Summary
מטרת טכניקה זו היא להכין תרבות מועשר של ראשי motoneurons (MNs) של חוט השדרה מאתר. כדי להעריך את ההשלכות של מוטציות גורמות למחלות MN, נתאר כאן ניתוקה של אלה מבודדים MNs של תרביות תאים שלהם על-ידי magnetofection.
Abstract
הייתה שם הקשורים ניוון מוחיים של עמוד השדרה motoneurons (MNs) במגוון גדול של הפרעות נוירולוגיות כולל נוירודגנרטיביות שארקו-מארי-טות ', ניוון שרירי עמוד השדרה, אשר ישויכו כולן ניוון שרירים. תרבויות העיקרי MNs בעמוד השדרה היו בשימוש נרחב כדי להדגים את מעורבותם של גנים ספציפיים במחלות כגון ולאפיין את ההשלכות שלהם מוטציות הסלולר. תרבות זו מודלים MN העיקרי פרוטוקול נגזר העבודה החלוצי של הנדרסון ועמיתיו לפני יותר מעשרים שנה. ראשית, אנחנו פירוט שיטת לנתח את הקרניים הקדמי של חוט השדרה של העובר העכבר ובידוד MNs מגבולות תאים באמצעות מעבר הדרגתי צפיפות. לאחר מכן, אנו מציגים דרך חדשה ביעילות transfecting MNs עם פלסמידים ביטוי באמצעות magnetofection. בסופו של דבר, אנחנו להמחיש כיצד לתקן, immunostain העיקרי ש-mns. באמצעות neurofilament מוטציות הגורמות שארקו-מארי-שן מחלות מסוג 2, פרוטוקול זה מדגים בגישה איכותית המבטאים חלבונים עניין ולימוד שלהם מעורבות MN, תחזוקה, וצמיחה של הישרדות.
Introduction
מחלות נוירומוסקולריות מקיפים מגוון רחב של פתולוגיות ברורים קליניות, גנטית המאופיינת על ידי משינוי של שריר ו/או מערכת העצבים. הודות להתפתחות הטכנולוגית של טכנולוגיות רצף, מאות גנים אחראים אלה מחלות נדירות זוהו במהלך העשור האחרון (הרשימה זמינה במרכז המחלה Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). מגוון מוטציות מזוהה מציין כי מוטציות שונות בגן גן יחיד יכול לגרום מתבטא בצורות שונות ומחלות1,2,3 , כי מוטציות בגנים שונים ניתן לייצר דומה פנוטיפים 4 , 5. בהקשר זה, ישנם מאמצים לפתח דגמי הסלולר שיכולים להיות כלים רבי-עוצמה לניתוח ההשלכות מוטציה ומנגנונים פתולוגי.
MNs בעמוד השדרה יש somas גדולה הממוקמת הקרניים הבטני של חוט השדרה, אקסונים ארוכים טופס היעד סיבי שריר השלד, ולאפשר תנועות מרצון באמצעות השחרור אצטילכולין ובצמתים עצב-שריר. מאז MNs מושפעות על ידי מחלות נוירומוסקולריות כגון נוירודגנרטיביות, שארקו-מארי-טות (CMT), ניוון שרירי עמוד השדרה, דוקטור הנדרסון ועמיתיו פיתחו הראשון פרוטוקול6 שמותר קומפלקסים במבחנה MNs בעמוד השדרה, על גילוי neurotrophic גורם GDNF7 (תא גליה נגזר neurotrophic פקטור). ליטושים טכני מאז אפשרו לטיהור מדויקת יותר של עמוד השדרה MNs ובסוגי שלהם באמצעות FACS8, אך העשרה על ידי צפיפות הצבע נשאר בשימוש נרחב ועוצמתי במעבדות כרגע עובד עם MNs בעמוד השדרה הראשית 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. לאחר מכן, זה גם אפשרי להשיג ציון גבוה יותר של טיהור MN דרך immunopanning על ידי ניצול של סמן משטח p75(NTR)15,16,17.
חוט השדרה מכיל תתי סוגים שונים של צוואר הרחם,, מותניים MNs, וכן החציוני לרוחב המנוע וטורים שונים בין המיקום שלהם ב הצופר הקדמי על ציר dorso-הגחוני /, בין היעדים הם innervate8, 18. תרבויות MN הראשי יכול לשחזר את כל תת אלה MN בפרופורציות פיזיולוגיים. המגבלה העיקרית של שיטה זו הוא המספר הנמוך של MNs שהושג בסופו של ההליך; למעשה, ניתן לצפות להשיג סביב 105 MNs של שישה עוברי, אשר מתאימה מיקרוסקופ, אבל הגבלת לניסויים ביוכימיה. ביצוע ניסויים עם יותר סטנדרטית יחוברו, שופע MNs (> 106 תאים) עובריים תאי גזע-derived MNs צריך להיחשב18.
תרביות תאים של transgenes פראי-סוג/מוטציה או תמונות ציפורים גנים אנדוגני לתוך MNs העיקרי הוא כלי מהיר ויעיל עבור פענוח מסלולים physiopathological, במיוחד כאשר העכבר מודלים אינן זמינות. Magnetofection היא טכניקה אחת עבור נוירונים העיקרי transfecting, הדומה lipofection בלי neurotoxicity קשורים. יתר על כן, ניתן לבצע תרביות תאים בנוירונים בוגרים לאחר מספר ימים במבחנה, בניגוד טכניקות בהתבסס על אלקטרופורציה9. אולם חיסרון אחד של שיטה זו הוא כי החרוזים לאגד חומצות גרעין בתרבות, גרימת רעש דאפי תיוג. זיהום ויראלי הוא כנראה הטכניקה היעילה ביותר עבור transfecting MNs; עם זאת, magnetofection אינו מצריך מסוימים נהלי הבטיחות לצורך ייצור ויראלי ולדלקת הסלולר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בכל ההליכים הכרוכים חיות התקבלו על-ידי הוועדה האתית של המוסד.
1. פתרון הכנה
- הכינו 10 מ"ל של 4% BSA דיאליזה L-15 בינוני.
- לפזר אבקת אלבומין שור ב- 4% (w/v) ב- 10 מ"ל של L-15 בינונית.
- הוסף את הפתרון קלטת דיאליזה 20 מ עם ניתוק kDa 20. Dialyze נגד 500 מ"ל של מדיום L-15 במשך 3 ימים תחת עצבנות ב 4 º C. מחליף המדיום L-15 כל יום.
- לסנן את הפתרון דרך ממברנה מיקרומטר 0.22 aliquot 15 mL צינורות. לאחסן את הצינורות ב-20 ° C.
הערה: פרוטוקול זה משתמש בהפניות הבאות: שלא שונתה בינוני L-15 גולמי = L-15 בינוני, בינוני L-15 חומצי = pH L-15, והמדיום L-15 בסיסי = L-15 ביקרבונט.
- להכין 200 מ של pH L-15.
- להתאים את ה-pH של המדיום L-15: ראשית, למלא בקבוק שטיפה עם כמה חתיכות של קרח יבש. להחדיר גז (CO2) לתוך המדיום L-15 עד הצבע כתום (~ pH 6.4 ו-40 ~ לחצים). ה-pH ניתן להתאים גם עם מד pH הרגיל.
- לסנן המדיום דרך ממברנה מיקרומטר 0.22 החנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד.
- הכן 100 מ של ביקרבונט L-15.
- להוסיף 2.5 מ של 7% סודיום ביקרבונט mL 97.5 L-15 בינוני ולאחסן ב 4 º C.
- הכינו את תוספי IPCS (אינסולין Putrescin Conalbumin סלנייט).
- להמיס 2.5 מ ג של אינסולין בדם 0.5 מ של 0.1 M HCl. הוסף 4.5 מ ל מים מזוקק פעמיים.
- להמיס 8 מ ג של putrescine ב 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
- להמיס 100 מ ג של conalbumin ב- 10 מ"ל ל- PBS.
- 1 מ ג של סודיום סלניט ב- 19.3 מ ל מים, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4, ו לדלל את הפתרון 10-fold.
- לשלב 1 מ"ל של האינסולין, 1 מ"ל של פתרון putrescine, 1 מ"ל של conalbumin ו- 0.1 מ"ל של נתרן פתרון הסלנייט להשיג 3.1 מ של IPCS תוספת פתרון. לאחסן את הפתרון ב-20 ° C.
- להכין פתרון פרוגסטרון מ מ 0.02 נקודות.
- להמיס 1 מ ג של פרוגסטרון ב- 1.6 מ ל 80% אתנול.
- לדלל את פתרון 100-fold ב 100% אתנול ואחסן אותו ב-20 ° C.
- הכן 100 מ של מדיום L-15 מלאה.
- להוסיף 1.8 מ של תמיסת D-גלוקוז (200 מ"ג/מ"ל) 92 מ של pH L-15 להשיג ריכוז סופי של 3.5 מ"ג/מ"ל גלוקוז.
- לשלב 1 מ"ל של 100 x פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL), 2 מ של סרום סוס חום-לא פעיל, 3.1 מ של תערובת IPCS ו- 0.1 מ"ל של פרוגסטרון פתרון (2 x 10-5 מ').
- לסנן את המדיום על קרום מיקרומטר 0.22 ואחסן אותו ב 4 º C.
- להכין 5 מ של צפיפות פתרון הדרגתי (הריכוז הסופי של 5.5%) לכל ניסוי.
- להוסיף 476 µL של המדיום הדרגתיות מסחרי 60% צפיפות 4524 µL של L-15 (אם הדבר אפשרי, ללא פנול אדום כדי להגדיל את החדות חזותי-לאטמוספרה; יחס דילול של 1:10. 5).
- לאחסן את הפתרון ב 4 ° C 2 שבועות או להקפיא אותו ב-20 ° C.
- הכינו 10 מ"ל של תרבות התקשורת.
- להוסיף 200 µL בינוני תוספת 9.6 מ של נוירון תא תרבות בינוני.
- להוסיף 200 µL של נסיוב סוס חום-לא פעיל (אשר נוטה להבחין בין סימנים מקדימים תא גליה ופועל נגד ההפצה) 25 µL של גלוטמין ו 10 µL של מרקפטואתנול.
- לסנן את המדיה דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
- הוסף את הגורמים neurotrophic הבאים: ciliary neurotrophic פקטור (CNTF)-ריכוז סופי של 10 ng/mL, ואת המוח נגזר neurotrophic פקטור (BDNF) גורם נגזר neurotrophic תא גליה (GDNF) בריכוזים הסופי של 1 ng/mL.
- חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס.
- להכין 50 מ של דיסקציה מדיה.
- להוסיף 2.25 מ של גלוקוז (200 מ"ג/מ"ל) 47.05 מ של HBSS. להוסיף 700 µL של 1 מ' HEPES עם pH 7.4. חנות המדיה ב- 4 מעלות צלזיוס.
- להכין פתרון PFA 4%.
- לפזר 20 גרם של מחברים ב- 500 מ ל- PBS.
- ברדס כימי, מחממים את הפתרון עד 60 ° צלזיוס ולהוסיף כמה טיפות 1 M NaOH עד הפתרון נעשה ברור.
- לסנן את הפתרון דרך נייר פילטר ולהתאים את ה-pH ל- 7.2. אחסן אותו ב-20 ° C.
הערה: לחלופין, פתרונות PFA מסחריים אחרים שניתן להשתמש ו מדולל 4% ב- PBS.
- לנקות את הכלים ניתוח כולל מלקחיים, מספריים, ומנות סיליקון עם 70% אתנול לפני השימוש, ועם סבון ונקה מים לאחר השימוש.
2. פולי-ornithine/Laminin (Po/L) דיש ציפוי
הערה: אמצעי אחסון מותאמים את המעיל צלחת 24-. טוב.
- אם יש צורך, הכניסו הבאר coverslip עקר 12 מ מ.
- מעיל הבארות עם µL 500 בפתרון 10 µg/mL פולי-L-Ornithine, מומס במים.
- תן הבארות להסתפק 1 h בטמפרטורת החדר.
- הסר את הפתרון פולי-L-Ornithine, מילה נהדרת למשך 30 דקות.
- מעיל הבארות בין לילה ב 37 ° C עם 500 µL של 3 µg/mL laminin של ביקרבונט L-15.
הערה: בארות שניתן לאחסן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים בחממה. עבור incubations ארוכה, הוספת PBS סטרילי בין הבארות יכולה לסייע כדי למנוע אידוי בינוני.
3. ניתוח
- אקריב עכבר בהריון כאשר העוברים בשלב העוברי E12.5. לנקות את הבטן עם 70% אתנול.
- הסרת הרחם על ידי חיתוך של שני oviducts, הנרתיק ושם אותו בתוך צלחת פטרי עם PBS קר (ללא Ca2 + Mg2 +).
- לאסוף את כל העוברים ולהעביר אותם טריים, PBS קר (ללא Ca2 + Mg2 +) של צלחת פטרי.
- לשים אחד העובר מאכל מצופה עם סיליקון ומלא לנתיחה מדיה (עם HBSS, גלוקוז 4.5 g/L ו- 7 מ מ HEPES pH 7.4).
הערה: העובר לנתיחה מתבצע תחת מיקרוסקופ באמצעות נקי בסדר. מלקחיים ומספריים. לחלופין, צלחת פטרי רגיל ללא סיליקון יכול לשמש עבור ניתוח. - להסיר את הראש, הזנב, מעיים, באמצעות מלקחיים כמו מספריים.
- לשמור על העובר עם הבטן נגד שהסיליקון עם מלקחיים.
- עם זוג מלקחיים השני, להוסיף אחד הטיפים לתוך התעלה המרכזית של חוט השדרה rostral.
- סגור את המלקחיים להרוס את רקמת הגבי כמה מילימטרים.
- חזור על פעולה זו כלפי הצד סימטרית עד לחוט השדרה כולו פתוח (איור 1B).
- ניתוק החלק rostral של חוט השדרה (עורק מוחי) מן הגוף.
- להפוך את העובר כדי לשמור על חוט השדרה פתוח נגד שהסיליקון.
- לצבוט את החלק rostral של חוט השדרה ומשוך את העובר על ידי ראש כדי לחלץ את חוט השדרה.
הערה: קרומי המוח ואת הגרעינים העזוב שורש (DRGs) צריכים להישאר מחוברים העובר. אחרת, משוך בזהירות משם כל קרומי המוח הנותרים, DRGs עדיין מחובר לחוט השדרה. בשלב זה, DRGs יכול גם להיות שנאספו עבור תא עצב רגיש תרבות (ראה דיון). - לשטח את חוט השדרה על שהסיליקון ולהסיר את החצי הגבי של החוט על ידי גזירה לאורך האמצע בכל צד באמצעות אזמל. לחתוך את החלק האמצעי ל-10 חלקים באמצעות אזמל ולאחר להעביר את החתיכות צינור חדש.
4. חוט השדרה תא השעיה
- חזור על הליך זה דיסקציה עבור 6-8 שידרה.
- תן חוט השדרה חתיכות לאסוף בחלק התחתון של הצינור ולהחליף את HBSS עם 1 מ"ל של חזיר-F10 בינוני.
- להוסיף 10 µL של טריפסין (2.5% w/v; הריכוז הסופי 0.025%). דגירה הצינור 10 דקות ב 37 º C.
- כדי להפסיק את עיכול אנזימטי, להעביר שברי צינור 15 מ"ל המכיל µL 800 של בינוני L-15 מלאה, 100 µL של 4% (w/v) BSA µL 100 של DNase (1 מ"ג/מ"ל L-15 בינוני).
- Triturate פעמיים על-ידי כ רפה בעברית 1 מ"ל באמצעות פיפטה של P1000. תן השברים להסתפק 2 דק. לאסוף תגובת שיקוע בשפופרת טריים 15 מ"ל.
- כדי השברים, הוסף 900 µL בינוני L-15 מלאה µL 100 של 4% (w/v) BSA, 100 µL של DNase (1 מ"ג/מ"ל L-15 בינוני).
- Triturate 6 פעמים לפי כ רפה בעברית 1 מ"ל באמצעות פיפטה של P1000. תן השברים להסתפק 2 דק. הוסף תגובת שיקוע על הצינור 15 מ"ל שהושג בשלב 4.5.
- כדי השברים, הוסף 900 µL בינוני L-15 מלאה µL 100 של 4% (w/v) BSA, 100 µL של DNase (1 מ"ג/מ"ל L-15 בינוני).
- Triturate 10 פעמים על ידי כ רפה בעברית 1 מ"ל באמצעות פיפטה של P1000. תן השברים להסתפק 2 דק. הוסף תגובת שיקוע על הצינור 15 מ"ל שהושג בשלב 4.5. להמשיך תגובת שיקוע.
- בעדינות באמצעות pipet P1000, מקם כרית 4% (w/v) 2 מ ל BSA בתחתית של התחתית supernatant. צנטריפוגה ב g x 470 במשך 5 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא 2 מ של מדיום L-15 מלאה.
5. MN העשרה על ידי דחיסות צבע
- פצל התליה תא 15 מ"ל שני צינורות (1 מ"ל כל אחד). לאחר מכן, להוסיף 2 מ"ל של מדיום L-15 מלאה. אם החל מ- 6 עוברי, להשתמש המקבילה של עוברי 3 למחזור ב- 3 מ"ל של מדיום.
- להוסיף 2 מ"ל של צפיפות פתרון מעבר צבע על-ידי הוספת לאט הפתרון לתחתית של כל שפופרת להשיג ממשק חד.
- צנטריפוגה ב g x 830 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שלב זה, תאים קטנים צריך להיות בחלק התחתון של הרכבת התחתית, ואילו תאים גדולים כגון MNs צריך להיות ממשק פתרון הדרגתי/בינוניים של צפיפות.
- לאסוף את התאים-הממשק על ידי כ רפה בעברית 1 או 2 מ"ל ומעבירים אותם אל צינור טריים 15 מ"ל. לכוון את עוצמת הקול כדי 10 מ"ל L-15 pH בינונית.
- להוסיף 2 מ של כרית BSA 4% החלק התחתון של צינור, צנטריפוגה ב 470 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של מדיום L-15 מלאה.
- חזור על שלב 5.5.
- הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב- mL 2 בינוני תרבות שלמה. לספור את מספר הטלפון ואת הכדאיות במיקרוסקופ ניגוד שלב עם hemocytometer.
הערה: עבור 6 שידרה, המספר הנייד צפוי להיות בסביבות 1 x 105 MNs.
6. MN תרבות
- לדלל MNs לצפיפות המתאים, בדרך כלל 5,000 עד 10,000 תאים µL 500 של תרבות בינוני לכל טוב לתוך צלחת 24-. טוב.
הערה: זריעה צפיפות היא סביב התאים 30,000 ו 1,500 עבור לוחות 6 - ו 96-ובכן, בהתאמה. - הסר את הפתרון laminin עם P1000.
- להעביר מיד MNs מדולל במדיום תרבות הלוחות ציפוי כדי למנוע ייבוש.
- תקופת דגירה התרבות של 2 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס.
7. Magnetofection של MNs
הערה: בשלבים הבאים, הכמויות שבהן משתמשים נועדו תרביות תאים של אחד טוב של צלחת 24-. טוב. נא עיין הפרוטוקול של היצרן עבור תבנית אחרת.
- לשם הכנת ה-DNA, resuspend 1 µg של ה-DNA ב- 50 µL עצביים תרבות בינוני ו מערבולת עבור 5 s.
- הכנה צינור חרוז, resuspend 1.5 µL של חרוזים ב µL 50 בינוני תרבות עצביים.
- להוסיף את הפתרון חרוז 50 µL הפתרון DNA 50 µL, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר (סה כ נפח = 100 µL).
- במהלך זה דגירה, לסגת µL 100 של תרבות בינוני מן הבאר זה להיות transfected.
הערה: לשים את הצלחת מגנטי בחממה כדי לחמם את זה ל- 37 מעלות צלזיוס. - להעביר µL 100 של המיקס DNA/חרוז לבאר ולאחר דגירה לצלחת 20 – 30 דקות בצלחת מגנטי ב 37 º C.
- . אני לא. לפחות 24 שעות לפני גילוי של הביטוי cDNA
8. קיבוע, מכתים
- לשטוף את התרבות פי 2 עם PBS.
- דגירה התרבות של 20 דקות בטמפרטורת החדר ב-4% מחברים/PBS.
- לשטוף את התרבות פי 2 עם PBS.
- דגירה התרבות ב- 500 µL מאגר חסימה (PBS BSA 4%, 2% נורמלית בסרום, 0.3% טריטון X-100, גליצין 0.1 M) לשעה בטמפרטורת החדר.
הערה: סרום נורמלי צריך להיגזר מאותו המין כמו הנוגדן המשני (למשל, סרום עז רגיל). - דגירה התרבות בין לילה ב 4 ° C עם נוגדן ראשוני מעורבבת עם µL 250 מאגר חסימה.
הערה: לדוגמה, TUJ1 משמש ב- 1/1000, SMI32 משמש ב- 1/1000, ומשמש Lc3b 1/200. - לשטוף את התרבות 3 פעמים עם PBS.
- דגירה התרבות עם נוגדנים משניים fluorophore מצומדת מעורבבת עם µL 250 מאגר חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התרבות 3 פעמים עם PBS.
- הר בשקופיות זכוכית באמצעות הרכבה בינונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר 24 שעות בתרבות, motoneurons (MNs) כבר להראות צמיחה משמעותית עצב (לפחות 6 פעמים יותר מאשר הגודל soma). בימים שלאחר מכן, אקסונים צריך להמשיך לצמוח ולהציג מסעף (איור 2). יהיו מורפולוגיות שונות עקב סוג של specificities. לדוגמה, העמודה החציוני MNs זה innervate השרירים צירית יש אקסונים נמוך, מסועף יותר מאשר MNs לרוחב עמודה מנוע זה innervate איבר שרירי18.
לאחרונה היו בשימוש כדי לאפיין מוטציה חדשה בגן neurofilament NEFH הגורמת טופס אוטוזומלית עצב דומיננטית של CMT13אלה בידוד וטכניקות culturing שתוארו לעיל. במקרה זה, יומיים לאחר ציפוי, MNs מטוהרים היו transfected עם פלסמידים קידוד או בצורת מוטציה NEFH דבוקה eGFP או את הטופס פראי-סוג דבוקה eGFP. יומיים מאוחר יותר, מוטציה NEFH-eGFP נוצרו אגרגטים לאורך הרשת cytoskeletal. ארבעה ימים לאחר magnetofection, אגרגטים אלה התפתח ב- aggresome perinuclear בולטים המכילה סמן autophagic LC3b (איור 3). גישה זו מאפשרת לנו להפגין כי הטופס mutant של NEFH המושרה היווצרות של אגרגטים המשויכות autophagic מסלולים ב- MNs העיקרי.
איור 1: סקירה של שלבים עיקריים בהליך. (א) E12.5 העכבר העוברים הם גזור כדי לחלץ את הצופר הבטני של חוט השדרה. לאחר מכן, הנוירונים את התאים הצופר הגחון הם חלופה מועדפת, MNs וגופם מטוהר על ידי דחיסות צבע לפני ציפוי. לבסוף, MNs transfected מאת magnetofection, ניתח אחרי כמה ימים. (B) בשלב הראשון של חיתוך בחוט השדרה הוא כאשר נפתח את הצלחת גג של חוט השדרה לאורך הציר rostro-סימטרית עם מלקחיים. לאחר מכן, חוט השדרה מנותק מן הגוף על ידי משיכת המטען מוחי. בשלב זה, קרומי המוח ואת הגרעינים העזוב שורש (DRG) נשארים בגוף מתחלקים. החלק הגבי של חוט השדרה נחתך longitudinally עם אזמל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: MN נציג תרבות. (א) MNs מורפולוגיה לאחר 4 ימים של התרבות על ידי צביעה של שרשרת כבדה אנדוגני-phosphorylated neurofilament (SMI32). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (B) MNs מורפולוגיה לאחר 4 ימים במבחנה , transfected עבור eGFP transgene על ידי magnetofection ביום 2. MNs היו counterstained עם הסמן SMI32 או דה מרקר עצבית פן Tuj1. חיצים מראים somas של הנוירונים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: תמונות קונאפוקלית של magnetofected MNs לבטא פראי-סוג או מוטציה eGFP-NEFH בונה (בצבע ירוק), מוכתם דה מרקר autophagic LC3b (באדום). חיצים מראים eGFP מוטציה-NEFH אגרגטים חלבון כי גם LC3b חיובי. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. תמונות עוברות שינוי מן Jacquier. ואח 2017, Acta Neuropathologica תקשורת13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד של נקודות קריטיות של פרוטוקול זה הוא העוברים העכבר הם שפרופסור-חלון זמן מדויק במהלך הפיתוח (E12.5) כדי למטב את כמות MNs שהושג בסופו של דבר. בנוסף, עבור תשואה אופטימלית, הקרע צריכה להתבצע בבוקר או בשעות אחר הצהריים המוקדמות. לפני E12.5 (למשל, ב- E11.5), ניתוח קשה, במיוחד לגבי חיסול של קרומי המוח. לאחר E12.5, מספר MNs שהושג טיפות באופן משמעותי. כדי לשלוט עובר לשלב ההתפתחות, למבוגרים נקבות וזכרים קודם ממוקמים יחד בסוף היום. למחרת בבוקר, המבוגרים מופרדות, וכל הנקבות נבדקים לנוכחות של פקק הנרתיק. אם פקק, העוברים, בשלב זה נחשבת ביום E0.5 של פיתוח. לניסויים אלה, אנו משתמשים בדרך כלל קו העכבר הוא נמרץ ויעיל. אבות שמקורם מושבה bred במיזורי שהיו בשימוש פרוטוקול זה, ומאז המתח נקרא CF1 (משקים Carworth זן 1). זן זה הוצג לראשונה ב (Charles river) מעבדות צרפת בשנת 1967, רכשה את השם OF1 (Oncins צרפת 1).
נקודה קריטית שנייה היא המדרגות צנטריפוגה המשפיעים באופן משמעותי על טוהר התרבות. MNs מייצג אחוז נמוך של התאים חוט השדרה (סביב 1%), המטרה היא להשיג תרבות המכיל 40-50% MNs בין תאים עצביים אחרים בעמוד השדרה, פחות מ-5% תא גליה אבות. כדי לנטר את היעילות של centrifugations, תא דגימות ההשעיה רכשה לפני ואחרי כל שלב יכול להיות מצופה MNs בינוני למשך 24 שעות, ואחריו תיקון, צביעת עבור הביטוי של נוירון מוטורי סמנים Hb9 (81.5C10, DSHB) או איון-1/איון-2 (ISL1 / 40.2D6 2, /39.4D5, DSHB), שילובים של מי להגדיר MNs שונים subpopulation19. ב- MNs בוגרת יותר, סמנים אחרים כגון כולין אצטיל טרנספראז (צ'אט, Ab144P) או Neurofilament H phosphorylated (SMI - 32 P) ניתן להשתמש כדי להעריך את האיכות של התרבות. חלופה טובה לניטור במהירות את היעילות של טיהור היא להשתמש העכברים הטרנסגניים המבטאים את ירוק ניאון חלבון (GFP) בפרט MNs. לדוגמה, Wichterle ועמיתיו שפותחו בעבר העכברים הטרנסגניים לבטא GFP תחת השליטה של העכבר יזם Hb9 (המכונה גם Hlxb9 או Mnx1)18. העכברים הטרנסגניים Hb9::GFP להציג ביטוי מובהק של GFP דנדריטים, אקסונים ו somas של עמוד השדרה MNs מיום עובריים 9.5 כמחנכת ליום 10.
MNs דורשים גידול על מצע מתירניות מתקבל על ידי פולי-L-Ornithine, ציפוי laminin. בהתאם לתנאי הניסוי, מגוון רחב של פלסטיק - פולימר-, מיכלי זכוכית מבוסס יכול לשמש (6-,למשל, 24, צלחות 96-ובכן, coverslips זכוכית או קאמרית שקופיות). בין אפשרויות אלה, ייתכן microfluidic התקנים עניין להפנות שאלות ספציפיות לגבי היווצרות סינפסה או הדרכה ואמצעי התחבורה עצב20. MNs ידועים להיות רגישים לשינויי שלהם microenvironment מעורבים דפוסים, ריכוז גורמים, שינויים מכניים המצע (למשל, נוקשות), ללחץ מוחלט, וכן ייתכן הדרגתיים ברמזים (למשל, סימון שבילים תכונות, המתבנת של משטחים עם חומרים שונים הזיקות הסלולר). Microfluidic פלטפורמות הן מערכות המשלבות תנאים multifactorial, המאפשרות הקביעה של האופטימלית microenvironments הסלולר.
מאז הגילוי של GDNF הישרדות אפקטים7, גדל מספר גורמים neurotrophic מעורב הגידול הראשוני MN, הישרדות, הדרכה, פיתוח של אקסונים, וגרימת של פלסטיות סינפטית. מעניין, כל גורם פועלת על subpopulation ספציפיים של MNs8. לדוגמה, CNTF תואר כדי להגן על העמודה מנוע החציוני (MMC) אשר innervates השרירים צירית, ואילו דבורה שחר פועלת על העמודה המנוע לרוחב (LMC) אשר innervates שרירי הגפיים. מצד שני, GDNF וגם BDNF מציגים את פעילות פרו-הישרדות החזקים באוכלוסיות שלמות של MNs. לבסוף, השילוב של GDNF, BDNF ו- CNTF מספיקה להגנה על יותר מ 70% של האוכלוסייה MN, משמש בדרך כלל במעבדות.
בתנאים סטנדרטיים תרבות, MNs יכול להישאר ערה חוץ גופית בתוך ל-14 ימים על-ידי החלפת מחצית התקשורת תרבות המדיה טריים פעם אחת כל 3 ימים, החל מהיום החמישי של תרבות. במהלך ההבשלה במבחנה , יכול transfected MNs מאת magnetofection בכל עת באמצעות פרוטוקול זה. יעילות ורעילות של טכניקה זו עשויה להיות מווסת על ידי הטבע של פלסמידים, מוסיף. במקרה שלנו, כאשר magnetofection בוצעה MN תרבות לאחר יומיים במבחנה באמצעות פלסמיד 9 kb עם promotor CAGGS (pCAGEN21) שליטה neurofilament cDNA, הבחנו בממוצע 31.48% ± 9.94 (סטיית תקן) של transfected MNs 48 שעות שלאחר תקנים. עם זאת, עבור מבנים אחרים, יחס שונה של ה-DNA/חרוזים צריך להיבדק כמפורט בפרוטוקול של היצרן. פרמטר נוסף שעשוי להשפיע על היעילות ברמה של תרביות תאים הוא ההבשלה של MNs לאורך זמן. ואכן, במהלך 3 הימים הראשונים של תרבות, הצמיחה של אקסונים, הגדלה של somas תתרחש, אשר מגדילה את פני השטח שבו יחדור החרוזים. פרמטר זה עשוי להגביר את היעילות תרביות תאים MN לאורך זמן תוך כדי בגרותם.
לבסוף, בהשוואה MN תרבויות, זה יהיה מעניין לטפח החישה הניריונים22,23,24. בפרט, שארקו-מארי-טות ' קשורה נוירופתיה מוטורית חושית מאופיין על ידי ניוון שרירים דיסטלי התנוונות הן MNs בעמוד השדרה, החישה הניריונים של DRGs. מעניין, DRGs נמצאים משני צידי השדרה, יכול להיות אסף במהלך ההליך אותו לנתיחה והשיג MNs. בהקשר זה, זה אפשרי להשוות את המנגנונים הקשורים pathophysiological בעבודה אלה שני סוגי תאים הרלוונטיים, motoneurons, נוירונים הרגישים DRG.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות את "האגודה יציקת le développement de la neurogénétique" אחוות של ד ר Jacquier, AFM-הטלויזיונית על התמיכה באמצעות תוכנית אסטרטגית MyoNeurAlp. אנחנו רוצים גם תודה ד ר כריס הנדרסון, ד ר ויליאם camu ב, ד ר בריג'יט Pettmann, ד ר סדריק ראול ו ד ר גיאורג Haase, אשר השתתף בפיתוח ושיפור הטכניקה ולהפיץ את הידע שלהם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
References
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
- Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
- Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
- Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
- Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
- Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
- Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
- Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
- Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
- Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
- Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
- Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
- Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
- Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
- Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
- Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
- Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
- Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
- Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
