Summary
여기, 우리는 큰 동물 혈관 손상 모델에서 잘 특징이 고 일반적으로 사용 되 작은 동물 제 2 철 염화 유도 (FeCl3) 경 동맥 상해 모델에 사용 하기 위해 필요한 수정 제시. 결과 모델은 예방 및 thrombolytic 약리 및 기계적 개입의 전 임상 시험 평가 위해 활용할 수 있습니다.
Abstract
대뇌 허 혈 성 뇌졸중 및 심근 경색 폐색 동맥 혈전 증 기여 ~ 13 백만 죽음에 매년 전세계적으로. 여기, 우리는 번역 작은 동물에서 혈관 상해 모델 큰 동물 (개), 예방 및 thrombolytic 요원의 사전 임상 심사에 사용할 수 있는 약간의 수정. 수정된 프로토콜 수술 방법 이외에 두뇌와 조직학 분석 경 동맥을 확인을 위해 경 동맥을 처리 하는 데 자세한 내용은 제품은에 의해 경 동맥 수로 화를 평가 하기 위해 단계별 메서드에 대해 설명 합니다. 수로 화와 대뇌 출혈, 자기 공명 영상 (MRI)을 이용 하 여 다운스트림 thromboembolic 사건의 평가 완료 하는 특정 매개 변수. 또한, 큰 동물 (개) 혈관 상해로 번역 하는 데 필요한 이전 확고 작은 동물 모델에서 특정 절차 변경 내용은 설명 합니다.
Introduction
뇌졸중 치료는 크게 개입 심혈 관 질환에 약물 치료와 혈관 내 수술 개입1에 잘 반응 하기 때문에 주로 관상 동맥 질병 치료를 모방한. 그러나 이러한 치료,, 번역 되지 않았습니다 성공적으로 뇌를. 현재 뇌졸중 치료와 함께 어려움 그는 재조합 조직 플라스 미노 겐 활성 제 (rTPA) 되돌릴 수 없습니다, 있으며 관리 출혈 성 변환2,3, 의 중요 한 6.4% 위험을 운반 4. 작은, 종종 어려운 창5그것의 사용을 제한 하는 결과 병 적 상태와 사망률. 또한, restenosis 및 폐색 초기 thrombolysis, 초기 신경 개선 반전 후 종종 발생 합니다. 요약, 환자의 고통을 허 혈 성 뇌혈관 모욕의 rTPA 대다수 (~ 90%)를 제외 하는 관리할 좁은 시간 창이 있다.
정 맥 antiplatelet 치료의 역할은 향상 된 선박 recanalization, 생존 및 결과2허 혈 성 뇌졸중 치료에 약속을 보이고 있다. 불행히도, 이러한 약물 내 두개골 및 두개골 외 출혈의 예측 가능한 부작용, 주로 있기 때문에 방법에 적절 하 게 반전 또는 그들의 활동2를 제어. 혈소판을 방지에 효과적인, 반면 출혈과 그들의 활동을 반대 하는 무 능력의 위험 뇌졸중 환자 처리 루틴에서 사용을 배제 했습니다. 따라서, 필요, 혼자 또는 조합 방지 하 고 혈전을 lyse 아직 안전 프로필이 출혈 용납 제대로 뇌 같은 폐쇄, 낮은 볼륨 공간에서 사용 하면 강력한 지원을 약물에 대 한 존재 합니다.
동맥 혈전 증 및 재 협 착 증의 메커니즘을 이해 하 고 평가 thrombolytics 및 재 협 착을 방지 하는 약물 전 임상 약물 개발의 일환으로 소형 및 대형 동물 모델을 요구 한다. 제 2 철 염화 유도 혈관 상해 신속 하 고 정확 하 게 쥐, 쥐, 기니 피그의 노출된 혈관에 혈전의 형성을 유발 하는 널리 사용된 기법 이며 토끼6,,78, 9 , 10 , 11 , 12. 유전자 조작 편의성, 저렴 한 동물 구입, 낮은 일당 주택 비용을 포함 한 여러 가지 이점을 제공 하는 이러한 작은 종. 불행히도, 작은 동물 실험 액세스 혈소판 반응성, 혈액 가스 분석 및 염증 반응에 수술 하는 동안 여러 피 무를 부정할. 더 중요 한 것은, 큰 동물을 훨씬 더 밀접 하 게 인간 혈소판 생리학6,13모방. 혈전 증의 병 태 생리학의 연구, 새로운 항 혈소판 및 항 응고 약물의 유효성 검사 및 잠재적인 thrombolytics6 의 발견 FeCl3 경 동맥 상해 모델 주된 역할을 담당해 왔습니다. , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. 이전 모델 생쥐, 쥐, 기니 피그, 토끼 용이성 및 유전자 조작에 대 한 유연성 제공 하지만 번역 전 임상 모델은 잠재적 치료제6의 환자 투약 및 독성 연구에 중요 한 ,13. 비록 thrombotic 장애의 몇 가지 모델 생쥐, 말 초 혈관 질환에 적용 되는 혈전의 대형 동물 모델에서에서 개발 된 뇌졸중과 심근 경색 몇과 있습니다. 원숭이, 개, 돼지에 첫 번째 혈전 증 모델 협 착 증, 혈관, 순환 흐름 감소14,,1516에 일반적으로 결과에 hemostats 및 나중 실린더 적용에 집중 했다. 제 2 철 염화 모델에서 내 피 손상의 사이트에서 폐색 혈전, 대신 이러한 모델에 혈전 주기적 혈전 증, 말 초 색전술 귀착되 고 정상 혈액 흐름을 반환 합니다. 비교에서는, 제 2 철 염화 모델 여기 큰 동물, 부상 사이트에서 폐색 혈전에 결과에서 수정 및 안정 이며 thrombolytic 치료 전에 혈관에 의해 확인. Diem와 개 그리고 적절 한 외과 전문의 구입, 우리가 세부 혈전 증 활용 수술, 이미징 및 조직학 연구 실험실 수 있도록 혈관 상해의 큰 개 모델 여기에 대 한 조사는 충분 한 자금을 제공 기술입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
설명 된 조사 관리 및 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 사용에 대 한 지침을 준수 하 고는 오하이오 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (#2015A00000029)에 의해 승인 했다. 모든 수술 조작 했다 깊은 마 취하에 수행 하 고 동물 절차 동안 고통을 모든 단계에서 발생 하지 않았다. 설명 하는 모든 실험 비 복구 했다입니다.
1입니다. 준비
- 갓 제 2 철 염화 물 (FeCl3) 50% (w/v) 이온된 수에 희석 50 mL를 준비 합니다.
- 5.5 cm 조각으로 탯 줄 테이프를 잘라내어 수술 전에 1 주 갓된 50% FeCl3 솔루션에 담근 다.
참고: 사용 하는 탯 줄 테이프 두께 이며 50% FeCl3 솔루션을 흡수 하는 시간이 좀 걸립니다. - 빠른 수술 전에 각 개 하룻밤입니다.
- 플라스마와 소변 컬렉션에 대 한 cryovials, 모든 장기 저장용 50 mL 메 마른 분리기 관 및 H & E 염색 동물 식별, 생년월일, 수술 및 치료에 대 한 두뇌와 경 고정을 위한 10% 포 르 말린 컨테이너에 레이블을 지정 합니다.
- 각 솔루션의 100 mL 각 개 절차에 대 한 준비: 버퍼링 버퍼링 하는 인산 염 (pH 7.4), 10% 중립에서 4 %paraformaldehyde 포 르 말린, 및 2 %2,3,5 triphenyltetrazolium 염화 물 [TTC PBS (pH 7.4)에 어둠에 저장].
- 모든 cryovials에 대 한 충분 한 액체 질소 및 50 mL 조직 튜브 플래시 절차의 하루에 대 한 동결에 대 한 습득.
- 관심의 각 시간 지점에 대 한 각 개에 대 한 PFA-100 (혈소판 기능 분석기) 혈소판 반응성에 대 한 두 개의 ADP/콜라겐 카트리지를 취득 합니다.
- 취득 한 4.5 mL 나트륨 시트르산 혈액 컬렉션 튜브, 희생, 플라즈마 분리 및 저장 하기 전에 각 혈액 무승부. 희생에 플라즈마 저장용 16 혈액 컬렉션 튜브를 그립니다. 각 혈액 컬렉션 튜브, 후 4000 x g 30에서 스핀 혈소판 부유한 플라스마 및 전송 분리 s cryovials에 레이어를 취소. 플래시-80 ° c.에 저장 하기 전에 액체 질소 고정
- 한 4.5 mL 리튬 헤 파 린 혈액 컬렉션 튜브, 기록 혈소판 반응성에 대 한 관심의 각 PFA-100 시간 포인트를 획득. 각 혈액 무승부에서 혈소판 반응성에 따라 기포 없이 각 ADP/콜라겐 카트리지로 사용 리튬 헤 파 린 혈액 컬렉션 튜브에서 전체 혈액의 800 µ L을 소개 합니다.
- 기준선과 희생의 시간이 두 K3 EDTA 혈액 컬렉션 튜브 (혈액의 1 mL 당 무수 EDTA의 1.8 mg), 완전 한 혈액 검사 (CBC)에 대 한 취득.
참고:이 볼륨 기계적 오류 두 번의 경우 각 실행 대부분 핵심 시설에 대 한 적절 한입니다. 비록 한 CBC 실행 부상 하기 전에 모두 기준선에 희생의 때에, 조사자 추가 분석에 대 한 그들의 동물 프로토콜 승인으로 더 많은 혈액을 그립니다 추가할 수 있습니다. 볼륨 및 그들의 장비에 대 한 배달 요구 시설 확인 하십시오. - 작성 하 고 희생 시 혈액 가스 분석을 위한 절차의 하루는 주사기를 코팅 하 여 2 mL heparinized 주사기를 준비 합니다.
참고: 볼륨 및 그들의 장비에 대 한 배달 요구 시설 확인.
2. 개 경 동맥 폐색
- 무게는 성인 (> 18 개월) 비글 개 고 미리 근육 acepromazine와 함께 의료를 베 풀 (0.025-.2 mg/kg) 뒤에 케 타 민 (5-20 mg/kg)와 midazolam의 초기 복 주사 (0.01-.25 mg/kg). 심장 박동, 호흡, 그리고 턱 톤에 따라 1 ~ 5 %isoflurane 깊은 마 취를 유도.
참고: 정확한 마 취는 무게와 승인 된 동물 프로토콜에 의해 결정 됩니다. 주사는 동물에 대 한 고통에 발생할 수 있습니다, 있지만이 불편의 기간 최소화 될 것입니다 (이 하 3 s). - 수술 테이블에 동물을 복용 하기 전에 클리핑에 의해 머리를 제거 합니다. 건조를 방지 하기 위해 마 취 동물의 눈에 안과 연 고 윤 활 적용 됩니다.
- 동물 위치 시스템을 사용 하 여 부정사 위치에 놓고 발을 심전도 (ECG) 리드를 연결 패드. 6.5 m m 수 갑을 차고 endotracheal 튜브와 기도 통해 intubate, 기계적으로 14 호흡/분, 환기 하 고 1-5 %isoflurane (승인 된 동물 프로토콜에 따라 다름)의 지속적인 흡입으로 각 개를 유지 한다.
- 수로 화는 경 동맥의 폐색 혈전의 길이의 범위를 확인 하려면 혈관 상해, MRI, 전과 희생 (대 한 추가 지침은 아래 참조)의 시간에 전에 수행 합니다.
- 대 퇴 동맥 칼 집 및 플라스틱 카 테 터를 삽입 하 고 느슨한 0-실크 봉합 사로 고정. 일시적으로 전송 및 이미징 연구 동안 칼 및 카 테 터를 닫습니다. 추가 지침에 대 한 개 제품은 아래 참조).
- 피 무에 대 한 사이트를 줄이려고 대 퇴 동맥 칼 집에 원심 그대로 피부를 통해 16G x 45 m m 정 맥 카 테 터를 삽입 합니다. 수술 노출으로 테를 사전 및 노출된 대 퇴 정 맥 동맥 칼 집에 인접 한에 입력으로 그것을 시각화. 일단 완전히 정 맥에 삽입, 바늘을 철회 하 고 3 방향 자 지와 테 모자 0.9% 멸 균 식 염 수의 2 mL와 함께 그것을 플러시. 0-실크 봉합 사를 피부에 카 테 터를 보호 합니다.
- 바로 일반적인 경 동맥 영역 위에 직접 8-10 cm의 피부 절 개를 만들고 주변 조직에서 선박을 근 막 해 부.
- 신중 하 게 경 동맥과 별도로 미주 신경 사이 겸을 소개 합니다. 경 동맥 혈관의 수축이 발생할 수 있습니다 이상 필요한 만지지 마십시오.
- FeCl3 솔루션 희석을 피하기 위해 멸 균 거 즈와 동맥의 노출된 영역을 건조.
- 장소는 도플러 흐름 조사를 건드리지 않고는 경 동맥 주위 탯 줄 테이프를 감아 혈액 속도 기록을 시작을 산보 공간이 경 주변 조사 흐름 및 절차 ( 상단그림 1 )를 통해 계속. 기록에 대 한 기준선 흐름 ~ 탯 줄 테이프를 적용 하기 전에 5 분.
참고: 기준선 흐름 FeCl3 탯 줄 테이프 배치 하기 전에 일반적으로 평균 약 250 mL/min. - 준비 FeCl3 탯 줄 테이프 경 hemostat 흐름 조사 바로 아래를 사용 하 여 15 분, 제거, 및 삭제에 대 한 그것을 건드리지 않고 주위를 바꿈.
참고: 폐색 제로 흐름 mL/min으로 지정 됩니다. - 신호를 유지 하는 데 필요한 조사를 45 분 추가 추가 염 분에 대 한 폐색 혈전을 안정화 합니다.
참고: 연령에 따라 성별 및 준비 FeCl3 탯 줄 테이프의 개, 추가 게재 위치 유형에 필요할 수 있습니다 다시 신청 전에 발생 하는 폐색에 대 일 분을 허용. 차이가 성별 beagles에 제 2 철 염화 응용 프로그램에 의해 혈전 증에서 관찰 되었다. 그것은 필요한이 모델 신선한 FeCl3 탯 줄 테이프를 여러 번 다시 적용 하 고 있다 결코 FeCl3 탯 줄 테이프 준비 프로토콜에서 이탈을 찾지 못했습니다. 실험실에는 다른 품종 또는 개과,3 탯 줄 테이프 혈전 증 프로토콜 이탈 하지 않는, 또는 개 그룹 FeCl3 을 설정 해야 할 수 있습니다 다는 것을 확인 하는 초기 과목에 적용할 FeCl의 나이 사용 하는 경우 해당 품종 또는 특정 연구 그들의 나이 대 한 응용 프로그램 시간입니다. 오 번이이 실험, FeCl3 탯 줄 테이프 신청 후 8-30 분에 이르기까지. - 확인 하려면 획 또는 출혈 볼륨 약리학 내정간섭에서 발생할 수 있습니다 다운스트림 thromboembolic 이벤트 뿐만 아니라, 자기 공명 영상 기 (아래 참조에 추가 케 타 민 주입으로 개 전송 추가 처리).
- 최종 혈관 촬영/MRI (이미징 프로토콜에 대 한 아래 참조), 유해 자극에 응답의 부족에 의해 표시에서 마 취의 깊은 수술 평면에서 나중에 분석을 위해 전체 혈액 수집 다음 갈비뼈를 통해 절단 하 여 가슴을 열고 흉 골, 그리고 소비는 심장 혈관 (exsanguination)를 절단 하 여 시작 합니다.
참고:이 실험에서 전체 혈액 (< 10 mL) 넓 적 다리 칼 집에서 초기 계획, 에이전트 관리, 후 5 분 및 60 분 주입 후에 당겨 지 고 보았다 thrombolysis의 과정에 영향을 주지 않습니다. 희생에는 무제한 볼륨 그릴 수 있습니다 추가 플라즈마 저장용 동물 프로토콜에서 승인 하는 경우. 분석, 처리 하 고 희생의 30 분 이내 모든 전체 혈액을 저장 합니다. 승인 된 동물 프로토콜에 혈액으로 동물의 몸 무게의 승인된 비율 초과 그려 하지는 확인 하십시오. 설명 하는 모든 실험 비 복구 했다입니다. - 0.9% 식 염 수와 함께 마음을 헹 구 고 플래시 동결 액체 질소에 샘플 원하는 경우.
- 고 년을 제거 하기 전에 그것과 기록 옆에 눈금자를 배치 하 여 응고 길이 측정 합니다. 조직학 트리밍에 쉽게 contralateral 경에 같은 장소에는 응고의 한가운데에 조직 마커를 놓습니다. 동일한 길이에서 contralateral 경을 표시 합니다.
참고:이 모델 평균 응고 길이 1.75 cm입니다. - 두 혈관에 응고의 전체 길이 제거 하 고 10% 포 르 말린에 고정. 조직 감 적에 의해 표시 된 길이 내 contralateral 경 동맥을 제거 합니다. Contralateral 경 동맥 혈전의 중간에 반으로 잘라. 플래시는 향후 분석을 위해 액체 질소에 절반 contralateral 경 동맥을 동결 하 고 조직학 분석 아래 부상된 경 옆에 포함 10% 포 르 말린에 나머지 절반을 해결.
- 어떤 원하는 분석에 대 한 장기를 제거, 플래시 동결 액체 질소에 0.9% 식 염 수와 린스.
- 원형 뼈 톱으로 두개골을 제거 합니다. 천천히 아래 뇌 손상 없이 두개골을 제거 합니다.
- 두뇌는 두개골에서 제거 되, 감기 0.9% 염 분에서 그것을 씻어 하 고 날카로운 메스와 옆으로 절단 하는 두뇌의 중간에서 4mm 섹션과 잘라. 2%로 4 m m 섹션 중 하나를 장소 TTC 허 혈 성 경계 (두뇌 TTC에 대 한 처리 추가 참조)에 대 한 다른 슬라이스 7 일 H & E 염색 (H & E 뇌에 대 한 추가 처리 참조)에 대 한 10% 포 르 말린에 배치 하는 동안.
3. 개 혈관
참고:이 그림 2 에 표시 되 고 관심의 시간 지점에서 수술 동안 이루어집니다.
- 오른쪽 사 타 구니 지역에서 펄스에 대 한 느낌과 3-5 cm 복 부 화살 절 개를 하 게.
- 대 퇴 동맥을 노출 하 고 무딘 해 부를 사용 하 여 주변 조직에서 분리.
- 직각 hemostat 노출된 동맥의 말 초 끝 주위 0-실크 봉합 사를 사용 합니다.
- 원심 0-실크 봉합 사 고 hemostats와 피부에 느슨한 0 비단 봉합 끝 클램핑 함으로써 동맥에 약간의 긴장을 적용.
- 두 번째 0-실크 봉합 사 노출된 세그먼트의 인접 끝 주위를 놓습니다.
- 동맥에 가이드 와이어를 통과 하는 18 G 중개자 바늘을 사용 하 여 인접 및 원심 0 비단 봉합 관계 사이 동맥 미드웨이 찔린 합니다.
- 로드는 조립된 6Fr 칼 가이드 와이어, 와이어 어셈블리에서 종료로 파악에 팽창 합니다.
- 가이드를 통해 팽창과 칼 집 사전. 그것은 팽창 칼 집 어셈블리 발전 하면서는 팽창에서 돌출 철사의 확고 한 이해를 유지할 수 있는지 확인 합니다.
- 완전 삽입 후 동맥 펑크 사이트에 hemostasis 유지 하기 위해 칼 집 주위 근 0-실크 봉합 넥타이.
- 동시에 팽창 및 가이드 와이어를 제거 합니다.
- 단방향 밸브 타악기 혈액 흐름의 존재를 확인 하 고 정상적인 염 분의 3-5 mL으로 플러시를 엽니다.
- 채워진된 확장 라인 모니터 및 기록 서 혈압 측정 압력 변환기에 연결 된 액체에 액세스 덮개 단방향 밸브를 연결 합니다.
- 4Fr. angiographic 카 테 터에 0.35"가이드 와이어를 미리 로드 하 고 대비 주입 매니폴드 Tuohy y-어댑터 설정에 연결 합니다.
- 카 테 터의 원심 끝 내 가이드 와이어의 끝을 당겨 하 고 염 분으로 전체 어셈블리를 플러시.
- 칼 집의 hemostatic 밸브에 angiographic 카 테 터를 삽입 하 고 사전 가이드 와이어 원심 카 테 터 팁 넘어 약 5 cm.
- Fluoroscopic 지도 및 역행 트랜스 대동맥 방식을 사용 하 여, 천천히 대동맥 아치에 테 사전.
- Brachiocephalic 트렁크의 이륙 식별 하는 일반적인 염 분으로 대비 희석 에이전트 1: 1의 2-3 mL를 주사.
- 가이드 와이어를 사용 하 여 brachiocephalic 트렁크에는 카 테 터를 직접 그리고 바로 일반적인 경 동맥에 선택적으로.
- 가이드 와이어를 제거 하 고 카 테 터는 경 동맥에 배치 됩니다 확인 하려면 희석된 대조의 2-3 mL를 주입.
- Angiographic 실행 디지털 빼기 및 표준 angiographic 기술을 사용 하 여 기록 하는 동안 undiluted 대비의 3-4 mL를 주사.
- 추가 시간 지점에서 반복된 혈관에 대 한 3.18-3.21 단계를 반복 합니다.
4. 자기 공명-확산 가중치 이미징 (뒤)과 t 2가 개 뇌의 (T2WI) 이미징
참고:이 그림 3A에서 표시 됩니다-3B.
- 개가 깊은 마 취 인지 확인 합니다.
- 강아지의 생리 적 매개 변수는 심전도 심장 박동을 포함 하 여 영상에 걸쳐 모니터링 있는지 확인 합니다.
- 개는 뇌 코일의 양자 구멍에서 머리와 부정사 위치에 거짓말을 확인 합니다.
- 3 테슬라 (3T) 자석 사용.
- T 2가 중 영상 (T2WI), MRI에서 기본 펄스 시퀀스를 수행 합니다.
참고: 시퀀스 다른 병 적인 조건에서 조직의 T2 이완 시간에 차이 사용 하 여. - T 2가 중 기온 변화도 에코 순서를 이미지를 사용 하 여 해 부 영상 전에 개 뇌의 파일럿 이미지 이미징 지역화를 수행 하 고 시야 (FOV), 분할 영역 및 슬라이스 두께 두뇌를 완전히 커버 하는 수를 결정 합니다.
- 다음 T2-매개 변수를 사용 하 여: 슬라이스 두께 3 m m, TR = = 4000 석사, 테 75 ms, ETL = = 7, 인수 매트릭스 320 x 256, FA = = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 픽셀, 이미지 해상도 mm 당 2.4615 픽셀 =.
- 보급이 중 영상 (뒤) 후 MCA 폐색 및 희생 직전 에코 평면 DTI 시퀀스 4 h를 사용 하 여 수행 합니다.
- 다음 뒤 매개 변수를 사용 하 여: b = 1500 s/m m2, 슬라이스 두께 3 m m, TR = = 4600 석사, 외 = 86 석사, ETL 55, 인수 매트릭스 = 140 x 140, FA = = 90ᵒ, FOV 231 x 257, 이미지 해상도 = = 0.9333 픽셀/m m (표 1).
5. hematoxylin 및 오신 (H & E) 개 뇌의 얼룩
참고:이 그림 3D에 표시 됩니다.
- 7 일 후에 10% 포 르 말린, 파라핀에 4mm 뇌 섹션을 포함 합니다.
- 때까지 그들은 뇌 조직 위에서 어떤 추가적인 파라핀을 제거 하는 톰으로 수준 다음 뇌 조직을 4 µ m에서 잘라내어 한 뇌 섹션 각 2 "x 3" 인치 슬라이드에 파라핀 블록을 잘라.
주: 얼룩, 전에 두고 모든 솔루션 별도 용기에 슬라이드 밖으로 건조 하지 않고 다른 하나의 솔루션에서 이동할 수 있도록. - 드 paraffinize 각 뇌 슬라이드 및 수돗물 수 화.
- 8 분 되며 560에 각 두뇌 슬라이드를 배치 합니다.
- 린스 수돗물에 각 두뇌 슬라이드.
- 각 뇌 슬라이드 1% 차별화 산 알코올 1 s 세 번.
- 린스 수돗물에 각 두뇌 슬라이드.
- 1 %1에 대 한 수산화 암모늄과 각 뇌 슬라이드 블루 s.
- 각 뇌 슬라이드 실행 2 분 동안 수돗물에 씻어.
- 70%에 각 두뇌 슬라이드를 탈수 에탄올 (EtOH) 1 s 12 번.
- 1 분 동안 오신 각 뇌 슬라이드 counterstain
- 95%에서 각 뇌 슬라이드를 탈수 1 EtOH s 12 번.
- 100%에 각 두뇌 슬라이드를 탈수 EtOH.
- 크 실 렌에 각 두뇌 슬라이드를 취소 하 고 그것이 수 설치 미디어와 공기 방울을 제거 뇌 슬라이드 위에 2 "x 3" 인치 coverslip 적용 합니다.
참고: 모든 솔루션은 얼룩의 여러 날, 여러 슬라이드에 대 한 물과 에탄올을 제외 하 고 다시. 유리 항아리, 얼룩에 행해진다 뇌 섹션 슬라이드에 배치 됩니다 후에 모든 처리 하지만 플라스틱 착 색 용기 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 변색 되는 경우 어떤 솔루션을 장착 하 고 엄격 하 게 적용.
6. hematoxylin 및 오신 (H & E) 개 년의 얼룩
참고:이 그림 1 (왼쪽)에 표시 됩니다.
- 10% 포 르 말린에 24-72 h, 후 부상된 경 동맥 혈전의 중간에 반으로 자르고 포함 ~ 1cm 부상된 경와 ~ 같은 파라핀 카세트에 contralateral 컨트롤의 1 cm.
참고:은 경 동맥 내 혈액 응고는 깨지기 쉬운. 배는 응고 방해 하지를 절단 하기 전에 10% 포 르 말린에 수정 되었습니다 때까지 기다립니다. 모두 부상 포함 하 고 경 동맥을 제어 같은 파라핀 블록 있게 됩니다 절단 동시에 혈관에 같은 장소에서. - 톰, 어떤 추가적인 파라핀 제거와 파라핀 블록 수준까지 트림. 그럼 contralateral 경 섹션에서 슬라이드의 위쪽에 배치 됩니다 있도록 파라핀 블록을 회전 하지 않고 25 x 75 mm x 1 mm 슬라이드에 4 µ m에서 섹션을 잘라.
참고: 각 슬라이드에 3 경 섹션 배치 하지만 하나 얼룩의 관심에 따라 추가할 수 있습니다. - -각 경 슬라이드 paraffinize 하 고 수돗물에 수 화.
참고: 개별적으로 처리 해야 하는 뇌 슬라이드와 달리 경 슬라이드 처리할 수 있습니다 대량에 서로 건드리지 않고 한 번에 여러 슬라이드를 맞는 항아리에 배치 하 여. - 각 경 슬라이드 8 분 hematoxylin에 얼룩.
- 린스 수돗물에 각 경 슬라이드.
- 각 경 슬라이드 1% 차별화 산 알코올 1 s 세 번.
- 린스 수돗물에 각 경 슬라이드.
- 1 %1에 대 한 수산화 암모늄과 각 경 슬라이드 블루 s.
- 각 경 슬라이드 실행 2 분 동안 수돗물에 씻어.
- 70%에 각 경 슬라이드를 탈수 1 EtOH s 12 번.
- 오신 또는 1 분 각 경 슬라이드 counterstain
- 95%에서 경 각 슬라이드를 탈수 EtOH 1 s x 12.
- 100%에 각 경 슬라이드를 탈수 EtOH.
- 크 실 렌에 경 각 슬라이드를 취소 하 고 기포를 제거 하 수 설치 미디어와 함께 24 m m x 50 m m coverslip 추가.
7. 2,3,5-triphenyl-2 H-tetrazolium 염화 (TTC) 개 뇌의 얼룩
참고:이 그림 3C에 표시 됩니다.
- 장소 이전에 H & E 섹션에 즉시 인접 두뇌의 중간에서 4mm 섹션 제거 준비 2 %TTC (경 동맥 폐색). 선회도 마다 5 분을 얼룩이 지기 위한 뇌 섹션 적어도 20 분 동안 37 ° C에서 어둠 속에서 품 어.
참고: 20 분 후 섹션 양쪽 모두 빨간 체리를 이어야 한다. 추가 시간 TTC 신선도 및 조직 단면도의 두께에 따라 필요할 수 있습니다. - TTC 솔루션을 제거 하 고 4% paraformaldehyde PBS, pH 7.4 색상 대비를 최적화 하기에 바꿉니다.
- 백색과 빨강 얼룩이 사이의 대비 최적의 때 허 혈 성 지역의 추적에 대 한 높은 해상도에서 투명 한 플라스틱 시트, 초과 하는 액체의 건조 및 스캔 사이 TTC 뇌 조각 장소.
참고: 섹션에에서 저장할 수 있습니다 무기한 paraformaldehyde 솔루션, 하지만 얼룩이 사라질 것 이다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
여기 자세한 절차를 수행 하는 것은 폐색 동맥 내정간섭의 예방 또는 thrombolytic 평가에 사용할 수 있는 모델 개발 귀 착될 것 이다. 전에, 하는 동안, 그리고 상용 소프트웨어에 의해 기록 된 치료 후 그림 1A 기준선 흐름 속도 결과 혈액 흐름 속도 보여줍니다. 이 녹음에서 데이터는 경 동맥 상해와이 개 모델에서 치료 재 관류의 비율을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 그림 1B contralateral (맨 위) 및 부상된 (아래) 개 경 섹션 스테인드 H와 희생의 때에 재 수로 화 상태를 확인 하는 전자의 예를 제공 합니다. 다양 한 소프트웨어 프로그램 있는 % 각 치료와 함께 수로 화에 도착 하는 선박의 전체 면적으로 분할 될 수 있다 (혈전) 없이 혈관을 추적 하 여 혈관의 perfused 영역을 분석을 사용할 수 있습니다. 그림 2 는 혈전 폐색 여부를 확인 하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 이미징이 개에 대 한 자세한 경 동맥 혈관의 몇 가지 예를 보여 줍니다. 또한, 마커로 평방 흐름 프로브를 사용 하 여, 조사는 혈관 촬영 촬영 각 시간 지점에서 혈전의 길이 확인할 수 있습니다. 있지만, 여기 우리가 부상, 차량 치료 후, 그리고 희생의 시간에서 60 분 전에 이미지 제시 탐정 영상 그들의 요구를 조정할 수 있습니다. 그림 3 은 자기 이미지 매개 변수 개 뇌에 적용의 결과 ~ 4 h 희생, 유포가 중 (그림 3A)과 t 2를 활용 하 여 바로 앞 경 동맥 폐색 후 가중치 (그림 3B) 이미징 이 프로토콜의 섹션 4에에서 자세히. 비록 우리는 뇌의 서로 다른 수준에서 찍은 전체 배열 한 사진 표시, 출혈과 뇌졸중 볼륨의 크기 다른 수준과 두뇌의 영역에서 확인 된 고 quantitated 탐정에 의해 각 시간 지점에서 수 있습니다. 정량 조사의 영상에 특정 MRI 기계 소프트웨어를 사용 하 여 완료 됩니다. 그림 3C 와 같이 결과 얼룩 TTC 뇌 조직의 세포는 여전히 metabolically 활성 되지 않은 그 외에 있는 윤곽을 그리 다 사용할 수 있습니다. TTC 반면 죽은 세포는 TTC 유지 되지 것입니다 및 따라서 되지 것입니다 빨간색 빨간색 스테인드 라이브 셀에 결과 효소 감소 될 것 이다. 마지막으로, hematoxylin와 오신 기술 그림 3d에서 개 뇌에 얼룩이 높아집니다 붉은 혈액 세포를 얼룩이 지기 밝은 빨간색 영역 출혈 발생 했습니다 확인 하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 1: 경 혈의 모니터링. (A) 대표 경 동맥 혈액 속도 (mL/min)는 도플러에서 기록 된 희생을 통해 부상 하기 전에 기준선에서 프로브. ((B)) 대표 H & E 폐색된 경 동맥 (아래)와 contralateral 컨트롤 (위)의 얼룩. 배율 20 배 이다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 경 혈의 혈관에 의해 모니터링. 바로 개 경 동맥의 대표 제품은 보기. 이미지와 희생, 폐색 (C)후 h 4.5의 시간에 차량 주입 (A), (B), 차량 주입 후 60 분 전에 초기에 찍은 사진. 빨간색 화살표 표시 FeCl3의 선박에 위치-배꼽 테이프 배치 했다 상해를 유발. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 차량 처리 후 개 뇌의 대표 이미지. 자기 공명 영상 (MRI) 수행 ~ 4 h 폐색, 희생, 직전 후 유포가 중 영상 활용 (뒤, (A) 과 t 2가 영상 중 (B). 죽은 조직에서 라이브 TTC 윤곽을 그리 다 희생의 때에 중간 섹션의 얼룩 (C). H & E의 중간 얼룩 섹션, TTC 섹션에 즉시 인접는 metabolically 조직 윤곽을 그리 다 희생의 시간에 그 TTC 되지 않은 액티브 (레드) 빨간 제품 라이브 세포에 의해 채택 하는 때에 감소 되 고 따라서, 귀 착될 것 이다 다양 한 소프트웨어를 추적 하 게 측정할 수 있는 섹션 라이브 대 죽은 지역. (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 실험적인 매개 변수 | T 2가 중 | 보급이 중 |
| 반복 시간 (TR) 석사 | 4000 | 4600 |
| 에코 시간 (TS) 석사 | 75 | 86 |
| 대칭 이동 각도도 | 180 | 90 |
| 인수 매트릭스 | 320 x 256 | 231 x 257 |
| 평균 수 | 2 | 4 |
| 평면 이미지 해상도 (픽셀/m m) | 2.4615 | 0.9333 |
표 1: 자기 공명 영상 (MRI) 매개 변수. 이미지 개 T2 및 확산 중 개 경 동맥 혈전 증 모델에서 뇌졸중과 출혈 량 측정의 평가 대 한 극대화를 위해 개발 된 MRI 매개 변수입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FeCl3 유도 혈관 상해 모델 작은 동물에서 혈전 증 연구에 널리 이용 되 고 다양 한 장점 가진 큰 동물, 전 임상 모델을 변환 하기 쉽습니다. 한 개에는 프로토콜에 맞게 약간의 수정을 허용 약리학 내정간섭 및 선박 수로 화 하기 전에, 평가 제품은 후 뇌졸중과 출혈 볼륨을 평가 하 두 자기 공명 영상 활용 중, 고 후 치료. 다른 thrombotic 큰 동물 모델 부상의 사이트에서 안정화 폐색 혈전을 공부 하지 않은 수 없습니다 angiography와 재 수로 화 각 상의 prophylactic 또는 thrombolytic의 정도 평가 하기 위해 경 동맥의 조직학 치료입니다. (플라즈마, 소변 독성 연구 등에대 한 장기) 분석에 대 한 충분 한 조직을 포함 하는 큰 동물의 장점, 이외에 큰 동물 모델 훨씬 더 밀접 하 게 모방 심장 박동, 혈압, 그리고 인 간에 있는 응고 캐스케이드 설치류 모델 보다. 적절 한 크기의 두뇌와 경 동맥, 조직학 및 생물 소재 각 실험 동물에 대 한 염증 및 생 화 확 적인 조사의 과다에 대 한 사용할 수 있는 결과. 수정 FeCl3의 또 다른 장점은-한 개에 유도 혈관 모델은 훨씬 더 큰 혈액 양 혈액 가스 및 완전 한 혈액 혈소판 반응성 또는 혈전 형성 등을 수정 하지 않고 실험 도중 추출 될 수 있다 건의 부상 및 약물 주입을 통해 모니터링할 수 있습니다. 또한, 제 2 철 염화 부상 산화 손상;에 기인 했다 따라서, 그것은 임상 뇌졸중과 심근 경색을 훨씬 더 밀접 하 게 다른 유형의 게시 동맥 상해 모델7보다 앞에 atherosclerotic 손상을 모방 합니다. 마지막으로, 일상적으로 사용 되는 임상, thrombectomy, 같은 기계적 개입 내 피 벽 건강의 상태를 다시 협 다중에 대 한 충분 한 조직학 조직으로 해결 될 수 있도록 약리 치료 따를 수 있다 같은 개에 조사입니다.
이 모델의 제한 사항 몇 가지 고려해 야 할 필요가... 첫째, 비록 시간 점과이 책에서 선택 하는 치료 (경 동맥 손상, 후 4.5 h 희생 차량) 측정 스트로크 또는 출혈을 초래 하지 않았다,이 방법은 소설 안티 thrombotic의 조사에 대 한 임상 관련 그리고 효능 및 주입 결정 thrombolytic 요원입니다. 실제로, 뇌졸중 및 출혈 thrombotic 초기와 모욕 또는 약리 치료 (즉, rTPA)와 함께이 모델 발생지 않습니다. 둘째, 구매, 배송, 유전자 조작 및 일당 개 비용 매우 높은 고 약 잘 설치류 모델에서 특징이 될 때까지 금지 비용.
혈소판 활성화, 집계 및 접착, 혈전 증의 핵심 프로토콜 센터에서 중요 한 단계. 이후 1600 µ L 중복에서 전체 혈액의 혈소판 기능 분석기 (PFA-100) 수행할 수 있습니다, 간단 하 고 쉬운 혈액 항상성을 영향을 주지 않고 절차를 통해 혈소판 반응성을 추적 하기 위해이 메서드는. 임피던스 또는 lumi aggregometry를 사용 하 여 혈소판 활동으로 더 비보 전 연구 관 부상 전에 마지막 혈액 끌기는으로 실험 혈전 증 영향을 주지 않고 수행할 수 있습니다 > 상해 후에 수술 전 1 주 그리고 희생의 시간에 치료입니다. 이전, 50 %FeCl 품종3 , 성별에 따라 필요할 수 있습니다, 또는 각 개의 나이에 배어 탯 줄 테이프의 추가 응용 프로그램을 설명 합니다. 우리는 폐색에 대 한 부상 후 30 분을 허용 하 고 신선한 50% FeCl3 필요한 경우 다른 15 분 동안 다시 적용. 이 과정 나이 또는 성별 성인 비글을 사용 하 여 thrombolytic 편차에 상당한 차이가 발생 하지 않았다. 이 연구에서 우리가 중된 영상 (뒤), 이미징 미스터 조직 복 내 물 분자의 브라운 모션 (입자의 무작위 유포)의 측정에 따라 중요 하 고의 상태--예술 보급을 해명 했습니다. 이 기술은 하이퍼 세포 조직에서 보여주는 확산 하 여 종양 등 다른 병 리 중 급성 허 혈 성 뇌졸중의 검출에 유용 또는 셀룰러 붓기와 함께 그들은 더 높은 확산 계수17,18 와 낮은 19. 뇌 조직17,,1819에 있는 물 분자의 유포와 확산 지도 다. B 값은 H2O 분자의 확산에 대 한 그라디언트를 측정합니다. 허 혈 성 부상 사이트에서 무료 수 높은 B 값19에서 강한 신호 감쇄를 경험 한다.
에 주입, 독성, 그리고 예방 및 thrombolytic 요원의 효능 연구에 대 한이 개 프로토콜의 사용, 이외에 송곳 니의 크기 게 실험 기계 thrombectomy 임상 적절 하 고 쉽게 달성. 년 수 있습니다 쉽게 처리, 스테인드, 그리고 응고 검색 후 면역 세포 침투의 연구에 대 한 인간의 조직학에 대 한 프로토콜을 활용 하 여 평가. 이러한 연구는 우리의 다음 상세한 프로토콜을 될 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
없음
Acknowledgments
우리는 인지 및 행동 두뇌 개발 하 고 수행 개 자기 공명 영상 그들의 재정 및 과학 지원에 대 한 오하이오 주립 대학에서 이미징 센터 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8” umbilical tape | Jorgensen Laboratories Inc., | #J0025UA | for ferric chloride application |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | AAJ61899AP | |
| 10% neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5701 | |
| 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4) | Sigma Aldrich | T8877 | |
| ADP/Collagen cartridges | Siemens Diagnostics | B417021A | |
| 4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer | Becton Dickinson | BD 369714 | |
| 4.5 ml lithium heparin vacutainer | Becton Dickinson | BD 368056 | |
| EDTA K3 vacutainers | Becton Dickinson | BD455036 | |
| Doppler flow probe | Transonic Systems Inc | MA2.5PSL | |
| Hematoxylin 560 | Surgipath | 3801570 | |
| Eosin | Surgipath | 3801602 | |
| LabChart Software | ADInstruments Inc. | ||
| Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet | Siemen's Diagnostics | ||
| Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) | NovaPlus | 402525D | |
| HUG-U-VAC positioning system | DRE Veterinary | 1320 |
References
- Adams, H. P. Jr Stroke: a vascular pathology with inadequate management. Journal of Hypertension Supplement. 21 (5), S3-S7 (2003).
- Lansberg, M. G., Bluhmki, E., Thijs, V. N. Efficacy and safety of tissue plasminogen activator 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke: a metaanalysis. Stroke. 40 (7), 2438-2441 (2009).
- Nagel, S., et al. Therapy of acute basilar artery occlusion: intraarterial thrombolysis alone vs bridging therapy. Stroke. 40 (1), 140-146 (2009).
- Ciccone, A., Motto, C., Abraha, I., Cozzolino, F., Santilli, I. Glycoprotein IIb-IIIa inhibitors for acute ischaemic stroke. The Cochrane database of systematic reviews. 3 (3), (2014).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. New England Journal of Medicine. 333 (24), 1581-1588 (1995).
- Leadley, R., Chia, L., Rebellob, S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
- Bodary, P. F., Eitzman, D. T. Animal Models of Thrombosis. Current Opinion In Hematology. 16 (5), 342-346 (2009).
- Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circulation Research. 100 (7), 979-991 (2007).
- Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. Journal of Visualized Experiments. (100), e52838 (2015).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (6), 1452-1460 (2011).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and Thrombosis: Insights from Large Animal Models. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-12 (2011).
- Coller, B. S., Folts, J. D., Smith, S. R., Scudder, L. E., Jordan, R. Abolition of in vivo Platelet Thrombus Formation in Primates with Monoclonal Antibodies to the Platelet GPIIb/IIIa Receptor. Correlation with Bleeding Time, Platelet Aggregation, and Blockade of GPIIb/IIIa Receptors. Circulation. 80 (6), 1766-1774 (1989).
- Folts, J. An in vivo Model of Experimental Arterial Stenosis, Intimal Damage, and Periodic Thrombosis. Circulation. 83 (6 Suppl), (1991).
- Yasuda, T., et al. A canine model of coronary artery thrombosis with superimposed high grade stenosis for the investigation of rethrombosis after thrombolysis. Journal of the American College of Cardiology. 13 (6), 1409-1414 (1989).
- Schob, S., et al. Correlation Between Aquaporin 4 Expression and Different DWI Parameters in Grade I Meningioma. Molecular Imaging and Biology : MIB : the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 19 (1), 138-142 (2017).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted Imaging Using a Readout-Segmented, Multishot EPI Sequence at 3 T Distinguishes between Morphologically Differentiated and Undifferentiated Subtypes of Thyroid Carcinoma-A Preliminary Study. Translational Oncology. 9 (5), 403-410 (2016).
- Schob, S., et al. Diffusion-Weighted MRI Reflects Proliferative Activity in Primary CNS Lymphoma. Public Library of Science One. 11 (8), e0161386 (2016).
