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Immunology and Infection

치 메이 트 남성 및 여성에서 미국의 Trypanosomes의 성적인 전송

Published: January 27, 2019 doi: 10.3791/57985
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory, Faculty of Medicine, University of Brasilia, 2Instituto Evandro Chagas

Summary

Chagas 질병의 Trypanosoma cruzi 에이전트 오랫동안 무 증상 감염 갑자기 인식된 임상 병리학으로 개발 생산. 다음 연구 프로토콜 설명 짧은 실행 가족 기반 역학 연구를 푸는 T. cruzi 감염 성적으로 부모 로부터 자손에 전달 합니다.

Abstract

미국의 trypanosomiasis 수혈에 의해 또는 병원과 연구 실험실에 우발적으로 오염 된 식품의 섭취를 통해 triatomine 버그에 의해 인 간에 게 전송 됩니다. 또한, Trypanosoma cruzi 감염 전송 선천적인 chagasic 어머니 로부터 그녀의 자손, 하지만 utero에서 오염에 남성 파트너의 기여는 알 수 없습니다. 둥지와 난소의 티크 셀에는 goniablasts에서, seminiferous tubules의 루멘에서 trypomastigotes와 amastigotes의 덩어리의 결과 T. cruzi 감염 전송 성적으로 좋습니다. 본 연구 프로토콜 2 중 혈액 단 세포에서 기생충 핵 DNA를 보여주는 인간을 대상의 단일 gametes에는 가족 연구의 결과 제공 합니다. 따라서, 1 년 떨어져 수집 된 3 개의 독립적인 생물 학적 샘플 확인 T. cruzi 감염 자손 성적으로 전송 했다. 흥미롭게도, 특정 T. cruzi 항 체 결 석 했다 기생충 항 원에 면역 관용을 낳은 가족 자손의 대부분에서. 면역 관용의 배아 성장, 첫 주 후 닭 T. cruzi 내 화물에서 설명 되었다 그리고 flagellate 주사 계란에서 부 화 하는 병아리 특정 항 체를 생산 하지 못했습니다. 또한, 인간 정액의 주입 사정 intraperitoneally 또는 T. cruzi amastigotes는 epididymis seminiferous 관, vas deferens , 염증의 부재와 튜브를 자 궁에 굴복 하는 순진한 마우스 질으로 생식 면역 권한 있는 기관에서 반응입니다. T. cruzi의 번 식-순진한 동료와 감염 된 남성 및 여성 쥐 나중 자손 전송 했다 감염의 수집 결과. 따라서, 인구 및 사회 단체를 포함 하는 강력한 교육, 정보 및 통신 프로그램 Chagas 질병을 방지 하기 위해 필요한 간주 됩니다.

Introduction

Trypanosomatidae 포유류 호스트에서 trypomastigote 및 amastigote 라이프 사이클 단계를 겪 습 곤충 벡터에 epimastigotes로 존재 하는 가족에 속하는 protozoan 기생충 Trypanosoma cruzi (Reduviid: Triatominae) 창 고에 axenic 문화입니다. 최근 수십 년간, 여러 연구 국가에서 Chagas 질병의 존재 triatomine 버그 무료1,2,3,,45, 를 고려 하는 4 개의 대륙에 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13; 미국 trypanosomes의 분산 처음 북반구, 라틴 아메리카 이주자에 기인 했다 하지만 일부는 학위 경우 샤 가스 병의 가능성3,4 거부 이상 수 있습니다. , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. T. cruzi 전송의 생만 인식할 수 있는 소스 임신15;의 약 10%에서 자손에 게 기생충의 chagasic 어머니의 전송을 관찰 되었습니다 남성 파트너의 공헌 정액 ejaculates 통해 utero에서 감염을 알 수 없는 남아 있다.

한 세기 전, 수 사관16,17 관찰 세포내 T. cruzi amastigotes 난소의 티크 세포와 세균 세포의 Chagas 질병의 급성 경우 고환의 라인. 둥지와 T. cruzi trypomastigotes 및 amastigotes 난소의 티크 셀, goniablasts 및 치명적인 급성 샤 가스 질병 경우의 (그림 1) seminiferous tubules의 루멘 수 풀 개발의 장기에 면역 권한 염증의 부재에서 복제18,19침투. 최근 수십 년간, 몇 가지 실험 연구 T. cruzi 의 amastigote 라운드 형태의 둥지 seminiferous 관, epididymis, vas deferens 뿐만 아니라 자 궁, 관 및 난소에 심하게 감염 된 쥐 의 티크 셀 1,20,,2122. 또한, 가족 연구 인간 단일 세균 선 셀23, 그들의 자손, T. cruzi 핵 DNA (nDNA)에 게 부모의 Chagas 환자에서 미토 콘 드리 아 DNA 확인 protozoan의 전송 문서를 동안 및 기생충의 수명 주기 단계 chagasic 마우스24ejaculates에서 관찰 되었다. 이러한 결과 T. cruzi-감염 된 호스트는 특정 항 체1,,2526의 부재에서의 자손에 의해 획득 면역 관용에 대 한 보고서와 일치 하 여. 또한, 다른 대륙3,,45,6,7,8 발병 Chagas 질병의 확산을 제안 하는 역학 보고서 ,,910,11,,1213 실험 연구 보여주는 Chagas 질병 성적으로 전달 될 수 있다1에 의해 지원 됩니다 . 현재 조사 역학 가족 연구 프로토콜을 선물 하 고 T. cruzi 감염 성교에 의해 전파를 보여줍니다.

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Protocol

인간과 동물 연구 위원회 브라질리아 대학의 학부의 연구 프로토콜 2500.167567 및 10411/2011에서에서 인체 및 실험 동물, 모든 절차 각각 승인. 윤리 위원회는 공공 재단 병원이 스파 Vianna (프로토콜 n º 054/2009, CONEP 11163/2009)의 확장 하는 사역의 건강 국가 위원회에 인간의 연구 (CONEP 2585/04)와 현장 연구에 대 한 자유로운 동의 양식을 승인. 프로토콜은 T. cruzi DNA 2 중 혈액 단 세포 및 정액 ejaculates의 단일 gametes를 평가 하기 위해 조정 되었다. 실험실 동물 받은 인도적인 치료; 희생, 전에 심장 찔린 대상이 쥐 취하 했다.

1입니다. 인간 참가자 모집

  1. 연구 팀 Chagas 환자에 게 의료 서비스를 제공 하는 건강 시스템 Chagas 질병 프로그램에 참여 하 고 있는지 확인 합니다.
  2. 가족 프로그램에 적어도 1 개의 경우 발열, 불쾌, 두통, 심 박 급진, 및 부 종, 급성 샤 가스 질병14의 주요 임상 증상을 보여주는 인간 참가자를 모집 합니다.
  3. 5 년의 기간에 대 한 연구 가족에 있는 사람들에 게 의료 서비스를 제공 합니다.
  4. 정 맥 혈액의 15 mL 연구 참가자에서 3 차례 떨어져 1 년에, 3 개의 5 mL aliquots 샘플을 나눌 가져오고 4 ° c.에 냉장고에 보관
  5. 성인 자원 봉사 가족 구성원에서 정액 ejaculates의 2 개 mL를 수집 하 고 진행 단계 3.3에에서 설명 된 대로.

2입니다. 기생충의 성장

  1. Anticlotting 나트륨 덤플링; 5 단위 혈액을 혼합 단계 1.4에서에서 약 수를 사용 하 여, 가족 참가자 급성 샤 가스 병의 진단에서 혈액의 접종에 의해 경사 문화를 확인 합니다.
    1. Unclotted 인간 혈액 5 mL 50 mL 스크류 캡 튜브 혈액 한 천 경사 플러스 간 주입-tryptose 매체 (LIT)의 5 mL에 접종 하 고 3 개월 동안 27 ° C에서 통에 샘플을 품 어.
    2. 유리 슬라이드 위에 표면에 뜨는 매체의 100 µ L, 전표 및 혈액 현미경, T. cruzi epimastigotes에 대 한 검색 모든 4 주 커버.
    3. 27 ° C에서 axenic LIT 매체의 상쾌한에 epimastigote 격리 수확 PBS ph 7.4, 1000 x g 에서 원심 분리기는 10 분;에 대 한 셀을 씻어 Dulbecco의 수정 필수 매체 (DMEM) 5 mL에 펠 릿에 epimastigotes 희석.
    4. 접종 confluent L6 근육 세포 배양 플라스 크 1 x 106 ECI1 ECI21 T. cruzi epimastigote 격리.
    5. 베 레 니케 상 trypomastigotes 75 mL 문화 플라스 크에서 L6 근육 세포 배양에는 T. cruzi ECI1에 ECI21 성장 합니다.
    6. PH 7.4 5% 태아 둔감 한 혈 청, 100 IU/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 250 nM L-글루타민, 및 5% CO2 37 ° C1에 보충에서 DMEM의 15 mL로 세포를 피드.
    7. 사용 긍정적인 표현 형을 T. cruzi 베 레 니케 trypomastigotes 조직 문화에서 ECI1 ECI21 격리 단계 5.2에서에서 설명한 대로.
    8. 부정적인 통제 Leishmania braziliensis27 DMEM 20% 태아 둔감 한 혈 청만, 보충에 성장 하 고 부정적인 컨트롤로 기생충 promastigotes를 사용 하 여.
    9. 세포 배양에서 상쾌한 1 x 106 T. cruzi ECI1 ECI21 trypomastigotes을 사용 하 여 마우스를 감염.
    10. 감염의 첫 번째 주 후 T. cruzi trypomastigotes 꼬리 혈액에 대 한 검색.
    11. 되며 오신 스테인드 심장, 골격 근육 및 감염 된 쥐의 생식 기관에의 한 달 후에 amastigotes의 둥지를 검색 합니다.

3. DNA 추출 및 PCR 분석

  1. 살 균 EDTA 튜브에 aliquot (1.4 단계) 혈액의 5ml를 배치 하 고 3000 x g에서 45 분을 위한 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 수행. 레드 셀 위의 약간 흰 단계에서 단 세포 수확, 세척 하는 백혈구 5 mL PBS, pH 7.4, 다른 15 mL 튜브에 1500 x g 에서 10 분 동안 원심 분리 하 여의 두 번 고 DNA 추출에 대 한 셀을 사용 하 여 한 피 펫을 사용 합니다.
  2. ECI-1에서 ECI 21 T. cruzi, 베 레 니케 T. cruzi, 부정적인 컨트롤 L. braziliensis (2.1.8), 단계에서에서 긍정적인 통제에서 DNA를 추출 하 고 109 인간 가족의 테스트 혈액 단 세포에서 공부 과목1 , 27 , 28.
  3. DMEM (1:4, v/v);에 1.5 단계에서 얻은 정자 샘플의 희석 2 mL 5% CO2 45 분 및 37 ° C에 품 어, 13000 x g에 5 분 동안 원심 분리 후에 상쾌한에서 정 충을 복구 하 고 단일 DNA23추출.
  4. 셀의 1 mL 추출 버퍼에 배치 (10 µ M NaCl, 20 µ M EDTA, 1 %SDS, 0.04% 가수분해-K 및 1 %dithiothreitol), 흔들어 반전 하 여 솔루션을 섞는다.
    1. 13000 x g 와 25 ° C에서 10 분에 대 한 솔루션을 원심 그리고 회전 열에 점성 상쾌한 전송.
    2. 10000 x g 에서 1 분 동안 회전 열 원심 및 삭제 eluate; 스핀 열 (자료 테이블)에 500 µ L 바인딩 버퍼를 추가 하 고 12000 x g에 1 분 동안 원심은 eluate 삭제.
    3. 스핀 열 600 µ L 세척 버퍼를 추가 하 고 12000 x g에 1 분 동안 원심은 eluate 삭제.
    4. 두 번,이 단계를 반복 하 고 살 균 1.5 mL 마이크로 원심 튜브를 회전 열을 전송.
    5. 100 µ L의 TE 버퍼 2 분 동안 실내 온도에 튜브를 품 어 다음 12000 x g에서 1 분 동안 튜브를 원심 추가 합니다. Microcentrifuge 튜브에 버퍼는 DNA를 포함 됩니다.
    6. 0.8 %agarose 젤에 aliquots를 실행 하 여 및 260에서 흡 광도 읽어서 DNA 농도 측정 한 분 광 광도 계 nm. PCR 분석에서 사용까지-20 ° C에서 DNA 샘플을 저장 합니다.
  5. 사용 T. cruzi Tcz1/2 뇌관 특정 188-nt 특정 telomere 순서를 단련29 프로브 및 가족 연구 과목의 혈액과 정자, 베 레 니케 T. cruzi 긍정적인 제어 및에서 dna는 PCR를 실행에 L. braziliensis 부정적인 제어 합니다.
    1. 10 ng 템플릿 DNA, 뇌관, 2 U의 Taq DNA 중 합 효소, 0.2 µ M dNTPs, 및 15 µ M MgCl2 25 µ L 최종 볼륨에서의 각 쌍의 0.4 µ M으로 PCR 혼합물을 준비 합니다.
    2. 94 ° c 30에 대 한 DNA 증폭 프로그램을 시작할 서식 파일, 변성 및 55 ° c 30에 대 한 샘플을 냉각 s s. 그런 다음, 94 ° C 90에서 샘플을 품 어 단련 한 뇌관을 확장 하는 s. 30 대 94 ° C에 온도 반환 다음 사이클을 시작 하 고 샘플을 품 어 s 72 ° c.에 추가 3 분 32nd 사이클의 끝에, 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 냉각 하 고 4 ° C29에 냉장고에 보관 합니다.
    3. T. cruzi DNA telomere 반복 시퀀스 두 말단에서 Tcz1/2 뇌관에 단련을 증폭.
    4. 1.3 %agarose 젤에 증폭 제품을 분석 하 고 관찰 자외선 조명 기에 188-nt DNA 밴드.

4. 남부 교 잡

참고: 남부 교 잡 agarose 젤에서 거짓 긍정적인 PCR amplicons의 대부분을 삭제 하도록 사용 되었다.

  1. 감염된 컨트롤, Chagas 케이스 긍정적인 컨트롤, 2 중 DNA의 109 테스트 샘플 및 남부 내 21 연구 가족 참가자의 단일 DNA에서에서 PCR 증폭 제품 제목.
  2. T. cruzi 188-nt DNA 특정 telomere 순서 조사 표시; Tcz1/2 뇌관에 단련을 사용합니다 [α-32P] 2'-deoxyadenosine 3 인산 염 (dATP) 라벨 키트, 무작위 뇌관을 사용 하 여와 프로브 고 4 ° c.에 하룻밤 60 V에서 1.3 %agarose 젤에 증폭 제품 분석
  3. 밤새 모 세관 메서드를 사용 하 여 충전 된 나일론 막에 젤을 전송 합니다.
  4. 변수 기간에 대 한 게놈 DNA의 에코R1 소화 효소 특정 버퍼의 25 µ L에 바인딩하는 방사선된 188-nt 프로브 나일론 막 전송 DNA 밴드 교배
  5. 2 x SSC와 0.1 %SDS 65 ° C에서 15 분 동안 두 번 막 씻으십시오.
  6. 1 주일에 대 한 나일론 막과 autoradiograph를 x 선 필름 막에 밴드를 노출 합니다.
  7. T. cruzi PCR 증폭 제품의 특정 방사선 DNA 프로브 때 교배는 PCR와 남부 교 잡에서 선정 하는 클론을 성장.
  8. 상업적으로는 T. cruzi-특정 telomere 발자국2,23단련 설정 Tcz1/2 뇌관을 사용 하 여 복제 시퀀스.

5. 면역학 분석 실험

참고: 감도 특이성 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)과 간접 면역 형광 검사 (IIF)의 평가 했다 혈 청 될지도 parasitemia 6 Chagas 환자와 6 Chagas 무료에서 혈 청 deidentified 은행 샘플입니다. PBS, pH 7.4에 이중 혈 청 희석 1: 100 희석에서 IIF와 ELISA 광학 조밀도 (ODs) 0.150에서 및 위에 부정적인 결과에서 긍정적인 분리 공개는 분석 실험 실시.

  1. 1 시간, 실 온에서 보관 하는 unclotted 혈액 aliquot (1.4 단계)의 5 mL을 사용 하 고는 상쾌한에 혈 청을 분리 하기 위하여 30 분 1500 x g 에서 원심.
  2. IIF 및 ELISA triplicate 1: 100 혈 청 희석 T. cruzi 와 L. braziliensis 항 원28. 위에서 설명한 대로 검색을 수행합니다
  3. IIF
    1. 3 번 1 년 떨어져 얻은 109 연구 과목의 샘플의 triplicate 혈 청 희석에 IIF 분석 결과 수행 합니다.
    2. 장소는 포 르 말린의 5 µ L 정지 1%- T. cruzi epimastigotes 또는 유리 슬라이드;에 L. braziliensis promastigotes 처리 기생충 후드 실 온에서 하룻밤을 건조 시키고 사용까지-20 ° C에서 유리 슬라이드를 저장.
    3. 유리 슬라이드 위에 환자의 혈 청 희석의 장소 20 µ L 코팅 포 르 말린 죽 (10 기생충 / µ L) T. cruzi epimastigotes 또는 L. braziliensis 의 5 µ L promastigotes.
    4. 37 ° C와 PBS와 몇 번이 고 씻어 습 한 약 실에 1 시간을 위한 슬립으로 덮여 유리 슬라이드를 품 어.
    5. 37 ° C에서 1 시간에 대 한 인간의 IgG fluorescein 표시 된 토끼 항 체 (자료 테이블)의 1:1,000 희석와 air-dried 유리 슬라이드를 품 어 세척 하 고 건조 한 슬라이드.
    6. 커버 슬립 슬라이드를 탑재 하 고 UV 빛 현미경 검사.
      참고: 긍정적인 시험은 애플 그린 T. cruzi epimastigote 실루엣, 비디오에 표시.
  4. ELISA
    1. T. cruzi 와 코팅된 미 판 우물에 L. braziliensis 수용 성 항 (1 µ g/100 µ L에서 0.1 M 탄산 버퍼, pH 9.6)를 검출 하는 ELISA를 실행 합니다.
    2. 실 온에서 2 h triplicate 코팅 스에서 1: 100 혈 청 희석을 품 어.
    3. 몇 번이 고 PBST와 접시 세척 (PBS 0.5%를 포함 트윈-20), pH 7.4, 건조 하기 전에 솔루션.
    4. 37 ° c.에 90 분 동안 토끼 반대로 인간 IgG 항 체의 1:1,000 희석의 50 µ L와 번호판을 품 어
    5. PBST 솔루션으로 몇 번이 고 접시를 세척 하 고 실 온에서 건조 하도록 허용.
    6. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활용 된 염소-토끼 IgG (자료 테이블) 37 ° c.에 90 분의 1:1,000 희석의 100 µ L와 번호판을 품 어
    7. 몇 번이 고 PBST와 접시 세척 기판 p-니트로 페 닐 인산 염 추가 하 고 색상 개발에 대 한 대기.
    8. 630에서 ODs 읽기 다중 플레이트 리더에 nm.
    9. 연구 인구에서 시험 혈 청의 triplicate 희석을 실행 하 고 특정 식별 하 ODs 플롯 T. cruzi 항 체 titers.

6입니다. 면역 관용의 평가

참고: 치킨 모델 시스템 배아 개발의 첫 번째 주 후 T. cruzi 의 감염을 테스트에 사용 되었다.

  1. 조직 문화 매체;에서 수확 하는 100/10 µ L T. cruzi trypomastigotes와 비옥한 계란을 예방 µ L 문화 매체 당 10 T. cruzi trypomastigotes와 모의 제어 계란 접종 테이프로 구멍을 봉인.
  2. 21 일 20 T. cruzi-감염 된 계란과 37 ℃와 65% 습도에 모의 제어 비옥한 계란의 동등한 수를 품 어.
  3. 계속 여자를 해치 24 h에 대 한 하 고, 그 후, 온도 제어와 후드에 32 ° C에 인큐베이터에서 3 주 동안.
  4. T. cruzi-주사 계란에서와 별도 통로 개별 장에서 24 ° C에서 긍정적인 공기 압력 실에서 성인 무대에 모의 제어 계란에서 부 화 하는 병아리를 성장.
  5. 107 포 르 말린을 죽인 trypomastigotes 비디오에서 스키마에 따라 피하, 매주 주입과 모든 성인 여자 나이의 6 달에 몇 번이 고 도전 한다.
  6. 혈 청을 얻기 위해 마지막 접종 후 4 주 모의 컨트롤 및 T. cruzi-주사 계란에서 부 화 하는 닭의 날개 정 맥에서 혈액을 그립니다.
  7. 특정을 닭 혈 청을 사용 하 여 IIF와 ELISA 프로토콜의 단계 5에서에서 설명한 대로 T. cruzi 항 체.

7. 감염 쥐의 Chagas 환자 정액에서 T. cruzi 사정

  1. 정액 ejaculates 성인 PCR + Chagas 질병 환자 (1.5 단계)와 성인 PCR-Chagas-무료 개인 사용 합니다.
  2. 12 1 개월 BALB/c 순진한 마우스 후드 24 ° C에서 긍정적인 공기 압력 아래에 보관 하 고 식품 광고 libitum먹이의 2 개 그룹을 사용 합니다.
  3. 복 막 및 그룹 A 쥐의 질에 동일 금액으로 인간의 Chagas 긍정적인 정액 aliquots (100 µ L)를 주는.
  4. 복 막 및 그룹 B 마우스 질으로 동일한 금액으로 제어 Chagas 무료 정액 aliquots (100 µ L)를 주는.
  5. 희생 마 취 실험 쥐 정액 instillations 후 5 주 있으며 조직 단면도 되며 오신와 얼룩을.
  6. 현미경을 사용 하 여 T. cruzi trypomastigotes 및 amastigotes 심장, 골격 근육, 및 그룹 쥐의 생식 기관에 대 한 검색.

8. 는 T. cruzi 성교에 의해 감염의 전송

  1. 10 남녀 6 주 된 BALB/c 마우스를 사용 하 여 실험에서.
  2. 5 남자 및 1 x 105조직 문화에서T. cruzi trypomastigotes와 intraperitoneally 5 여성 쥐를 예방. 
  3. 3 개월까지 쥐를 사육: 그룹 난 5 T. cruzi에 의해 형성 될 것 이다-감염 된 여성 쥐와 5 제어 noninfected 남성 동료; 그룹 II를 남성 5 T. cruzi-감염에 의해 형성 됩니다 그리고 5 noninfected 여성 동료를 제어. 그룹 III 5 남성과 여성 5 제어 감염 되지 않은 순진한 동료에 의해 형성 됩니다.
  4. 각 집에는 탈출을 방지 하기 위해 5mm 그리드 및 잠금 도어 안전 상자 안에 배치 하는 한 장에 쌍 사육.
  5. 차 우와 ad libitum 물 쥐를 피드. 적어도 6 주 동안 그룹 II 그리고 progenies 이유 70 총을 올립니다.
  6. 혈액 심장 펑크에 의해 부모의 (FO)와 마 취 자손 (F1) 쥐, 쥐, 희생 그리고 심장, 골격 근육 및 생식 기관의 병 적인 분석에 대 한 섹션을 제출.

9입니다. 면역 권한 평가

  1. T. cruzi에서 조직 얻을-감염 그리고 순진한 쥐 (8.6), 단계 제어 4 µ m 두꺼운 부분으로 파라핀 포함 샘플을 잘라.
  2. 파라핀을 제거 하 고 탈수 크 실 렌의 몇 가지 변화를 유리 슬라이드와 1 분에 100% ~ 70% 에탄올과 등급된 세척에 섹션.
  3. 품 어 0.05% 사포닌과 조직 섹션 한 번 뒤에 실 온에서 3 증류수 세척.
  4. 45 분 세척에 대 한 5% 탈지 분유와 조직 단면도 0.1 M PBST에에서 슬라이드를 차단 하 고 섹션 Chagas 마우스 안티-T. cruzi 혈 청 또는 1시 20분에서 감염 되지 않은 컨트롤 마우스 혈 청을 품 어 2 h에 대 한 희석.
  5. PBST 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활용 된 토끼 반대로 마우스 IgG의 1:1,000 희석와 부 화 하기 전에 실내 온도에 건조 세 번 5 분에 대 한 슬라이드를 씻어.
  6. PBST에서 슬라이드를 헹 구 고 추가 3, 3' 5 분 인큐베이션, PBST와 3 세척 및 30에 대 한 해리스 hematoxylin와 counterstaining에 대 한 diaminobenzidine의 100 µ L s.
  7. 5 분 동안 증류수에 슬라이드를 세척 하 고 70%, 80%, 90%, 그리고 1 분, 100% 에탄올에서 탈수 버퍼링 된 글 리세 린에 탑재.
  8. 밝은 분야 가벼운 현미경, 슬라이드를 검사 하 고 사진 이미지 소프트웨어와 분석기 프로그램 microcamera.
  9. 생식 기관에 염증 반응의 부재에서 기생충의 면역 권한 문서.

10. 통계 분석

  1. 시퀀스 분석에 대 한 생물 의학 편집 사용 하 여, 폭발와 정렬 수행 하 고 E 값 통계적 유의 성 (p < 0.05)를 결정 합니다.
  2. 단방향 분산 분석 (ANOVA) 및 Tukey 테스트 표준 편차 전후로 OD 수단 비교를 수행 합니다.

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Representative Results

이 연구, 프로토콜에 따라 급성의 경우 샤 가스 병의 임상 및 parasitological 시험에 의해 검출을 목적으로. 정 맥 혈액 샘플을 직접 현미경 검사와 기생충 성장 위한 생체 외에서 문화를 받게 했다. 샤 가스 병의 경우에는 21 급성 혈액 T. cruzi 보였다. T. cruzi ECI1의 절연을 확보 하는 연구 프로토콜-급성 샤 가스 질병, ECI21 및 DNA 샘플 전시 연구 인구의 나머지에 있는 긍정적인 DNA 발자국: nDNA PCR 분석 실험 나왔고 전형적인 telomere 반복 시퀀스 T. cruzi 베 레 니케 상을1뿐만 아니라 현재 188-nt 밴드와 함께 Chagas 케이스 및 그들의 가족 연구에 참여 하는 자원 봉사 들 4 가족1로 분류 되었다.

가족 연구, T. cruzi nDNA PCR 뇌관 증폭 세트1,23 21 급성 샤 가스 질병 케이스의 각각에서 특정 telomere 순서를 단련 했다. 이러한 T. cruzi nDNA amplicons 때 특정 방사선된 시퀀스 프로브 (그림 2)와 함께 교배 클로닝 및 시퀀싱은 amplicons T. cruzi 188-nt telomere 반복 모티브 구성 공개. 이 교 잡 절차의 특이성 L. braziliensis promastigotes를 사용 하 여 수행 하는 부정적인 컨트롤에 표시 했다. 병 리 분석 검증 급성 샤 가스 질병 환자에 있는 hemoflagellates 정말 악성 했다 T. cruzi. 우리는 T. cruzi nDNA (188-bp) 밴드에서에서 발견 21 급성 샤 가스의 경우 (그림 2)는 지속적인 감염의 직접 데모 결론.

인 간에 있는 Trypanosoma cruzi 의 성적인 전송

T. cruzi 감염의 비율을 평가, 우리 가족 연구 인구1기생충 발자국의 고감도 검출을 위한 핵 산 시험 적용. 이 PCR 분석 실험에서 특정 방사선 188-nt 프로브 때 교배 증폭 제품 테스트 샘플;의 76.1% (83/109)에 nDNA 밴드를 형성 특정 188-nt 방사선된 조사와 nDNA PCR 증폭 제품의 남부 교 잡의 결과 그림 3에 나와 있습니다. 또한,는 내 자원 봉사 가족 구성원 (그림 4)의 생식 세포 라인에 기생충 DNA를 보여주었다.

IIF, 혈액에서 protozoan의 parasitological 데모와 함께 Chagas 질병 혈 청 은행 샘플에서 인간의 혈 청 IgG와 ECI21 T. cruzi trypomastigotes에는 ECI1 형을 고용 했다 그리고는 fluorescein 안티 인간 IgG 사용 활용 . T. cruzi 베 레 니케 Chagas 항 체에 대 한 긍정적인 통제 이었고 부정적인 컨트롤은 그것의 가족의 promastigote 상대 L. braziliensis. 그림 5 는 베 레 니케 상을 긍정적인 애플 그린 실루엣 야생-타입와 상관 관계가 T. cruzi 봉투는 비디오에 표시 된.

ELISA IIF 밝혀 특정 테스트 샘플의 28.4% (31/109)에 T. cruzi 항 체1,28 . ELISA와 IIF,으로 nDNA PCR amplicon 남부 내에서의 결과 그림 6에 구성 됩니다. NDNA PCR 발자국과 특정 항 체 분석 실험 heredograms (그림 7), 가족 A 4 과목에에서 묘사에서 그의 결과 불일치 했다 긍정적인 nDNA 및 안티-T. cruzi 항 체, 그리고 11만 했다는 긍정적인 nDNA; 5 남성 정액 정액에서 T. cruzi 를 했다. 가족 B 44 명, 11 특정 했다 T. cruzi 항 체, 그리고 23 했다 특정 항 체와 기생충 nDNA; 7 개인 T. cruzi 정액 사정 했다. 29 회원 가족 C 항 체와 T. cruzi nDNA 5 개인, 그리고 17 했다 기생충 nDNA 혼자; 4 남성 정액 정액 nDNA PCR 양성을 했다. 21 과목 중 가족 d에서 11 특정 안티-T. cruzi 항 체와 nDNA 발자국 졌고 9 긍정적인 nDNA-PCR 혼자 했다. 그림 3, 그림 6 과 그림 7 실행 1 년 떨어져 3 개의 독립적인 실험에서 가족 과목에서 얻은 생물학 견본에서 결과, 광범위 한 불일치 일관 되 게 묘사.

표 1 에서는 양적 차이 IIF, 엘리 사, 그리고 nDNA PCR 분석 실험 샘플에서 인간의 연구 가족 A. 긍정적인 핵 산 분석 실험 (76.1%)의 항 체 분석 실험 (28.4%)의 비율 간의 차이 통계적으로 유의 한 (p < 0.005). 이러한 가족, T. cruzi-감염 된 사람 (III와 IV)의 그룹 간의 차이 혼자 긍정적인 핵 산 성 테스트를 보여주는, 인구의 62.6% (52/83) 차지 했다. 광범위 한 불일치 긍정적인 nDNA 발자국의 비율 및 특정 T. cruzi 의 중 항 체 치킨 모델 시스템에서 실시 한 실험에 의해 설명 했다.

면역 관용

순진한 제어 닭 (A);를 포함 하는 별도 통로에 개별 장에서 성인 무대에 올린 닭의 그룹에서 실시 하는 면역 반응의 평가 문화 매체 (B); 주사 계란에서 부 화 모의 제어 닭 그리고 닭 부 T. cruzi trypomastigotes 주사 계란 (C)26화. 그룹 B와 C 도전 세 번 말린 살해와 성인 닭 T. cruzi trypomastigote 항 원, 주간, 비디오와 같이. ELISA와 IIF 분석 실행 되었습니다 수집 된 혈 청으로 그룹 a, B 및 C 닭 도전 후에 1 달. 그림 8 그룹 A와 C 닭, 그룹 B 접종 T. cruzi 항 원에에서 특정 항 체 생산와 예리하게 대조를 특정 항 체의 부재를 보여 줍니다. 결과 명확 하 게는 면역을 보여주었다 T. cruzi에서 부 화 그룹 C에서에서 허용-계란을 주사.

성적인 전송 시도 panosoma cruzi 마우스 모델 시스템에

또한, PCR에서 양성 하 고 특정 항 체 부족, Chagas 환자 사정에서 T. cruzi 의 infectivity 남성 생쥐의 고 통해 복 막 구멍으로 정액의 100 µ L의 instillations를 통해 시연 했다는 같은 양의 정액 질으로 얻은 5 주 후에, T. cruzi 의 amastigote 둥지 심장 및 골격 근육에서 발견 되었습니다. 그리고 기생충 차별화의 덩어리로 vas deferens 과 자 궁 관의 루멘에 참석 했다. 흥미롭게도, 파괴적인 염증 반응 둥지와 T. cruzi amastigotes (그림 9)의 덩어리를 둘러싸고 하지 않았다.

T. cruzi 감염의 성적인 전송의 평가 1 × 105 T. cruzi 베 레 니케 trypomastigotes 폼1,30, intraperitoneally 주사 하는 생쥐의 두 그룹에 추가 실시 31. 난, 10 T. cruzi-10 순 제어 여성 쥐와 성관계 남성을 감염 하는 실험적인 그룹에. 실험 그룹 II, 10 T. cruzi-감염 10 순진한 제어 남성과 성관계 여성. 그림 10 T. cruzi보여줍니다-남성 쥐 (A-E)를 감염 하 고는 T. cruzi-여성 쥐에 감염 (F-g) 188 bp nDNA 밴드 (홀수 번호)를 나왔고. 번 식, 후 순진한 동료 (짝수)는 쉽게 T. cruzi chagasic 친구와 독특한 성행위 다음 인수. 동일한 조건 하에서 수행 하는 비슷한 반복 실험을 각 순진한 여성 또는 남성 마우스를 성적으로 성관계 T. cruzi와 확인-감염 된 남성 또는 여성 flagellate 감염 인수. 이러한 nDNA 긍정적인 설립자 (F0) 그들은 6 주의 나이까지 제기 자손 생성. 다음, 테스트 및 컨트롤 감염 되지 않은 쥐 심장 찔린 출혈이 통해 약 0.5 mL의 혈액을 수집 했다. NDNA PCR 분석 실험 188 bp nDNA 밴드 (그림 11)에서 같이 창시자 (F0) 성적 획득 감염 F1 자손 전송 했다 보여주었다. F1 자손 nDNA-70 (58.6%) 샘플 검사의 41에 긍정 했다. 41 (22%)의 9 했다 T. cruzi 항 체 몇 세로 획득된 감염의 암시 nDNA 밴드와 함께이 쥐.

F1 자손 마우스 마 취, 희생 했다 그리고 신체 조직 학적 및 면역 과산화 효소 얼룩 분석 대상이 됐다. 이러한 실험의 결과 그림 12에 표시 됩니다. T. cruzi amastigotes에 대 한 결과 epididymis의 중간 셀에 및 goniablasts;에 문서화 되었다 amastigotes trypomastigotes로 차별화 염증 반응의 부재에서 seminiferous tubules의 루멘에 참석 했다.

Figure 1
그림 1 . Trypanosoma cruzi 급성 샤 가스 병의 죽은 소년의 seminiferous 관 감염 . Microphotograph 의사 텍사스의 파일, 197018에서. T. cruzi 양식 goniablasts에 있으며 amastigotes 및 무료 trypomastigotes (화살표)의 덩어리는 선 동적인 침투1. 의 부재에서 seminiferous 관의 루멘에 되며 오신 얼룩. 바, 20 μm. Reprinted 게시자와 저자1,19허가.

Figure 2
그림 2 . 발자국 Trypanosoma cruzi 급성 샤 가스 질병에서. T. cruzi nDNA PCR 증폭 제품 특정 방사선 188-nt 프로브 188-nt 밴드를 형성 했다. Tc, T. cruzi; 노스캐롤라이나, 부정적인 컨트롤입니다. 게시자와 저자1에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 남쪽 의 분석 blotting Trypanosoma cruzi 인간 연구 가족의 과목에 감염. 가족 A-모든 15 과목 특정 nDNA PCR 188-nt 밴드 보여주었다. 가족 B 43 과목 (81.4%)의 35의 총 특정 nDNA 밴드를 형성 했다. 가족 C 29 회원 중 22 (75.8%)는 nDNA 밴드 형성. 가족 d에서 21 과목 (52.4%)의 11 nDNA 밴드를 했다. T. cruzi-특정 nDNA 밴드 클로닝 및 시퀀싱에 의해 확인 되었다. 게시자와 저자1에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 활성 Trypanosoma cruzi 는 정액에 감염 연구 가족 자원 봉사자에서 사정. Chagas 환자 ejaculates nDNA PCR 188 bp 밴드에 의해 식별에 감염. Tc, T. cruzi 긍정적인 통제 노스캐롤라이나, L. braziliensis 부정적인 제어입니다. 게시자와 저자1에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 표현 형 Trypanosoma cruzi 샤 가스 질병 환자의 혈 청 항 체와. T. cruzi 동일시 Chagas 혈 청 IgG 항 체 기생충 trypomastigote를 인식 하는 FITC 표시 된 단일 클로 널 Ab 안티 인간 IgG와 치료. 안티-T. cruzi Ab Leishmania braziliensis promastigotes를 인식 하지 못합니다. 인세트 부정적인 컨트롤을 표시합니다. 바, 20 µ m. Reprinted 게시자와 저자1허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 6
그림 6 . ELISAs 가족에서 nDNA PCR 분석 실험의 그래픽 표현을 인구 연구. 나 그룹 (n = 10) II 그룹 (n = 20) parasitological 데모와 T. cruzi 의 감염에서 부정적인 제어 및 긍정적인 제어 세라를 각각, 했다. 3 세 그룹 (n = 31) T. cruzi188 bp nDNA 밴드와 특정 항 체 가족 과목에서 샘플을 포함. 4 그룹 (n = 52) T. cruzi 감염 nDNA PCR 188-nt amplicons 특정 항 체의 부재에 의해 감지 과목에서 샘플을 구성. 그룹 V (n = 26) 부정적인 테스트 샘플 가족 연구에서 감염 없는 사람들을 구성 했다. 게시자와 저자1에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7 . Heredograms 및 매핑은 Trypanosoma cruzi- 가족 인구 감염. T. cruzi 항 체와 nDNA PCR 분석 실험의 그 그림의 안티-비율 간의 차이입니다. 열린 광장 및 원, 부정적인 남성 및 여성 빨간 사각형, 원, 긍정적인 안티-T. cruzi 항 체 및 nDNA PCR 검은 사각형 및 원형, 긍정적인 nDNA-PCR 혼자 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 

Figure 8
그림 8 . 닭에서 부 화에 면역 관용 Trypanosoma cruzi- 주사 계란. A) preimmune 항 체 모의 제어 닭에 프로필 (n = 10). T. cruzi 항 원 도전 B) 순진한 컨트롤에 특정 항 체 응답 닭 (n = 20). T. cruzi에서 부 화 C) 닭에서 특정 면역 반응의 부재- T. cruzi 항 원 도전은 후 계란을 주사 (n = 20). 광학 밀도 차이 A와 C (024 ± 0.17) B 쪽으로 (0.85 ± 0.6)은 통계적으로 유의 한 (p < 0.05). 이 그림 참조26 에서 수정 하 고 게시자 및 작성자의 허가로 증 쇄 하는.

Figure 9
그림 9 . 감염 Trypanosoma cruzi 활성 murine 감염 변환 인간 ejaculates에. 쥐의 질 또는 복 막 구멍으로 Chagas 환자 ejaculates의 aliquots 얻은 했다. 생쥐는 주입 후 3 주를 희생 했다. 최고의 레인, T. cruzi amastigotes 둥지 (왼쪽) 심장 및 골격 근 (오른쪽) 하단 레인, T. cruzi 의 amastigote 둥지 vas deferens (왼쪽)과 자 궁 관 (오른쪽) 삽입 나누어 amastigote (원)을 보여 줍니다. 조직 섹션에서 선 동적인 침투의 부재를 확인 합니다. 되며 오신 얼룩. 바: 상단, 왼쪽, 아래 20 µ m; 하단 오른쪽, 10 µ m. Reprinted 게시자와 저자1허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 10
그림 10 . 성적인 전송 Trypanosoma cruzi 는 마우스에서 감염 성교에 의해 시스템 모델. 순진한 동료 남부 내에서 특정 nDNA 188 bp 밴드에 의해 증명에 chagasic에서 T. cruzi 감염의 전송. T. cruzi-감염 된 생쥐의 고 순진한 쥐의 PCR 증폭 제품의 최고 레인) Prebreeding 프로필. 이상한 숫자 나타냅니다 T. cruzi-남성 A E 및 여성 F-에-난 마우스 샘플 감염. 짝수 번호는 순진한 여성 (2-10)과 남성 (12-20) 쥐. 사육, 마우스 2-20 취득 T. cruzi 감염도 프로필 표시 후 하단 레인 게시자와 저자1,30에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 11
그림 11 . Trypanosoma cruzi 감염 수직으로 F1 자손 쥐 부모의 F0 chagasic에서 전송 됩니다. Chagasic 부모 단일 번 식 발생으로 T. cruzi 감염을 전송. T. cruzi-감염 된 여성 했다 순진한 남성 A-E, 성관계 하 고 순진한 여성 T. cruzi-감염 된 남성 F-제이 게 성관계를 했다 번 식, 후 모든 창시자 (F0) 긍정적인 protozoan nDNA-PCR 188 bp 밴드를 보여주었다. 남부 럽 F1 새끼의 대다수에서 방사선된 188-nt 프로브와 교 잡 후 특정 nDNA 밴드 계시. Nc, L. braziliensis 부정적인 제어; Tc, T. cruzi 긍정적인 통제 게시자와 저자1,31에서 허가로 증 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 12
그림 12 . 문서화 histopathology Trypanosoma cruzi 염증 반응의 부재에서 F1 자손 및 면역 관용 F0에서 성병. 섹션은 epididymis, goniablasts 및 F1 쥐의 seminiferous tubules에서 T. cruzi 형태의 성장을 보여줍니다. 쥐 마 취, 희생 했다 그리고 면역 과산화 효소 스테인드 섹션 현미경으로 조사 됐다. photomicrographs 표시 갈색 면역 과산화 효소 스테인드 T. cruzi epididymis (A의 중간에 amastigotes)와 amastigotes trypomastigotes는 seminiferous의 루멘으로 창 고에 차별화의 덩어리 가느다란 관 (B, C 및 F) Goniablast (D)에서 본 amastigote 둥지. 긍정적인 통제 마우스 seminiferous 관 정상적인 조직학 (E). Chagas 기생충의 부하를 보여주는 F1 쥐의 고환에 염증 성 침투의 부재를 확인 합니다. Giemsa의 얼룩입니다. 바: A, B, C, E, 20 µ m; D와 F, 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1입니다. 인간 연구 가족 A에서에서 수집 된 샘플에서 nDNA PCR 분석 실험의 긍정적인 IIF 및 ELISA 시험의 비율 사이 불일치-에-D *

그룹 * * 엘리 사: 세럼 안티-T. cruzi Ab (%) T. cruzi nDNA-PCR (%)
제어 Ab-PCR-(n = 10) 10/10 100 10/10 100
II-제어 Ab + PCR + 20/20 100 20/20 100
(n = 20)
III-Chagas Ab + PCR + ᵟ 31/109 28.4 31/109 28.4
(n = 31)
IV-Chagas Ab-PCR + ᵟ - - 83/109 76.1
(n = 52)
V-샤 가스 무료 Ab-PCR- 26/109 23.9 26/109 23.9
(n = 26)
* 3 개의 독립적인 ELISA와 nDNA PCR 분석 실험의 결과 1, 2, 및 3 년에서 3 개의 다른 경우에 수집 된 샘플에서 실행 합니다. [1]. 188-nt T. cruzi DNA의 증폭 반복 복제와 시퀀싱에 의해 확인.
* * (그룹 I 및 V) 부정과 긍정적인 과목 (그룹 III와 IV) 간의 차이 통계적으로 유의 한 (p < 0.05).
ᵟ 그룹 III와 IV T. cruzi 항 체의 부재에 면역 관용에 의해 설명 사이 불일치는 PCR 긍정적인 과목의 62.6% (52/83)에 달성 했다.

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Discussion

여기, 우리 인간의 Chagas 질병 성병된 공략 T. cruzi 에서 유래 여부의 질문에 대답 하는 가족-기반 연구 프로토콜 토론 감염. 초기 연구 수 제공 하지 T. cruzi 의 감염, 성적인 전송의 증거 아마 때문에 사용 가능한 데이터 및 샤 가스 병에 대 한 정보는 개별3,4,에서에서 별도로 입수 했다 5,6,7,8,9,10,11,,1213. (그림 1) 소년의 seminiferous 관 T. cruzi 의 발견 스파크 임상 및 역학 조사를 촉진 했다. 몇 십년 후 알만 가족 연구 접근 방식 및이 연구 프로토콜에 설명 된 기술을 사용할 수 있었던, T. cruzi 라이프 사이클 단계 인간의 사정1,19에 등장.

21 급성 샤 가스 질병 경우에서 protozoan의 parasitological 직접 데모가 했다 T. cruzi심하게 감염 모든 과목에서 샘플에서 특정 밴드를 형성한 nDNA PCR 증폭 제품의 유효성을 검사 하는 중요 한. 이 포인트의 케어 연구소 마커 면역 및 핵 산 분석 실험의 결과 평가. 근본적인 장기 Chagas 질병 가족 연구, 따라서 실험실 동물의 그룹에 그 인간의 발견을 결합 합니다. T. cruzi 는 처음으로 공개 하는 프로토콜에 따라 연구 실시 인간1감염 전송 성적으로.

기생충 관련 항 체 분석 실험에서 비율 및 핵 산 시험에서 그의 광범위 한 차이 나타냅니다 nDNA 발자국의 대부분 T. cruzi 안티 특정의 부재에서 성병된의 경우에서 결과 항 체입니다. 따라서, 특정 IgG 항 체의 부재에 긍정적인 nDNA 전시 가족 구성원에서 T. cruzi 의 성적인 전송 면역 관용 때문 이었다.

면역 관용 배아 성장1,25,26,,3233의 첫 번째 주 후 T. cruzi 감염 내 화물 치킨 모델 시스템에서 설명 되었다 34. 그 후, 미 성숙한 면역 체계의 무 능력 신체의 외국 구성 요소 표시 허용 오차 성숙 면역 시스템을 향해 늦은 닭의 기생충을 인식 T cruzi. 이러한 결과 비추어 허용 오차는 면역계의 자기 인식 및 생리 적 조건25,26, 에서 자신의 신체 구성의 유지 보수에서 발생 하는 자연 현상1 32 , 33 , 34. 면역 Chagas 심장 질환에 면역 관용 상태에서 따라서 연결 될 수 있습니다 호스트의 게놈1 T. cruzi kinetoplast (kDNA) 돌연변이에서 발생 하는 이펙터 셀 수정 2,,1423,,2526.

주요 기술 수정 및 성병된 Chagas 기생충1,14,,2325, 공개 하기 위해서는 문제 해결 연구 프로토콜의 중요 한 단계 설명 26: 나) 급성 샤 가스 질병35,의36;의 경우 연구 가족 선택 급성의 경우;의 혈액에서 야생-타입 T. cruzi 의 ii) 분리 iii) 취득 DNA 샘플 가족 참가자 혈액 flagellates, 베 레 니케 T. cruzi 원형에서 긍정적인 deidentified 은행 DNA 샘플, 및에서 부정적인 제어 L. braziliensis; 참가자의 flagellates nDNA 발자국 동일 하 그 긍정적인 은행 DNA 샘플;의 베 레 니케 T. cruzi 상을 보여주는 iv) 수행 깔끔한 기술 절차 3 개의 경우; 1 년에 가족 구성원에서 T. cruzi 감염을 설명 하기 위해 v) 실행 독립적인 triplicate nDNA 프린팅 세트 6) 관리 지점 실시 nDNA PCR 기술 복제 하 고 특정 뇌관에 단련 된 모든 amplicons 시퀀싱에 의해 확인 결과 수익률 보장, 따라서 일관 되 게 보여주는 T. cruzi 188-nt 시퀀스 1,25,,2829,30; vii) 혈 청 샘플 3 다른 시간 지점;에서 수집된에 여전히 항 체 titers 재현 하 고품질 상표 시 약을 사용 하 여 viii) 가족 연구 프로토콜 공개 정액 ejaculates Chagas 기생충 감염에서 수집에 특정 혈 청 항 체의 부재에서 T. cruzi nDNA의 데모 시 세균 선 세포에서 기존 라이브 감염 개인1; ix) 관점은 연구 프로토콜은 성병 해명 하도록 T. cruzi 감염 5 대륙; autochthonous Chagas 질병을 공개 해야 합니다 x)은 nDNA 및 kDNA 발자국 보안 인간1,2; 무 증상 만성 샤 가스 병의 진단 사이)은 nDNA의 부재, 돌연변이T. cruzi의 kDNA 시퀀스1,2,23,,2526 혼자 위한 실험실 마커는 idiopathic 확대 cardiomyopathies23,25,37,,3839에서 차동 진단을 달성.

또한, 악성 T. cruzi Chagas 환자 ejaculates 문서화 마우스 질으로 및의 복 막 구멍으로 주입 시 광범위 한 감염을 시작 할 수 있었다. 병 리 연구는 마음과 vas deferens 과 자 궁 관 뿐만 아니라 골격 근육에 T. cruzi 의 amastigote 둥지를 보여주었다. 흥미롭게도, 기생충 둥지에는 중요 한 생식 기능을 방해 것이 염증 반응을 자극 하지 않았다. 염증 성 반응의 부재 렌더링 기능 중요 한 신체 구조40,41,42,43,44,45 면역 권한 때문 생식 기관에서의 T. cruzi uncurbed 성장에 설명합니다.

또한, 순진한 동료와 함께 자란 chagasic 쥐에서 실험 연구 인 간에 있는 T. cruzi 감염의 성적인 전송 추가 설명 했다. 감염된 여성 및 남성 성관계, 감염 되지 않은 순진한 동료에 게 T. cruzi 감염을 전송 하 고 그들의 담가의 대부분 인수 T. cruzi 수직으로 부모 로부터 자손에 전송. 이 실험에서 초기 단계 튜브 및 자 궁 뿐만 아니라 seminiferous 관 및 vas deferens, 면역 권한 일어났다 T. cruzi 의 성장 이라고 합니다. 그럼, 성적인 전송 정액 또는 질으로 자 궁 분 비에서 기생 단계를 통해 발생 했습니다. 면역 권한40,41,,4243,44,45 는 downregulate에 일부 기관 (생식, 눈 및 두뇌)를 허용 하는 현상 염증 성 반응, 과민 하 고 특정 중요 한 기능40의 손상을 방지 하 고. 호르몬41 와 여러 면역 요인 downregulate 세포41,,4243, 자연 킬러 세포41, T-세포, 및 T-규제 (Treg) 세포, 따라서 계획은 proinflammatory cytokines 그리고 면역 권한 트리거40,41,,4243,44,45의 수 억제

순진한 파트너 남성 및 여성에서 T. cruzi 감염의 성적인 전송 Chagas 질병의 컨트롤에 필요한 국제 연대를 나타냅니다. 여기 논의 결과 더 창의적인 연구가 필요 하다는 것이 좋습니다. 다음 즉시 목표를 달성할 수 있다: 나) 특정 하 고 매우 민감한 핵 산 성교, 전송한 감염의 예방에 대 한 목표는 정확한 진단을 도달 테스트 처리량이 높은 플랫폼을 개발 하 임상 및 역학 문의 확인 진단 및 샤 가스 병;의 보급을 촉진 뿐 아니라 수혈과 장기 이식 ii) T. cruzi 감염;의 근절에 대 한 새로운 약물을 얻기 위해 되 약물 개발 프로그램 홍보 그리고 iii) 교회, 사회 단체, 및 샤 가스 병의 확산을 방지 하기 위해 보건 기관 적합 한 교육, 학교의 참여를 포함 하는 정보 및 통신 프로그램 구현.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

우리 실험실 시설 및 브루노 Dalago과 라파엘 이드의 기술 지원과 Izabela Dourado, 칼라 아라우와 영리한 고메스의 중요 한 의견을 인정합니다. 우리는 과학의 발전 (FAPDF), 국가 연구 위원회, 사역의 과학 및 기술 (CNPq/MCT), 재단 하는 기관 교육 인적 자원, 교육에 대 한 빚을 (망 토 / 나), 브라질, 이러한 지원에 대 한 조사입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCIP and NBT redox system Sigma-Aldrich 681 451 001
Blood DNA Purification columns Amersham Biosciences 27-9603-01
d-ATP, [α-32P], 250 µCi.   Perkin Elmer   BLU012H
DNA, Solution Salt Fish Sperm AMRESCO 064-10G
dNTP Set, 100 mM Solutions GE Healthcare 28-4065-51
Eco RI Invitrogen 15202-021
Goat anti-human IgG- alkaline phosphatase conjugated Southern Biotech        2040-04
Goat anti-human IgG- FITC conjugated Biocompare MB5198020
Hybond – N+ nylon membrane GE Healthcare RPN303B
Hybridization oven Thomas Scientific 95-0031-02
Micro imaging software cell Sens software Olympus, Japan
Molecular probes labeling System Invitrogen 700-0030
Nsi I Sigma-Aldrich R5584 1KU
Plasmid Prep Mini Spin Kit GE Healthcare 28-9042-70
Plate reader  Bio-Tek GmBH 2015
Rabbit anti-chicken IgG-alkaline phosphatase conjugated Sigma-Aldrich A9171
Rabbit anti-chicken IgG-FITC conjugated Sigma-Aldrich F8888
Rabbit anti-mouse IgG- alkaline phosphatase conjugated Sigma Aldrich A2418 
Rabbit anti-mouse IgG-FITC conjugated Biorad MCA5787
Spin Columns for radio labeled DNA purification, Sephadex G-25, fine Sigma-Aldrich G25DNA-RO 
Taq DNA Polymerase Recombinant Invitrogen 11615-010
Thermal cycler system Biorad, USA 1709703
Vector Systems Promega A1380

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References

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면역학 그리고 감염 문제점 143 가족 연구, Trypanosoma cruzi 정액 사정 자 궁 분 비 마우스 모델 시스템 수직 전송 면역의 특권 치킨 모델 시스템 면역 관용 Chagas 질병.
치 메이 트 남성 및 여성에서 미국의 Trypanosomes의 성적인 전송
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Almeida, A. B., Araújo, P.… More

Almeida, A. B., Araújo, P. F., Bernal, F. M., Rosa, A. d. C., Valente, S. A., Teixeira, A. R. L. Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates. J. Vis. Exp. (143), e57985, doi:10.3791/57985 (2019).

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