er tilgængelige til at analysere perfused inden for fartøjet ved sporing blodkar (uden Trombe), som kan være divideret med arealet af fartøjet at ankomme på en procent af kanalbygning med hver behandling. Figur 2 viser flere eksempler på halspulsåren angiografi detaljeret i denne canine imaging protokol, som kan bruges til at afgøre, om blodprop er okklusiv. Derudover kan bruger firkantede flow sonden som en markør, efterforskere bestemme længden af blodprop for hver tidspunkt, angiogram er taget. Men her har vi præsenteret billeder før skade, 60 min. efter køretøj behandling, og på tidspunktet for offer, kan investigator skræddersy imaging til deres behov. Figur 3 er resultatet af de magnetiske imaging parametre anvendes til canine hjernen ~ 4 h efter carotis arterieokklusion umiddelbart før offer, udnytter både diffusion vægtet (figur 3A) og T2 vægtet imaging (figur 3B) beskrevet i afsnit 4 i denne protokol. Selvom vi viser kun ét foto af hele arrayet taget på forskellige niveauer i hjernen, kan størrelsen af både blødning og slagtilfælde volumen identificeret i forskellige niveauer og områder af hjernen og quantitated på hvert tidspunkt ønsket af investigator. Kvantitering er fuldført ved hjælp af specifikke MRI maskine software specifikt for investigators imager. Den TTC farvning resultaterne som vist i figur 3 c kan bruges til at afgrænse hjernevæv, hvor cellerne er stadig metabolisk aktive ud over dem, ikke der. TTC reduceres enzymatisk til resultere i rød farvede levende celler, hvorimod døde celler ikke vil beholde TTC og dermed ikke bliver røde. Endelig hæmatoxylin og eosin pletter teknik demonstreret i canine hjernen i figur 3D vil resultere i farvning røde blodlegemer lyse rødt, som kan bruges til at kontrollere områder hvor blødning opstod.

Figure 1
Figur 1: overvågning af carotis blodgennemstrømningen. (A) repræsentative halspulsåren blod hastighed (mL/min) optaget fra Doppler sonde fra baseline før skade gennem offer. (B) repræsentant H & E farvning af både tilstoppet halspulsåren (nederst) og kontralaterale kontrol (øverst). Forstørrelsen er på 20 X. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: overvågning af carotis blodgennemstrømningen af angiografi. Repræsentative angiografi opfattelse af lige canine halspulsåren. Billeder blev taget på baseline før køretøjet infusion (A), 60 min efter køretøj infusion (B), og på tidspunktet for offer, 4,5 h efter okklusion (C). Røde pile angiver lokationen på fartøj af FeCl3-induceret skade hvor navlestrengen båndet blev placeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant billeder af canine hjernen efter køretøj behandling. Magnetisk resonans Imaging (MR) udført ~ 4 h efter okklusion, umiddelbart før offer, udnytte diffusion vægtet imaging (DWI, (A) og T2 vægtet imaging (B). TTC farvning af mediale sektion på tidspunktet for offer at afgrænse lever fra dødt væv (C). H & E farvning af mediale afsnit, straks proksimalt for TTC afsnit, på tidspunktet for offer at afgrænse væv som er metabolisk aktive (rød) fra dem, ikke der TTC er reduceret til en rød produkt når det tages af levende celler og derfor vil resultere i sektioner, der kan kvantificeres med et væld af software til at spore live vs døde regioner. (D). venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Eksperimentelle Parameter T2-vægtede Diffusion vægtet
Gentagelse tid (TR) ms 4000 4600
ECHO tid (TS) ms 75 86
Flip vinkel, grader 180 90
Erhvervelse matrix 320 x 256 231 x 257
Antallet af gennemsnit 2 4
I flyet Originalbilledets opløsning (pixels/mm) 2.4615 0.9333

Tabel 1: magnetisk resonans Imaging (MR) parametre. Mr parametre, der er blevet udviklet for canine T2 - og Diffusion-vægtede billeder for at maksimere for vurdering af slagtilfælde og blødning volumen måling i canine carotis arterie trombose model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FeCl3 induceret vaskulære skade model er almindeligt anvendt til at studere trombose i små dyr og er let at oversætte til et stort dyr, prækliniske model med et væld af fordele. Mindre ændringer at tilpasse protokollen til en canine tillade udnyttelse af begge magnetisk resonans at vurdere slagtilfælde og blødning mængder efter en farmakologisk intervention og angiografi til at vurdere fartøj kanalbygning før, under, og efter behandling. Andre trombotiske store dyremodeller har ikke studeret stabiliseret okklusiv trombi på stedet for skade og derfor ikke kan udnytte angiografi og histologi i halspulsåren at vurdere omfanget af re kanalbygning for hver profylaktisk eller trombolytisk behandling. Ud over de fordele ved et stort dyr, som omfatter rigelig væv til analyse (plasma, urin, organer til undersøgelser af toksicitet, osv.), efterligner den store dyremodel langt tættere hjertefrekvens, blodtryk og koagulationskaskaden hos mennesker end gnavere modeller. Passende størrelse af både hjernen og carotis arterierne, resulterer i histologiske og biologisk materiale, der kan bruges til et utal af inflammatoriske og biokemiske undersøgelser på hvert eksperimentelle dyr. En anden fordel ved ændring af FeCl3-induceret vaskulære model i en hunde er, at en meget større blodvolumen kan udvindes under eksperimentet uden at ændre trombocyt reaktivitet eller blodprop dannelse sådan der blod gas og komplet blod tæller kan blive overvåget i hele den skade og narkotika infusion. Derudover har ferrichloridopløsning skade tilskrevet oxidant skader; Derfor vil det efterligner aterosklerotisk skader, der går forud for kliniske slagtilfælde og myokardieinfarkt langt tættere end de andre typer af offentliggjort arteriel skade modeller7. Endelig, mekaniske interventioner såsom thrombectomy, som rutinemæssigt anvendes klinisk, kan følge farmakologisk behandling, således at re-stenose og status i endothelial væg sundhed kan behandles med rigelig histologiske væv for flere undersøgelser på den samme hunde.

Begrænsningerne i denne model er få men skal overvejes. Første, selv om det tidspunkt, og behandling valgt i denne publikation (ofre 4,5 h efter carotis arterie skade, køretøj) resulterede ikke i en målbar slagtilfælde eller blødning, denne metode er klinisk relevant for undersøgelsen af roman anti-trombotiske og trombolytisk agenter til at fastslå effektiviteten og dosering. Ja, både slagtilfælde og/eller blødning med den oprindelige trombotiske fornærmelse eller med farmakologisk behandling (dvs. rTPA) sker med denne model. For det andet, canine omkostninger for køb, levering, genmanipulation og diæten er ganske høje og koste uoverkommelige indtil et stof er godt præget i gnavere modeller.

Kritiske trin i protokollen center på trombocyt aktivering, sammenlægning og vedhæftning, kernen i trombose. Da blodplade funktion Analyzer (PFA-100) kan udføres med 1600 µL fuldblod i to eksemplarer, er denne metode enkel og let at spore trombocyt reaktivitet under hele proceduren uden at påvirke blod homøostase. Yderligere ex vivo undersøgelser i trombocyttal aktivitet ved hjælp af impedans eller lumi-aggregometry kan udføres før vaskulære skade uden at påvirke experimental trombose, så længe de sidste blod drage er > 1 uge før operationen ud over efter skade og behandling på tidspunktet for offer. Som tidligere diskuteret yderligere programmer umbilical tape gennemblødt i 50% FeCl3 kan være nødvendige afhængigt af køn, race eller alder af hver canine. Vi tilladt 30 minutter efter skade for okklusion og genanvendes frisk 50% FeCl3 i en anden 15 min. Hvis det er nødvendigt. Denne proces resulterede ikke i en betydelig forskel i trombolytisk afvigelse med alder eller køn ved hjælp af voksne beagler. I denne undersøgelse har vi belyst de kritiske og state-of-the-art diffusion vejede imaging (DWI), en hr. imaging baseret på måling af Brownske bevægelser (tilfældig diffusion i partikler) af vandmolekyler i væv voxel. Denne teknik er nyttig i detektion af akut iskæmisk slagtilfælde blandt andre patologier såsom tumorer ved viser diffusion i hyper-cellulære væv eller dem med cellulære hævelse er lav med højere diffusion koefficient17,18 ,19. Diffusion kort variere med diffusion af vandmolekyler i hjernen væv17,18,19. B-værdien måler gradienten for formidling af H2O molekyler. På webstedet iskæmisk skade oplevelser den frie vand stærkeste signal dæmpning på højere B-værdier19.

Ud over brugen af denne canine protokol for studier i dosering, toksicitet, og virkningen af profylaktiske og trombolytisk agenter gør størrelsen af en hunde eksperimenter i mekaniske thrombectomy klinisk relevante og let opnåelige. Halspulsåren kan behandles let, farves, og vurderede udnytte protokoller for menneskelige histologi for undersøgelse af immun celle infiltration efter blodprop hentning. Disse undersøgelser vil være vores næste detaljerede protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Vi vil gerne takke centeret for kognitive og adfærdsmæssige Brain Imaging ved The Ohio State University for deres finansielle og videnskabelig støtte til at udvikle og udføre canine magnetisk resonans.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/8” umbilical tape  Jorgensen Laboratories Inc.,  #J0025UA  for ferric chloride application
4% paraformaldehyde in PBS Alfa Aesar AAJ61899AP
10% neutral buffered formalin  Richard-Allan Scientific 5701
 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)  Sigma Aldrich T8877
ADP/Collagen cartridges Siemens Diagnostics B417021A
4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer  Becton Dickinson BD 369714
4.5 ml lithium heparin vacutainer  Becton Dickinson BD 368056
EDTA K3 vacutainers  Becton Dickinson BD455036
Doppler flow probe Transonic Systems Inc MA2.5PSL
Hematoxylin 560  Surgipath 3801570
Eosin Surgipath 3801602
LabChart Software ADInstruments Inc.
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) NovaPlus 402525D
HUG-U-VAC positioning system   DRE Veterinary 1320

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adams, H. P. Jr Stroke: a vascular pathology with inadequate management. Journal of Hypertension Supplement. 21 (5), S3-S7 (2003).
  2. Lansberg, M. G., Bluhmki, E., Thijs, V. N. Efficacy and safety of tissue plasminogen activator 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke: a metaanalysis. Stroke. 40 (7), 2438-2441 (2009).
  3. Nagel, S., et al. Therapy of acute basilar artery occlusion: intraarterial thrombolysis alone vs bridging therapy. Stroke. 40 (1), 140-146 (2009).
  4. Ciccone, A., Motto, C., Abraha, I., Cozzolino, F., Santilli, I. Glycoprotein IIb-IIIa inhibitors for acute ischaemic stroke. The Cochrane database of systematic reviews. 3 (3), (2014).
  5. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. New England Journal of Medicine. 333 (24), 1581-1588 (1995).
  6. Leadley, R., Chia, L., Rebellob, S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
  7. Bodary, P. F., Eitzman, D. T. Animal Models of Thrombosis. Current Opinion In Hematology. 16 (5), 342-346 (2009).
  8. Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circulation Research. 100 (7), 979-991 (2007).
  9. Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. Journal of Visualized Experiments. (100), e52838 (2015).
  10. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  11. Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (6), 1452-1460 (2011).
  12. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  13. Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and Thrombosis: Insights from Large Animal Models. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-12 (2011).
  14. Coller, B. S., Folts, J. D., Smith, S. R., Scudder, L. E., Jordan, R. Abolition of in vivo Platelet Thrombus Formation in Primates with Monoclonal Antibodies to the Platelet GPIIb/IIIa Receptor. Correlation with Bleeding Time, Platelet Aggregation, and Blockade of GPIIb/IIIa Receptors. Circulation. 80 (6), 1766-1774 (1989).
  15. Folts, J. An in vivo Model of Experimental Arterial Stenosis, Intimal Damage, and Periodic Thrombosis. Circulation. 83 (6 Suppl), (1991).
  16. Yasuda, T., et al. A canine model of coronary artery thrombosis with superimposed high grade stenosis for the investigation of rethrombosis after thrombolysis. Journal of the American College of Cardiology. 13 (6), 1409-1414 (1989).
  17. Schob, S., et al. Correlation Between Aquaporin 4 Expression and Different DWI Parameters in Grade I Meningioma. Molecular Imaging and Biology : MIB : the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 19 (1), 138-142 (2017).
  18. Schob, S., et al. Diffusion-Weighted Imaging Using a Readout-Segmented, Multishot EPI Sequence at 3 T Distinguishes between Morphologically Differentiated and Undifferentiated Subtypes of Thyroid Carcinoma-A Preliminary Study. Translational Oncology. 9 (5), 403-410 (2016).
  19. Schob, S., et al. Diffusion-Weighted MRI Reflects Proliferative Activity in Primary CNS Lymphoma. Public Library of Science One. 11 (8), e0161386 (2016).

Tags

Medicin sag 139 ferrichloridopløsning trombose hunde carotis arterie dyr Model vaskulære skade Doppler flow meter magnetisk resonans angiografi
Ferrichloridopløsning-induceret Canine carotis arterie trombose: En stor dyr Model af vaskulære skade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huttinger, A. L., Wheeler, D. G.,More

Huttinger, A. L., Wheeler, D. G., Gnyawali, S., Dornbos III, D., Layzer, J. M., Venetos, N., Talentino, S., Musgrave, N. J., Jones, C., Bratton, C., Joseph, M. E., Sen, C., Sullenger, B. A., Nimjee, S. M. Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury. J. Vis. Exp. (139), e57981, doi:10.3791/57981 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter