Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Хлорида железа индуцированной собак сонной артерии тромбоза: Большой животных модель сосудистых повреждений

Published: September 7, 2018 doi: 10.3791/57981
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 4, 2, 3, 1
1Department of Neurological Surgery, Ohio State University, 2Department of Surgery, Ohio State University, 3Department of Surgery, Duke University, 4Department of Internal Medicine, Ohio State University

Summary

Здесь мы представляем изменения, необходимые для хорошо изученных и часто используемых малых животных хлорное индуцированной (3FeCl) сонной артерии травмы модели для использования в модели крупных животных сосудистых повреждений. Результирующая модель может использоваться для доклинических суда оценки как профилактических, так и тромболитической фармакологических и механических вмешательств.

Abstract

Окклюзионные артериальный тромбоз, ведущих к церебрального ишемического инсульта и инфаркта миокарда способствует ~ 13 миллионов смертей каждый год во всем мире. Здесь мы перевели модель сосудистых повреждений от мелких животных на крупных животных (собак), с незначительными изменениями, которые могут быть использованы для доклинических скрининг профилактического и тромболитической агентов. В дополнение к хирургические методы измененный Протокол описывает шаг за шагом методы для оценки сонной артерии канализации, ангиография, подробные инструкции для обработки мозга и сонной артерии для гистологического анализа для проверки сонной артерии канализация и кровоизлияние в мозг и конкретные параметры для завершения оценки течению тромбоэмболических событий, используя магнитно-резонансной томографии (МРТ). Кроме того обсуждаются конкретные процедурные изменения от ранее устоявшихся малые животной модели, необходимо перевести на крупных животных (собак) сосудистых повреждений.

Introduction

Терапия инсульта во многом моделируется после лечения болезни коронарной артерии, главным образом потому, что вмешательство в сердечно-сосудистых заболеваний также откликнулись наркотиков терапии и эндоваскулярных вмешательств1. Однако, эти процедуры не успешно переведены к ишемии миокарда. Трудности с текущей лечение инсульта, что рекомбинантных активатор плазминогена ткани (rTPA) не может быть отменено, и что администрация несет значительный 6,4% риск геморрагических преобразования2,3, 4. полученный заболеваемости и смертности, ограничивает его использование для малых, часто недостижимой окна5. Кроме того часто после первоначального тромболизис, вспять первоначальное улучшение неврологической происходят рестеноза и окклюзии. В резюме пациентов, которые страдают ишемических цереброваскулярных оскорбления существует узкое временное окно распоряжаться rTPA, что исключает подавляющее большинство (~ 90%).

Роль внутривенного антитромбоцитарной терапии показал обещание в лечении ишемического инсульта с реканализации улучшение судна, выживание и результат2. К сожалению эти препараты имеют предсказуемые побочный эффект внутри черепной и экстра черепной кровоизлияния, главным образом потому, что нет никакой возможности адекватно вспять или контролировать их деятельность2. Во время эффективного предотвращения агрегации тромбоцитов риск кровоизлияния и неспособности прекратить их деятельность помешали их использования в рутине ухода за пациентов, перенесших инсульт. Таким образом, существует необходимость, мощной антитромботической наркотиков, которые действуют самостоятельно или в комбинации, чтобы предотвратить и лизируют сгустки еще имеют профиль безопасности, что позволит использовать в закрытых, низкий объем пространства например мозга, где плохо переносится кровоизлияния.

Понимание механизма артериальный тромбоз и ре стеноза и оценке Тромболитиков и лекарств, которые препятствуют ре стеноза, требует больших и малых животных моделей как часть развития доклинических наркотиков. Хлорида железа индуцированной сосудистых повреждений является широко используется способ быстро и точно вызвать образование тромбов в открытых сосудах мышки, крыски, морские свинки и кролики6,,78, 9 , 10 , 11 , 12. Эти меньше видов предлагают несколько преимуществ, включая простоту генетических манипуляций, недорогой покупки животных и низкий, суточные расходы на жилье. К сожалению небольшие эксперименты на животных отменяет несколько крови ничьих во время операции доступа реактивность тромбоцитов, анализ газа крови и воспалительной реакции. Что еще более важно крупных животных гораздо более тесно имитировать человека тромбоцитов физиологии6,13. FeCl3 сонной артерии травмы модель играет доминирующую роль в изучении патофизиологии тромбоза, в проверке Роман анти коагулянта и анти-тромбоцитарный лекарств и в открытие потенциальных Тромболитиков6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12. предыдущие модели мышей, крыс, морских свинок и кроликов обеспечивают простоту и гибкость для генетической манипуляции, но переводимых доклинических моделей имеют решающее значение для пациента дозирования и токсичность исследования потенциальных терапевтических средств6 ,13. Хотя были разработаны несколько моделей тромботических расстройств у мышей, большие животные модели тромбоза, которые применимы к заболевания периферических сосудов, инсульт и инфаркт миокарда являются несколько и далеко. Первые модели тромбозы в обезьян, собак и свиней сосредоточена на стеноз, применение hemostats и позднее цилиндры для судов, часто, что приводит к циклической потока сокращений14,,1516. Вместо окклюзионной тромба на сайте эндотелиального повреждения как модель хлорное тромб в этих моделях привели к циклических тромбоза, дистальная эмболизации и вернуться к нормальной крови поток. В сравнении хлориду модель изменения здесь в больших животных, результаты в окклюзионной тромба на месте травмы стабилизировалась и проверены ангиографии до тромболитической лечения. Условии, что следователь имеет достаточно средств для каждого diem и покупку клыки и адекватного хирургического опыта, мы подробно здесь больших собак модель сосудистых повреждений, чтобы позволить лаборатории для изучения тромбоза используя хирургические, обработки изображений и гистологические методы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Расследований описал соответствовать руководящим принципам для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здоровья и были одобрены Огайо государственного университета институциональных животное уход и использование Комитетом (#2015A00000029). Все хирургические манипуляции выполнялись под глубокой анестезии и животных не испытывали боль на любой стадии во время процедуры. Все эксперименты, в описанный были без восстановления.

1. Подготовка

  1. Свеже Подготовьте 50 мл хлорида железа (3FeCl) на 50% (w/v) разводят в деионизированной воде.
  2. Пупочную ленты нарезать 5,5 см и замочить в свежеприготовленный раствор 50% FeCl3 1 неделю перед процедурой.
    Примечание: Пупочной лента используется толстая и занимает некоторое время, чтобы покрыть 50% раствора FeCl3 .
  3. Быстро каждый собак на ночь перед операцией.
  4. Ярлык криопробирки сбора мочи и плазмы, 50 мл стерильного пробирок для хранения всех органов и формалина 10% емкости для мозга и сонной артерии фиксации для H & E пятнать с идентификации животных, Дата рождения, Дата хирургии и лечения.
  5. Подготовка 100 мл каждого решения для каждой процедуры, собак: параформальдегида 4% в фосфатный буфер (рН 7,4), 10% нейтральные буферизуются формалин и 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида [TTC в PBS (рН 7,4), хранить в темноте].
  6. Приобрести достаточно жидкого азота для всех криопробирки и 50 мл трубки ткани для flash замораживания на день процедуры.
  7. Приобрести два ADP/коллагена картриджи для реактивность тромбоцитов PFA-100 (анализатор функции тромбоцитов) для каждого собак для каждой точки время интерес.
  8. Приобрести один 4,5 мл натрия цитрата пробирка, для каждого тиража крови перед жертву, для разделения плазмы и хранения. В жертву Нарисуйте 16 пробирки для хранения плазмы. После каждой пробирки, спина на 4000 x g 30 s изолировать тромбоцитов богатой плазмы и передачи снять слой в криопробирки. Флэш-замораживание в жидком азоте до хранения при температуре-80 ° C.
  9. Приобрести один 4,5 мл литий гепарин пробирка, для каждой точки время PFA-100, представляющих интерес для записи тромбоцитов реактивности. В каждом тираже крови ввести 800 мкл цельной крови от литий гепарин пробирки в каждом картридже ADP/коллагена без пузырьков воздуха следовать реактивность тромбоцитов.
  10. Приобрести два ЭДТА K3 пробирки (1.8 мг безводный ЭДТА на 1 мл крови), общий анализ крови (CBC) на базовых и во время жертвоприношения.
    Примечание: Этот объем является достаточным для большинства основных объектов для запуска каждой дважды в случае механических ошибок. Хотя CBC выполнялся на базовой линии до травмы и в то время жертвоприношения, следователи можно добавить, что больше крови рисует утвержденная в их животных протоколы для дополнительного анализа. Проверьте с фондом относительно объемов и требования по доставке для их оборудования.
  11. Подготовьте гепаринизированным шприц 2 мл, заполнив и покрытие шприц в день процедуры для анализа газов крови во время жертвоприношения.
    Примечание: Проверьте с фондом относительно объемов и требования по доставке для их оборудования.

2. собачий сонной артерии окклюзии

  1. Вес взрослого (> 18 месяцев) Бигл собак и предварительно лекарства с внутримышечным acepromazine (0,025-.2 мг/кг) следуют первоначальный внутрибрюшинной инъекции кетамин (5-20 мг/кг) и мидазоламом (0,01-.25 мг/кг). Вызвать глубокий наркоз с 1-5% изофлюрановая, основанный на частоты сердечных сокращений, дыхания и челюсть тон.
    Примечание: Точное анестезии определяется вес и утвержденных животных протокол. Хотя инъекции может привести к боли для животных, продолжительность этого дискомфорта будет минимальным (менее 3 s).
  2. До принятия животное в хирургии таблицу, удалите волосы, отсечения. Примените смазочные глазная мазь на наркотизированных животное глаза для предотвращения сухости.
  3. Поместите животное в лежачем положении, с использованием системы позиционирования и прикрепить электрокардиография (ЭКГ) приводит к ноге колодки. Интубации через трахеи с эндотрахеальной трубки манжетой 6,5 мм, механически проветривать в 14 вдохов/мин и поддерживать каждый собака с непрерывной ингаляции 1-5% изофлюрановая (зависит от утвержденных животных протокол).
  4. Чтобы определить степень канализации сонной артерии и длина окклюзионной тромба, выполняют ангиографии до травмы, перед Исследованием и во время жертвоприношения (дополнительные инструкции см. ниже).
  5. Вставьте бедренной оболочка артериальной и катетера и зафиксируйте с свободно 0-Шелковый шов. Временно закройте оболочкой и катетер во время транспортировки и обработки изображений исследования. Увидеть собак ангиографии дополнительные инструкции ниже.)
  6. Для крови ничьих вставьте 16 g x 45 мм внутривенного катетера через неповрежденную кожу дистальной бедренной оболочка артериальной вырубают сайта. Продвигать катетер в хирургического воздействия и визуализировать его, как он вступает в подвергаются бедренной вены, непосредственно примыкающем к оболочке артерий. После того, как полностью вставлена в Вену, снять иглу, крышка катетер с 3-way краном и промойте его с 2 мл стерильного 0,9% физиологического раствора. Закрепите катетер на кожу с 0-Шелковый шов.
  7. Сделать надрез 8-10 см кожи непосредственно на верхней правой общей сонной артерии региона и вскрыть фасции, чтобы изолировать судна от окружающих тканей.
  8. Осторожно ввести пинцет между сонной артерии и блуждающего нерва для разделения. Не дотрагивайтесь до сонной артерии, больше, чем необходимо, как это может вызвать сужение судна.
  9. Сухие области подвергаются артерии с стерильной марли, чтобы избежать разбавления раствора FeCl3 .
  10. Место Doppler потока зонд вокруг сонной артерии, позволяя иноходь пространства обернуть пупочной ленту вокруг сонной артерии не касаясь потока зонд и начать запись скорость кровотока и продолжаться на протяжении всей процедуры (Рисунок 1 сверху). Записи базового потока для ~ 5 мин до применения пуповинной ленты.
    Примечание: Базовый поток перед FeCl3 пупочной лента размещения обычно в среднем около 250 мл/мин.
  11. Перенос подготовленных FeCl3 пупочной ленту вокруг сонной артерии, используя кровоостанавливающий непосредственно под датчик потока без касатьться на 15 мин, удалить и удалить.
    Примечание: Непроходимость обозначается как нулевой потока мл/мин.
  12. Стабилизируйте окклюзионной thrombus для 45 мин добавить дополнительные физиологического раствора для зонда, необходимо поддерживать сигнал.
    Примечание: В зависимости от возраста, пола и тип собак, дополнительные места размещения подготовленных FeCl3 пупочной ленты могут быть необходимы для позволяя 30 мин для окклюзии произойти до повторного применения. Нет различия наблюдались в тромбоз хлориду приложением с пола в гончих. Это не было сочтено необходимым с этой моделью повторно свежие FeCl3 пупочной ленты более чем один раз и никогда не отклонились от FeCl3 пупочной ленты подготовки протокола. Если лаборатория использует другой породы или возраст собак, FeCl,3 пупочной ленты должны применяться первоначальной темы, чтобы убедиться, что протокол тромбоз не отступать, или группа клыки могут оказаться необходимыми для установления FeCl3 время в приложения для этой породы или возраста в их конкретного исследования. Непроходимость раз, в этом эксперименте, в диапазоне от 8-30 мин после FeCl3 пупочной ленты приложения.
  13. Чтобы определить объем инсульта или кровоизлияние в дополнение к течению тромбоэмболических событий, которые могут возникнуть в результате фармакологического вмешательства, транспорт клыки с дополнительной кетамин инъекций на магнитно-резонансной томографии машину (см. ниже Дополнительная обработка).
  14. Хотя все еще под глубоко хирургического плоскости анестезии от окончательного Ангиограмма/МРТ (см. ниже для визуализации протокола), указывается на отсутствие реакции на вредных раздражителей, сбору цельной крови, необходимые для последующего анализа, затем откройте грудь, резка через ребра начиная с грудины и акцизных сердце путем разрезания кровеносные сосуды (обескровливания).
    Примечание: В этом эксперименте, весь в крови (< 10 мл) было обращено на базовой линии, 5 мин после агента администрирования и 60 мин после вливания из бедренной оболочка и увидел не влияет на процесс тромболизиса. В жертву неограниченный объем могут быть составлены для хранения дополнительных плазмы, если одобрено в животных протокол. Анализировать, обрабатывать и хранить все цельной крови в течение 30 мин жертвоприношения. Убедитесь, что кровь не рисуется сверх утвержденных процент веса тела животного как подробно на утвержденных животных протокол. Все эксперименты, в описанный были без восстановления.
  15. Промойте сердце с 0,9% физиологического раствора и вспышки заморозить образцов в жидком азоте при желании.
  16. Перед удалением аорт, Измерьте длину сгусток, поместив правитель рядом с его и запись. Поместив маркер ткани на середине сгусток и в том же месте на контралатеральной сонной артерии для удобства в гистологии обрезки. Марк контралатеральную сонной артерии на той же длины.
    Примечание: Длина средний сгусток с этой модели составляет 1,75 см.
  17. Удалите всю длину сгусток на обоих судах и исправить в формалина 10%. Удаление контралатеральной сонной артерии в пределах длины, помеченные маркером ткани. Пополам контралатеральной сонной артерии в середине сгусток. Вспышки заморозить половины контралатерального сонной артерии в жидком азоте для последующего анализа и исправить другая половина в формалина 10% для внедрения у потерпевшего сонной артерии для гистологического анализа ниже.
  18. Удаления органов для любого желаемого анализа, промыть 0,9% физиологического раствора и флэш-замораживание в жидком азоте.
  19. Удаление черепа с круговой пилой. Медленно извлеките черепа без повреждения мозга под.
  20. После того, как мозг удаляется из черепа, промыть в холодной 0,9% физиологического раствора и вырезать две секции 4 мм от середины мозга, боково резки с острый скальпель. Поместите один из разделов 4 мм в 2% TTC ишемического демаркации (см. дополнительную обработку для мозга ТТС), а другой срез в формалина 10% на 7 дней для H & E окрашивание (см. дополнительную обработку для мозга H & E).

3. собачий ангиография

Примечание: Это показано на рисунке 2 и делается во время операции на время точек интереса.

  1. Почувствовать пульс в правой паховой области и сделать 3-5 см брюшные Сагиттальный разрез.
  2. Подвергать бедренной артерии и отделить его от окружающих тканей, с использованием тупых рассечение.
  3. Используйте кровоостанавливающий углом 0-Шелковый шов вокруг дистального конца подвергаются артерии.
  4. Галстук дистальной 0-Шелковый шов и применить небольшое напряжение к артерии, зажимные сыпучих 0-Шелковый шов концы для кожи с hemostats.
  5. Разместите второй 0-Шелковый шов вокруг проксимальный конец сегмента подвергаются.
  6. Прокол артерии на полпути между проксимальном и дистальном 0-Шелковый шов связей, с помощью иглы интродьюсер 18G пройти проволочный направитель в артерию.
  7. Загрузите собрал 6Fr оболочка и расширитель на проволочный направитель, схватив провода, как он выходит из сборки.
  8. Заранее через проволочный направитель расширитель и оболочкой. Убедитесь в том поддерживать твердое понимание провода, как она выступает из расширителя при продвижении Ассамблеи оболочки расширитель.
  9. После полного вставки галстук проксимальной 0-Шелковый шов вокруг оболочкой для поддержания гемостаза на сайте артериальной проколов.
  10. Одновременно удалите расширитель и проволочный направитель.
  11. Откройте односторонний клапан проверить наличие пульсирующего кровотока и заподлицо с 3-5 мл физиологическим.
  12. Подключите односторонний клапан оболочка доступа к жидкости заполнены выносной линии придают датчика давления на мониторинг и запись измерения инвазивных артериального давления.
  13. Предварительная загрузка проволочный направитель 0,35" в 4Fr. Ангиографический катетер и подключитесь к Коллектор впрыска контраст с y адаптером туи.
  14. Вытащить кончик проволоки руководство только внутри дистального наконечника катетера и очистить всю сборку с saline.
  15. Вставьте Ангиографический катетер в гемостатический клапан оболочка и затем продвигать проволочный направитель около 5 см за дистальной катетера.
  16. Под руководством рентгеноскопические и используя Ретроградная транс аортальный подход медленно продвиньте катетер в аорты.
  17. Придать 2-3 мл контраст агент разводят 1:1 с физиологическим для идентификации взлета плечеголовной ствол.
  18. Используйте проволочный направитель для прямой катетер в плечеголовной ствол, а затем выборочно в правой общей сонной артерии.
  19. Извлеките проволочный направитель и придать 2-3 мл разбавленного контраст, чтобы убедиться, что катетер размещается в сонной артерии.
  20. Придать 3-4 мл неразбавленного контраст во время записи ангиографические работает с использованием цифровой вычитание и стандартных ангиографические методов.
  21. Повторите шаги 3.18-3.21 для повторных ангиографии в точках дополнительное время.

4. магнитный резонанс - диффузии взвешенных изображений (DWI) и Т2 взвешенных изображений (T2WI) собак мозга

Примечание: Это показано на рисунке 3A-3B.

  1. Убедитесь, что собака находится под глубокой анестезии.
  2. Убедитесь, что собаки физиологические параметры контролируются на протяжении всего изображений, включая ЭКГ, ЧСС.
  3. Убедитесь, что собака лежит в лежачем положении с ее головой в двусторонних отверстий мозга катушки.
  4. Включение магнита 3 Тесла (3Т).
  5. Выполните Т2 взвешенных изображений (T2WI), основной импульс последовательностей в МРТ.
    Примечание: Последовательность использует различия в T2 времени релаксации тканей в различных патологических состояний.
  6. Выполняют локализатор imaging для приобретения экспериментальных изображения собака мозга до анатомических изображений, используя T2-взвешенный градиента эхо изображений последовательности и определяют поле зрения (FOV), количество фрагментов и толшины чтобы полностью покрыть мозга.
  7. Используйте следующие параметры T2: ломтик толщина = 3 мм, TR = 4000 мс, TE = 75 МС, ETL = 7, приобретение матрицы = 320 x 256, FA = 180ᵒ, ПЗ = 320 х 320 пикселей, разрешение изображения = 2.4615 пикселей на мм.
  8. Выполните диффузии взвешенных изображений (DWI) с помощью эхо рубанок DTI последовательности 4 h после окклюзии MCA и непосредственно перед жертву.
  9. Используйте следующие параметры DWI: b = 1500 s/мм2, толшины = 3 мм, TR = 4600 МС, ET = 86 МС, ETL = 55, приобретение матрицы = 140 х 140, FA = 90ᵒ, ПЗ = 231 x 257, разрешение изображения = 0.9333 пикселей/мм (Таблица 1).

5. гематоксилином и эозином (H & E) пятная собак мозга

Примечание: Это показано в рисунке 3D.

  1. После 7 дней в 10% формалина внедрите в разделах мозга 4 мм в парафин.
  2. Трим парафиновые блоки до тех пор, пока они уровне с микротом, удаление любых дополнительных парафин из верхней части ткани мозга, а затем вырезать ткани мозга в 4 мкм и место одной секции мозга на каждый слайд дюйм 2 "x 3".
    Примечание: До окрашивания, место все решения в отдельных контейнерах, чтобы слайды могут быть перемещены из одного решения в другой без высыхания.
  3. Де paraffinize каждый слайд мозга и увлажнения с водопроводной водой.
  4. Место каждого слайда мозга в 560 гематоксилином 8 мин.
  5. Промойте каждый слайд мозга в водопроводной воде.
  6. Дифференцировать каждый мозг слайд с 1% кислоты спирта на 1 s три раза.
  7. Промойте каждый слайд мозга в водопроводной воде.
  8. Синий каждый мозг слайды с 1% Окисоводопод аммония 1 s.
  9. Промойте каждый мозг слайд в проточной водой в течение 2 мин.
  10. Обезвоживает каждый мозг слайд в 70% этанола (EtOH) для 1 s двенадцать раз.
  11. Counterstain каждый мозг слайд эозина за 1 мин.
  12. Обезвоживает каждый мозг слайд в 95% EtOH 1 s двенадцать раз.
  13. Обезвоживает каждый мозг слайд в 100% EtOH.
  14. Очистить каждый мозг слайд в ксилоле и затем применить coverslip дюйм 2 "x 3" на вершине мозга слайд, удаление пузырьков воздуха с смолистые монтажа СМИ.
    Примечание: Все решения используются повторно Кроме воды и этанола для нескольких дней окрашивания и несколько слайдов. Все обработки после секции мозга помещаются на слайды сделали в стекле, окрашивание баночки, но пластиковые контейнеры окрашивание коммерчески доступны также. Замените любое решение, когда он становится бесцветные и держать их плотно покрыты.

6. гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание собак аорт

Примечание: Это показано на рисунке 1 (слева).

  1. После 24-72 h в 10% формалина, пополам потерпевшего сонной артерии в середине сгусток и внедрить ~ 1 см раненых сонной артерии и ~ 1 см контралатеральной управления в том же кассету парафина.
    Примечание: Сгусток крови внутри сонной артерии является хрупкой. Подождите, пока судно было зафиксировано в формалина 10% до резки так что сгусток не нарушается. Встраивание раненых и контролировать сонных артерий в том же парафин блок позволит резки в то же время в том же месте в кровеносный сосуд.
  2. Трим парафиновые блоки до уровня с микротом, удаление любых дополнительных парафина. Затем вырежьте секций на 4 мкм на 25 мм x 75 мм x 1 мм слайдов без поворота блока парафин, так что контралатеральной сонной секции размещены в верхней части слайда.
    Примечание: Три сонные секции были помещены на каждый слайд, но можно добавить зависимости пятна интерес.
  3. Де paraffinize каждый слайд, сонных и гидратов в водопроводной воде.
    Примечание: В отличие от мозга слайд, который должен быть обработан индивидуально, сонных слайды могут обрабатываться навалом, поместив в банки, которые соответствуют несколько слайдов в то время, не касаясь друг друга.
  4. Пятно каждый сонной слайд гематоксилином за 8 мин.
  5. Промойте каждый сонной слайд в водопроводной воде.
  6. Дифференцировать каждый сонной слайд с 1% кислоты спирта на 1 s три раза.
  7. Промойте каждый сонной слайд в водопроводной воде.
  8. Синий каждый сонной слайд с 1% Окисоводопод аммония 1 s.
  9. Промойте каждый сонной слайд в проточной водой в течение 2 мин.
  10. Обезвоживает каждый сонной слайд в 70% EtOH 1 s двенадцать раз.
  11. Counterstain каждый сонной слайд эозином или 1 мин.
  12. Обезвоживает каждый сонной слайд в 95% EtOH 1 s x 12.
  13. Обезвоживает каждый сонной слайд в 100% EtOH.
  14. Очистить каждый сонной слайд в ксилоле и добавить coverslip 24 x 50 мм с смолистые монтажа СМИ для удаления пузырьков воздуха.

7. 2,3,5-илидами-2H-tetrazolium хлорид (TTC) пятная собак мозга

Примечание: Это показано в рисунке 3 c.

  1. Место другой раздел 4 мм удалены из середины мозга немедленно проксимальнее H & E секции в ранее подготовленных 2% TTC (окклюзия сонной артерии). Инкубируйте в темноте при 37 ° C для по крайней мере 20 минут, переворачивая секции мозга для даже пятнать каждые 5 мин.
    Примечание: После 20 мин, Секция должна быть вишневый с обеих сторон. Может потребоваться дополнительное время, основанные на TTC свежесть и толщина ткани секции.
  2. Удаление решения TTC и заменить его с параформальдегида 4% в PBS, рН 7,4 оптимизировать цветовой контраст.
  3. Когда контраст между белой и красной окраски является оптимальным, место ломтики TTC мозга между прозрачные пластиковые листы, сухой лишней жидкости и сканирование с высоким разрешением для трассировки ишемического регионов.
    Примечание: Секции могут храниться бессрочно в растворе параформальдегида, но окрашивание будет исчезать.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После подробных процедур здесь приведет к разработке модели, который может использоваться для оценки профилактических или тромболитических окклюзионной артериальной вмешательств. Рисунок 1A показывает базовой скорости потока и результирующей скорости кровотока до, во время и после лечения зарегистрировано коммерческого программного обеспечения. Данные из этой записи может использоваться для определения процента повторного перфузии с сонной артерии травмы и лечения в этой модели собак. Рисунок 1B пример контралатеральной (вверху) и раненых (внизу) собак сонной секций, окрашенных с H & E, который проверяет состояние повторной канализации во время жертвоприношения. Множество программ доступны для анализа области перфузии судна путем отслеживания кровеносного сосуда (без тромба), который можно разделить на общей площади судна прибыть на процент канализации с каждой процедурой. На рисунке 2 показано несколько примеров сонной артерии ангиографии, подробно изложены в этом собак изображений протокол, который может использоваться для определения, является ли тромб окклюзионной. Кроме того используя зонд квадратных потока как маркер, следователи могут определить длину тромба в каждый момент времени, принятых Ангиограмма. Хотя здесь мы представили изображения до травмы, 60 мин после лечения транспортного средства и в то время жертвоприношения, следователь могут адаптировать изображений для их потребностей. Рисунок 3 является результатом магнитных параметров визуализации, применяется для собак мозга ~ 4 h после окклюзия сонной артерии непосредственно перед жертву, используя взвешенный диффузии (Рисунок 3А) и T2 взвешенных изображений (рис. 3B) подробно описаны в разделе 4 настоящего Протокола. Хотя мы показываем только одна фотография всего массива, принятых на различных уровнях в головном мозге, размер тома кровоизлияния и инсульта может определены на различных уровнях и областях головного мозга и предел в каждый момент времени лучшего следователя. Количественный завершено с использованием специального программного обеспечения машина МРТ для следователя тепловизор. TTC пятнать результаты, как показано на рисунке 3 c может использоваться для разграничения мозговой ткани, в которой клетки по-прежнему метаболически активные, помимо тех, которые не являются. TTC ферментативно сократится до привести к красным витражи живых клеток, тогда как мертвые клетки не сохранит ТТС и таким образом не будет красным. И наконец, гематоксилином и эозином, техника, продемонстрировал в собачьей мозга в рисунке 3D окрашивания приведет к пятнать красные кровяные клетки ярко-красный, который может быть использован для проверки областей, где произошло кровоизлияние.

Figure 1
Рисунок 1: Мониторинг потока крови сонной. (A) скорость кровотока представитель сонной артерии (мл/мин), записанных с Допплер зонда от базовой линии до травмы через жертву. (B) представитель H & E пятнать перекрытых сонной артерии (внизу) и контралатерального управления (сверху). Увеличение — на 20 X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Мониторинг потока сонной крови, ангиография. Представитель ангиографии вид право собак сонной артерии. Изображения были взяты в базовых перед вливанием транспортного средства (A), 60 мин после инфузии транспортного средства (B)и во время жертвоприношения, 4.5 ч после окклюзии (C). Красные стрелки показывают расположение на судне FeCl3-индуцированного повреждения, где был помещен пупочной ленты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: представитель изображения собак мозга после лечения автомобиля. Магнитно-резонансная томография (МРТ) выполнены ~ 4 h после окклюзии, непосредственно перед жертву, используя диффузии взвешенных изображений (DWI, (A) и Т2 взвешенных изображений (B). TTC пятнать медиальной секции во время жертвоприношения разграничить жить от мертвых тканей (C). H & E окрашивание медиальной раздел, сразу же проксимальнее TTC секции, во время жертвоприношения разграничить ткани, которые являются метаболически активные (красный) от тех, которые не являются TTC сводится к красный продукт, когда принятые живых клеток и таким образом, приведет к разделы, которые могут быть количественно с множеством программного обеспечения для трассировки живут против мертвых регионов. (D). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Экспериментальный параметр T2-взвешенный Диффузия Средневзвешенная
Повторение время (TR) ms 4000 4600
Эхо времени (TS) ms 75 86
Флип угол, в градусах 180 90
Приобретение матрица 320 x 256 231 x 257
Количество средние 2 4
В плоскости изображения резолюции (точек/мм) 2.4615 0.9333

Таблица 1: параметры Imaging магнитного резонанса (MRI). МРТ-параметры, которые были разработаны для собак T2 и диффузия взвешенный изображения, чтобы максимизировать для оценки измерение объема инсульта и кровоизлияние в собачьей сонной артерии тромбоза модели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FeCl3 искусственных сосудистых повреждений модель широко используется для изучения тромбоза в мелких домашних животных и легко переводить на крупных животных, доклинические модель с множеством преимуществ. Незначительные изменения для адаптации протокол в собак допускается использование обоих магнитно-резонансной томографии оценить объемы инсульта и кровоизлияние после фармакологического вмешательства и ангиографии оценить канализации судна до, во время, и После лечения. Другие тромботических большие животные модели не изучал стабилизированный окклюзионной тромбов на месте травмы и поэтому не может использовать ангиографии и гистология сонной артерии, чтобы оценить степень повторного канализации для каждой профилактических или тромболитической лечение. Помимо преимуществ крупного животного, которые включают в себя достаточно ткани для анализа (плазма, моча, органов для исследований токсичности и т.д.) большие животные модели гораздо более тесно имитирует сердечный ритм, кровяное давление и каскад свертывания в организме человека чем у грызунов моделей. Адекватные размер мозга и сонных артерий, результат гистологического и биологического материала, который может использоваться для множества воспалительных и биохимических исследований на каждом экспериментальных животных. Еще одно преимущество изменения FeCl3-индуцированного сосудистой модель в собак является, что гораздо больший объем крови могут быть извлечены в ходе эксперимента без изменения тромбоцитов реактивности или тромб формирования такой что крови газ и полное крови счетчики могут контролироваться на протяжении травмы и наркотиками вливания. Кроме того было обусловлено хлорного вреда окислителя ущерб; Таким образом он будет подражать атеросклеротического повреждения, которые гораздо более тесно, чем другие типы публикации артериальная повреждения модели7предшествует клинических инсульта и инфаркта миокарда. И наконец механические мероприятия, например тромбэктомии, которые регулярно используются клинически, может следовать медикаментозное лечение, так что ре стеноз и состояние здоровья эндотелиальные стены могут быть решены с достаточно гистологические ткани для нескольких исследования на же собак.

Ограничения этой модели несколько, но должны быть рассмотрены. Во-первых, хотя время точкой и лечение, выбранные в этой публикации (жертву 4,5 ч после травмы сонной артерии, транспортного средства) не привели к измерению инсульта или кровоизлияния, этот метод является клинически значимых для расследования против тромботических Роман и тромболитической агентов, чтобы определить эффективность и дозировки. Действительно инсульта или кровоизлияния с первоначальным тромботических оскорблять или с медикаментозное лечение (например, rTPA) происходят с этой моделью. Во-вторых собак расходы на покупку, Доставка, генетические манипуляции и суточные довольно высоки и стоимость непомерно высока до тех пор, пока препарат хорошо изученных в моделях грызунов.

Важнейшие шаги в центре протокол на активации тромбоцитов, агрегации и адгезии, суть тромбоза. Так как анализатор функции тромбоцитов (PFA-100) могут быть выполнены с 1600 мкл цельной крови в двух экземплярах, этот метод является простым и легко отслеживать реактивность тромбоцитов во всей процедуре не затрагивая гомеостаз крови. Дальнейшие исследования ex vivo активности тромбоцитов с использованием импеданс или lumi-aggregometry могут быть выполнены перед сосудистых повреждений не затрагивая экспериментальной тромбоза, пока последний розыгрыш крови > 1 неделю до операции в дополнение к после травмы и лечение во время жертвоприношения. Как уже упоминалось, дополнительные приложения пупочной ленты, смоченный в 50% FeCl3 может быть необходимым в зависимости от пола, породы, или возраст каждого собак. Мы 30 минут после травмы для окклюзии повторно применяется и свежие 50% FeCl3 еще 15 мин при необходимости. Этот процесс не привела к значительной разнице в тромболитической отклонение с возраста или пола, с помощью взрослого гончих. В этом исследовании мы освещены критически и состояние искусства диффузии, взвешенных изображений (DWI), Мистер изображений на основе измерения броуновского движения (случайные диффузия частиц) молекул воды в пределах voxel ткани. Этот метод является полезным в обнаружении острого ишемического инсульта среди других патологий, таких как опухоли путем диффузии показаны в гипер клеточных тканях или тех, с сотовой отек низка с выше17,-коэффициент диффузии18 ,19. Карты распространения зависит от диффузии молекул воды в мозге ткани17,18,19. Значение B меры градиент для диффузии H2O молекул. На сайте ишемического повреждения свободной воды испытывает сильнейшие затухание сигнала выше значения B19.

Помимо использования этой собак протокол для исследований в дозирования, токсичность и эффективность профилактического и тромболитической агентов размер собак делает эксперименты в механических тромбэктомии клинически значимых и легко достижимо. Аорт легко обрабатывается, окрашенных и начисленных взносов, используя протоколы для человека гистологическое исследование иммунных клеток инфильтрата после извлечения сгусток. Эти исследования будет наш следующий подробных протоколов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить центр когнитивной и поведенческой мозга изображений в университете штата Огайо за их финансовую и научную поддержку для разработки и выполнения собак магнитно-резонансной томографии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/8” umbilical tape  Jorgensen Laboratories Inc.,  #J0025UA  for ferric chloride application
4% paraformaldehyde in PBS Alfa Aesar AAJ61899AP
10% neutral buffered formalin  Richard-Allan Scientific 5701
 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)  Sigma Aldrich T8877
ADP/Collagen cartridges Siemens Diagnostics B417021A
4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer  Becton Dickinson BD 369714
4.5 ml lithium heparin vacutainer  Becton Dickinson BD 368056
EDTA K3 vacutainers  Becton Dickinson BD455036
Doppler flow probe Transonic Systems Inc MA2.5PSL
Hematoxylin 560  Surgipath 3801570
Eosin Surgipath 3801602
LabChart Software ADInstruments Inc.
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe) NovaPlus 402525D
HUG-U-VAC positioning system   DRE Veterinary 1320

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adams, H. P. Jr Stroke: a vascular pathology with inadequate management. Journal of Hypertension Supplement. 21 (5), S3-S7 (2003).
  2. Lansberg, M. G., Bluhmki, E., Thijs, V. N. Efficacy and safety of tissue plasminogen activator 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke: a metaanalysis. Stroke. 40 (7), 2438-2441 (2009).
  3. Nagel, S., et al. Therapy of acute basilar artery occlusion: intraarterial thrombolysis alone vs bridging therapy. Stroke. 40 (1), 140-146 (2009).
  4. Ciccone, A., Motto, C., Abraha, I., Cozzolino, F., Santilli, I. Glycoprotein IIb-IIIa inhibitors for acute ischaemic stroke. The Cochrane database of systematic reviews. 3 (3), (2014).
  5. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. New England Journal of Medicine. 333 (24), 1581-1588 (1995).
  6. Leadley, R., Chia, L., Rebellob, S., Gagnon, A. Contribution of in vivo models of thrombosis to the discovery and development of novel antithrombotic agents. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 43 (2), 101-116 (2000).
  7. Bodary, P. F., Eitzman, D. T. Animal Models of Thrombosis. Current Opinion In Hematology. 16 (5), 342-346 (2009).
  8. Sachs, U. J. H., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circulation Research. 100 (7), 979-991 (2007).
  9. Bonnard, T., Hagemeyer, C. E. Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel. Journal of Visualized Experiments. (100), e52838 (2015).
  10. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  11. Karatas, H., Erdener, S. E., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (6), 1452-1460 (2011).
  12. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  13. Vilahur, G., Padro, T., Badimon, L. Atherosclerosis and Thrombosis: Insights from Large Animal Models. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-12 (2011).
  14. Coller, B. S., Folts, J. D., Smith, S. R., Scudder, L. E., Jordan, R. Abolition of in vivo Platelet Thrombus Formation in Primates with Monoclonal Antibodies to the Platelet GPIIb/IIIa Receptor. Correlation with Bleeding Time, Platelet Aggregation, and Blockade of GPIIb/IIIa Receptors. Circulation. 80 (6), 1766-1774 (1989).
  15. Folts, J. An in vivo Model of Experimental Arterial Stenosis, Intimal Damage, and Periodic Thrombosis. Circulation. 83 (6 Suppl), (1991).
  16. Yasuda, T., et al. A canine model of coronary artery thrombosis with superimposed high grade stenosis for the investigation of rethrombosis after thrombolysis. Journal of the American College of Cardiology. 13 (6), 1409-1414 (1989).
  17. Schob, S., et al. Correlation Between Aquaporin 4 Expression and Different DWI Parameters in Grade I Meningioma. Molecular Imaging and Biology : MIB : the Official Publication of the Academy of Molecular Imaging. 19 (1), 138-142 (2017).
  18. Schob, S., et al. Diffusion-Weighted Imaging Using a Readout-Segmented, Multishot EPI Sequence at 3 T Distinguishes between Morphologically Differentiated and Undifferentiated Subtypes of Thyroid Carcinoma-A Preliminary Study. Translational Oncology. 9 (5), 403-410 (2016).
  19. Schob, S., et al. Diffusion-Weighted MRI Reflects Proliferative Activity in Primary CNS Lymphoma. Public Library of Science One. 11 (8), e0161386 (2016).

Tags

Медицина выпуск 139 хлорное тромбоз собак сонной артерии модель животных сосудистых повреждений доплеровского расходомера магнитно-резонансная томография ангиография
Хлорида железа индуцированной собак сонной артерии тромбоза: Большой животных модель сосудистых повреждений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huttinger, A. L., Wheeler, D. G.,… More

Huttinger, A. L., Wheeler, D. G., Gnyawali, S., Dornbos III, D., Layzer, J. M., Venetos, N., Talentino, S., Musgrave, N. J., Jones, C., Bratton, C., Joseph, M. E., Sen, C., Sullenger, B. A., Nimjee, S. M. Ferric Chloride-induced Canine Carotid Artery Thrombosis: A Large Animal Model of Vascular Injury. J. Vis. Exp. (139), e57981, doi:10.3791/57981 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter