Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

העברה מינית של Trypanosomes האמריקאי של זכרים ונקבות כדי החברים נאיבי

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

סוכן Trypanosoma cruzi Chagas המחלה מייצרת לטווח ארוך ללא תסמינים זיהומים בפתאומיות להתפתח פתולוגיה רפואית מוכרת. פרוטוקול המחקר הבאים מתאר הקצר על בסיס משפחתי אפידמיולוגיים מחקר כדי לפענח את הזיהום טי cruzi מחלות מהאב את רומא.

Abstract

Trypanosomiasis האמריקאית מועבר לבני אדם על ידי חרקים triatomine דרך הבליעה של מזון מזוהם, על-ידי עירויי דם או בטעות, בתי חולים, מעבדות מחקר. בנוסף, הזיהום Trypanosoma cruzi מועבר מלידה מאמא chagasic לצאצא שלה, אבל התרומה של השותף זכר לזיהום ברחם אינו ידוע. הממצאים של קנים ובתצורות של amastigotes ושל trypomastigotes בתאים theca של השחלה, את goniablasts, לומן של בקוריאנית וכמה מראים כי זיהומים cruzi ט מועברות מינית. פרוטוקול המחקר במסמך זה מציג את התוצאות של אוכלוסיה משפחה המחקר מציג טפיל DNA גרעיני תאי תאי הדם דיפלואידי, את גמטות הפלואידי של בני אדם. לפיכך, שלוש דגימות ביולוגיות עצמאית שנאספו ששנה מבדילה בנינו אישר כי זיהומים טי cruzi מינית מועברות אל רומא. מעניין, הספציפית נוגדן cruzi ט נעדר הרוב צאצאי המשפחה זה נשא מחוסן סבילות אנטיגן טפיל. עמידות המערכת החיסונית הודגם עוף עקשן ל ט cruzi לאחר השבוע הראשון של צמיחה עוברית, בחורות בקעו מהביצים מצליפים-מחוסן היו מסוגלים לייצר נוגדן ספציפי. יתר על כן, החדרה של זרע אנושי גומר intraperitoneally או לתוך הנרתיק של עכברים תמים הניב cruzi ט amastigotes יותרת האשך, וכמה צנורית, צינור , צינור הרחם עם היעדרות של דלקתיות תגובות באיברים מיוחס המערכת החיסונית של רבייה. הרבייה של cruzi טי-עכברים נגועים זכר ונקבה עם החברים תמימה, גרמו רכישה של דלקות, אשר מאוחר יותר מועברות אל הוא צאצא. לכן, חזקים חינוך, מידע ותקשורת תוכנית המערבת את האוכלוסייה של הארגונים החברתיים נחשבת הדרושים למנוע Chagas המחלה.

Introduction

טפילים protozoan Trypanosoma cruzi השייך למשפחת Trypanosomatidae עובר שלבים במחזור החיים trypomastigote ו- amastigote בתרבית של המארחים, קיים epimastigotes של חרקים-וקטור (Reduviid: Triatominae) הבטן ואת תרבות axenic. במהלך העשורים האחרונים, מספר מחקרים הראו הנוכחות של Chagas המחלה במדינות ב-4 יבשות נחשב triatomine באג חינם1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; הפיזור של trypanosomes האמריקאי יוחס בתחילה עולים מאמריקה הלטינית הכדור הצפוני, אך האפשרות כי חלקם מקרים autochthonous של Chagas המחלה ניתן עוד למנוע3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. מקור אנדוגני המוכרת היחידה שידור cruzi ט יש כבר המיוחס העברת של האם chagasic הטפיל אופספרינג כ- 10% של הריונות15; התרומה של השותף זכר זיהומים ברחם דרך שופך זרע נותר לא מזוהה.

מעל מאה שנה, אחד החוקרים16,17 נצפתה תאיים cruzi ט amastigotes תאי theca של השחלה, הנבט שורת תאים של האשכים במקרים אקוטיים של Chagas המחלה. הקנים ואת גושים של cruzi ט trypomastigotes, amastigotes תאי theca של השחלה, ב- goniablasts וב -לומן של וכמה בקוריאנית (איור 1) של מקרים Chagas המחלה חריפה קטלני לפתח הרשאות מערכת החיסון באיברים של רבייה בהיעדרו של דלקתיות מחלחל18,19. במהלך העשורים האחרונים, כמה ניסיוני מחקרים הראו קינים של צורות עגולות amastigote של cruzi טי צנורית וכמה, יותרת האשך, וכן הזרע כמו גם הרחם, צינורות, השחלה תאי theca של עכברים נגועים בחריפות 1,20,21,22. יתר על כן, במהלך לימודי משפחה כדי לתעד את העברת protozoan דנ א מיטוכונדריאלי מחולים Chagas הורים לצאצאיהם, DNA גרעיני ט cruzi (nDNA) אומתה נבט הפלואידי האנושי שורת תאים23, ו שלבים במחזור החיים של הטפיל נצפתה שופך chagasic עכברים24. ממצאים אלה הם מסכים עם דיווחים על הסובלנות המערכת החיסונית על-ידי הוא צאצא של cruzi טי -נגוע מארחים בהיעדרו של25,1,26נוגדן ספציפי. בנוסף, דוחות אפידמיולוגיים כי הציע את התפשטות אנדמיים Chagas המחלה ביותר אחרים יבשות3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13 נתמכות כעת על-ידי ניסיוני מחקרים המראים כי Chagas המחלה יכול להיות מועבר מינית1 . החקירה הנוכחי מציג פרוטוקול מחקר אפידמיולוגי משפחה, מראה כי זיהום cruzi ט מפיצה על ידי יחסי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

האדם הוועדות מחקר חיה בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת של ברזיליה אישר כל ההליכים עם בני אדם, חיות מעבדה, בהתאמה, בפרוטוקולים מחקר 2500.167567 ו- 10411/2011. ועדת האתיקה של הציבור קרן בית החולים גספר ויאנה (פרוטוקול מאנו 054/2009 ו CONEP 11163/2009) אושרה על טפסי הסכמה חופשית ללימודי שדה, עם סיומת כדי משרד של הבריאות הלאומי הנציבות על מחקר אנושי (CONEP 2585/04). הפרוטוקול היה מותאם כדי להעריך cruzi ט ה-DNA בתאי תאי הדם דיפלואידי, גמטות הפלואידי של שופך זרע. חיות מעבדה קיבל טיפול אנושי; העכברים, נתון לב לנקב לפני הקרבה, היו תחת הרדמה.

1. גיוס משתתפים אנושי

  1. ודא כי צוות המחקר משתתף בתוכנית בריאות מערכת Chagas המחלה כדי לספק טיפול רפואי לחולים Chagas.
  2. גייס משתתפים האנושי ממשפחות שהשתתפו בתוכנית, מציג לפחות מקרה אחד עם חום, חולשה, כאב ראש, טכיקרדיה, בצקת, הסימפטומים הקליניים העיקריים של חריפה Chagas המחלה14.
  3. לספק טיפול רפואי בני המשפחות המחקר לתקופה של חמש שנים.
  4. להשיג 15 מ"ל של דם ורידי של המשתתפים במחקר בשלוש הזדמנויות שנה אחת לגזרים, לחלק את הדגימה aliquots מ ל שלוש, ולאחסן אותם במקרר-4 מעלות צלזיוס.
  5. לאסוף מ 2 ל שופך זרעו של מבוגרים מתנדבים בני משפחתו והמשך כפי שמתואר בשלב 3.3.

2. צמיחה של טפילים

  1. באמצעות את aliquot מהשלב 1.4, לערבב את הדם עם 5 יחידות של הפארין נתרן anticlotting; להפוך תרבות המדרון על-ידי חיסון של דם המשתתפים משפחה עם האבחנה של חריפה Chagas המחלה.
    1. לחסן 5 מיליליטר דם אנושי unclotted לתוך 50 מ ל cap בורג צינור הדם-אגר שיפוע פלוס 5 מ של אינפוזיה כבד-tryptose בינוני (LIT), דגירה המדגם ב שייקר ב 27 מעלות צלזיוס במשך 3 חודשים.
    2. במקום 100 µL של המדיום supernatant על גבי מדרון זכוכית, לכסות עם פתקי ולחפש דם cruzi ט epimastigotes תחת המיקרוסקופ, כל ארבעה שבועות.
    3. לקצור את מבודד epimastigote ב תגובת שיקוע של מדיום axenic LIT ב 27 ° C; לשטוף את התאים ב- PBS pH 7.4, צנטריפוגה ב x 1000 g 10 דקות; לדלל את epimastigotes ב בגדר ב 5 מ של Dulbecco-השתנה חיוני בינוני (DMEM).
    4. לחסן confluent שרירים L6 המבחנות תא תרבות עם עונה 1 פרק 10 מבודד6 ECI1-אל-ECI21 ט cruzi epimastigote.
    5. לגדל את cruzi ט ECI1-אל-ECI21, את trypomastigotes ארכיטיפ ברניקי בתרבויות תא שריר L6 ב 75 מ ל תרבות מבחנות.
    6. להאכיל תאים עם 15 מ"ל של DMEM ב- pH 7.4 בתוספת סרום שור העוברי 5% 100 IU/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100, 250 ננומטר-גלוטמין ו- 5% CO2 -37 ° C1.
    7. השתמש בפקד חיובי trypomastigotes ט cruzi ברניקי כדי פנוטיפ מבודד את ECI1-אל-ECI21 של תרביות רקמה, כפי שמתואר בשלב 5.2.
    8. לגדול הפקד שלילי לישמניה braziliensis27 DMEM בתוספת 20% עוברית סרום שור בלבד ולהשתמש promastigotes את הטפיל כפקד שלילי.
    9. להשתמש עונה 1 פרק 106 ט cruzi ECI1-אל-ECI21 trypomastigotes תגובת שיקוע מתרבות תא להדביק עכברים.
    10. חפש cruzi ט trypomastigotes בדם הזנב לאחר השבוע הראשון של הזיהום.
    11. חפש קינים של amastigotes ב hematoxylin-אאוזין צבעונית מקטעים של הלב, שרירי השלד, אברי הרבייה של העכברים הנגועים, חודש לאחר מכן.

3. חילוץ DNA וניתוחים PCR

  1. מקום 5 מ של הדם (שלב 1.4) aliquot בשפופרת EDTA סטרילי, ולבצע צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות למשך 45 דקות ב x 3000 g. השתמש פיפטה כדי לקצור תאי תאי מהשלב לבנבן מעל תאי אדום, לשטוף את התאים הלבנים פעמיים ב 5 מ של PBS, pH 7.4, על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב x 1,500 גרם בשפופרת שונים 15 מ"ל, ולהשתמש התאים להפקת DNA.
  2. תמצית ה-DNA של ECI-1 ECI-21 ט cruzi, מהפקד חיובי ברניקי ט cruzi, מהפקד שלילי ל' braziliensis (שלב 2.1.8 תגובה על), וללמוד מן הבדיקה תאי תאי הדם של המשפחה האנושית 109 נושאים1 , 27 , 28.
  3. ML 2 שתדללו דגימות זרע שהושג בשלב 1.5 ב- DMEM (1:4, וי/v); תקופת דגירה של 45 min ב- 5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס, להתאושש spermatozoa תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 13,000 x g, לחלץ את ה-DNA הפלואידי23.
  4. מקום 1 מ"ל של התאים במאגר החילוץ (10 מיקרומטר NaCl, 20 מיקרומטר EDTA, 1% מרחביות, 0.04% proteinase-K, ו- 1% dithiothreitol), ומערבבים את הפתרונות על ידי היפוך ורעדתי.
    1. Centrifuge פתרונות 10 דקות-13,000 x g ו- 25 ° C, ולהעביר את תגובת שיקוע צמיגה לעמודה ספין.
    2. Centrifuge את העמודה ספין עבור 1 דקות ב x 10,000 ג'י ולמחוק את eluate; להוסיף 500 µL מחייב מאגר לעמודה ספין (טבלה של חומרים), centrifuge זה עבור 1 דקות ב 12,000 x g, למחוק את eluate.
    3. להוסיף מאגר כביסה µL 600 אל העמודה ספין, centrifuge זה עבור 1 דקות ב 12,000 x g, למחוק את eluate.
    4. חזור על שלב זה פעמיים, ולהעביר את העמודה ספין שפופרת צנטרפוגה מיקרו mL 1.5 סטרילי.
    5. להוסיף 100 µL טה מאגר, דגירה הצינור בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ולאחר מכן centrifuge את צינור 1 דקות ב 12,000 x g. המאגר בצינור microcentrifuge מכיל את ה-DNA.
    6. למדידת ריכוזי ה-DNA על-ידי הפעלת aliquots על ג'ל agarose 0.8% ועל ידי קריאת את ספיגת ב-260 nm עם ספקטרופוטומטרים. לאחסן דגימות ה-DNA ב-20 ° C עד שימוש בניתוח ה-PCR.
  5. שימוש cruzi ט Tcz1/2 תחל annealed רצף ספציפי 188-nt טלומר ספציפי בדיקה29 ולהפעיל את ה-PCR עם ה-DNA זרע ודם של הנבדקים במחקר המשפחתי, מהפקד חיובי ברניס cruzi ט ו מ בקרה שלילית ל' braziliensis .
    1. להכין לתערובת PCR עם 10 ng תבנית ה-DNA, 0.4 מיקרומטר של כל זוג תחל, 2 U של Taq DNA פולימראז, 0.2 µM dNTPs, ו- 15 מיקרומטר MgCl2 נפח סופי 25 µL.
    2. ליזום תוכנית ההגברה DNA ב 94 ° C ל 30 s כדי denature את התבנית, ומגניב הדגימות עד 55 ° C ל 30 s. לאחר מכן, דגירה בדגימות ב 94 ° C עבור 90 s כדי להרחיב את תחל annealed. להחזיר את הטמפרטורה עד 94 ° C ל 30 s כדי ליזום המחזור הבא, דגירה בדגימות 3 דקות נוספות-72 מעלות צלזיוס. בסוף מחזור 32nd , מגניב הדגימות 10 דקות בטמפרטורת החדר, לאחסן אותם במקרר 4 ° C29.
    3. להגביר את cruzi טי טלומר חוזרים ברצף של DNA annealed כדי תחל Tcz1/2-בשני הגפיים.
    4. לנתח את המוצרים הגברה ב- 1.3% agarose ג'ל ולצפות הלהקות דנ א 188-nt UV-המאייר.

4. הכלאה בדרום

הערה: הכלאה הדרומי שימש כדי למחוק את רוב amplicons PCR חיובי כוזב הג'ל agarose.

  1. נושא מוצרי הגברה PCR של פקדים נגוע, מפני פקדי חיובי במקרה Chagas, 109 הבדיקה דוגמאות של DNA דיפלואידי ומן הפלואידי-DNA של משתתפי המחקר 21 משפחה כדי hybridizations הדרומי .
  2. מעסיקים cruzi ט 188-nt DNA ספציפיים טלומר רצף החללית annealed כדי תחל Tcz1/2 מוצגים; תווית החללית עם [α -32P] 2'-deoxyadenosine טריפוספט (dATP) באמצעות פריימר אקראי תיוג קיט, ולנתח המוצרים הגברה ג'ל agarose 1.3% 60 וי לילה ב 4 º C.
  3. להעביר את הג'ל קרום ניילון הטעון חיובית בשיטת נימי בן לילה.
  4. Hybridize הלהקות DNA הועבר קרום ניילון עם החללית 188-nt radiolabeled, אשר מאגד את R1 לסביבהמעכל את ה-dna גנומי ב 25 µL של המאגר אנזים ספציפי לפרקי זמן משתנים.
  5. לשטוף את הקרום פעמיים למשך 15 דקות ב 65 ° C עם מרחביות x SSC ו- 0.1% 2.
  6. חושפים את הסרטים רנטגן ניילון הממברנה, autoradiograph הלהקות הקרום למשך שבוע.
  7. לגדול שיבוטים שנבחרו הכלאה PCR, בדרום עם המוצרים הגברה PCR cruzi ט , אשר הם hybridized עם החללית ה-DNA radiolabeled ספציפיים.
  8. מסחרית רצף שיבוטים באמצעות תחל את Tcz1/2 להגדיר annealed כדי cruzi טי -טלומר ספציפי טביעת רגל2,23.

5. מבחני אימונולוגי

הערה: רגישות וספציפיות של immunofluorescence עקיף (IIF) ואת וזמינותו מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) היו מוערך בהסרום Chagas שש, חולי parasitemia הניתנת ומן Chagas נטולת שש, deidentified סרום דוגמאות הבנק. מבחני ניצח עם דילולים סרום זוגי ב- PBS, pH 7.4, חשף כי את IIF ב מטריים דילולים וצפיפות את אליסה אופטי (נחמד) ב 0.150 ומעל הופרדו החיובי התוצאות השליליות.

  1. השתמש 5 מ"ל של unclotted לדם aliquot (שלב 1.4) המשיך בטמפרטורת החדר מאובטח, centrifuge זה ב 1,500 x g למשך 30 דקות להפריד את הנסיוב, תגובת שיקוע.
  2. לבצע IIF ואליסה במטריים triplicate דילולים סרום כדי לזהות אנטיגנים cruzi ט ול' braziliensis כפי שתואר לעיל28.
  3. IIF
    1. התנהגות וזמינותו IIF בסרום triplicate דילולים דגימות של הנבדקים במחקר 109 מתקבל בשלוש הזדמנויות שנה בנפרד.
    2. מקום 5 השעיות µL של פורמלין 1% - התייחסו cruzi ט epimastigotes או ל' braziliensis promastigotes על גבי זכוכית מהשקופיות... תן טפילים הלילה יבש בשכונה בטמפרטורת החדר, לאחסן שקופיות זכוכית ב-20 ° C עד השימוש.
    3. מקום 20 µL של דילולים סרום המטופלים על גבי מדרון זכוכית מצופה µL 5 epimastigotes cruzi ט נהרג פורמלין (10 טפילים/µL) או braziliensis ל' promastigotes.
    4. דגירה השקופית זכוכית מכוסה מעידה על h 1 בתוך תא לחה 37 ° C, שטיפת שלוש פעמים עם PBS.
    5. דגירה שהשקופית זכוכית אוויר יבש עם 1:1,000 לדילול נוגדן ארנב התווית על-ידי fluorescein (טבלה של חומרים) IgG אנושי עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס; לשטוף, לייבש את השקופית.
    6. טעינת השקופית עם מכסה ונבדוק את זה תחת מיקרוסקופ אור UV.
      הערה: מבחן חיובי הוא ירוק-תפוח cruzi ט epimastigote צללית, שמוצג בסרטון.
  4. אליסה
    1. הפעל של אליסה כדי לזהות את cruzi ט ו אנטיגנים מסיסים ל' braziliensis (1 µL µg/100 במאגר קרבונט 0.1 M, pH 9.6) על בארות microplate מצופה.
    2. דגירה של דילולים סרום מטריים בבארות מצופה triplicate עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף צלחות שלוש פעמים עם PBST (PBS המכילה 0.5% Tween-20), pH 7.4, פתרון לפני ייבוש.
    4. דגירה הצלחות עם 50 µL של 1:1,000 לדילול ארנב נגד נוגדנים IgG במשך 90 דקות ב 37 º C.
    5. לשטוף צלחות שלוש פעמים עם פתרון PBST ולאפשר להם לייבוש בטמפרטורת החדר.
    6. דגירה הצלחות עם 100 µL של דילולים 1:1,000 של עז מצומדת פוספטאז אלקליין אנטי-ארנב IgG (טבלה של חומרים) במשך 90 דקות ב 37 º C.
    7. לשטוף צלחות שלוש פעמים עם PBST, להוסיף את המצע p-ניטרו phenyl פוספט והמתן לפיתוח צבע.
    8. לקרוא את מקרי מוות ממנת יתר-630 nm, קורא כינוייהם צלחת.
    9. להפעיל את דילולים triplicate של הסרום מבחן מתוך אוכלוסיית המחקר ותכין את לקיחת לזהות הספציפית את טי cruzi נוגדן titers.

6. הערכות של רגישות המערכת החיסונית

הערה: מערכת מודל עוף היה משמש לבדיקת cruzi ט זיהומים לאחר השבוע הראשון של התפתחות העובר.

  1. לחסן ביצי פורייה עם 100/10 µL ט cruzi trypomastigotes שנקטפו תרביות רקמה בינוני; לחסן שליטה מדומה ביצים עם 10 טי cruzi trypomastigotes לכל µL תרבות בינוני. לאטום את החור עם הקלטת.
  2. תקופת דגירה 20 ט cruzi -נגוע ביצים עם מספר שווה של שליטה מדומה ביצים פוריות-37 ° C ו- 65% לחות של 21 ימים.
  3. שמור האפרוחים את הפתח בחממה במשך 24 שעות, לאחר מכן, ב- 32 מעלות צלזיוס בברדסים עם בקרת טמפרטורה במשך שלושה שבועות.
  4. לגדל את האפרוחים בקעו מביצים ט cruzi -מחוסן, מביצים שליטה מדומה על הבמה למבוגרים בחדר לחץ אוויר חיובי ב 24 ° C, בכלובים בודדים להציב למעבר נפרד.
  5. לאתגר את כל הבחורות למבוגרים שלוש פעמים ב גיל שישה חודשים עם 107 פורמלין-נהרג trypomastigotes מוזרק subcutaneously, מדי שבוע, על פי התכנית וידאו.
  6. דם מווריד כנף של תרנגולות בקעו מן הביצים cruzi טי -מחוסן ומן הפקדים מעושה ארבעה שבועות לאחר החיסונים שעברה כדי לקבל את הנסיוב.
  7. להשתמש את הנסיוב עוף כדי לאתר הספציפי נוגדן cruzi ט מאת IIF ואליסה כפי שמתואר בשלב 5 של הפרוטוקול.

7. זיהום של עכברים עם טי cruzi בזרע Chagas המטופלים גומר

  1. השתמש שופך זרע של חולים במחלה PCR + Chagas למבוגרים (שלב 1.5) ומן אדם מבוגר PCR Chagas-חינם.
  2. השתמש בשתי קבוצות של 12 בן חודש אחד BALB/c תמים עכברים המשיך בברדסים תחת לחץ אוויר חיובי ב 24 ° C. וניזון מזון ad libitum.
  3. להחדיר את aliquots זרע אנושי Chagas-חיוביות (100 µL) לתוך הצפק ואת כמויות שוות לתוך הנרתיק של קבוצה-A עכברים.
  4. להחדיר את הבקרה ללא Chagas זרע aliquots (100 µL) לתוך הצפק וכמות שווה לתוך הנרתיק של עכברים קבוצה-B.
  5. להקריב את העכברים ניסויית תחת הרדמה חמישה שבועות לאחר הפתיחה המיצגים זרע, נושא הסעיפים רקמות מכתים עם hematoxylin-אאוזין.
  6. השתמש במיקרוסקופ לחיפוש ט cruzi trypomastigotes, amastigotes הלב, שרירי השלד ולאחר איברי הרבייה קבוצות של עכברים.

8. העברת טי cruzi זיהום על ידי קיום יחסי מין

  1. השתמש 10 זכר ונקבה בת שבוע 6 BALB/c עכברים בניסויים.
  2. לחסן זכר חמש ועכברים הנשי חמש intraperitoneally עם עונה 1 פרק 105 טי cruzi trypomastigotes מן התרבות רקמות.
  3. להרבות העכברים עד לגיל 3 חודשים: קבוצה ייווצר על ידי חמישה cruzi טי-עכברים נגועים הנשי ובקרת חמשת החברים זכר noninfected; הקבוצה השנייה יכול להיווצר על ידי חמישה cruzi טי -נגוע זכר ושליטה חמישה חברים הנשי noninfected. קבוצה III יכול להיווצר על ידי הזכר חמישה והחברים תמים uninfected חמש הנקבה שולטת.
  4. כל רבייה זוג בכלוב אחד בתוך הכספת עם דלת רשת וקווי הנעילה 5 מ מ כדי למנוע בריחה.
  5. להאכיל העכברים צ'או ומים ad libitum. העלאת סכום כולל של 70 הגמילה progenies קבוצות השני ואני לפחות שישה שבועות.
  6. דם על ידי דקירה בלב הורים (פו), רומא (F1) עכברים תחת הרדמה, להקריב את העכברים, ולהגיש מקטעים של הלב, שרירי השלד, איברי הרבייה לבדיקה פתולוגית.

9. הערכת רמת הרשאות מערכת החיסון

  1. להשיג רקמות של cruzi טי-נגוע, תמים לשלוט עכברים (שלב 8.6), ולגזור הדגימות פרפין-מוטבע לתוך 4 מיקרומטר סעיפים עבה.
  2. הסרת הפרפין, מייבשים הסעיפים עלו על שקופיות זכוכית עם מספר שינויים של קסילן שוטף מדורגת עם אתנול 100% עד 70%, עבור 1 דקות כל אחד.
  3. דגירה הסעיפים רקמות עם 0.05% סאפונין פעם אחת, ואחריו שלושה שוטף מים מזוקקים בטמפרטורת החדר.
  4. לחסום את הסעיפים רקמות עם 5% שומן אבקת חלב במשך 45 דקות לשטוף את השקופיות ב 0.1 M PBST, דגירה הסעיפים עם ה Chagas העכבר אנטי-סרוםcruzi ט או עם הסרום עכבר שליטה uninfected-1:20 דילול כבר שעתיים.
  5. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- PBST ויבש בטמפרטורת החדר לפני הדגירה עם 1:1,000 לדילול ארנב מצומדת פוספטאז אלקליין אנטי-העכבר IgG.
  6. לשטוף את השקופיות ב PBST ולהוסיף 100 µL של 3, 3' diaminobenzidine עבור דגירה 5 דקות, ואחריו שלושה שוטף עם PBST ו counterstaining עם האריס hematoxylin ב-30 s.
  7. לשטוף את השקופיות במים מזוקקים למשך 5 דקות, מייבשים אותם ב- 70%, 80%, 90% ו 100% אתנול עבור 1 דקות, והר אותם בגליצרין במאגר.
  8. לבחון את השקופיות עם מיקרוסקופ אור בהיר-שדה, לכידת תמונה תמונות עם microcamera עם התוכנה, תוכנית מנתח.
  9. המסמך הזכות המערכת החיסונית של הטפיל, בהעדר תגובות דלקתיות של איברי הרבייה.

10. ניתוחים סטטיסטיים

  1. השתמש לערוך ביו לניתוח רצף לבצע יישור עם הפיצוץ, לקבוע את הערך האלקטרוני מובהקות סטטיסטית (p < 0.05).
  2. מבצעים שונות של ניתוח בכיוון אחד (ANOVA) במבחן Tukey, כדי להשוות את האמצעים OD פלוס או מינוס סטיות תקן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר זה, שנערך לפי הפרוטוקול, שמטרתו לזהות במקרים אקוטיים של Chagas המחלה על-ידי מבחנים קליניים, parasitological. דגימות דם ורידי היו נתון בבדיקה מיקרוסקופית ישירה ותרבות במבחנה לצמיחה טפיל. עשרים ואחד במקרים אקוטיים של Chagas המחלה הראו טי cruzi בדם. פרוטוקול מחקר לאבטח את ניתוקה של טי cruzi ECI1-ECI21 מ חריפה Chagas המחלה ולאחר ה-DNA דגימות הציג טביעות DNA חיובי השארית של אוכלוסיית המחקר: מבחני nDNA-PCR הניב את רצף חוזר טלומר טיפוסי עם הלהקות 188-nt הנוכחית כמו גם ארכיטיפ ברניס cruzi ט 1. המקרים Chagas ובני משפחותיהם שהתנדבו להשתתף במחקר היו מקובצים לתוך ארבע משפחות1.

במחקר זה משפחה, nDNA cruzi ט היה PCR מוגבר עם פריימר קובע1,23 annealed רצף ספציפי טלומר מכל אחת 21 Chagas המחלה במקרים אקוטיים. אלה amplicons nDNA ט cruzi hybridized עם המכשיר הספציפי רצף radiolabeled (איור 2); שיבוט ורצף חשף amplicons מורכבת cruzi ט 188-nt טלומר מוטיב חוזר. ייחודה של הליכים אלה הכלאה הוצגה בפקד שלילי עם ל' braziliensis promastigotes. הניתוח פתולוגיה לאמת כי hemoflagellates של חולים במחלה חריפה Chagas היו באמת מדבק ט cruzi. אנו מסיקים כי הלהקה (188-bp) nDNA ט cruzi נמצאו 21 חריפה Chagas במקרים (איור 2) הוא הפגנה ישירה של זיהומים מתמיד.

העברה מינית של Trypanosoma cruzi בבני אדם

כדי להעריך את היחס של דלקות cruzi ט , והגשנו בקשה חומצת גרעין הבדיקה לגילוי רגישות גבוהה של העקבות טפיל אוכלוסיית המחקר משפחה1. ב אלה מבחני ה-PCR, המוצרים הגברה hybridized עם המכשיר הספציפי 188-nt radiolabeled הקימו להקות nDNA 76.1% (83/109) של הדגימות מבחן; התוצאות של הכלאה הדרומי של מוצרי הגברה nDNA-PCR עם המכשיר הספציפי של radiolabeled 188-nt מוצגים באיור3. יתר על כן, hybridizations הראה הטפיל DNA בשורה תא הנבט של בני המשפחה למען הקהילה (איור 4).

IIF הועסק על פנוטיפ ECI1 ל ECI21 ט cruzi trypomastigotes עם הסרום האנושי IgG מתוך מדגם הבנק סרום של המחלה Chagas עם parasitological הוכחת protozoan בדם, fluorescein מצומדת האדם אנטי שאיג שימש . ט cruzi ברניקי פקד חיובי עבור הנוגדן Chagas והיה הפקד שלילי promastigote של המשפחה שלה יחסית ל' braziliensis. איור 5 מראה הצללית ירוק תפוח חיובית של הארכיטיפ ברניקי להרכב הפראי-סוג המעטפה cruzi ט שמוצג בסרטון.

אליסה ואת IIF חשף הספציפית טי cruzi נוגדנים1,28 28.4% (31/109) של הדגימות הבדיקה. התוצאות של אליסה IIF, וכן אלה מן nDNA-PCR אמפליקון hybridizations הדרומי , הותוו ב איור 6. הסתירות בין התוצאות של העקבות nDNA-PCR, ואלה מתוך נוגדן ספציפי מבחני מתוארים ב- heredograms (איור 7), A המשפחה, ארבעה נושאים היה חיובי nDNAט cruzi נוגדן אנטי - ו 11 הייתה רק nDNA חיובי; חמישה גברים היו ט cruzi השפיכה זרע. במשפחה B עם אנשים 44, 11 היה הספציפית נוגדן cruzi ט , ו- 23 היה גם נוגדן ספציפי וגם את הטפיל nDNA; שבעה אנשים היו ט cruzi השפיכה זרע. משפחה C עם 29 חברי הנוגדן ו nDNA ט cruzi של חמישה אנשים, והיה 17 את הטפיל nDNA לבד; ארבעה גברים היו החיובי nDNA-PCR השפיכה זרע. ברה המשפחה, בין נושאים 21, 11ט cruzi נוגדן ספציפי אנטי - ועקבות nDNA, והיו תשעה nDNA PCR חיובית לבד. איור 3, איור 6 ו -7 איור מתארים את הסתירות רחבה בין התוצאות, באופן עקבי, בדגימות ביולוגיות המתקבל משפחה נושאים שלושה ניסויים עצמאי המנוהל שנה בנפרד.

טבלה 1 מציגה את ההבדלים הכמותיים בין את IIF, את אליסה את מבחני nDNA-PCR הדגימות מן המשפחות שמחקר אנושי א-לד הסתירות בין את היחס של מבחני נוגדנים (28.4%) לבין אלה של מבחני חומצת גרעין חיובי (76.1%) הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית (p < 0.005). במשפחות אלו, היוו ההבדלים בין קבוצות של אנשים cruzi טי -נגוע (III ו- IV) 62.6% (52/83) של האוכלוסייה, מציג את מבחן חומצת גרעין חיובי לבד. הסתירות רחבה בקרב את היחס של nDNA חיובי עקבות ואלו של ספציפית cruzi טי נוגדן היו מוסברת על ידי הניסויים שנערכו במערכת מודל עוף.

עמידות המערכת החיסונית

הערכת תגובות מערכת החיסון שנערכו בקבוצות של תרנגולות שהועלו על הבמה למבוגרים בכלובים בודדים למעבר נפרד המכיל תמים שליטה תרנגולות (א); שליטה מדומה תרנגולות בקעו מביצים מחוסן עם תרבות בינוני (B); תרנגולות בקעו מן הביצים מחוסן-trypomastigotes (ג) ט cruzi 26. המבוגר תרנגולות בקבוצות B ו- C לערער שלוש פעמים עם פורמלין-הרגתי cruzi טי trypomastigote אנטיגן, שבועי, כפי שמוצג בסרטון. את אליסה, את מבחני IIF היו להפעיל את הנסיוב שנאספו מקבוצה A, B ו- C תרנגולות חודש לאחר אתגר. איור 8 מציגה את העדר של נוגדן ספציפי קבוצה A ו- C תרנגולות, אשר שנעצו ייצור נוגדנים ספציפיים בקבוצה B חיסון עם אנטיגן ט cruzi . התוצאות הראו בבירור מערכת החיסון סובלנות בקבוצה C בקעו מן cruzi טי-מחוסן ביצים.

העברה מינית של נסה panosoma cruzi במערכת מודל העכבר

יתר על כן, infectivity של cruzi ט מ לפלוט של החולה Chagas, אשר נבחנה חיובית ב- PCR חסרה נוגדן ספציפי, הודגם דרך המיצגים של 100 µL של זרע לתוך חלל הצפק של עכברים זכרים, דרך כמות שווה של זרע שהוחדרו לתוך הנרתיק. חמישה שבועות מאוחר יותר, הקנים amastigote ט cruzi אותרו שרירי השלד והלב, גושים של הבחנה טפילים היו נוכח לומן של צינור הזרע , שפופרת הרחם. מעניין, תגובות דלקתיות הרסני לא מקיפים את הקנים ואת גושים של amastigotes cruzi ט (איור 9).

להערכת שההעברה המינית של זיהומים cruzi ט נוסף נערך בשתי קבוצות של עכברים מחוסן intraperitoneally עם עונה 1 פרק 105 טי cruzi ברניקי trypomastigotes טפסים1,30, 31. בקבוצה ניסיוני אני, 10 טי cruzi -נגוע זכרים הזדווגה עם 10 תמים עכברים שליטה נשית. בקבוצה ניסיוני II, 10 טי cruzi -נגוע נקבות הזדווגה עם 10 גברים שליטה תמים. איור 10 מראה כי את cruzi טי-נגוע זכר עכברים (א-ל-E), cruzi טי -נגוע עכברים הנשי (F-גרם) הניב להקות nDNA 188-bp (מספרים אי-זוגיים). לאחר הרבייה, חברים תמימה (אפילו מספרים) רכשה בקלות cruzi ט בעקבות מפגש מיני ייחודי עם בן זוג chagasic. ניסויים דומים אני חוזר תחת תנאים זהים אישר כי כל עכבר נקבה או זכר תמים זה מינית הזדווגה עם cruzi טי-נגועים זכר או נקבה רכשה את הזיהום flagellate. המייסדים האלה nDNA-חיוביות (F0) שנוצר רומא שהועלו עד גיל 6 שבועות. אז, את המבחן, הפקד uninfected עכברים היו ודימם דרך הלב לנקב לאסוף כ- 0.5 מ"ל של דם. מבחני nDNA-PCR הראה כי זיהומים המייסדים (F0) מינית רכשה מועברות אל הוא צאצא F1, כפי שמוצג על ידי הלהקות nDNA 188-bp (איור 11). הוא צאצא F1 היו nDNA-חיוביות 41 של הדגימות (58.6%) 70 בחן. של אלו עכברים עם להקות nDNA רמיזות של אנכית רכשה זיהומים, כמו כמה כמו 9 של 41 (22 אחוז) היו נוגדנים cruzi טי .

העכברים רומא F1 הוקרבו תחת הרדמה, רקמות הגוף היו נתונים מכתים peroxidase ניתוחים פתולוגיים ואת המערכת החיסונית. התוצאות של ניסויים אלה מוצגות באיור12. התוצאות עבור amastigotes cruzi ט תועדו בתאים אינטרסטיציאליות של יותרת האשך, goniablasts; amastigotes הבחנה לתוך trypomastigotes היו קיימות בלומן של וכמה בקוריאנית, בהעדר תגובות דלקתיות.

Figure 1
איור 1 . Trypanosoma cruzi זיהום צנורית וכמה של ילד שמת ממחלת Chagas חריפה . Microphotograph מקובץ של דוקטור טיישיירה, 197018. הטפסים ט cruzi ב goniablasts, גושים של amastigotes ו- trypomastigotes חינם (חיצים) נמצאים בלומן של צנורית וכמה בהיעדרו של תסנין דלקתי1. כתמי hematoxylin-אאוזין. בר, מ ממוצע20 Reprinted באישור המוציא לאור ואצל כותבים1,19.

Figure 2
איור 2 . טביעת רגל של Trypanosoma cruzi מן חריפה Chagas המחלה. ט cruzi nDNA-PCR הגברה והמוצרים שנוצר 188-nt להקות גשש 188-nt radiolabeled ספציפיים. Tc, ט cruzi; nc, שליטה שלילי. הודפס מחדש באישור המוציא, מחבר1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 . הדרומי סופג ניתוח של Trypanosoma cruzi זיהומים בנושאים של משפחות למחקר על בני האדם. משפחת א - כל הנושאים 15 הראה nDNA-PCR ספציפי להקות 188-nt. ב B המשפחה, סך של 35 43 נושאים (81.4%) הקימו את הלהקות nDNA ספציפיים. ב C המשפחה, בין בני 29, 22 (75.8%) הקימו הלהקות nDNA. משפחת ד', 11 מתוך 21 נושאים (52.4%) היו הלהקות nDNA. Cruzi טי-להקות nDNA ספציפיות שאושרו על-ידי שיבוט ורצף. הודפס מחדש באישור המוציא, מחבר1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . הפעילים Trypanosoma cruzi דלקות הזרע שפיכה של מתנדבים משפחה המחקר. דלקות שופך Chagas המטופלים המזוהה על-ידי הלהקות 188-bp nDNA-PCR. Tc, cruzi ט בקרה חיובית. Nc, ל' braziliensis שליליות שליטה. הודפס מחדש באישור המוציא, מחבר1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . פנוטיפ של Trypanosoma cruzi עם נוגדנים בסרום החולים Chagas המחלה. ט cruzi מזוהה עם הנוגדן IgG בסרום Chagas מזהה את trypomastigote טפיל מטופלים עם התווית על-ידי FITC monoclonal Ab נגד אדם IgG. אנטי-טי cruzi Ab לא מזהה לישמניה braziliensis promastigotes. ההזחה להציג את הפקדים שלילי. יספ, 20 מיקרומטר Reprinted באישור המוציא לאור ואצל של מחבר1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 6
איור 6 . ייצוג גרפי של ELISAs ו nDNA-PCR מבחני במשפחה לומדים האוכלוסייה. קבוצה אני (n = 10), קבוצת השני (n = 20) היו שליליות ובקרה של sera בקרה חיובית, בהתאמה, מדלקות cruzi טי עם הפגנה parasitological. קבוצה III (n = 31) כללו דגימות מן הנבדקים משפחה עם להקות nDNA 188-bp, נוגדנים ספציפיים ט cruzi. קבוצה IV (n = 52) מורכבת דגימה מן הנבדקים עם זיהומים cruzi ט שזיהה את amplicons 188-nt nDNA-PCR בהיעדרו של נוגדן ספציפי. קבוצה V (n = 26) היו דוגמאות בדיקה שלילית הכוללת העם ללא זיהום במחקר המשפחתי. הודפס מחדש באישור המוציא, מחבר1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 . Heredograms ואת המיפוי של Trypanosoma cruzi- נגוע האוכלוסייה משפחה. האיור מציג הסתירות בין היחס anti-נוגדןcruzi ט ושל מבחני nDNA-PCR. כיכר פתוח, מעגל, שלילי זכר ונקבה. ריבועים אדומים עיגולים,cruzi ט נוגדן אנטי חיובי - ו nDNA-PCR. ריבועים שחורים, עיגולים, nDNA PCR חיובית לבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 8
איור 8 . הסובלנות המערכת החיסונית בעופות בקעו מן Trypanosoma cruzi- מחוסן ביצים. א) נוגדנים preimmune בפרופיל התרנגולות שליטה מדומה (n = 10). תרנגולות B) התגובה נוגדן ספציפי של הפקד תמים עם אנטיגן ט cruzi (n = 20). ג) היעדר תגובה חיסונית ספציפית בעופות בקעו מן cruzi טי-מחוסן הביצים לאחר אתגר עם אנטיגן ט cruzi (n = 20). ההבדל צפיפות אופטית בין A ו- C (024 ± 0.17) לכיוון B (0.85 ± 0.6) הוא משמעותי מבחינה סטטיסטית (p < 0.05). דמות זו שונתה הפניה26 , מודפס באישור המוציא לאור והמחבר.

Figure 9
איור 9 . זיהומיות Trypanosoma cruzi ב שופך האדם מיתרגם זיהום פעיל מאתר- Aliquots של שופך החולה Chagas היו שהוחדרו לתוך חלל הצפק או לתוך הנרתיק של עכברים. העכברים הוקרבו כשלושה שבועות לאחר החדרה. ליין העליון, קינים amastigotes ט cruzi (משמאל), בלב, בשריר השלד (מימין). ליין התחתון, cruzi ט amastigote קינים של צינור הזרע (משמאל), בצינור הרחם (מימין). הוסף מראה של amastigote החלוקה (עיגול). שים לב להעדר תסנין דלקתי בסעיפים רקמות. כתמי hematoxylin-אאוזין. ברים: העליון והתחתון שמאלה, 20 מיקרומטר; למטה מצד ימין, 10 מיקרומטר Reprinted באישור המוציא לאור ואצל של מחבר1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10 . שההעברה המינית של Trypanosoma cruzi זיהומים העכבר מודל המערכת על ידי קיום יחסי מין. השידור של זיהומים cruzi ט מ chagasic כדי החברים תמים שמגלה הלהקות 188-bp nDNA מסוים חשף במקום hybridizations הדרומי . פרופילי Prebreeding ליין העליונה) של מוצרי הגברה PCR של העכברים cruzi טי -נגוע ואת העכברים תמים. המספרים מוזר לציין את cruzi טי-נגוע זכר א-ל-E ודוגמאות הנשי F-כדי-אני עכבר. המספרים גם הם נקבה תמים (2-ל-10) ועכבר זכר (12-ל-20). ליין התחתון, לאחר גידול, הצג פרופילים אפילו עכברים 2-ל-20 רכשה זיהומים ט cruzi . הודפס מחדש באישור המוציא, מחבר1,30. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 11
איור 11 . Trypanosoma cruzi זיהום אנכית יועברו מ chagasic F0 הורים כדי העכברים רומא F1. האב chagasic מועבר זיהומים cruzi ט על ידי מפגש רבייה יחיד. Cruzi טי-נקבות הנגועים היו הזדווגו to תמים זכרים A-E, הנקבות תמים היו הזדווגו to cruzi טי -נגוע הזכרים F-ג'יי לאחר הרבייה, כל המייסדים (F0) הראו הלהקה 188-bp חיובי protozoan nDNA-PCR. סופג הדרומי חשף את הלהקה nDNA ספציפיים לאחר הכלאה עם החללית 188-nt radiolabeled ברוב המלטות F1. Nc, ל' braziliensis בקרה שלילית; Tc, cruzi ט בקרה חיובית. הודפס מחדש באישור המוציא, מחבר1,31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 12
איור 12 . Histopathology מתועדים Trypanosoma cruzi המועברות במגע מיני של F0 כדי סובלנות רומא ואת החיסון F1 בהיעדר לתגובה דלקתית. הסעיפים מראים צמיחה של צורות cruzi ט יותרת האשך, goniablasts, את בקוריאנית וכמה של העכברים F1. העכברים הוקרבו תחת הרדמה, הסעיפים שהוכתמו peroxidase המערכת החיסונית נבחנו תחת מיקרוסקופ. Photomicrographs הצג חום המערכת החיסונית שהוכתמו peroxidase cruzi ט amastigotes ב אינטרסטיציאליות של יותרת האשך (A) וגושי amastigotes הבחנה לתוך trypomastigotes לשפוך לתוך לומן של וכמה צנורית (B, C, ו- F). הקן amastigote לראות את goniablast (D). צנורית וכמה היסטולוגיה העכבר לשלוט נורמלי (E). שים לב להעדר תסנין דלקתי באשכים של העכברים F1 מציג המון טפילים Chagas. צביעת גימזה של. ברים: A, B, C ו- E 20 מיקרומטר; D ו- F, 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1. הסתירות בין את יחס חיובי לבחינת IIF ואליסה ואלו של מבחני nDNA-PCR הדגימות שנאספו מן המשפחות שמחקר אנושי א-ל-D *

* קבוצות * אליסה: סרום אנטי-טי cruzi Ab (%) ט cruzi nDNA-PCR (%)
שליטה Ab - PCR - (n = 10) 10/10 100 10/10 100
II - פקד Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
השלישי - Chagas Ab +. PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV - Chagas Ab - PCR + ᵟ - - 83/109 76.1
(n = 52)
V - Chagas נטול Ab - PCR- 26/109 23.9 26/109 23.9
(n = 26)
תוצאות של שלושה אליסה עצמאית, מבחני nDNA-PCR לרוץ הדגימות שנאספו בשלוש הזדמנויות שונות בגיל 1, 2 ו- 3 [1]. ההגברה של 188-nt cruzi ט דנ א חוזר אושרה על-ידי שיבוט ורצף.
* * ההבדלים בין שלילי (קבוצות ו- V), הנושאים חיובי (קבוצות III ו- IV) הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית (p < 0.05).
ᵟ אי-ההתאמות בין קבוצות III ו- IV מוסברת על ידי הסובלנות המערכת החיסונית בהיעדרו של הנוגדן cruzi ט השיגו 62.6% (52/83) של הנושאים PCR חיובית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במסמך זה, נדון פרוטוקול מחקר מבוסס המשפחה ענית לי על השאלה של האם האדם Chagas המחלה נובעת התמקדנו המועברות במגע מיני cruzi ט זיהומים. לימודי יכול לא לספק ראיות שההעברה המינית של זיהומים cruzi ט , כנראה בגלל זמינות הנתונים ואת המידע על Chagas המחלה, התקבלו בנפרד הפרט3,4, 5,6,7,8,9,10,11,12,13. הממצא של cruzi טי ב צנורית וכמה של ילד (איור 1) היה הניצוץ זה התיישר קליניים ואפידמיולוגיים החקירה. לאחר מספר עשורים, שכעיקרון כאשר המשפחה ללמוד גישות וטכנולוגיות שמתואר פרוטוקול מחקר זה היו זמינים, שלבי מחזור החיים cruzi ט הופיע לפלוט אדם1,19.

ההפגנה parasitological ישירה protozoan במקרים 21 חריפה Chagas המחלה היה תפקיד חשוב לאמת את מוצרי הגברה nDNA-PCR, אשר הקימו להקות ספציפי בדגימות של כל הנושאים בחריפות נגוע cruzi טי. סמן מעבדה בשלב של טיפול זה להעריך את התוצאות של מבחני חיסוניות ו חומצות גרעין. היסוד הארוך Chagas המחלה משפחה המחקר, לכן, משלב הממצאים בבני אדם עם שהושג בקבוצות של חיות מעבדה. המחקר שנערך לפי הפרוטוקול חשף לראשונה את cruzi טי זיהומים מועברות מינית לבני אדם1.

ההבדל רחבה בין את היחס של מבחני נוגדן ספציפי טפיל אלה של הבדיקות חומצת גרעין מציין כי הרוב המכריע של העקבות nDNA נבעה המועברות במגע מיני מקרים בהיעדרו של ספציפי נגד טי cruzi נוגדנים. לפיכך, שההעברה המינית של cruzi טי ב בני המשפחה מפגין nDNA חיובי בהיעדרו של הנוגדן IgG ספציפי היה עקב עמידות המערכת החיסונית.

עמידות המערכת החיסונית הודגם במערכת מודל עוף עקשן לזיהומים cruzi ט לאחר השבוע הראשון של העובר צמיחה1,25,26,32,33, 34. לאחר מכן, תלוכיה של מערכת החיסון לא בשלה הטפיל כמצוין מרכיב זר של הגוף של העוף מאוחר בוגר המערכת החיסונית סובלנות כלפי T cruzi. לאור תוצאות אלו, סובלנות הוא תופעת טבע1 הנובע של מערכת החיסון העצמי-הכרה ותחזוקה של רכיבי גוף משלה תחת התנאים הפיזיולוגיים25,26, 32 , 33 , 34. בין המדינה של המערכת החיסונית עמידות בפני מחלות אוטואימוניות של הלב Chagas ולכן אפשר לשייך אפקטור תא שינויים הנובעים cruzi ט kinetoplast (kDNA) מוטציות של המחשב המארח הגנום1 ,2,14,23,25,26.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול המחקר מתארים השינוי הטכניקה העיקרית ופתרון בעיות כדי לחשוף את המועברות במגע מיני Chagas טפילים1,14,23,25, 26: אני) בחירת לימוד למשפחות עם מקרים של חריפה Chagas המחלה35,36; ii) בידוד של פראי-סוג cruzi ט מהדם של המקרים חריפה; iii) להשיג דגימות די אן איי מן המשתתפים דם flagellates המשפחות על, של הארכיטיפ ברניקי ט cruzi , מדגימות הדנ א חיובי בנק deidentified ומן השליליים לשלוט ל' braziliensis; iv) ביצוע טכני נהלים מסודרים כדי להדגים כי flagellates nDNA טביעת רגל המשתתפים הוא זהה לזה של הארכיטיפ ברניס cruzi ט ושל הדגימות דנ א חיובי הבנק; v) footprinting nDNA triplicate לפעול עצמאית כדי להדגים דלקות ט cruzi ב בני המשפחה בשלוש הזדמנויות שנה בנפרד; vi) להבטיח כי הטכניקה nDNA-PCR שנערך בעת טיפול מניב תוצאות מאושרות על ידי שיבוט של רצף כל amplicons annealed כדי ומהצמיגים ספציפי מגדיר, ובכך מציג באופן עקבי את רצף 188-nt cruzi ט 1,25,28,29,30; vii) שימוש מסחרי איכותי ריאגנטים לשחזר את titers נוגדנים עדיין בתוך הדוגמאות סרום שנאספו בנקודות זמן שונות שלוש; viii) פרוטוקול המחקר המשפחתי חשף הזיהום בשידור חי הקיים בתאים קו נבט על ההפגנה של nDNA cruzi ט בהיעדרו של נוגדנים בסרום ספציפי בשופך זרע שנאסף Chagas נגוע טפיל יחידים1; ix) ההיבט הוא פרוטוקול מחקר שנועד לפענח את המועברות במגע מיני זיהומים cruzi ט צריך לחשוף את autochthonous Chagas המחלה בחמש יבשות; x) את nDNA, העקבות kDNA לאבטח את האבחנה של מחלה כרונית Chagas אסימפטומטיים בני אדם1,2; xi) בהיעדר nDNA, מוטציהשל cruzi טי kDNA רצף1,2,23,25,26 לבד הוא סמן מעבדה להשגת האבחנה המבדלת של cardiomyopathies מורחבים אידיופטית23,25,37,38,39.

בנוסף, ארסית cruzi ט שתועדה שופך החולה Chagas היו מסוגלים ליזום זיהומים נפוצים על החדרה לתוך הנרתיק העכבר ולתוך חלל הצפק שלה. המחקר פתולוגיה הראה קינים amastigote ט cruzi הלב ואת שרירי השלד גם צינור הזרע , שפופרת הרחם. מעניין, הקנים טפיל לא לעורר תגובות דלקתיות חיוניים פונקציות הרבייה המונעים זאת. העדר תגובות דלקתיות מעבד את הזכות המערכת החיסונית של חיוניות הגוף פונקציונלי מבני40,41,42,43,44,45 ולכן מסביר את הגידול uncurbed של cruzi טי איברי הרבייה.

יתר על כן, המחקרים ניסויי בעכברים chagasic זה הוליד עם החברים תמים הסביר בהמשך שההעברה המינית של cruzi טי זיהומים אצל בני אדם. הנגועים נקבות וזכרים ששודרו את טי cruzi הידבקויות חברים תמים נגוע במהלך קיום יחסי מין, הרוב המכריע של המלטות שלהם רכשה את cruzi טי אנכית מועבר מהאב רומא. בניסויים אלה, השלב הראשוני התייחס לצמיחה של cruzi ט בצינור, ברחם, וכן צנורית וכמה, צינור הזרע, שבו הזכות המערכת החיסונית התרחשו. לאחר מכן, העברה מינית אירעה דרך השלבים טפיליות הזרע או בכל ההפרשות הרחם לתוך הנרתיק. הרשאות מערכת החיסון40,41,42,43,44,45 היא תופעה המאפשר כמה איברים downregulate (מערכת הרבייה, העיניים והמוח) תגובות דלקתיות, למנוע נזק פונקציות חשובות, רגיש וספציפי40. הורמונים41 , מספר גורמים המערכת החיסונית downregulate מקרופאגים41,42,43תאים רוצח טבעי41, לימפוציטים, תאי T רגולטוריים (Treg), ובכך מנצח עיכוב של מספר proinflammatory ציטוקינים, הרשאה החיסונית מפעילה40,41,42,43,44,45.

שההעברה המינית של זיהומים cruzi ט זכרים ונקבות לשותפים נאיבית מציין כי השליטה Chagas המחלה דורש הסולידריות הבינלאומית. התוצאות הנדונים כאן מראים כי דרוש מחקר יותר יצירתי. היעדים הבאים מיידית השגה: אני) לפתח תפוקה גבוהה פלטפורמות ספציפי ולבדיקה חומצת גרעין רגישה מאוד להגיע אבחנה מדויקת, מכוון למניעת זיהומים מועבר על ידי מגע מיני, עירויי דם, השתלת איברים כמו גם הקלה על פניות קליני אפידמיולוגי, כדי לקבוע את האבחנה ועל השכיחות של Chagas המחלה; ii) כדי לקדם את תוכנית הפיתוח multicenter סמים כדי לקבל תרופות חדשות למיגור של זיהומים ט cruzi ; ו iii) ליישם חינוך מתאים, תוכנית מידע ותקשורת הכוללת את ההשתתפות של בתי ספר, כנסיות, ארגונים חברתיים ומוסדות בריאות כדי למנוע את התפשטות Chagas המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

אנו להכיר במתקני מעבדה, את תגובות ביקורתיות של Izabela Dourado. קרלה אראוז'ו, גומס חכם וסיוע טכני של ברונו Dalago, רפאל אנדרדה. אנחנו חבים הקרן לקידום המדע (FAPDF), המועצה הלאומית למחקר, משרד המדע, הטכנולוגיה (CNPq/MCT), סוכנות עבור משאבי הדרכה אנוש, משרד החינוך (גלימות / לי), ברזיל, לתמיכה אלה חקירות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Araujo, P. F., et al. Sexual transmission of American trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (6), 437-446 (2017).
  2. Teixeira, A. R. L., Nitz, N., Bernal, F. M., Hetch, M. M. Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model. Journal of Visualized Experiments. (65), 3716 (2012).
  3. Kalil-Filho, R. Globalization of Chagas Disease Burden and New Treatment Perspectives. Journal of the American College of Cardiology. 66 (10), 1190-1192 (2015).
  4. Nunes, M. C. P., Dones, W., Morillo, A., Encina, J. J., Ribeiro, A. L. Chagas Disease: An Overview of Clinical and Epidemiological Aspects. Journal of the American College of Cardiology. 62 (9), 767-776 (2013).
  5. Pinazo, M. J., Gascon, J. Chagas disease: from Latin America to the world. Reports in Parasitology. 2015 (4), 7-14 (2015).
  6. Kessler, D. A., Shi, P. A., Avecilla, S. T., Shaz, B. H. Results of lookback for Chagas disease since the inception of donor screening at New York Blood Center. Transfusion. 53 (5), 1083-1087 (2013).
  7. Klein, N., Hurwitz, I. R. Globalization of Chagas Disease: A Growing Concern in Nonendemic Countries. Epidemiology Research International. , (2012).
  8. Pérez-Molina, J. A., Norman, F., López-Vélez, R. Chagas disease in non-endemic countries: epidemiology, clinical presentation and treatment. Current Infectious Diseases Report. 14 (3), 263-274 (2012).
  9. Hotez, P. J., et al. Chagas disease: "the new HIV/AIDS of the Americas". PLoS Neglected Tropical Diseases. 6, e1498 (2012).
  10. Schmunis, G. A., Yadon, Z. E. Chagas disease: a Latin American health problem becoming a world health problem. Acta Tropica. 115 (1-2), 14-21 (2010).
  11. Franco-Paredes, C., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. The Unfinished Public Health Agenda of Chagas Disease in the Era of Globalization. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (7), e470 (2009).
  12. Teixeira, A. R. L., Vinaud, M., Castro, A. M. Emerging Chagas Disease. In: Chagas Disease: - A Global Health Problem. 3, Bentham Science Publishers. New York. Chapter 3 18-39 (2009).
  13. Lee, B. Y., Bacon, K. M., Bottazzi, M. E., Hotez, P. J. Global economic burden of Chagas disease: a computational simulation model. Lancet Infectious Diseases. 13 (4), 342-348 (2013).
  14. Teixeira, A. R. L., Hecht, M. M., Guimaro, M. C., Sousa, A. O., Nitz, N. Pathogenesis of Chagas Disease: Parasite Persistence and Autoimmunity. Clinical Microbiology Review. 24 (3), 592-630 (2011).
  15. Murcia, L., et al. Risk factors and primary prevention of congenital Chagas disease in a nonendemic country. Clinical Infectious Diseases. 56 (4), 496-502 (2013).
  16. Chagas, C. New human trypanosomiasis. Morphology and lifecycle of Schizotrypanum cruzi, the cause of a new human disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 1, 159 (1909).
  17. Vianna, G. Contribution to the study of the Pathology of Chagas disease. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 3, 276 (1911).
  18. Teixeira, A. R. L., Roters, F., Mott, K. E. Acute Chagas disease. Gazeta Médica da Bahia. 3, 176-186 (1970).
  19. Teixeira, A. R. L., et al. Prevention and Control of Chagas Disease – An Overview. International STD Research, Reviews. 7 (2), 1-15 (2018).
  20. Rios, A., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  21. Lenzi, H. L., et al. Trypanosoma cruzi: compromise of reproductive system in acute murine infection. Acta Tropica. 71 (2), 117-129 (1998).
  22. Carvalho, L. O. P., et al. Trypanosoma cruzi and myoid cells from seminiferous tubules: Interaction and relation with fibrous components of extra cellular matrix in experimental Chagas’ disease. International Journal of Experimental Pathology. 90 (1), 52-57 (2009).
  23. Hecht, M. M., et al. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 12, e9181 (2010).
  24. Alarcon, M., et al. Presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en el plasma seminal de ratones con infección aguda. Boletín Malariología y Salud Ambiental. 51, 237 (2011).
  25. Teixeira, A. R. L., et al. Trypanosoma cruzi in the Chicken Model: Chagas-Like Heart Disease in the Absence of Parasitism. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (3), e1000 (2011).
  26. Guimaro, M. C., et al. Inhibition of Autoimmune Chagas-Like Heart Disease by Bone Marrow Transplantation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), e3384 (2014).
  27. Oliveira, C. I., et al. Leishmania braziliensis isolates differing at the genome level display distinctive features in BALB/c mice. Microbes and Infection. 6 (11), 977-984 (2004).
  28. Mendes, D. G., et al. Exposure to mixed asymptomatic infections with Trypanosoma cruzi, Leishmania braziliensis and Leishmania chagasi in the human population of the greater Amazon. Tropical Medicine, International Health. 12, 629 (2007).
  29. Moser, D. R., Kirchhoff, L. V., Donelson, J. E. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology. 27 (7), 1477-1482 (1989).
  30. Da Silva, A. R. Sexual transmission of Trypanosoma cruzi in mus musculus [MsD thesis]. , University of Brasília. Brasília. Available from http://repositório.unb.br/handle/10482/14829 (2013).
  31. Ribeiro, M., et al. Can sexual transmission support the enzootic cycle of Trypanosoma cruzi? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 113 (1), 3-8 (2018).
  32. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  33. Burnet, F., Fenner, F. The production of Antibodies. , MacMillan. Melbourne, Australia. (1949).
  34. Hasek, M. Parabiosis of birds during their embryonic development. Chekhoslovatskaia Biology. 2 (1), 29-31 (1953).
  35. Coura, J. R., Junqueira, A. C. V., Fernades, O., Valente, S. A., Miles, M. A. Emerging Chagas Disease in Amazonian Brazil. Trends Parasitology. Trends Parasitology. 18 (4), 171-176 (2002).
  36. Teixeira, A. R. L., et al. Emerging Chagas disease: Trophic network and cycle of transmission of Trypanosoma cruzi from palm trees in the Amazon. Emerging Infectious Diseases. 7 (1), 100112 (2001).
  37. Hazebroek, M., Dennert, R., Heymans, S. Idiopathic dilated cardiomyopathy: possible triggers and treatment strategies. Netherland Heart Journal. 20 (7-8), 332-335 (2012).
  38. Arimura, T., Hayashi, T., Kimura, A. Molecular etiology of idiopathic cardiomyopathy. Acta Myologica. 26 (3), 153-158 (2007).
  39. Dec, W. G., Fuster, V. Idiopathic Dilated Cardiomyopathy. New England Journal of Medicine. 33, 1564-1575 (1994).
  40. Niederkorn, J. Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature Immunology. 7 (4), 354-359 (2006).
  41. Smith, B. E., Braun, R. E. Germ cell migration across Sertoli cell tight junctions. Science. 338 (6118), 798-802 (2012).
  42. Garth, A., Wilbanks, J., Streilein, W. Fluids from immune privileged sites endow macrophages with the capacity to induce antigen-specific immune deviation via a mechanism involving transforming growth factor-β. European Journal of Immunology. 22 (4), 1031-1036 (1992).
  43. Meng, J., Anne, R., Greenlee, C., Taub, J., Braun, R. E. Sertoli Cell-Specific Deletion of the Androgen Receptor Compromises Testicular Immune Privilege in Mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 254-260 (2011).
  44. Fujisaki, J., et al. In vivo imaging of Treg cells providing immune privilege to the haematopoietic stem-cell niche. Nature. 474 (7350), 216-219 (2011).
  45. Wood, K. J., Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature Review Immunology. 3 (3), 199-210 (2003).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 143 גומר המשפחה המחקר, Trypanosoma cruzi זרע הפרשת הרחם מערכת מודל העכבר שידור אנכי הרשאות מערכת החיסון מערכת מודל עוף סובלנות המערכת החיסונית Chagas המחלה.
העברה מינית של Trypanosomes האמריקאי של זכרים ונקבות כדי החברים נאיבי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Almeida, A. B., Araújo, P.… More

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter