Summary
यहाँ, हम एक बड़े जानवर संवहनी चोट मॉडल में उपयोग के लिए एक अच्छी तरह से चरित्रीय और आमतौर पर छोटे जानवर घाट क्लोराइड-प्रेरित (FeCl3) मन्या धमनी की चोट मॉडल इस्तेमाल करने के लिए आवश्यक संशोधनों प्रस्तुत करते हैं । परिणामस्वरूप मॉडल दोनों नियत्रंण और thrombolytic औषधीय और यांत्रिक हस्तक्षेप के पूर्व नैदानिक परीक्षण मूल्यांकन के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
Abstract
पूर्णावरोधक धमनी घनास्त्रता मस्तिष्क कोरोनरी स्ट्रोक और रोधगलन के लिए अग्रणी करने के लिए योगदान देता है ~ १३,०००,००० हर साल विश्व स्तर पर मौतें. यहां, हम एक छोटे जानवर से एक बड़े जानवर (कुत्ते) में एक संवहनी चोट मॉडल अनुवाद किया है, मामूली संशोधन है कि पूर्व नियत्रंण और thrombolytic एजेंटों के नैदानिक जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ । सर्जिकल तरीकों के अलावा, संशोधित प्रोटोकॉल के लिए कदम दर कदम तरीकों का वर्णन मन्या धमनी canalization द्वारा एंजियोग्राफी, दोनों मस्तिष्क और मन्या धमनी ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए प्रक्रिया करने के लिए विस्तृत निर्देश मन्या सत्यापित करने के लिए canalization और मस्तिष्क नकसीर, और विशिष्ट मापदंडों चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) का उपयोग करके बहाव thromboembolic घटनाओं के एक आकलन को पूरा करने के लिए । इसके अलावा, पहले अच्छी तरह से स्थापित छोटे जानवर एक बड़े जानवर (कुत्ते) संवहनी चोट में अनुवाद करने के लिए आवश्यक मॉडल से विशिष्ट प्रक्रियात्मक परिवर्तन पर चर्चा कर रहे हैं ।
Introduction
स्ट्रोक थेरेपी मुख्यतः कोरोनरी धमनी रोग के उपचार के बाद मॉडलिंग की है, मुख्य रूप से क्योंकि हृदय रोग में हस्तक्षेप दवा चिकित्सा और अंतर्वाहिकी हस्तक्षेप करने के लिए अच्छी तरह से जवाब दिया है1. इन उपचार, तथापि, मस्तिष्क रोधगलन के लिए सफलतापूर्वक अनुवाद नहीं किया है । वर्तमान स्ट्रोक उपचार के साथ कठिनाइयों कर रहे है कि रिकॉमबिनेंट ऊतक plasminogen उत्प्रेरक (rTPA) उलट नहीं किया जा सकता है, और है कि प्रशासन रक्तस्रावी रूपांतरण2,3 के एक महत्वपूर्ण ६.४% जोखिम वहन करती है, 4. जिसके परिणामस्वरूप रुग्णता और मृत्यु एक छोटी सी, अक्सर अप्राप्य खिड़की5करने के लिए इसके उपयोग की सीमा । इसके अलावा, restenosis और रोड़ा अक्सर प्रारंभिक thrombolysis के बाद, प्रारंभिक स्नायविक सुधार reversing होते हैं । सारांश में, वहां एक संकीर्ण लौकिक खिड़की के लिए rTPA है कि बड़े बहुमत (~ ९०) रोगियों जो कोरोनरी मस्तिष्कवाहिकीय अपमान पीड़ित के शामिल नहीं है प्रशासन है ।
नसों में antiplatelet चिकित्सा की भूमिका में सुधार पोत recanalization, अस्तित्व और परिणाम2के साथ कोरोनरी स्ट्रोक के इलाज में वादा दिखाया गया है । दुर्भाग्य से, इन दवाओं के अंतर कपाल और अतिरिक्त कपाल नकसीर का एक पूर्वानुमान पक्ष प्रभाव है, मोटे तौर पर है क्योंकि वहां कोई रास्ता नहीं पर्याप्त रूप से रिवर्स या अपनी गतिविधि को नियंत्रित2है । जबकि प्लेटलेट एकत्रीकरण को रोकने में प्रभावी, नकसीर का खतरा है और उनकी गतिविधि रिवर्स करने में असमर्थता स्ट्रोक रोगियों की दिनचर्या की देखभाल में उनके उपयोग precluded है । एक जरूरत है, इसलिए, शक्तिशाली antithrombotic दवाओं है कि अकेले या संयोजनों को रोकने के लिए और लाइसे के थक्के अभी तक एक सुरक्षा प्रोफ़ाइल है कि एक बंद में उपयोग की अनुमति देगा के लिए मौजूद है, कम मात्रा अंतरिक्ष जैसे मस्तिष्क, जहां नकसीर खराब सहन किया है ।
धमनी घनास्त्रता और पुनः के तंत्र को समझना-एक प्रकार का रोग, और मूल्यांकन thrombolytics और दवाओं है कि फिर से रोकने-एक प्रकार का रोग, पूर्व नैदानिक दवा के विकास के एक भाग के रूप में दोनों छोटे और बड़े पशु मॉडल की आवश्यकता है । घाट क्लोराइड-प्रेरित संवहनी चोट तेजी से और सही ढंग से चूहों, चूहों, गिनी सूअरों के उजागर रक्त वाहिकाओं में थ्रोम्बी के गठन को प्रेरित करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग तकनीक है, और खरगोश6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. इन छोटे प्रजातियों आनुवंशिक हेरफेर, सस्ती पशु खरीद, और एचडीएम आवास लागत प्रति कम की आसानी सहित कई लाभ प्रदान करते हैं । दुर्भाग्य से, छोटे जानवर प्रयोगों प्लेटलेट जेट, रक्त गैस विश्लेषण, और भड़काऊ प्रतिक्रिया का उपयोग करने के लिए सर्जरी के दौरान कई रक्त ड्रॉ नकारना. इससे भी महत्वपूर्ण बात, बड़े जानवरों ज्यादा बारीकी से मानव प्लेटलेट फिजियोलॉजी6,13की नकल । FeCl3 मन्या धमनी चोट मॉडल घनास्त्रता के pathophysiology के अध्ययन में एक प्रमुख भूमिका निभाई है, उपंयास विरोधी प्लेटलेट और विरोधी कौयगुलांट दवाओं के सत्यापन में है, और संभावित thrombolytics6 की खोज में , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. चूहों में पिछले मॉडल, चूहों, गिनी सूअर, और खरगोश आनुवंशिक हेरफेर के लिए आसानी और लचीलापन प्रदान की है, लेकिन अनुवाद पूर्व नैदानिक मॉडल रोगी खुराक और विषाक्तता के लिए महत्वपूर्ण हैं संभावित चिकित्सीय चिकित्सा के अध्ययन6 ,13. हालांकि थ्रोम्बोटिक विकारों के कई मॉडलों चूहों में विकसित किया गया है, परिधीय संवहनी रोग, स्ट्रोक और रोधगलन के लिए लागू कर रहे हैं कि घनास्त्रता के बड़े पशु मॉडल कुछ और दूर हैं. बंदरों, कुत्तों, और एक प्रकार का रोग पर ध्यान केंद्रित सूअरों में पहली घनास्त्रता मॉडल, hemostats लागू करने और बाद में जहाजों के लिए सिलिंडरों, सामांयतः चक्रीय प्रवाह में कटौती14,15,16में जिसके परिणामस्वरूप । घाट क्लोराइड मॉडल के रूप में endothelial क्षति के स्थल पर एक पूर्णावरोधक थक्का के बजाय, इन मॉडलों में थक्का चक्रीय घनास्त्रता, बाहर embolization के परिणामस्वरूप और सामान्य रक्त प्रवाह के लिए वापस । इसकी तुलना में, घाट क्लोराइड मॉडल एक बड़े जानवर में यहां संशोधित, चोट साइट पर एक पूर्णावरोधक थक्का में परिणाम और स्थिर है और thrombolytic उपचार से पहले एंजियोग्राफी द्वारा सत्यापित । बशर्ते कि जांचकर्ता एचडीएम प्रति और कुत्ते और पर्याप्त शल्य चिकित्सा विशेषज्ञता की खरीद के लिए पर्याप्त धन है, हम यहां विस्तार संवहनी चोट का एक बड़ा कुत्ते मॉडल प्रयोगशालाओं शल्य चिकित्सा, इमेजिंग और ऊतकवैज्ञानिक का उपयोग घनास्त्रता अध्ययन करने की अनुमति तकनीक.
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Protocol
जांच की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के अनुरूप वर्णित है और ओहियो राज्य विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (#2015A00000029) द्वारा अनुमोदित किया गया । सभी शल्य चिकित्सा जोड़तोड़ गहरी संज्ञाहरण के तहत प्रदर्शन किया और जानवरों की प्रक्रिया के दौरान किसी भी स्तर पर दर्द का अनुभव नहीं किया गया । वर्णित सभी प्रयोगों गैर वसूली थे ।
1. तैयारी
- हौसले से घाट क्लोराइड (FeCl3) के ५० मिलीलीटर तैयार ५०% (डब्ल्यू/वी) में पानी में पतला ।
- ५.५ cm टुकड़ों में नाल टेप काटें और इस प्रक्रिया से पहले हौसले से तैयार ५०% FeCl3 समाधान 1 सप्ताह में भिगो दें ।
नोट: नाल टेप इस्तेमाल किया मोटी है और कुछ समय के लिए ५०% FeCl3 समाधान अवशोषित लेता है । - तेजी से प्रत्येक कुत्ते को सर्जरी से पहले रातोंरात ।
- लेबल cryovials प्लाज्मा और मूत्र संग्रह के लिए, ५० मिलीलीटर बाँझ केंद्रापसारक सभी अंग भंडारण के लिए ट्यूब, और मस्तिष्क और एच एंड ई के लिए मन्या निर्धारण के लिए 10% formalin कंटेनरों पशु पहचान, जन्म तिथि, सर्जरी की तारीख, और उपचार के साथ धुंधला.
- प्रत्येक कुत्ते की प्रक्रिया के लिए प्रत्येक समाधान के १०० मिलीलीटर तैयार: फॉस्फेट में 4% paraformaldehyde (पीएच ७.४), 10% तटस्थ बफर formalin, और 2% 2, 3, 5-triphenyltetrazolium क्लोराइड [टीटीसी में (पीएच ७.४), स्टोर अंधेरे में) ।
- प्रक्रिया के दिन के लिए फ्लैश ठंड के लिए सभी cryovials और ५० मिलीलीटर ऊतक ट्यूबों के लिए पर्याप्त तरल नाइट्रोजन प्राप्त करें ।
- पीएफए के लिए दो ADP/कोलेजन कारतूस मोल-१०० (प्लेटलेट समारोह विश्लेषक) ब्याज की प्रत्येक समय बिंदु के लिए प्रत्येक कुत्ते के लिए प्लेटलेट जेट ।
- एक ४.५ मिलीलीटर सोडियम साइट्रेट रक्त संग्रह ट्यूब प्राप्त, बलिदान से पहले प्रत्येक रक्त ड्रा के लिए, प्लाज्मा जुदाई और भंडारण के लिए । बलिदान पर, प्लाज्मा भंडारण के लिए 16 रक्त संग्रह ट्यूबों ड्रा । के बाद प्रत्येक रक्त संग्रह ट्यूब भरा है, ४,००० एक्स जी में स्पिन 30 एस के लिए प्लेटलेट रिच प्लाज्मा को अलग और cryovials में स्पष्ट परत हस्तांतरण । -८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज ।
- एक प्राप्त ४.५ मिलीलीटर लिथियम हेपरिन रक्त संग्रह ट्यूब, प्रत्येक पीएफए के लिए-१०० प्लेटलेट जेट रिकॉर्ड करने के लिए ब्याज की समय बिंदु । प्रत्येक रक्त ड्रा में, एक लिथियम हेपरिन रक्त संग्रह ट्यूबों से एक ADP/कोलेजन कारतूस में हवा के बुलबुले के बिना प्लेटलेट जेट का पालन करने से पूरे खून की ८०० µ एल परिचय ।
- अधिग्रहण दो EDTA K3 रक्त संग्रह ट्यूबों (१.८ मिलीग्राम के रक्त की 1 मिलीलीटर प्रति निर्जल EDTA), बेसलाइन पर पूरा रक्त गणना (सीबीसी) के लिए और बलिदान के समय में ।
नोट: यह मात्रा यांत्रिक त्रुटि के मामले में प्रत्येक दो बार चलाने के लिए सबसे महत्वपूर्ण सुविधाओं के लिए पर्याप्त है. हालांकि एक सीबीसी चोट से पहले दोनों आधार रेखा पर चला गया था और बलिदान के समय में, जांचकर्ताओं और अधिक रक्त के रूप में अतिरिक्त विश्लेषण के लिए अपने पशु प्रोटोकॉल में अनुमोदित ड्रॉ जोड़ सकते हैं । अपने उपकरणों के लिए मात्रा और वितरण आवश्यकताओं के रूप में इस सुविधा के साथ की जाँच करें । - एक 2 मिलीलीटर heparinized भरने और सिरिंज के बलिदान के समय रक्त गैस विश्लेषण के लिए प्रक्रिया के दिन कोटिंग द्वारा सिरिंज तैयार करें ।
नोट: अपने उपकरणों के लिए मात्रा और वितरण आवश्यकताओं के रूप में सुविधा के साथ की जाँच करें.
2. कुत्ते मन्या धमनी रोड़ा
- एक वयस्क वजन (> 18 महीने) बीगल कुत्ते और इंट्रामस्क्युलर acepromazine के साथ पूर्व औषधि (०.०२५-.2 मिलीग्राम/intraperitoneal के एक प्रारंभिक ketamine इंजेक्शन के बाद (5-20 मिलीग्राम/किग्रा) और मिदाजोलम (०.०१-.25 मिलीग्राम/ दिल की दर, श्वसन, और जबड़े टोन के आधार पर 1-5% isoflurane के साथ गहरी संज्ञाहरण के लिए प्रेरित ।
नोट: सटीक संज्ञाहरण वजन और अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल द्वारा तय किया जाता है । हालांकि इंजेक्शन जानवरों के लिए दर्द में परिणाम हो सकता है, इस असुविधा की अवधि कम हो जाएगा (3 एस से अधिक) । - पशु को सर्जरी टेबल पर ले जाने से पहले, कतरने से बाल हटा दें । anesthetized जानवर की आंखों के लिए चिकनाई नेत्र मरहम लागू करने के लिए सूखापन को रोकने के ।
- एक पोजिशनिंग सिस्टम का उपयोग कर लापरवाह स्थिति में पशु प्लेस और जी॰ (ईसीजी) पैर पैड को देते हैं । Intubate एक ६.५ मिमी endotracheal ट्यूब के साथ श्वासनली के माध्यम से, यांत्रिक रूप से 14 सांसों/मिनट में हवादार, और बनाए रखने के एक निरंतर साँस लेना के साथ कुत्ते को 1-5% isoflurane (अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है) ।
- मन्या और पूर्णावरोधक थक्का की लंबाई के canalization की हद निर्धारित करने के लिए, चोट से पहले एंजियोग्राफी प्रदर्शन, एमआरआई से पहले, और बलिदान के समय (अतिरिक्त निर्देशों के लिए नीचे देखें).
- एक ऊरु धमनी म्यान और एक प्लास्टिक कैथेटर डालें और एक ढीला 0-रेशम सीवन के साथ सुरक्षित । अस्थाई रूप से परिवहन और इमेजिंग अध्ययन के दौरान म्यान और कैथेटर बंद । अतिरिक्त निर्देशों के लिए नीचे कुत्ते एंजियोग्राफी देखें) ।
- रक्त ड्रॉ के लिए, ऊरु धमनी म्यान कट नीचे साइट के लिए बाहर बरकरार त्वचा के माध्यम से एक 16G x ४५ mm नसों कैथेटर डालें । सर्जिकल जोखिम में कैथेटर अग्रिम और यह कल्पना के रूप में यह तुरंत धमनी म्यान के निकट उजागर ऊरु नस में प्रवेश करती है । एक बार पूरी तरह से नस में डाला, सुई वापस लेने, एक 3 तरह टोंटी के साथ कैथेटर कैप, और यह ०.९% बाँझ खारा के 2 मिलीलीटर के साथ फ्लश । एक 0-रेशम सीवन के साथ त्वचा के लिए कैथेटर सुरक्षित ।
- सही आम मन्या धमनी क्षेत्र के शीर्ष पर सीधे त्वचा की एक 8-10 सेमी चीरा बनाओ और आसपास के ऊतकों से पोत को अलग करने के लिए प्रावरणी काटना ।
- ध्यान से मन्या धमनी और vagus तंत्रिका अलग करने के लिए के बीच संदंश परिचय. के रूप में यह पोत के कसना कारण हो सकता है आवश्यक से अधिक मन्या धमनी को छूने से बचें ।
- FeCl3 समाधान कमजोर पड़ने से बचने के लिए बाँझ धुंध के साथ धमनी के उजागर क्षेत्र सूखी ।
- के आसपास डॉपलर प्रवाह जांच प्लेस मन्या के आसपास प्रवाह जांच को छूने और रक्त वेग रिकॉर्डिंग शुरू और प्रक्रिया भर में जारी रखने के बिना नाल टेप मन्या लपेटो करने के लिए अनुमति देने के लिए अंतरिक्ष (चित्रा 1 शीर्ष). रिकॉर्ड के लिए आधारभूत प्रवाह ~ 5 मिनट नाल टेप लागू करने से पहले ।
नोट: आधारभूत प्रवाह से पहले FeCl3 नाल टेप स्थान आमतौर पर औसत के आसपास २५० मिलीलीटर/ - एक hemostat तुरंत नीचे प्रवाह जांच के लिए यह 15 मिनट के लिए छूने के बिना का उपयोग कर मन्या के आसपास तैयार FeCl3 गर्भनाल टेप लपेटें, निकालें, और त्यागें ।
नोट: रोड़ा शूंय प्रवाह एमएल के रूप में नामित/ - ४५ मिनट के लिए पूर्णावरोधक थक्का स्थिर । जांच के लिए अतिरिक्त खारा जोड़ें के रूप में एक संकेत बनाए रखने की जरूरत है ।
नोट: आयु, लिंग और कुत्ते के प्रकार पर निर्भर करता है, तैयार FeCl3 नाल टेप के अतिरिक्त प्लेसमेंट रोड़ा के लिए 30 मिनट पुनः आवेदन करने से पहले होने के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक हो सकता है । बीगल में लिंग के साथ घाट क्लोराइड आवेदन द्वारा घनास्त्रता में कोई अंतर नहीं मनाया गया । यह इस मॉडल के साथ आवश्यक नहीं पाया गया एक ताजा FeCl3 नाल टेप से अधिक एक बार फिर से लागू है और FeCl3 गर्भनाल टेप तैयारी प्रोटोकॉल से विचलित नहीं है । यदि प्रयोगशाला एक अलग नस्ल या कुत्ते की उंर का उपयोग कर रहा है, FeCl3 गर्भनाल टेप प्रारंभिक विषयों के लिए लागू किया जाना चाहिए सुनिश्चित करें कि घनास्त्रता प्रोटोकॉल विचलित नहीं करता है, या कुत्तों के एक समूह FeCl3 स्थापित करने के लिए आवश्यक हो सकता है उनके विशिष्ट अध्ययन में उस नस्ल या उम्र के लिए आवेदन समय । रोड़ा टाइंस, इस प्रयोग में, FeCl3 नाल टेप आवेदन के बाद 8-30 मिनट से लेकर । - के लिए बहाव thromboembolic घटनाओं जो औषधीय हस्तक्षेप से परिणाम हो सकता है के अलावा स्ट्रोक या रक्तस्राव की मात्रा निर्धारित करने के लिए, अतिरिक्त ketamine इंजेक्शन के साथ एक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग मशीन के लिए कुत्ते परिवहन (के लिए नीचे देखें अतिरिक्त संसाधन) ।
- हालांकि अभी भी एक अंतिम एंजियोग्राम से संज्ञाहरण के एक गहरी शल्य चिकित्सा के तहत/एमआरआई (इमेजिंग प्रोटोकॉल के लिए नीचे देखें), हानिकारक उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संकेत, बाद में विश्लेषण के लिए वांछित पूरे रक्त इकट्ठा, तो पसलियों के माध्यम से काटने से छाती खुला उरोस्थि पर शुरू, और रक्त वाहिकाओं (exsanguination) काटने से दिल उत्पाद ।
नोट: इस प्रयोग में, पूरे रक्त (< 10 mL) को बेसलाइन पर, एजेंट एडमिनिस्ट्रेशन के बाद 5 मिनट और ऊरु म्यान से अर्की के बाद ६० मिनट पर तैयार किया गया और thrombolysis की प्रक्रिया पर कोई प्रभाव नहीं देखा गया । बलिदान पर, एक असीमित मात्रा में अतिरिक्त प्लाज्मा भंडारण के लिए तैयार किया जा सकता है अगर पशु प्रोटोकॉल में मंजूरी दे दी । विश्लेषण, प्रक्रिया और बलिदान के 30 मिनट के भीतर सभी पूरे खून की दुकान । सुनिश्चित करें कि रक्त पशुओं के शरीर के वजन के अनुमोदित प्रतिशत से अधिक में तैयार की है के रूप में अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल पर विस्तृत नहीं है । वर्णित सभी प्रयोगों गैर वसूली थे । - तरल नाइट्रोजन में ०.९% खारा और फ्लैश फ्रीज नमूनों के साथ दिल कुल्ला अगर वांछित ।
- मन्या को हटाने से पहले, यह बगल में एक शासक रखकर और रिकॉर्ड द्वारा थक्का लंबाई मापने । थक्का के बीच पर ऊतक मार्कर प्लेस और contralateral मन्या पर एक ही स्थान पर प्रोटोकॉल ट्रिमिंग में आसानी के लिए. मार्क contralateral मन्या एक ही लंबाई में ।
नोट: इस मॉडल के साथ औसत थक्का लंबाई १.७५ सेमी है । - दोनों जहाजों पर थक्का की पूरी लंबाई निकालें और 10% formalin में ठीक । ऊतक मार्कर द्वारा चिह्नित लंबाई के भीतर contralateral मन्या धमनी निकालें. contralateral मन्या धमनी का थक्का के बीच में आधे में कटौती. फ्लैश फ्रीज आधा contralateral मन्या धमनी तरल नाइट्रोजन में बाद में विश्लेषण के लिए और अन्य आधे को ठीक करने के लिए 10% formalin नीचे ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण के लिए घायल मन्या के पास एम्बेड करने के लिए.
- किसी भी वांछित विश्लेषण के लिए अंगों को निकालें, ०.९% खारा के साथ कुल्ला, और तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज ।
- एक परिपत्र हड्डी के साथ खोपड़ी को दूर देखा । धीरे नीचे मस्तिष्क को नुकसान पहुँचाए बिना खोपड़ी निकालें ।
- मस्तिष्क खोपड़ी से हटा दिया जाता है के बाद, यह ठंड ०.९% खारा में कुल्ला, और एक तेज स्केलपेल के साथ बाद में काटने, मस्तिष्क के बीच से दो 4 मिमी वर्गों में कटौती । कोरोनरी सीमांकन के लिए 2% टीटीसी में 4 मिमी वर्गों में से एक प्लेस (मस्तिष्क टीटीसी के लिए अतिरिक्त प्रसंस्करण देखें), जबकि अन्य टुकड़ा एच और ई के लिए 7 दिनों के लिए 10% formalin में रखा धुंधला (मस्तिष्क के लिए अतिरिक्त संसाधन एच एंड ई देखें).
3. कुत्ते एंजियोग्राफी
नोट: यह चित्रा 2 में दिखाया गया है और ब्याज की समय अंक पर सर्जरी के दौरान किया जाता है ।
- सही वंक्षण क्षेत्र में एक पल्स के लिए लग रहा है और एक 3-5 सेमी ventral sagittal चीरा बनाते हैं ।
- ऊरु धमनी बेनकाब और कुंद विच्छेदन का उपयोग आसपास के ऊतकों से अलग ।
- उजागर धमनी के बाहर के छोर के चारों ओर एक 0-सिल्क सीवन जगह करने के लिए एक सही कोण hemostat का प्रयोग करें ।
- बाहर 0-सिल्क सीवन टाई और ढीला 0-सिल्क टांका दबाना द्वारा धमनी को मामूली तनाव लागू hemostats के साथ त्वचा के लिए समाप्त होता है ।
- उजागर खंड के समीपस्थ अंत के आसपास एक दूसरे 0-सिल्क सीवन प्लेस ।
- धमनी में एक गाइड वायर पारित करने के लिए एक 18G प्रचार सुई का उपयोग कर समीपस्थ और बाहर 0-सिल्क टांका संबंधों के बीच बीच में धमनियों को पंचर ।
- एक इकट्ठे 6Fr म्यान और फैलाव गाइड वायर पर लोड, तार लोभी के रूप में यह विधानसभा से बाहर निकालता है ।
- गाइड वायर पर फैलाव और म्यान को उंनत करें । फैलावर म्यान विधानसभा को आगे बढ़ाने के रूप में यह फैलाव से बहर के रूप में तार की एक फर्म पकड़ बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें ।
- पूर्ण सम्मिलन के बाद, धमनी पंचर साइट पर रक्तस्तम्भन बनाए रखने के लिए म्याना के चारों ओर समीपस्थ 0-सिल्क सीवन टाई ।
- इसके साथ ही फैलाव और गाइड वायर को हटा दें.
- गुणवाला रक्त प्रवाह की उपस्थिति सत्यापित करने के लिए एक तरह से वाल्व खोलें और सामान्य खारा के 3-5 मिलीलीटर के साथ फ्लश ।
- निगरानी और आक्रामक रक्तचाप माप रिकॉर्ड करने के लिए एक दबाव transducer से जुड़ी एक द्रव भरा विस्तार लाइन के लिए पहुँच म्यान एक तरह से वाल्व कनेक्ट.
- पूर्व एक 4Fr. angiographic कैथेटर में एक ०.३५ "गाइड वायर लोड और इसके विपरीत इंजेक्शन कई गुना एक Tuohy y-अनुकूलक के साथ सेट से कनेक्ट ।
- बस कैथेटर के बाहर की नोक के अंदर गाइड वायर की नोक खींचो और खारा के साथ पूरे विधानसभा फ्लश ।
- म्यान के hemostatic वाल्व में angiographic कैथेटर डालें और फिर बाहर की कैथेटर टिप से परे 5 सेमी के बारे में गाइड वायर अग्रिम ।
- fluoroscopic मार्गदर्शन के तहत और एक प्रतिगामी ट्रांस महाधमनी दृष्टिकोण का उपयोग कर, धीरे महाधमनी चाप में कैथेटर अग्रिम ।
- इसके विपरीत एजेंट के 2-3 एमएल सुई सामांय खारा के साथ 1:1 ले-brachiocephalic ट्रंक के बंद की पहचान ।
- brachiocephalic ट्रंक में कैथेटर निर्देशित करने के लिए गाइड वायर का प्रयोग करें, और फिर सही आम मन्या धमनी में चुनिंदा.
- गाइड वायर निकालें और कैथेटर मन्या में रखा गया है सत्यापित करने के लिए पतला कंट्रास्ट के 2-3 मिलीलीटर सुई ।
- undilute विपरीत के 3-4 मिलीलीटर सुई जबकि रिकॉर्डिंग angiographic दोनों डिजिटल घटाव और मानक angiographic तकनीक का उपयोग कर चलाता है ।
- अतिरिक्त समय बिंदुओं पर दोहराई गई एंजियोग्राफी के लिए चरण
4. चुंबकीय अनुनाद-प्रसार भारित इमेजिंग (DWI) और टी 2 भारित इमेजिंग (T2WI) कुत्ते मस्तिष्क की
नोट: यह चित्र 3बी में दिखाया गया है ।
- सुनिश्चित करें कि कुत्ते गहरी संज्ञाहरण के तहत है ।
- सुनिश्चित करें कि ईसीजी और हृदय की दर सहित इमेजिंग भर में कुत्ते के शारीरिक मापदंडों पर नजर रखी जाती है ।
- सुनिश्चित करें कि कुत्ते मस्तिष्क के तार के द्विपक्षीय उद्घाटन में अपने सिर के साथ लापरवाह स्थिति में झूठ बोल रही है ।
- 3 Tesla (3T) चुंबक सक्षम करें ।
- टी 2 भारित इमेजिंग (T2WI), एमआरआई में एक बुनियादी नाड़ी दृश्यों प्रदर्शन ।
नोट: अनुक्रम अलग रोग की स्थिति पर टी 2 विश्राम के समय में मतभेद का उपयोग करता है । - 2 टी-भारित ढाल इको इमेजिंग अनुक्रम का उपयोग कर संरचनात्मक इमेजिंग से पहले एक कुत्ता मस्तिष्क के पायलट छवियों को प्राप्त करने के लिए स्थानीयकरण इमेजिंग प्रदर्शन और दृश्य (FOV), स्लाइस और टुकड़ा मोटाई की संख्या के क्षेत्र को पूरी तरह से मस्तिष्क को कवर निर्धारित करते हैं ।
- निंनलिखित टी 2-पैरामीटर का प्रयोग करें: स्लाइस मोटाई = 3 मिमी, TR = ४,००० ms, ते = ७५ ms, ETL = 7, अधिग्रहण मैट्रिक्स = ३२० x २५६, एफए = १८० ᵒ, FOV = ३२० एक्स ३२० पिक्सल, छवि संकल्प = २.४६१५ पिक्सल प्रति मिमी ।
- एमसीएल रोड़ा के बाद ईको प्लानर DTI सीक्वेंस 4 ज का उपयोग करते हुए और तुरंत कुर्बानी से पहले प्रसार भारित इमेजिंग (DWI) करें ।
- निंन DWI पैरामीटर्स का उपयोग करें: बी = १,५०० s/mm2, स्लाइस मोटाई = 3 मिमी, TR = ४,६०० ms, ET = ८६ ms, ETL = ५५, अधिग्रहण मैट्रिक्स = १४० x १४०, एफए = ९० ᵒ, FOV = 231x257, छवि संकल्प = ०.९३३३ पिक्सल/
5. Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) कुत्ते मस्तिष्क के धुंधला
नोट: यह चित्र 3dमें दिखाया गया है.
- 10% formalin में 7 दिनों के बाद, तेल में 4 मिमी मस्तिष्क वर्गों एंबेड ।
- आयल ब्लॉक ट्रिम कर दीजिए जब तक वे एक microtome के साथ स्तर रहे हैं, मस्तिष्क के ऊतकों के ऊपर से किसी भी अतिरिक्त तेल को हटाने, तो 4 µm पर मस्तिष्क के ऊतकों में कटौती और प्रत्येक 2 "x 3" इंच स्लाइड पर एक मस्तिष्क अनुभाग जगह है ।
नोट: धुंधला होने से पहले, सभी समाधानों को अलग कंटेनर में रखें ताकि स्लाइड को एक समाधान से बाहर सुखाने के बिना दूसरे पर ले जाया जा सके । - De-paraffinize प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड और नल का पानी के साथ हाइड्रेट ।
- Hematoxylin ५६० में 8 मिनट के लिए प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड प्लेस ।
- नल के पानी में प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड कुल्ला ।
- 1 एस के लिए 1% एसिड अल्कोहल के साथ प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड अंतर तीन बार ।
- नल के पानी में प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड कुल्ला ।
- 1 एस के लिए 1% अमोनियम हीड्राकसीड के साथ ब्लू प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड ।
- 2 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड कुल्ला ।
- 1 एस बारह बार के लिए ७०% इथेनॉल (ेतोः) में प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड निर्जलीकरण ।
- Counterstain प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड eosin में 1 मिनट के लिए ।
- 1 एस बारह बार के लिए ९५% ेतोः में प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड निर्जलीकरण ।
- १००% ेतोः में प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड निर्जलीकरण ।
- xylene में प्रत्येक मस्तिष्क स्लाइड स्पष्ट और फिर मस्तिष्क स्लाइड के शीर्ष पर एक 2 "x 3" इंच coverslip लागू होते हैं, राल बढ़ते मीडिया के साथ हवा के बुलबुले को हटाने ।
नोट: सभी समाधान धुंधला और एकाधिक स्लाइड के कई दिनों के लिए पानी और इथेनॉल को छोड़कर reused कर रहे हैं । सभी प्रसंस्करण के बाद मस्तिष्क वर्गों स्लाइड पर रखा जाता है कांच धुंधला जार में किया जाता है, लेकिन प्लास्टिक धुंधला कंटेनरों व्यावसायिक रूप से भी उपलब्ध हैं । किसी भी समाधान की जगह जब यह फीका हो जाता है और उंहें कसकर कवर किया जाता है ।
6. Hematoxylin और Eosin (एच एंड ई) कुत्ते मन्या के धुंधला
नोट: यह चित्र 1 (बाएं) में दिखाया गया है ।
- 10% formalin में 24-72 ज के बाद, घायल मन्या थक्का के बीच में आधे में कटौती और एंबेड ~ 1 सेमी के घायल मन्या और एक ही आयल कैसेट में contralateral नियंत्रण के ~ 1 सेमी.
नोट: मन्या के अंदर खून का थक्का नाजुक है. इस पोत को काटने से पहले 10% formalin में तय किया गया है जब तक रुको ताकि थक्का परेशान नहीं है । एक ही तेल ब्लॉक में दोनों घायल और नियंत्रण मन्या धमनियों embedding रक्त वाहिनियों में एक ही स्थान पर एक ही समय में काटने की अनुमति देगा । - किसी भी अतिरिक्त तेल को हटाने, एक microtome के साथ स्तर तक आयल ब्लॉक ट्रिम कर दीजिए । फिर 4 µm पर वर्गों में कटौती के लिए 25 मिमी x ७५ मिमी x 1 मिमी स्लाइड आयल ब्लॉक घूर्णन के बिना ताकि contralateral मन्या वर्गों स्लाइड के शीर्ष पर रखा जाता है.
नोट: तीन मन्या अनुभागों पर प्रत्येक स्लाइड के लिए रखा गया था, लेकिन एक ब्याज के दाग पर निर्भर करता है जोड़ सकते हैं । - De-paraffinize प्रत्येक मन्या स्लाइड और नल के पानी में हाइड्रेट.
नोट: मस्तिष्क स्लाइड जो व्यक्तिगत रूप से संसाधित किया जाना चाहिए विपरीत, मन्या स्लाइड थोक में जार जो एक दूसरे को छूने के बिना एक समय में कई स्लाइड फिट में रखकर संसाधित किया जा सकता है. - hematoxylin में 8 मिनट के लिए प्रत्येक मन्या स्लाइड दाग.
- प्रत्येक मन्या स्लाइड नल का पानी में कुल्ला.
- प्रत्येक मन्या स्लाइड 1% एसिड अल्कोहल के साथ 1 s के लिए तीन बार अंतर ।
- प्रत्येक मन्या स्लाइड नल का पानी में कुल्ला.
- 1 एस के लिए 1% अमोनियम हीड्राकसीड के साथ नीला प्रत्येक मन्या स्लाइड ।
- 2 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में प्रत्येक मन्या स्लाइड कुल्ला.
- निर्जलीकरण प्रत्येक मन्या स्लाइड ७०% ेतोः में 1 s बारह बार के लिए ।
- Counterstain प्रत्येक मन्या स्लाइड eosin या 1 मिनट में ।
- 1 एस एक्स 12 के लिए ९५% ेतोः में प्रत्येक मन्या स्लाइड निर्जलीकरण ।
- प्रत्येक मन्या स्लाइड १००% ेतोः में निर्जलीकरण ।
- xylene में प्रत्येक मन्या स्लाइड साफ़ करें और हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए राल बढ़ते मीडिया के साथ एक 24 मिमी x ५० mm coverslip जोड़ें ।
7.2, 3, 5-triphenyl-2H-tetrazolium क्लोराइड (टीटीसी) कुत्ते मस्तिष्क के धुंधला
नोट: यह चित्र 3 cमें दिखाया गया है ।
- अन्य 4 मिमी खंड तुरंत पहले से तैयार 2% टीटीसी (मन्या धमनी रोड़ा) में एच एंड ई अनुभाग के लिए समीपस्थ मस्तिष्क के बीच से हटा दिया । ३७ डिग्री सेल्सियस से कम 20 मिनट के लिए अंधेरे में गर्मी, यहां तक कि हर 5 मिनट धुंधला के लिए मस्तिष्क अनुभाग पर मोड़ ।
नोट: 20 मिनट के बाद, अनुभाग दोनों तरफ चेरी लाल होना चाहिए । अतिरिक्त समय टीटीसी ताजगी और ऊतक अनुभाग की मोटाई के आधार पर की जरूरत हो सकती है । - टीटीसी समाधान निकालें और यह पंजाब में 4% paraformaldehyde के साथ बदलें, पीएच ७.४ रंग कंट्रास्ट का अनुकूलन करने के लिए ।
- जब सफेद और लाल दाग के बीच इसके विपरीत इष्टतम है, जगह स्पष्ट प्लास्टिक शीट के बीच टीटीसी मस्तिष्क स्लाइसें, अतिरिक्त तरल पदार्थ का सूखा, और कोरोनरी क्षेत्रों के अनुरेखण के लिए उच्च संकल्प पर स्कैन ।
नोट: वर्गों paraformaldehyde समाधान में अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन धुंधला फीका हो जाएगा.
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Representative Results
निंनलिखित विस्तृत प्रक्रियाओं के साथ साथ एक मॉडल है कि पूर्णावरोधक धमनी हस्तक्षेप के नियत्रंण या thrombolytic आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के विकास में परिणाम होगा । चित्र 1a आधारभूत प्रवाह वेग और परिणामस्वरूप रक्त प्रवाह वेग से पहले, के दौरान, और एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर द्वारा दर्ज उपचार के बाद दिखाता है । इस रिकॉर्डिंग से डेटा मन्या धमनी की चोट और इस कुत्ते मॉडल में उपचार के साथ पुनः छिड़काव के प्रतिशत का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 1b दोनों contralateral का एक उदाहरण प्रदान करता है (ऊपर) और घायल (नीचे) कुत्ते मन्या वर्गों H & E के साथ सना हुआ है कि बलिदान के समय में पुनः canalization स्थिति की पुष्टि. सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों की एक भीड़ के लिए रक्त वाहिका अनुरेखण द्वारा पोत के perfused क्षेत्र का विश्लेषण उपलब्ध है (थक्का के बिना) जो पोत के कुल क्षेत्र के द्वारा विभाजित किया जा सकता है प्रत्येक उपचार के साथ canalization का एक प्रतिशत पर पहुंचें । चित्रा 2 इस कुत्ते इमेजिंग प्रोटोकॉल है जो अगर थक्का पूर्णावरोधक है निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में विस्तृत मन्या धमनी एंजियोग्राफी के कई उदाहरण से पता चलता है. इसके अलावा, एक मार्कर के रूप में वर्ग प्रवाह जांच का उपयोग, जांचकर्ताओं हर समय बिंदु एंजियोग्राम लिया जाता है पर थक्का की लंबाई निर्धारित कर सकते हैं । हालांकि, यहां हम छवियों को चोट से पहले प्रस्तुत किया है, वाहन उपचार के बाद ६० मिनट, और बलिदान के समय में, अन्वेषक अपनी आवश्यकताओं के लिए इमेजिंग दर्जी कर सकते हैं. चित्रा 3 चुंबकीय इमेजिंग कुत्ते मस्तिष्क के लिए लागू मापदंडों के परिणाम है ~ 4 एच के बाद मन्या धमनी रोड़ा तुरंत बलिदान से पहले, दोनों प्रसार भारित (आंकड़ा 3ए) और टी 2 भारित इमेजिंग (चित्रा ३ बी) का उपयोग इस प्रोटोकॉल की धारा 4 में विस्तृत । हालांकि हम केवल मस्तिष्क में विभिंन स्तरों पर उठाए गए पूरे सरणी की एक तस्वीर दिखाने के लिए, दोनों नकसीर और स्ट्रोक की मात्रा के आकार के विभिंन स्तरों और मस्तिष्क के क्षेत्रों और प्रत्येक समय अंवेषक द्वारा वांछित बिंदु पर quantitated में पहचाना जा सकता है । Quantitation विशिष्ट एमआरआई मशीन है अंवेषक imager के लिए विशिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पूरा हो गया है । चित्रा 3 सी में दिखाया गया के रूप में टीटीसी धुंधला परिणाम मस्तिष्क ऊतक जिसमें कोशिकाओं अभी भी उन है कि नहीं कर रहे हैं के अलावा चयापचय सक्रिय हैं चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । टीटीसी लाल दाग लाइव कोशिकाओं में परिणाम के लिए कम enzymatically हो जाएगा, जबकि मृत कोशिकाओं टीटीसी बनाए रखने नहीं होगा और इस तरह लाल नहीं होगा । अंत में, hematoxylin और eosin धुंधला तकनीक चित्र 3 डी में कुत्ते मस्तिष्क में प्रदर्शन लाल रक्त कोशिकाओं चमकीले लाल जो क्षेत्रों जहां नकसीर हुई है सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता धुंधला में परिणाम होगा ।
चित्रा 1: मन्या रक्त प्रवाह की निगरानी. (क) प्रतिनिधि मन्या धमनी रक्त वेग (एमएल/) बलि के माध्यम से चोट से पहले आधार रेखा से डॉपलर जांच से दर्ज की गई. (ख) दोनों occluded मन्या धमनी (नीचे) और contralateral नियंत्रण (ऊपर) के प्रतिनिधि एच एंड ई धुंधला । आवर्धन 20X पर है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: एंजियोग्राफी के द्वारा मन्या रक्त प्रवाह की निगरानी. सही कुत्ते मन्या धमनी की प्रतिनिधि एंजियोग्राफी देखें. छवियां वाहन आधान से पहले आधार रेखा पर ले जाया गया (क), ६० वाहन अर्क के बाद मिनट (ख), और बलिदान के समय, ४.५ रोड़ा के बाद एच (सी)। लाल तीर FeCl3प्रेरित चोट जहां गर्भनाल टेप रखा गया था की पोत पर स्थान का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: वाहन उपचार के बाद कुत्ते मस्तिष्क के प्रतिनिधि छवियों । चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) प्रदर्शन ~ 4 रोड़ा के बाद एच, तुरंत बलिदान से पहले, प्रसार का उपयोग भारित इमेजिंग (DWI, (A) और टी 2 भारित इमेजिंग (B). टीटीसी बलिदान के समय में औसत दर्जे का खंड के धुंधला मृत ऊतक (सी) से चित्रित रहते हैं । एच एंड ई औसत दर्जे का खंड के धुंधला, तुरंत टीटीसी अनुभाग के लिए, त्याग के समय में चित्रित ऊतक जो चयापचय से सक्रिय है (लाल) उन है कि टीटीसी नहीं कर रहे है से एक लाल उत्पाद को कम कर रहे है जब जीवित कोशिकाओं द्वारा लिया और इसलिए, परिणाम होगा वर्गों है कि सॉफ्टवेयर की एक भीड़ के साथ quantified के लिए जीवित बनाम मृत क्षेत्रों ट्रेस किया जा सकता है । (घ). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
| प्रायोगिक पैरामीटर | टी 2-भारित | प्रसार भारित |
| पुनरावृत्ति समय (एन) एमएस | ४००० | ४६०० |
| प्रतिध्वनि समय (TS) ms | ७५ | ८६ |
| फ्लिप कोण, डिग्री | १८० | ९० |
| अधिग्रहण मैट्रिक्स | ३२० x २५६ | २३१ x २५७ |
| औसत की संख्या | 2 | 4 |
| विमान छवि संकल्प में (पिक्सल/ | २.४६१५ | ०.९३३३ |
तालिका 1: चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) मापदंडों । एमआरआई मानकों कि कुत्ते टी 2 के लिए विकसित किया गया था और प्रसार-भारित छवियों को अधिकतम करने के लिए स्ट्रोक और कुत्ते मन्या धमनी घनास्त्रता मॉडल में रक्तस्राव मात्रा माप के आकलन के लिए.
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Discussion
FeCl3 प्रेरित संवहनी चोट मॉडल व्यापक रूप से छोटे जानवरों में घनास्त्रता अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और फायदे की एक भीड़ के साथ एक बड़े जानवर, पूर्व नैदानिक मॉडल में अनुवाद करने के लिए आसान है । एक कुत्ते में प्रोटोकॉल अनुकूलित करने के लिए थोड़ा सा संशोधन एक औषधीय हस्तक्षेप के बाद स्ट्रोक और नकसीर की मात्रा का आकलन करने के लिए दोनों चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग के उपयोग की अनुमति देते हैं और पहले पोत canalization का आकलन करने के लिए एंजियोग्राफी, के दौरान, और उपचार के बाद । अन्य थ्रोम्बोटिक बड़े पशु मॉडल चोट के स्थल पर स्थिर पूर्णावरोधक थ्रोम्बी का अध्ययन नहीं किया है और इसलिए प्रत्येक canalization या नियत्रंण के लिए पुन: thrombolytic की हद का आकलन करने के लिए एंजियोग्राफी और मन्या धमनी की प्रोटोकॉल का उपयोग नहीं कर सकते उपचार. एक बड़े जानवर जो विश्लेषण के लिए पर्याप्त ऊतक (प्लाज्मा, मूत्र, विषाक्तता अध्ययन के लिए अंगों, आदि) शामिल है के लाभों के अलावा, बड़े पशु बहुत अधिक बारीकी से दिल की दर, रक्तचाप, और जमावट झरना की नकल मानव में मॉडल से ज्यादा कुतर गए मॉडल । दोनों मस्तिष्क और मन्या धमनियों का पर्याप्त आकार, ऊतकवैज्ञानिक और जैविक सामग्री है कि प्रत्येक प्रयोगात्मक पशु पर भड़काऊ और जैव रासायनिक जांच के ढेर सारे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में परिणाम । एक कुत्ते में FeCl3-प्रेरित संवहनी मॉडल को संशोधित करने का एक और लाभ यह है कि एक बहुत बड़ा रक्त की मात्रा प्लेटलेट जेट या थक्का गठन को संशोधित करने के बिना प्रयोग के दौरान निकाला जा सकता है कि रक्त गैस और पूरा रक्त गिनती चोट और दवा अर्क भर में निगरानी की जा सकती है । इसके अलावा, घाट क्लोराइड चोट ऑक्सीडेंट नुकसान के लिए जिंमेदार ठहराया गया है; इसलिए, यह atherosclerotic क्षति है कि नैदानिक स्ट्रोक और रोधगलन बहुत अधिक निकटता प्रकाशित धमनी चोट मॉडल7के अन्य प्रकार से पहले की नकल करेंगे । अंत में, ऐसे thrombectomy, जो नियमित रूप से नैदानिक इस्तेमाल कर रहे है के रूप में यांत्रिक हस्तक्षेप, औषधीय उपचार का पालन कर सकते है ताकि पुन: एक प्रकार का रोग और endothelial वाल स्वास्थ्य की स्थिति कई के लिए पर्याप्त ऊतकवैज्ञानिक ऊतक के साथ संबोधित किया जा सकता है एक ही कुत्ते पर जांच ।
इस मॉडल की सीमाएं है लेकिन कुछ विचार किया जाना चाहिए । सबसे पहले, हालांकि समय बिंदु, और इस प्रकाशन में चुना उपचार (बलिदान ४.५ h मन्या धमनी की चोट के बाद, वाहन) एक औसत दर्जे का स्ट्रोक या रक्तस्राव में परिणाम नहीं था, इस विधि नैदानिक उपंयास विरोधी की जांच के लिए प्रासंगिक है थ्रोम्बोटिक और thrombolytic एजेंटों प्रभावकारिता और खुराक का निर्धारण करने के लिए । वास्तव में, दोनों स्ट्रोक और/या प्रारंभिक थ्रोम्बोटिक अपमान के साथ या औषधीय उपचार (यानी, rTPA) के साथ नकसीर इस मॉडल के साथ होते हैं । दूसरे, खरीद, शिपिंग, आनुवंशिक हेरफेर, और प्रति एचडीएम के लिए कुत्ते की लागत काफी अधिक है और एक दवा अच्छी तरह से कुतर मॉडल में विशेषता है जब तक लागत निषेध ।
प्लेटलेट सक्रियण, एकत्रीकरण और आसंजन, घनास्त्रता की जड़ पर प्रोटोकॉल केंद्र में महत्वपूर्ण कदम । के बाद से प्लेटलेट समारोह विश्लेषक (पीएफए-१००) डुप्लिकेट में पूरे रक्त की १६०० µ एल के साथ किया जा सकता है, इस विधि सरल और रक्त homeostasis को प्रभावित किए बिना प्रक्रिया के दौरान प्लेटलेट जेट ट्रैक करने के लिए आसान है. इसके अलावा पूर्व में vivo अध्ययन प्लेटलेट गतिविधि प्रतिबाधा या lumi-aggregometry का उपयोग कर के रूप में पिछले रक्त ड्रा के रूप में लंबे समय के रूप में प्रायोगिक घनास्त्रता को प्रभावित किए बिना संवहनी चोट से पहले किया जा सकता है > चोट के बाद सर्जरी से पहले 1 सप्ताह और बलिदान के समय उपचार । के रूप में पहले से चर्चा की, गर्भनाल ५०% FeCl3 में लथपथ टेप के अतिरिक्त आवेदन लिंग, नस्ल, या प्रत्येक कुत्ते की उंर के आधार पर आवश्यक हो सकता है । हम रोड़ा के लिए चोट के बाद 30 मिनट की अनुमति दी और फिर से एक और 15 मिनट के लिए नए सिरे से ५०% FeCl3 लागू यदि आवश्यक है । इस प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण अंतर वयस्क बीगल का उपयोग कर उंर या लिंग के साथ thrombolytic विचलन में नहीं किया । इस अध्ययन में हमने महत्वपूर्ण और राज्य के अत्याधुनिक प्रसार भारित इमेजिंग (DWI) का आविर्भाव किया है, जो ऊतक voxel के भीतर जल अणुओं के Brownian गति (कणों का यादृच्छिक प्रसार) के मापन पर आधारित एक श्री इमेजिंग है । इस तकनीक के ट्यूमर के रूप में अंय विकृतियों के बीच में तीव्र कोरोनरी स्ट्रोक का पता लगाने में उपयोगी है हाइपर सेलुलर ऊतकों में प्रसार दिखा रहा है या सेलुलर सूजन के साथ उन लोगों के साथ कम है उच्च प्रसार गुणांक17,18 ,19. प्रसार नक्शे मस्तिष्क ऊतक17,18,19में पानी के अणुओं के प्रसार के साथ बदलती हैं । B-मान एच2ओ अणुओं के प्रसार के लिए ढाल के उपाय । कोरोनरी चोट साइट में नि: शुल्क पानी उच्च B-मान19पर मजबूत संकेत क्षीणन अनुभव करता है ।
खुराक, विषाक्तता में अध्ययन के लिए इस कुत्ते प्रोटोकॉल के उपयोग के अलावा, और नियत्रंण और thrombolytic एजेंटों की प्रभावकारिता, एक कुत्ते के आकार यांत्रिक thrombectomy नैदानिक प्रासंगिक और आसानी से प्राप्त करने में प्रयोग करता है । मन्या आसानी से संसाधित किया जा सकता, दाग, और थक्का पुनः प्राप्ति के बाद प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के अध्ययन के लिए मानव प्रोटोकॉल के लिए उपयोग प्रोटोकॉल का मूल्यांकन. ये अध्ययन हमारे अगले विस्तृत प्रोटोकॉल होगा ।
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Disclosures
कोई
Acknowledgments
हम अपने वित्तीय और वैज्ञानिक समर्थन के लिए ओहियो राज्य विश्वविद्यालय में संज्ञानात्मक और व्यवहार मस्तिष्क इमेजिंग के लिए केंद्र को विकसित करने और कुत्ते चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
References
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